点青霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其酶学性质研究

doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.023

生物技术通报 ›› 2016, Vol. 32 ›› Issue (7): 152-159.doi: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.023

点青霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其酶学性质研究

高庆华¹, 胡美荣², 吴芳彤¹, 陶勇², 王云鹏¹, 罗同阳¹, 胡常英¹

1. 河北省微生物研究所,保定 071051；
2. 中国科学院微生物研究所,北京 100101

收稿日期:2015-11-09 出版日期:2016-07-25 发布日期:2016-07-25
作者简介:高庆华,男,博士,研究方向：微生物发酵技术;E-mail：gaoqinghua_mbb@126.com
基金资助:
河北省科技计划项目（14292804D）,河北省科学院科技计划项目（20150503 LR62-3）

Cloning of Gene for a Glucose Oxidase from Penicillium notatum and Its Enzymatic Properties

GAO Qing-hua¹, HU Mei-rong², WU Fang-tong¹, TAO Yong², WANG Yun-peng¹, LUO Tong-yang¹, HU Chang-ying¹

1. Institute of Microbiology,Hebei Academy of Sciences,Baoding 071051;
2. Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101

Received:2015-11-09 Published:2016-07-25 Online:2016-07-25

摘要/Abstract

摘要： 旨在克隆点青霉菌（Penicillium notatum）中的葡萄糖氧化酶基因（GOD）,在毕赤酵母（Phchia pastoris）中异源表达,纯化并研究其酶学性质。利用PCR技术从点青霉 No.8312菌株的基因组 DNA中克隆得到 GOD基因,将该基因克隆到穿梭载体pMD-AOX上并在毕赤酵母X33中表达,对纯化后的葡萄糖氧化酶的酶学性质进行分析。结果显示,X33-GOD可高表达具有活性的GOD,在30℃、pH6.5的条件下,其培养液上清GOD酶活可达496 U/mL,比活123.0 U/mg;重组表达的葡萄糖氧化酶最适温度为40-45℃,最适pH为6.0,酶的稳定性研究表明,该酶在pH3.5-7.0区间和温度低于50℃下稳定。1 mmol/L Zn²⁺对其有激活作用;Ag⁺对该酶活性有较大抑制作用。构建出GOD的高产毕赤酵母工程菌株,与点青霉GOD相比,具有更高的发酵酶活和比活。

关键词: 葡萄糖氧化酶, 点青霉菌, 重组表达

Abstract: The purpose of this work is to clone the gene of glucose oxidase（GOD）from Penicillium notatum,which was then in heterologous expression in Pichia pastoris,and the enzymatic properties of purified proteins were studied. GOD gene was cloned from genome DNA of P. notatum No. 8312 strain using PCR technique,the gene was ligated to the vector pMD-AOX and then expressed in strain X33 of P. pastoris,and finally the enzymatic properties of the purified proteins were analyzed. As results,the strain X33-GOD highly expressed the GOD with activity. Its activity of GOD in cultured supernatant reached 496 U/mL and the specific activity was 123.0 U/mg at 30℃ and pH6.5. The optimal temperature and pH of recombinant GOD was 40-45℃ and 6.0 respectively. The result of stability of the enzyme showed that the enzyme was stable when the temperature under 50℃ and the pH3.5-7.0,and it can be activated by 1 mmol/L Zn²⁺ and obvious inhibited by Ag⁺. The recombinant engineering P. pastoris strain with high-yield GOD has a higher fermentation activity and specific activity compared with GOD from P. notatum.

Key words: glucose oxidase, Penicillium notatum, recombinant expression

高庆华, 胡美荣, 吴芳彤, 陶勇, 王云鹏, 罗同阳, 胡常英. 点青霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其酶学性质研究[J]. 生物技术通报, 2016, 32(7): 152-159.

GAO Qing-hua, HU Mei-rong, WU Fang-tong, TAO Yong, WANG Yun-peng, LUO Tong-yang, HU Chang-ying. Cloning of Gene for a Glucose Oxidase from Penicillium notatum and Its Enzymatic Properties[J]. Biotechnology Bulletin, 2016, 32(7): 152-159.

参考文献

[1] Wong CM, Wong KH, Chen XD. Glucose oxidase：natural occurrence, function, properties and industrial applications[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 78（6）：927-938.
[2] Yin B, Yuan R, Chai Y, et al. Amperometric glucose biosensors based on layer-by-layer assembly of chitosan and glucose oxidase on the Prussian blue-modified gold electrode[J]. Biotechnol Lett, 2008, 30（2）：317-322.
[3] 周亚凤, 张先恩, 刘虹, 等. 黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其在酵母中的高效表达[J]. 生物工程学报, 2001, 17（4）：400-405.
[4] Damasceno L, Huang CJ, Batt C. Protein secretion in Pichia pastoris and advances in protein production[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 93（1）：31-39.
[5] Kombrink A. Heterologous production of fungal effectors in Pichia pastoris[M]// Bolton MD, Thomma BPHJ. Plant Fungal Pathogens：Humana Press, 2012：209-217.
[6] Krainer F, Dietzsch C, Hajek T, et al. Recombinant protein expression in Pichia pastoris strains with an engineered methanol utilization pathway[J]. Microb Cell Fact, 2012, 11（1）：22-35.
[7] 闵兆升, 郭会明, 颜旭, 等. 巴斯德毕赤酵母（P. pastoris）高密度发酵研究进展[J]. 生物技术通报, 2014（3）：42-49.
[8] Gietz RD, Woods RA. Genetic transformation of yeast[J]. Biotechniques, 2001, 30（4）：816-820, 822-816, 828.
[9] 朱运平, 褚文丹, 李秀婷, 等. 产胞外葡萄糖氧化酶菌株的分离鉴定及其诱变育种研究[J]. 中国食品学报, 2014, 14（4）：95-103.
[10] 唐菁, 赵芯, 苏茉, 等. 黑曲霉H1-9b发酵产葡萄糖氧化酶的工艺优化[J]. 食品科学, 2013, 34（9）：220-223.
[11] 胡常英, 刘丽娜, 王云鹏, 等. 点青霉高产葡萄糖氧化酶菌株的诱变选育[J]. 河北省科学院学报, 2006, 23（3）：11-15.
[12] 梁静娟, 李筱瑜, 官威, 等. 产葡萄糖氧化酶黑曲霉的诱变选育及葡萄糖酸钙发酵条件的研究[J]. 食品工业科技, 2010, 31（12）：218-220.
[13] 郭元芳, 孙高英, 郝建荣, 等. 黑曲霉葡萄糖氧化酶在毕赤酵母SMD1168中的表达[J]. 生物技术, 2013, 23（4）：25-29.
[14] Gu L, Zhang J, Liu B, et al. High-level extracellular production of glucose oxidase by recombinant Pichia pastoris using a combined strategy[J]. Appl Biochem Biotech, 2015, 175（3）：1429-1447.
[15] 陆永超, 蒋琳. 毕赤酵母高效表达策略概述[J]. 微生物学免疫学进展, 2013, 41（1）：70-76.
[16] 袁有忠, 赵思汇, 周宗祥, 等. 一个耐热碱性磷酸酯酶突变型的研究[J]. 遗传学报, 2000, 27（4）：361-368.
[17] 李卓夫. 葡萄糖氧化酶基因的克隆及高效表达[D]. 长春：长春理工大学, 2008.
[18] 苏茉, 高亚朋, 梁建荣, 等. 黑曲霉H1-9b葡萄糖氧化酶的分离纯化及部分性质研究[J]. 食品科学, 2011, 32（3）：181-185.
[19] 张茜, 傅婉辉, 康劲翮, 等. 青霉葡萄糖氧化酶的分离纯化及性质研究[J]. 厦门大学学报：自然科学版, 2009, 48（1）：99-102.
[20] 郝杰清, 王帅坤, 师慧, 等. 重组毕赤酵母葡萄糖氧化酶的纯化和性质[J]. 食品科学, 2013, 34（9）：159-163.
[21] 黄亮. 黑曲霉A9葡萄糖氧化酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达[D]. 保定：河北农业大学, 2007.
[22] Kelley RL, Reddy CA. Purification and characterization of glucose oxidase from ligninolytic cultures of Phanerochaete chrysosporium[J]. J Bacteriol, 1986, 166（1）：269-274.

点青霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其酶学性质研究

Cloning of Gene for a Glucose Oxidase from Penicillium notatum and Its Enzymatic Properties

PDF (PC)

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

参考文献

相关文章 15

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	常晴, 束月蓉, 王文韬, 蒋昊, 延泉德, 钱政, 高雪纯, 吴金鸿, 张勇. 来自Yeosuana marina sp. JLT21内切型海藻酸裂解酶的异源表达及酶学表征[J]. 生物技术通报, 2022, 38(2): 123-131.
[2]	曹汝菲, 李泽轩, 许欢, 张莎, 张敏敏, 戴枫, 段晓雷. 脆弱拟杆菌Pif1解旋酶的表达纯化与晶体生长[J]. 生物技术通报, 2021, 37(9): 180-190.
[3]	段绪果, 张玉华, 黄婷婷, 丁乾, 栾舒越, 朱秋雨. 化学分子伴侣及诱导条件协同强化Thermotoga maritima α-葡聚糖磷酸化酶可溶性表达[J]. 生物技术通报, 2021, 37(8): 233-242.
[4]	廖兆民, 蔡俊, 林建国, 杜馨, 王常高. 黑曲霉葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中的表达及产酶条件的优化[J]. 生物技术通报, 2021, 37(6): 97-107.
[5]	赵震, 王莎莎, 吕星星, 陶妍, 谢晶, 钱韻芳. 重组毕赤酵母产青蛤Mytimacin抗菌肽的表达研究[J]. 生物技术通报, 2020, 36(5): 150-158.
[6]	高云山, 刘丹丹, 徐俊林, 桑雨浓, 梁夏夏, 刘建欣, 王文彬. 嗜水气单胞菌孔蛋白OmpF重组表达及其免疫原性分析[J]. 生物技术通报, 2019, 35(9): 234-243.
[7]	张亚莉, 陶妍, 谢晶, 钱韻芳. 厚壳贻贝Mytilin-1成熟肽在毕赤酵母中的重组表达及其抑菌活性[J]. 生物技术通报, 2019, 35(7): 54-60.
[8]	高庆华, 董聪, 王玥, 胡美荣, 王庆庆, 王云鹏, 罗同阳, 刘蕾. 共表达分子伴侣PDI和Ero1对葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中表达的影响[J]. 生物技术通报, 2018, 34(7): 174-179.
[9]	韩唱,宿玲恰,吴敬. Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909麦芽寡糖基海藻糖合成酶在Bacillus subtilis中的重组表达和发酵优化[J]. 生物技术通报, 2017, 33(7): 162-168.
[10]	于林港, 宿玲恰, 吴敬. Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655海藻糖酶Tre F的重组表达及性质研究[J]. 生物技术通报, 2017, 33(4): 177-184.
[11]	林伯坤, 宋燕, 陆国永, 赵敏, 钟名其, 胡忠. 一种具有琼胶酶活性的海洋细菌淀粉酶的表达和分析[J]. 生物技术通报, 2017, 33(2): 125-130.
[12]	王楠, 李刚强, 郭文芳, 刘德虎. 毕赤酵母Kar2p过表达对假黑盘菌素表达量的影响[J]. 生物技术通报, 2016, 32(1): 180-186.
[13]	肖周婷, 黄郁葱, 简纪常, 鲁义善, 吴灶和. 斜带石斑鱼IL-10基因的克隆及其原核表达[J]. 生物技术通报, 2015, 31(9): 131-137.
[14]	马越, 宿玲恰, 吴丹, 吴敬. 重组精氨酸脱亚胺酶制备L-瓜氨酸的工艺条件优化[J]. 生物技术通报, 2015, 31(8): 180-185.
[15]	彭传林, 魏川川, 吴建伟, 王宇, 修江帆, 尚小丽, 赵学军. 家蝇抗真菌肽-溶菌酶基因的克隆、表达及序列分析[J]. 生物技术通报, 2015, 31(5): 200-205.