生物技术通报

孕穗期甜高粱耐旱性鉴定

袁闯, 许兴, 唐三元, 毛桂莲, 朱林

2019, 35(12): 1-9. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0391

摘要 ( 316 )

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筛选抗旱的孕穗期甜高粱品种及其鉴定指标。选取28个甜高粱（Sweet Sorghum）品种,设置正常灌水（T1）和干旱胁迫（T2）处理,测定孕穗期株高（PH）、茎粗（SD）、叶面积（LA）、植株含水量（WPC）、叶绿素相对含量（SPAD）、细胞膜透性（CMP）及净光合速率（Pn）等15项指标。以各项指标的耐旱系数为依据,分别运用隶属函数、主成分分析和聚类分析等分析方法,对孕穗期不同甜高粱品种的抗旱性进行了综合评价和分类。干旱胁迫对各项指标均有显著影响,在15项指标之间存在相关性;通过主成分分析将15项指标转化成6项新的互相独立综合指标,并可以代替原始所有指标的绝大部分抗旱信息;通过隶属函数计算不同品种甜高粱D值,并进行聚类分析,将28个甜高粱品种分为4类：第Ⅰ类为9个高度抗旱型品种;第Ⅱ类为10个抗旱型品种;第Ⅲ类为8个中度抗旱型品种;第Ⅳ类为1个敏感型品种。干旱胁迫对孕穗期甜高粱各项指标均产生影响。筛选出9个高抗旱品种分别为F6036、F6080、F6099、F6043、F6149、F6059、F6096、F6271、F6172。

广藿香FPPS重组蛋白表达及互作蛋白筛选分析

钟李婷, 陈秀珍, 唐云, 李俊仁, 王小兵, 刘彦婷, 周璇璇, 詹若挺, 陈立凯

2019, 35(12): 10-15. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0475

摘要 ( 401 )

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对广藿香的法尼基焦磷酸酶（PatFPPS）进行重组蛋白的原核表达,并筛选与之互相作用的蛋白。利用PCR扩增PatFPPS编码区并连接到pGEX-6P-1表达载体,测序验证后将质粒转化BL21（DE3）表达菌株,并用IPTG诱导表达蛋白,最终得到带有GST标签的PatFPPS融合蛋白。利用GST Pull-Down技术,将GST-PatFPPS融合蛋白分别与广藿香叶片总蛋白进行体外孵育,洗脱得到蛋白复合物,经SDS-PAGE及LC-MS/MS鉴定。结果表明,PatFPPS原核表达体系成功建立,获得纯化重组蛋白,并且筛选得到一些候选PatFPPS互作蛋白。利用优化的原核表达体系,可获得可溶性的PatFPPS蛋白,并鉴定得到与之互作的候选蛋白。

紫丁香花精油的抗氧化和抗肿瘤活性研究

胡建燃, 李平, 铁军, 金山

2019, 35(12): 16-23. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0144

摘要 ( 445 )

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采用水蒸气蒸馏法提取紫丁香花蕾精油,用3种不同的抗氧化体系检测了精油的抗氧化活性。测定不同质量浓度的紫丁香花精油溶液对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基、羟自由基的清除效果,并测定了其总抗氧化能力（Total antioxidant capacity,T-AOC）。结果显示,精油具有较好的DPPH自由基、羟自由基的清除作用,并且与精油浓度呈现出量效关系。精油的T-AOC是19.86±1.74 U/mg,高于化学抗氧化剂2,6-二叔丁基对甲酚（3,5-Di-tert-butyl-4-hydroxytoluene,BHT）（0.38±0.08 U/mg）。精油的抗肿瘤活性检测采用胃癌细胞株MGC80-3和HGC-27,3-（4,5-二甲基-2-噻唑基）-2,5-二苯基四氮唑溴化物（3-（4,5-Dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2H- tetrazolium bromide,MTT）法测定紫丁香花精油对癌细胞的抑制作用。TUNEL法检测精油对胃癌细胞凋亡的影响。MTT法检测结果证明紫丁香花精油可显著抑制两种胃癌细胞生长,其抑制作用与精油浓度呈正相关,MGC80-3和HGC-27细胞经精油处理48 h后的IC₅₀值分别为0.282 mg/mL和0.263 mg/mL。利用TUNEL法检测细胞凋亡情况,结果显示,凋亡细胞数量随精油浓度的提高而显著增多,并且HGC-27细胞对紫丁香花精油更敏感。研究结果表明,紫丁香花精油具有良好的体外抗氧化和抗肿瘤活性,具备进一步药用研究和开发的价值。

烟草过氧化物酶基因NtPOD2的克隆及表达分析

王静, 刘仑, 杨勇, 胡圣, 李立芹

2019, 35(12): 24-30. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0395

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过氧化物酶（Peroxidase,POD）存在于植物的各个器官,对植物生长发育以及逆境胁迫起着重要作用。为探究烟草中POD基因家族的功能,通过基因克隆方法,从普通烟草品种K326中克隆到一个过氧化物酶基因,该基因与绒毛状烟草（Nicotiana tomentosiformis）POD2具有99%同源性,故命名为NtPOD2。利用生物信息学分析来预测NtPOD2的结构,qRT-PCR技术来测定NtPOD2在不同组织中以及非生物逆境胁迫下的表达量。结果表明,该基因序列包含了一个897 bp的开放阅读框,编码由298个氨基酸残基,NtPOD2蛋白具有Ⅲ型过氧化物酶典型保守结构域。NtPOD2在根、茎、叶、花中都有表达,但在根中表达量最高,且能快速响应非生物胁迫诱导。NtPOD2可能参与了植物生长发育以及非生物逆境胁迫。

甘蔗抗坏血酸过氧化物酶基因ScAPX1的克隆和表达分析

张保青, 邵敏, 黄玉新, 黄杏, 宋修鹏, 陈虎, 王盛, 谭秦亮, 杨丽涛, 李杨瑞

2019, 35(12): 31-37. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0396

摘要 ( 312 )

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通过克隆甘蔗ScAPX1及分析其在低温胁迫中的表达,为深入研究甘蔗APX1在低温胁迫中的功能及为甘蔗抗寒育种的分子机理提供依据。以甘蔗叶片总RNA为模板,通过RT-PCR技术克隆甘蔗叶片ScAPX1的完整ORF序列,采用生物信息学软件分析所克隆基因的编码蛋白特性,并用荧光定量PCR分析该基因在2个抗寒性差异较大的甘蔗品种GT28和YL6低温胁迫下的表达模式。结果表明,克隆得到甘蔗ScAPX1（NCBI登录号为KC794939）,其包含一个759 bp的完整开放阅读框,编码252个氨基酸。该基因编码的蛋白不含信号肽,为可溶性蛋白,无跨膜结构,定位于细胞质,与高粱氨基酸的同源性为98%,推测其为胞质型抗坏血酸过氧化物酶基因。qRT-PCR分析结果表明,随着低温（0-4℃）时间的延长,2个甘蔗品种ScAPX1的表达量均是先上升后下降,但表达量存在差异,在整个胁迫过程中,抗寒强品种GT28的表达量始终比抗寒弱品种YL6高。甘蔗ScAPX1积极响应低温逆境胁迫,该基因的诱导表达与甘蔗品种本身的抗寒性密切相关。

稻瘟病菌精氨酸甲基转移酶基因MoHMT1的功能分析

张文泽, 张艳丽, 门彦明, 张玉娇, 孙志昕, 李文慧, 鲁国东, 齐尧尧

2019, 35(12): 38-44. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0313

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由蛋白质精氨酸甲基转移酶（Protein arginine methyltransferases,PRMTs）调控的精氨酸甲基化是真核生物中普遍存在的翻译后修饰。为研究稻瘟病菌MoHMT1（hnRNP arginine N-methyltransferase,PRMT1的同源蛋白）基因的功能,本研究根据同源重组的原理获得Mohmt1的敲除突变体,并对突变体进行了初步的表型分析。结果表明,与野生型相比,MoHMT1基因的缺失导致稻瘟病菌的菌落变小,表面气生菌丝变薄,生长速率明显减慢。虽然MoHmt1突变体的产孢量明显下降,仅为野生型的20%左右,但是产生的分生孢子能正常萌发产生附着胞,并成功侵入洋葱表皮细胞。进一步利用孢子悬浮液接种水稻叶片,发现Mohmt1缺失突变体病斑数显著减少,致病能力减弱。以上实验结果表明MoHMT1蛋白可能在稻瘟病菌菌丝生长发育和侵染致病过程中发挥了重要的调控作用。

Bacillus amyloliquefaciens YM6对盐胁迫条件下玉米促生长作用研究

王华笑, 刘环, 杨国平, 张琇, 李壮, 张炎

2019, 35(12): 45-49. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0263

摘要 ( 345 )

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以解淀粉芽孢杆菌YM6（Bacillus amyloliquefaciensYM6）为对象,研究其在盐胁迫条件下对玉米的促生效果,为提高盐碱地作物产量开发新型菌源。利用水培试验,设置0、25、50、75和100 mmol/L NaCl的植物营养液,培养玉米植株,同时接种YM6菌株,观察其对盐胁迫下玉米生长的影响。结果表明,在75 mmol/L的盐胁迫条件下,与盐胁迫对照组相比接种YM6菌株组的玉米幼苗株高增加15.18%、根长增加28.80%,植株干重增加27.01%。在盐碱土盆栽试验中,接种YM6菌株组的玉米株高比未接种YM6组增加37.8%,植株干重增加43.9%。此外,YM6菌株能够在玉米根系定殖。初步研究表明YM6菌株可有效缓解盐胁迫对玉米生长的不利影响,促进玉米生长。

Sl-miR482在番茄果实中的表达分析及STTM沉默载体的构建

莫显兰, 史列琴, 陆秋利, 王小敏, 任振新

2019, 35(12): 50-56. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0566

摘要 ( 362 )

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研究番茄Sl-miR482在果实成熟阶段特殊的表达模式,对其功能进行生物信息学分析并构建STTM沉默载体,为深入阐明Sl-miR482在番茄果实成熟软化中的作用机制奠定基础。采用定量PCR进行基因表达检测;利用启动子分析软件和靶基因预测网站进行生物信息学分析;利用PCR扩增及酶切、连接反应进行STTM载体构建,并转化农杆菌。Sl-miR482在开花期表达量逐渐上升,到未成熟绿期表达量达到最高峰,随后逐渐下降。进一步生物信息学分析结果表明,Sl-miR482启动子中存在乙烯应答元件等。靶基因预测网站结果显示,番茄果胶裂解酶Sl-PL13为Sl-miR482的靶基因;基因表达分析结果表明,Sl-PL13与Sl-miR482表达量在果实成熟不同阶段呈现此消彼长的关系。利用PCR扩增及酶切连接方法,成功构建STTM482沉默载体并转化农杆菌。Sl-miR482在果实成熟软化过程中发挥重要作用。

不同坡位对毛乌素沙地油蒿根区土壤水分及生理指标的影响

孟文婷, 王甜甜, 赵学琳, 朱林

2019, 35(12): 57-63. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0462

摘要 ( 282 )

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探究不同坡位油蒿灌丛根区土壤水分变化及油蒿的生理指标的变化,为揭示沙生植物抗旱生理生化机制以及毛乌素沙生植物的保护和修复提供一定的理论依据,为未来环境变化下荒漠植物群落的响应提供理论参考。在2018年于地处宁夏盐池的毛乌素沙地,以自然条件下生长的油蒿为试验材料,测定不同坡位油蒿（坡底、坡中、坡顶）的0-300 cm土层土壤体积含水量（SWC_0-300）、细胞膜透性、丙二醛含量和抗氧化系统酶。结果表明,土壤含水量随坡位的升高依次降低,0-300 cm土层土壤含水量总体呈现坡中>坡底>坡顶。随着坡位的升高,油蒿的细胞膜透性呈先降低后增加的趋势,超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活性呈先升高后降低的趋势。丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量随坡位的升高在7月、8月呈先升高后降低的趋势,但在9月和10月随坡位的升高而降低。过氧化物酶（Peroxidase,POD）活性在7月、8月随坡位的升高而降低,但在9月和10月随坡位的升高呈先降低后增加的趋势。细胞膜透性与坡位的抗旱性关系最密切。油蒿在坡中土壤含水量最大,有较强的抗干旱能力。

基于转录组学的金黄色葡萄球菌噬菌体安全性评估

耿慧君, 邹伟, 崔惠敬, 李晓宇, 王丽丽, 徐永平

2019, 35(12): 64-75. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0696

摘要 ( 323 )

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多重耐药菌的出现迫使我们将噬菌体治疗视为可能的替代治疗方法之一。旨在采用转录测序技术探讨金黄色葡萄球菌噬菌体在小鼠乳腺灌注治疗中的安全及长期使用的条件。选用24只泌乳10 d的昆明雌鼠,随机分成3组,包括健康对照组（T01）,噬菌体VBSM-A1实验组（T02）和噬菌体cocktail实验组（T03）。用非损伤方法经乳头管分别注入不同组分的金黄色葡萄球菌噬菌体悬浊液于小鼠的第4对（腹部）乳腺内。观察小鼠、组织病理学变化以及乳腺组织中TNF-α含量变化;同时,采用转录组测序技术对小鼠乳腺组织进行分析。结果显示,噬菌体灌注会导致小鼠乳腺呈现轻微炎症反应,但不足以影响小鼠正常生命体征;同时,24 h后噬菌体的数量会明显下降（起始为5×10⁷ PFU/gland;24 h后则分别为10^3.6和10^4.4PFU/gland）,提示在噬菌体给药的方式以及剂量还需要进一步的探索,同时提出了噬菌体和抗生素联合应用以降低噬菌体免疫应答和抗生素耐药性的前景,旨为后续噬菌体的使用从转录组层面提供理论依据和奠定实验基础。

鼠伤寒沙门菌baeSR和acrB双基因缺失株相关耐药基因的RNA-seq分析

徐军, 王瑞, 李锐, 高海侠, 张瑞良, 王文静, 赵霞, 李琳

2019, 35(12): 76-84. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0464

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应用转录组测序技术（RNA-seq）筛选鼠伤寒沙门菌baeSR和acrB相关的靶基因,为鼠伤寒沙门菌耐药机制的深入研究奠定基础。采用RNA-seq技术分析baeSR和acrB基因缺失后表达量变化的相关耐药基因,通过GO富集和KEGG通路探索其主要功能,qRT-PCR验证部分差异基因。以 |log₂（Fold Change）| > 1且q value < 0.005为条件,其中以CR△acrB和CR为比较组,共筛选到1 320个差异表达基因,894个下调,426个上调;以CR△baeSR△acrB和CR为比较组,共筛选到1 377个差异表达基因,972个下调,405个上调。GO 富集分类结果显示差异基因主要集中在跨膜运输、细胞黏附、纤毛或鞭毛运动等功能;KEGG 数据库显示,差异基因主要富集在代谢途径、ABC转运系统、双组份信号转导系统、鞭毛组装、β-内酰胺抗性等通路。其中,ompR、csgD、fliA、fliG可通过调节细菌生物膜形成能力调控其对多种抗生素的耐药性;emrA、mdtC、yejE属于外排泵相关基因,可介导细菌对黏菌素、新生霉素等的耐药性;STM3031可赋予沙门菌头孢曲松抗性;pmrF可参与调节细菌对多粘菌素的抗性。鼠伤寒沙门菌acrB和baeSR基因缺失可影响相关耐药基因的表达。

新型H7N9禽流感病毒NA蛋白胞外区片段的生物信息学分析及其多克隆抗体制备

仇书兴, 殷星, 苏淑娟, 殷俊磊, 张家友, 刘雪贺, 贾坤义, 杨晓明

2019, 35(12): 85-93. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0762

摘要 ( 350 )

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旨为以原核表达系统表达、纯化新型H7N9禽流感病毒（安徽株）NA蛋白胞外区片段并制备该蛋白的多克隆抗体。对新型H7N9禽流感病毒神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）蛋白胞外区片段进行生物信息学分析,基于大肠杆菌密码子偏爱性进行密码子优化并合成该蛋白编码基因。将构建的重组质粒pET28b-tN9（Truncated N9）转化至E. coli BL21（DE3）、E. coli Rosetta和E. coli Arctic Express（DE3）,进行诱导表达,并进行SDS-PAGE鉴定。选取E. coli BL21（DE3）重组菌进行放大培养、IPTG诱导并对诱导产物进行镍柱纯化、SDS-PAGE分析和质谱鉴定。将纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,以Western blotting和间接ELISA法检测抗体特异性及效价。成功表达并纯化目标蛋白,Western blotting显示制备的多克隆抗体能特异性识别重组蛋白和新型H7N9禽流感病毒（上海株）,间接ELISA方法检测制备的多克隆抗体,效价为1∶256 000。利用原核表达系统高效表达并纯化了tN9蛋白,制备的多克隆抗体效价高,特异性强,旨为深入探索NA蛋白结构及功能、H7N9禽流感病毒致病机制和建立快速检测方法奠定基础。

绵羊BMPR1B基因真核表达及产物互作蛋白的鉴定

贾建磊, 陈倩, 靳继鹏, 袁赞, 张利平

2019, 35(12): 94-104. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0447

摘要 ( 382 )

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旨为研究BMPR1B蛋白及其相互作用蛋白在绵羊卵巢卵母细胞发育及排卵的作用通路。通过构建BMPR1B基因真核表达体系并表征BMPR1B蛋白质,利用CoIP-MS技术鉴定母羊卵巢提取物中与BMPR1B特异性相互作用的蛋白质,构建目的蛋白质互作网络,通过生物信息学分析并预测BMPR1B蛋白及其相互作用蛋白在绵羊卵巢卵母细胞发育及排卵的作用通路。母羊卵巢提取物中23种蛋白质与BMPR1B蛋白具有关联性,其中6种目的蛋白（BMP2、BMP4、GDF5、GDF9、RhoD和HSP10）与BMPR1B具有特异性相互作用,通过生物信息学分析表明目的蛋白在TGF-β信号转导通路、卵巢类固醇生成通路和MAPK信号转导通路构成复杂且紧密的交互网络,基于互作结果设计BMPR1B蛋白调节绵羊卵母细胞的发育和排卵的代谢途径。BMPR1B蛋白与绵羊产羔性状途径中Smads家族蛋白具有交互作用,在绵羊卵母细胞发育和排卵中具有重要作用。

Cre/Loxp系统介导转基因山羊乳腺上皮细胞标记基因的删除

宋绍征, 于康英, 陆睿, 张婷, 陈朝军, 潘生强, 成勇, 周鸣鸣

2019, 35(12): 105-111. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0544

摘要 ( 316 )

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为了消除核移植转基因动物中标记基因潜在的生物安全风险,应用Cre/Loxp系统删除人乳铁蛋白（hLF）转基因山羊乳腺上皮细胞的标记基因,并以此探索标记基因删除前后对功能基因乳腺特异性表达的影响。首先复苏hLF转基因山羊乳腺上皮细胞并纯化;然后电转染PBS185纯化质粒,培养10-14 d,胰蛋白酶消化细胞,通过自制口控式移卵针挑取单克隆细胞;最后PCR检测标记基因是否删除,催乳素诱导表达,ELISA和Western Blot检测功能蛋白hLF的表达情况。结果表明,共获得65株单克隆乳腺上皮细胞,挑取状态较好的18株用于PCR检测,有3株为删除标记基因的细胞株,删除效率达16.7%（3/18）,且删除标记基因细胞株表达水平提高约8倍（2.85 g·L^-1/ 0.35 g·L^-1）,蛋白条带大小与目标蛋白一致（80 kD）。结果表明Cre/Loxp系统能够有效的删除乳腺上皮细胞基因组上的标记基因,且删除后细胞株表达水平明显提高,成功建立一套转基因山羊乳腺上皮细胞标记基因删除的系统,为进一步扩大生产无标记基因的转基因山羊奠定基础。

重组绵羊FSH在CHO-K1细胞中的表达及其应用

王兴陇, 李倩, 马瑞仙, 李生军, 李向茸, 冯若飞

2019, 35(12): 112-117. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0668

摘要 ( 368 )

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在CHO-K1细胞中分泌表达重组绵羊FSH及其生物活性初探。构建重组表达质粒pcDNA3.1-FSHβα,转染至全悬浮CHO-K1细胞中,经过G418加压筛选出表达量高的单克隆细胞,于生物反应器中扩大培养,并进行超滤浓缩,将浓缩后的重组绵羊FSH免疫小鼠,测定小鼠卵巢重量并分析血清中黄体生成素和孕酮含量。成功构建了重组质粒pcDNA3.1-FSHβα,并成功在全悬浮CHO-K1细胞中实现分泌表达,表达量为297.97 ng/mL,注射重组绵羊FSH的小鼠卵巢重量显著增加,黄体生成素和孕酮含量均显著上调。重组绵羊FSH蛋白在CHO-K1细胞中成功表达,并具有一定的生物活性。

基于文献计量的农作物基因组研究领域发展态势分析

袁雪, 钱万强, 郭溪川, 卢垚, 颜蕴

2019, 35(12): 118-128. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0228

摘要 ( 303 )

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基因组学研究是近年来世界上发展最为迅速的研究领域之一。农作物基因组学研究的发展,对于有效利用现代分子生物学手段进行物种的遗传改良发挥了重要作用。目前国内外科学家已经对诸如水稻、小麦、玉米、大豆、油菜、棉花等重要农作物的基因组进行了测序,并在此基础上克隆和鉴定了控制重要农艺性状的基因。科技文献客观地记录了各个学科或知识领域的发展概貌,基于文献计量学的学科发展态势分析,可以系统地总结领域研究现状与热点问题、评价研究机构科研实力与成果产出。本研究综合利用文献定量分析和专家定性分析相结合的方法,通过对中美自然科学基金项目资助情况及SCI论文收录文献多维度、深层次的计量分析,全面揭示近10年农作物基因组领域的研发现状、重要国家、重要机构和热门研究主题,相关研究结果可为我国相关领域未来的研发布局和决策提供参考依据。

植物WRKY转录因子家族研究进展

黄幸, 丁峰, 彭宏祥, 潘介春, 何新华, 徐炯志, 李琳

2019, 35(12): 129-143. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0626

摘要 ( 995 )

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WRKY转录因子是植物中最大的转录调控因子家族之一,是调控植物许多生物过程信号网络的组成部分。WKRY转录因子具有多种生物学功能,在植物的生长发育和衰老、非生物和生物胁迫等过程中发挥着重要的作用。在DNA水平上,WRKY转录因子可与靶基因启动子中的W-box TTGAC（C/T）结合,通过自调节或交叉调节激活或抑制下游基因的表达调控其反应。在蛋白水平上,WRKY转录因子可以与多种蛋白相互作用,包括MAP激酶、组蛋白去乙酰化酶、抗性R蛋白、多种转录因子等,调节植物的生长发育或各种应激反应。对WRKY转录因子的结构特征、生物学功能、调控机制和网络等方面进行了综述,有助于更加全面了解其在植物中的作用。

NAC转录因子在植物响应非生物胁迫中的作用

张丹, 马玉花

2019, 35(12): 144-151. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0525

摘要 ( 473 )

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面对全球日趋恶化的环境以及人口增长的压力,研究植物抗逆机制、提高植物抗逆性对实现农业的可持续发展极其重要。近年来,植物特异性转录因子以其在非生物胁迫响应中的重要作用被广泛关注。NAC家族是最大的植物特异性转录因子家族,其在植物的生长发育过程以及响应非生物胁迫的过程中起着重要的调节作用。就NAC转录因子的结构特征、作用机理及其在植物非生物胁迫中的功能研究进展进行综述,旨在为NAC相关基因的研究及植物抗逆新品种培育提供理论依据。

PAS蛋白融合修饰研究进展

韩斐, 江明锋, 冉嫆, 王刚

2019, 35(12): 152-158. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0519

摘要 ( 376 )

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PAS蛋白修饰技术是指通过基因融合的方法将具有功能性的多肽与由脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成的多肽序列连接起来并通过基因工程的手段进行融合表达,实现对多肽的修饰。目前,对于小分子多肽类药物而言,其较小的体积导致在血浆中的半衰期较短,而临床上应用PEG对小分子多肽药物进行修饰,使得其具有较大的流体力学体积,增加其药理活性。但是近年来,随着越来越多的PEG修饰药物进入临床应用市场,PEG化学多聚物的安全性弊端被不断发现。因此,寻找PEG化以外的更为安全有效的方法是非常有必要的,而PAS在小分子多肽修饰方面展示出了巨大的优势。就针对于PAS蛋白修饰技术的设计思路和优势,以及在应用方面取得的最新进展进行具体的阐述。

介孔二氧化硅在药物递送系统及其体内外研究进展

张文君, 吴梦婷, 吕春艳, 王晴, 陈泳霖

2019, 35(12): 159-168. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0481

摘要 ( 516 )

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介孔二氧化硅纳米粒因比表面积大、孔隙率高、介孔结构可调、表面易修饰等特点,近年来在生物医学领域受到广泛的关注。介孔二氧化硅作为一种新型载体,相比于传统的纳米载体不仅可以改善难溶性药物的溶解度,有效地提高药物的生物利用度,还可以通过修饰或包覆功能性物质实现对肿瘤细胞的靶向性及控制药物的吸附、释放,且其稳定的框架结构可以递送和保护核酸分子,达到基因治疗的目的。然而,要将介孔二氧化硅纳米粒应用于临床,还需要做进一步的工作来预测和评估潜在的毒性和不良反应,明确介孔二氧化硅纳米粒在体内的吸收、分布、代谢、排泄及生物相容性和毒性,以确保其在患者中的有效性和安全性。综述了介孔二氧化硅纳米粒在药物递送系统及基因治疗的应用,着重介绍了靶向型介孔二氧化硅以及刺激响应型介孔二氧化硅的一些研究成果,并对介孔二氧化硅的药物代谢动力学、生物相容性和毒性的研究情况进行了深入的总结,旨为介孔二氧化硅在生物医学的应用提供参考。

洋葱雄性不育分子标记在单倍体鉴定中的应用

杨妍妍, 霍雨猛, 吴雄, 刘冰江

2019, 35(12): 169-174. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0489

摘要 ( 307 )

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为有效鉴定和利用洋葱单倍体,以3个洋葱杂交种的未受精花蕾为外植体,通过离体雌核发育途径诱导产生再生植株。利用流式细胞仪对再生植株的倍性进行鉴定,利用DNF-566、RNS-357和AcSKP1标记对再生植株进行纯合性检测。结果表明,源于“阿盾”和“地球”的再生植株在Ms位点的基因型均为纯合的。源于“大宝”的16株再生植株中,有13株在Ms位点的基因型是纯合的,3株是杂合的。说明纯合植株是由大孢子母细胞发育而来,杂合植株可能是由子房壁或其他体细胞发育而来的二倍体。共获得7株二倍体,其中4株为双单倍体。获得的双单倍体,可进一步作为杂交种选育的亲本材料。洋葱Ms位点的分子标记可以作为一种有效的分子标记手段用于洋葱单倍体再生植株与供体杂交种亲本的同源性分析,与流式细胞仪结合起来可以快速准确鉴定双单倍体。

多价抗虫水稻外源Bt基因的多引物多重PCR检测方法

方欣怡, 阳菁, 王井章, 李阳生

2019, 35(12): 175-183. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0383

摘要 ( 295 )

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旨在研究多价Bt抗虫转基因水稻的简便有效的检测方法。根据3个Bt转基因事件的插入位置,设计引物,通过多重引物PCR技术,利用9条引物得到6条大小存在明显差异的条带,同时检测3个Bt基因的转基因情况。水稻3个Bt抗虫基因（cry1Ab/Ac、cry2A、cry1C）分别来源TT51-1、T2A-1和T1C-19,其中代表TT51-1事件插入的阳性、阴性条带大小分别为937 bp、718 bp;代表T2A-1事件插入的阳性、阴性条带大小分别为600 bp、434 bp;代表T1C-19事件插入的阳性、阴性条带大小分别为495 bp、792 bp;通过琼脂糖凝胶电泳能快速对转Bt基因插入事件水稻的纯合、杂合、阴性进行检测。该技术克服了多重引物之间可能存在的引物间的相互干扰的技术难度,对不同的PCR试剂有很好的兼容性,可配合水稻DNA的快速提取,迅速对大量选育后代进行分析。该方法的建立为利用多价Bt基因进行抗螟虫水稻分子育种提供了一个简便高效的基因检测技术,有助于提高Bt基因检测效率,加快抗螟虫水稻的育种进程。

马铃薯S病毒胶体金免疫层析试纸条的研制

张微, 李志新, 付春江, 刘卫平

2019, 35(12): 184-188. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0287

摘要 ( 324 )

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为了研制便于马铃薯（Solanum tuberosum L.）种薯生产田现场快速检测马铃薯S病毒（Potato virus S,PVS）的胶体金免疫层析试纸条。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,在波长524 nm处有最大吸收值,金颗粒大小20-30 nm。将PVS的羊源多克隆抗体与胶体金进行标记,喷射于玻璃纤维上作为金标垫。将PVS抗体和兔抗羊抗体划线于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线,制备胶体金试纸条。试纸条检测结果在2 min之内通过肉眼即可判断。当带PVS样本汁液稀释10⁴倍（W/V）时,仍可检测出。用其他5种常见病毒阳性样品进行检测,未出现交叉反应。田间采集的马铃薯叶片用试纸条检测和酶联免疫检测结果相吻合。本试纸条在密封、干燥、低温的条件下保存,有效期可达180 d。使用方便,操作简单,检测快捷,能够现场检测PVS,无需特殊设备,适用性广,实用性强。

微藻油脂含量的高效测定方法

李志, 周秋香, 黎秋玲, 刘孟荧, 周智友, 李汉广

2019, 35(12): 189-195. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0364

摘要 ( 374 )

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随着化石能源的逐年消耗以及人们环境保护意识的不断增强,微藻作为一种可持续的绿色能源近年来逐渐成为世界各国科学工作者研究的热点。选育高油脂含量微藻是发展微藻生物能源的重要一环,而高效快速的油脂测定方法则是选育过程中的关键技术之一。概述了几种高效、准确、简便的微藻油脂含量测定方法的基本原理和研究现状,主要包括尼罗红荧光光谱法、BODIPY 505/515荧光染色法、铜试剂法、苏丹黑B染色法、傅里叶变换红外光谱法、时域核磁共振法、可见/近红外光谱法等,并对这些方法各自的优缺点进行了比较,以期为微藻油脂含量测定提供一定的参考,同时为微藻油脂研究和生产实践提供理论依据。

利用旁侧引物提高重叠延伸PCR定点突变效率

王柳月, 李慧美, 马梦琪, 梁明星, 贺如阳, 陈华波

2019, 35(12): 196-202. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0358

摘要 ( 367 )

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平行模板法简化重叠延伸PCR定点突变流程的思路不能成立,靠近DNA末端的低效限制性酶切才是制约其突变效率的核心原因。故以旁侧引物法提高DNA产物的酶切效率,增加定点突变的成功率。将上、下游引物匹配位点由两侧酶切位点外延50-100 bp,使目标基因两端的酶切位点处于第二轮PCR产物的两端近侧,而非末端。由此提高随后的酶切效率,节省反应时间。由于此时酶切会明显缩短DNA长度,凝胶电泳结果显示仅1 h就完成了对PCR产物的充分酶切。连接产物转化感受态大肠杆菌后形成的克隆数也明显增加,且阳性率由33%-70%提高至100%。经对比检测,旁侧引物法既节省了工作时间,也极大地提高了重叠延伸PCR定点突变过程中的菌落形成数与突变成功率。

2019, 35(12): 203-203.

摘要 ( 139 )

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