生物技术通报

生长素和细胞分裂素调控植物根和微生物互作的研究进展

侯鹏飞,贾振华,宋水山,

2017, 33(7): 1-6. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0111

摘要 ( 385 )

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植物在与其生长环境中的微生物长期共同进化过程中形成了复杂而微妙的共生体系。生长素和细胞分裂素等植物激素不仅调控植物的自身发育，而且在植物-微生物互作中发挥重要的调节作用。综述了生长素和细胞分裂素调控植物根和土壤微生物包括有益菌或病原细菌和真菌间相互作用的最新研究进展，旨在揭示生长素和细胞分裂素调控功能的共性和特异性，为提高农作物的产量和抵抗微生物病害能力提供理论和实践指导。

高通量转录组在园艺植物色素代谢中的研究进展

李霞,王顺利

2017, 33(7): 7-14. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0018

摘要 ( 390 )

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色素代谢是园艺植物中最为重要的研究领域之一，目前相关研究主要集中在花青素代谢和类胡萝卜素代谢上，其决定园艺植物的品质性状和观赏性状。利用转录组学技术，可以从转录组水平上揭示园艺植物色素代谢的分子机理。综述了转录组学在主要果树、蔬菜和观赏植物的色素节点分离、分支代谢、新基因分离、调控机制及环境对色素代谢影响方面的主要研究进展，分析了目前应用中存在的问题，并展望了转录组学在园艺植物色素代谢中的发展前景，以期为利用高通量测序技术分析色素代谢机制、分离关键基因并应用于园艺作物品质定向育种提供参考。

光敏色素对植物抗逆反应的调控研究进展

姜敏,李魏,董铮,李利华,戴良英

2017, 33(7): 15-21. doi:10.13560/J.cnki.biotech.bull.1985.2017-0099

摘要 ( 401 )

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光敏色素是红光和远红光受体，不但在植物光形态建成中扮演着重要的角色，还参与调控植物抗逆信号通路。阐述了光敏色素及其互作的转录因子通过诱导植物激素信号途径调控植物对病原菌、害虫等生物胁迫的反应及作用机制，以及光敏色素调控植物对临近植物的竞争胁迫、干旱、低温、高温等非生物胁迫反应的作用机制研究进展，并讨论与展望了光敏色素研究领域所面临的挑战与发展方向。

甘蔗线条花叶病毒研究进展

冯小艳,王文治,沈林波,冯翠莲,张树珍

2017, 33(7): 22-28. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0084

摘要 ( 388 )

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甘蔗线条花叶病毒（Sugarcane streak mosaic virus，SCSMV）是引起甘蔗花叶病的主要病原之一，在世界各大蔗区普遍发生，严重威胁甘蔗产业的发展。综述了SCSMV的生物学特性、发生与危害、鉴定与检测、基因组结构与功能、防治策略等方面的研究进展，以期为深入研究SCSMV及其所致病害提供参考。

环状RNA的研究进展

张潆月,马月辉,赵倩君

2017, 33(7): 29-34. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0009

摘要 ( 289 )

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环状RNA（Circular RNA，circRNA）是一类具有闭合环状结构的内源性非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA），主要由前体RNA（pre-mRNA）通过可变剪切加工产生，circRNA广泛存在于所有真核生物中，并且非常稳定。目前，circRNA的研究已经成为了RNA研究领域的新热点，研究发现circRNA在转录本中占有相当大的比例，有的表达丰度甚至显著高于其他转录本。同时，circRNA对基因的表达有重要调控作用，在生物的发育进程中发挥了重要的生物学功能，如充当miRNA海绵、作为内源性RNA以及生物标记物，在疾病的诊断与治疗中也发挥重要作用。研究发现circRNA在一些疾病的发生中扮演了重要角色，包括动脉硬化、神经系统紊乱、糖尿病和癌症的发生。综述了circRNA的研究进展，阐述了circRNA的研究历史、circRNA的特点、形成过程、表达情况、circRNA与疾病间的关系以及circRNA的功能，并讨论了circRNA的研究意义及存在的问题。

家鸡全基因组测序研究进展

李东华,王鑫磊,李转见,孙桂荣,康相涛,闫峰宾

2017, 33(7): 35-39. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0194

摘要 ( 291 )

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鸡具有独特的生物学特性。全基因组测序是即对一种生物的基因组中的全部基因进行测序，主要包括de novo 测序和全基因组重测序。近年来，由于测序技术的飞速发展，鸡全基因组研究取得了很多重要的进展，为解释鸡的生物学特性和缩短分子育种周期发挥了重要作用。重点阐述了不同品种鸡全基因组de novo 测序的完成、全基因组重测序技术在解析品种遗传多样性、揭示进化机制、质量性状遗传机制广泛应用，讨论了鸡全基因组测序工作存在的问题及其展望，旨在为家鸡种质资源的改良和分子育种提供重要的参考资料。

植物抗旱性鉴定评价方法及抗旱机制研究进展

李瑞雪,孙任洁,汪泰初,陈丹丹,李荣芳,李龙,赵卫国,

2017, 33(7): 40-48. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0023

摘要 ( 386 )

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干旱显著影响植物各阶段的生长发育、各种生理生化代谢过程和生态环境，是植物成活与生长的重要限制因素之一，随着现代分子生物学的发展，从分子水平研究植物抵御干旱等逆境的机理已成为农业研究的一个重要任务。从植物抗旱性鉴定评价体系和抗旱机制研究两个方面对近年来植物抗旱性研究进展进行了综述，以期为今后植物抗旱分子机制的研究和改良植物抗旱性的分子遗传育种工作提供参考。

核酸等温扩增技术在微生物快速检测中的研究进展

王大洲,郭天笑,郑实,商颖,许文涛

2017, 33(7): 49-61. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0106

摘要 ( 458 )

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等温扩增技术在近20多年，得到了快速发展，依靠其等温反应的优势正逐渐取代传统的体外扩增技术聚合酶链式反应（Ploymerase chain reaction，PCR），其已经在临床医学、检验医学、分子生物学、基因组学、食品安全等不同领域中的发挥着重要作用，特别是在致病菌、病毒等微生物的检测中。将选取10余种关注度较高的等温扩增技术，主要针对其反应原理、优缺点以及发展应用等方面进行简要概述和对比，最后展望了等温扩增技术未来的发展趋势，以期对相关研究领域的发展起到积极的促进作用。

微生物浸出过程中胞外蛋白的作用及其机理研究进展

余润兰,刘阿娟,刘亚楠,刘学端,邱冠周,曾伟民

2017, 33(7): 62-68. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1197

摘要 ( 272 )

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矿物-微生物-溶液多相界面是硫化矿生物浸出的关键场所，界面微生物胞外多聚物（EPS）关键组分胞外蛋白在生物膜形成、结构稳定和硫化矿溶解等方面起到关键作用。综述了生物浸出过程中EPS关键组分胞外蛋白的研究进展和胞外蛋白现有的研究方法及其对冶金微生物胞外蛋白研究的适用性，展望了浸矿微生物胞外蛋白研究的前景，旨为生物冶金领域研究EPS关键组分胞外蛋白结构及其作用机理提供重要的理论和方法支撑。

小麦自噬相关因子ATG5的原核表达和抗血清制备

张加姿,李开心,于宝佳,岳洁瑜,王华忠

2017, 33(7): 69-74. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0020

摘要 ( 282 )

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细胞自噬在植物生长发育和环境响应中扮演了重要角色，ATG5是参与自噬小体组装的核心因子之一。在前期工作中我们克隆了两个小麦ATG5基因TaATG5a和TaATG5b，并对其开展了初步的功能分析。鉴于后续基因功能研究中的免疫学方法涉及对特异性抗体的需求，通过载体构建、原核表达和亲和层析过程获得了TaATG5a的重组蛋白，经兔免疫过程制备了TaATG5a的抗血清，采用ELISA和Western杂交等方法鉴定了抗体的效价和特异性。结果表明，克隆于pET30a载体上的TaATG5a在大肠杆菌中能够被IPTG高效诱导表达，重组蛋白的表观分子量与理论值基本一致，表达量在诱导0-8 h范围内逐渐增加。纯化的重组蛋白纯度较高，满足抗体制备要求。制备的抗血清能特异性识别原核表达和小麦内源的TaATG5a，效价达到1∶25 600。此外，制备的抗血清通过Western杂交还能够识别共价连接的小麦ATG12-ATG5复合物，该复合物是小麦叶片中ATG5的主要存在形式。

青香蕉苹果MdAFS基因序列与表达模式分析

王茹茹,邓帅,丁瑞瑞,赵荣荣,张元湖

2017, 33(7): 75-82. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0082

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以青香蕉苹果叶片为材料，研究青香蕉苹果 ‘White Winter Pearmain’ α-法尼烯合酶（α-farnesene synthase，MdAFS）全长基因结构特征及编码蛋白质性质，分析MdAFS基因的诱导表达模式。采用生物信息学软件对 MdAFS 及其编码蛋白质进行详细分析，应用MEGA 6.0对不同物种来源的AFS构建系统进化树，利用 qRT-PCR技术研究MdAFS诱导表达模式。α-法尼烯合酶基因（GenBank No：AY563622）全长1 731 bp，由576氨基酸组成，是α螺旋为主要构成元件的混合型蛋白。不同物种的α-法尼烯合酶氨基酸序列相似度低，但α-法尼烯合酶N端RRx8W和C端的H-α1loop具有高度保守性。非生物胁迫和激素信号能诱导MdAFS基因上调表达，且MV、ABA和MeJA诱导该基因上调表达更加明显。α-法尼烯合酶氨基酸序列相似度低，但蛋白三维结构相似；α-法尼烯合酶在蛋白结构和功能上具有单萜合酶特征，初步揭示了非生物胁迫和激素信号能诱导青香蕉苹果α-法尼烯代谢途径的关键酶MdAFS基因上调表达。

香蕉花芽分化期抗枯萎病相关基因表达分析

王贵花,张欣,漆艳香,王宇光,彭军,谢艺贤

2017, 33(7): 83-88. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0071

摘要 ( 220 )

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通过对‘巴西蕉’和‘宝岛蕉’花芽分化期响应枯萎病菌4号生理小种（Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4，Foc4）侵染的转录组进行分析，获得了大量差异表达基因。本研究以‘巴西蕉’和‘宝岛蕉’花芽分化期根部组织为材料，采用实时荧光定量PCR（qPCR）方法测定了10个与特定抗病机制相关基因的表达变化。结果表明，10个基因在‘巴西蕉’和‘宝岛蕉’花芽分化过程中均有表达，但其表达量存在差异。与对照‘巴西蕉’相比，除laccase-4（A）基因在‘宝岛蕉’中的表达量明显下调外，laccase-4（B）、periplasmic beta-glucosidase precursor、glutathione-S-transferase Cla47、class III peroxidase 136 precursor、peroxidase N、similar to T-phylloplanin、snakin-1、putative chitinase及cellulose synthase catalytic subunit 12等9个基因的表达量均上调，其中peroxidase N基因的表达量呈极显著上调，相对表达量约为‘巴西蕉’的1 682倍。10个差异表达基因可能参与‘宝岛蕉’花芽分化期对病原菌的防卫反应，为进一步探讨‘宝岛蕉‘复杂的抗病防御反应分子机理奠定基础。

小桐子类固醇还原酶基因Jc5β-StR的克隆和表达分析

黄尧瑶,文锦芬,邓明华,龚明,陈浩维

2017, 33(7): 89-95. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1114

摘要 ( 215 )

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以小桐子（Jatropha curcas L.）cDNA为模版，克隆了Jc5β-StR基因的CDS序列，并对其序列进行了生物信息学分析。序列分析表明该基因包含1 173 bp开放阅读框（ORF），编码390个氨基酸。预测其编码蛋白质的相对分子量为44.23 kD，理论等电点为5.22。Blast搜索结果及进化分析结果表明，Jc5β-StR与蓖麻5β-StR蛋白序列一致性最高（87%）且亲缘关系最近。Jc5β-StR是一个短链还原酶，该蛋白编码有一个短链还原酶家族（SDRs）的黄体酮5β还原酶（5β-POR），还含有SDRs的6个保守结构域。组织表达结果显示Jc5β-StR在小桐子根、茎、叶、花、果皮和种子中都有表达，在种子中表达量最高，且随种子发育过程表达量逐渐上升，在种子生长发育的后期（50 d）达到最高值后下降。非生物胁迫（PEG、NaCl、低温和机械损伤）诱导下，Jc5β-StR的表达量都不同程度上调，推测其参与小桐子非生物胁迫响应。

水杨酸对镉胁迫小麦叶绿素荧光参数的影响

王瑞波

2017, 33(7): 96-99. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1188

摘要 ( 290 )

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以新麦18为材料，利用叶绿素荧光技术，分析水杨酸对镉胁迫叶绿素荧光参数的影响。结果表明，水杨酸处理（SA）镉胁迫小麦，根系镉含量显著下降；根长，叶绿素含量，叶绿素荧光参数Fv/Fm、φPSⅡ、SqP和qN下降幅度显著小于CK。可见水杨酸阻止了镉进入小麦的根部，使其表现出较高的光合效率。上述结果表明水杨酸处理显著提高了小麦的耐镉特性。

氮肥对甘蔗叶片内生固氮菌nifH基因表达的影响

李佳慧,袁丹,陆建明,杨丽涛,李杨瑞,邢永秀

2017, 33(7): 100-106. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.20170002

摘要 ( 345 )

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为了探究氮肥对甘蔗叶片内生固氮菌nifH基因表达的影响，从RNA和蛋白质水平，采用RT-PCR和Western blot 等技术分析施氮和不施氮处理下3个甘蔗品种叶片中nifH基因表达的差异性及对固氮酶相对表达量的影响。结果表明，在大田生长的甘蔗，在施氮肥和对照处理的叶片内，都可检测到固氮菌nifH基因在基因水平和蛋白质水平的表达。施氮处理会抑制或降低叶片内固氮菌的nifH基因的表达，但有利于nifH在蛋白质水平的表达，3个甘蔗品种内生固氮菌nifH基因的相对表达量都是施氮处理下较高，尤其是甘蔗品种ROC22，处理与对照间达到了显著差异。

两种麻山药典型病害根际土壤微生物多样性的研究

康捷,章淑艳,韩韬,孙志梅,罗同阳

2017, 33(7): 107-113. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0067

摘要 ( 291 )

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为了解两种典型病害土壤根际微生物群落结构，明确土壤病害与微生物多样性变化的关系，采用高通量测序对两种典型病害根际微生物多样性进行对比分析，结果表明，细菌多样性和丰度值表现为糊头病的土壤>对照组>根茎腐病组；而真菌变化更明显，两种病害土壤真菌多样性和丰富度均高于对照组。物种分类注释表明，不同处理土壤细菌种类与对照组基本一致，只是不同类别所占的比例各不相同，真菌中含有一些与病害发生有关的特有属，且比例变化较大，说明土壤微生物群落结构变化在一定程度上影响病害的发生。

冬枣轮纹病菌拮抗放线菌的筛选、鉴定及其抑制效果

范延辉,王君,

2017, 33(7): 114-119. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0119

摘要 ( 250 )

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旨在筛选出能高效抑制冬枣轮纹病病原真菌的放线菌，为冬枣轮纹病的生物防治提供理论依据。通过纯培养法从黄河三角洲贝壳堤岛贝沙沉积物中分离获得198株放线菌，对抑菌作用最强的菌株BK作了进一步研究。通过形态特征、生理生化特征和16S rRNA序列分析对菌株BK进行了鉴定，并研究了其对冬枣轮纹病菌抑制效果。结果表明，菌株BK对冬枣轮纹病菌丝生长抑制率达72.30%。菌株BK发酵液对离体冬枣果实轮纹病的防效为73.72%，与50% 多菌灵的防效相差不显著。经鉴定菌株BK为绛红北里孢菌是一株较为理想的拮抗菌，在冬枣轮纹病生物防治方面有较好的应用前景。

一株枯草芽孢杆菌的生长特性及抑藻效果研究

程新,李昆太,黄林

2017, 33(7): 120-125. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0013

摘要 ( 496 )

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溶藻微生物能引起水华蓝藻的快速消亡，从而达到控制水华之目的。为了探讨枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）对铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）及小球藻（Chlorell）的抑制效果，在实验室条件下研究了枯草芽孢杆菌对两种藻类生长的影响、抑制藻类生长的作用方式以及发酵液处理下铜绿微囊藻丙二醛（MDA）及谷胱甘肽（GSH）含量、超氧化物歧化酶（SOD）及过氧化氢酶（CAT）活性。试验结果表明，筛选出的菌株具有较好的环境适应性和抑制藻类生长的能力，其抑制效果是通过分泌胞外物质实现的。经过枯草芽孢杆菌处理后，铜绿微囊藻的叶绿素a及藻体蛋白含量均显著低于对照组，而胞内MDA及GSH含量显著升高，SOD及CAT活性也有增高的趋势。

一种根癌农杆菌介导的耐盐椒样薄荷含芽茎段转化系统

赵忠娟,魏艳丽,李纪顺,王贻莲,杨合同

2017, 33(7): 126-132. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1199

摘要 ( 291 )

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椒样薄荷的转基因技术是提高精油产量和品质的重要手段，为解决耐盐椒样薄荷叶片不定芽诱导过程中易褐化，难分化，不适合作为转基因外植体的问题，利用含芽的椒样薄荷茎段作为外植体建立了一种根癌农杆菌介导的外源基因转化体系。利用正交试验对转化所用的根癌农杆菌菌液浓度、转化时间和共培养时间进行优化，结果显示：3个因素对转化效果的影响作用表现为转化时间（B）﹥菌液浓度（A）﹥共培养时间（C），筛选出的最优转化条件为菌液浓度为OD600=0.8，转化时间为15 min，共培养时间为3 d。对不同转化液组分进行优化筛选，结果获得最适的转化液组分为：1/5MS+ 0.5 g/L MES（2-（N-吗啡啉）乙磺酸）+1%葡萄糖+2%蔗糖，PH5.4。利用不同植物表达载体进行转化，并通过基因组PCR和GUS染色进行转化植株的阳性检测，结果表明该转化体系适用于多种植物表达载体的转化，容易获得再生植株，为耐盐椒样薄荷的基因转化提供新的方法与体系。

乙醇诱导对鼠李糖乳杆菌HCCB 20591代谢乙醛的影响

钟俭鸿,殷瑜,陈代杰

2017, 33(7): 133-137. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0051

摘要 ( 283 )

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乙醛是酒类饮品中的风味物质，但乙醛过高不仅会影响酒类饮品的风味，还会对人体产生潜在的危害。从可食用的益生菌中筛选可以代谢乙醛的菌株，并探究活性菌株的乙醛代谢能力跟乙醇诱导的关系。通过静息细胞法筛选获得的鼠李糖乳杆菌HCCB 20591具有较强代谢乙醛的能力，且其代谢能力受乙醇诱导。当乙醇诱导浓度为3%，诱导时间为12 h时，乙醛转化率达到41.13%。GC-MS分析其代谢产物除了乙酸外，还生成了乙醇。采用Real time RT-PCR方法分析相关基因的转录水平，发现乙醛代谢是乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶和醛氧化还原酶综合催化作用的结果。

家蚕GAPDH内参蛋白多克隆抗体的制备及其检测

陈莹,王远卓,杨娟娟,郭兴国,乔惠丽

2017, 33(7): 138-144. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0104

摘要 ( 284 )

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制备家蚕GAPDH内参蛋白多克隆抗体，并对该抗体进行检测。利用PCR技术从家蚕中克隆GAPDH基因，构建其原核表达载体，转化大肠杆菌，诱导表达重组蛋白并纯化。纯化后的蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔制备GAPDH多克隆抗体。用酶联免疫吸附法和Western blot检测抗体的效价和特异性。结果显示，成功构建GAPDH/pET-28a原核表达载体，获得高纯度的GAPDH重组融合蛋白；经SDS-PAGE和抗His单抗检测，纯化后蛋白的分子量大小与预测的一致；以该蛋白为免疫抗原，采用4次免疫方式对新西兰大白兔进行免疫，获得GAPDH多克隆抗体血清。酶联免疫吸附检测结果表明，GAPDH抗体的效价为1：8 000，并能与天然家蚕蛋白特异性结合。成功制备了家蚕内参蛋白GAPDH多克隆抗体，为深入研究家蚕中不同蛋白的生理功能和作用奠定了坚实的基础。

蛋白激酶BIN2的纯化及活性分析

袁敏,齐玉荣,王瑞菊,

2017, 33(7): 145-149. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1167

摘要 ( 428 )

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BIN2是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在油菜素内酯（BR）信号转导中发挥重要作用。为了获得具有激酶活性且不带标签的BIN2蛋白，将BIN2基因构建到带eXact标签的pPAL8表达载体上，获得BIN2基因的原核表达载体eXact-BIN2，转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）。摸索合适的诱导条件后成功诱导出51 kD 的eXact-BIN2蛋白。经eXact纯化介质纯化并切除标签，获得质量较高、不带标签的BIN2蛋白。该BIN2蛋白具有较高的激酶活性，能够在体外磷酸化MBP-BZR1蛋白。

羊口疮病毒蛋白ORFV035的表达、纯化和多克隆抗体的制备

陈慧芹,王小平,罗树红,王丽洁,陈倩倩,郝文波

2017, 33(7): 150-154. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1182

摘要 ( 292 )

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克隆表达羊口疮病毒蛋白ORFV035，并制备其多克隆抗体，为后续对病毒复制、装配、形态发生和成熟过程的研究奠定基础。PCR扩增羊口疮病毒ORFV035基因，将其与质粒pET-30a（+）经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后连接，构建重组质粒pET30a-035。重组质粒经双酶切和测序鉴定，转化感受态大肠杆菌BL21，IPTG诱导表达，SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况。表达产物进行超声破碎和Ni柱纯化，纯化后目的蛋白免疫小鼠，制备多克隆抗体并对其进行鉴定。成功构建了重组质粒pET30a-035，在大肠杆菌BL21中以包涵体形式高效表达。包涵体洗涤、溶解后进行Ni柱纯化，得到纯度较高的ORFV035-his融合蛋白。以纯化蛋白免疫小鼠获得多克隆抗体。Western blot检测显示该多抗可以识别天然ORFV035蛋白。成功诱导表达、纯化ORFV035蛋白并制备ORFV035多克隆抗体。

盐度对一株淡水栅藻Scenedesmus sp.生长及生化组成的影响

李嘉颖,李涛,谭丽,吴嘉仪,向文洲,刘德海

2017, 33(7): 155-161. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1159

摘要 ( 314 )

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通过管式光生物反应器培养，分析比较不同盐度（0-40‰）对一株淡水栅藻（Scenedesmus sp.）生长和生化特性影响，评价海水培养该藻株的产业化潜力，探讨其高盐适应机制，为进一步海水驯化研究提供理论参考。采用显微观察、索氏提取法、凯氏定氮法、苯酚硫酸法、气相色谱法及高效液相色谱法分别测定微藻生长及蛋白质、油脂、多糖含量以及色素、脂肪酸组成情况。结果表明，高盐条件下藻细胞明显增大，并出现自然沉降现象，可实现低成本采收。随盐度增加，栅藻生长逐步被抑制，40‰盐度条件下生长完全停止，但在3‰盐度下仍良好生长，培养末期生物量可达2.84 g/L。30‰盐度组蛋白质含量相对淡水组提高95.40%、产率与淡水组相近，加之高盐培养可较大幅度降低蛋白质的生产成本，因此，采用海水培养栅藻来开发蛋白资源具有一定的潜力。研究还表明，30‰盐度下藻细胞内β-胡萝卜素、虾青素、可溶性多糖等成分大量积累，可能是其适应高盐胁迫的重要生理基础。

Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909麦芽寡糖基海藻糖合成酶在Bacillus subtilis中的重组表达和发酵优化

韩唱,宿玲恰,吴敬

2017, 33(7): 162-168. doi:10.13560/J.cnki.biotech.bull.1985.2017-0086

摘要 ( 289 )

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为实现Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909来源的麦芽寡糖基海藻糖合成酶（MTSase）基因treY在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中的重组表达，以质粒pET-24a（+）-treY为模板PCR扩增得到目的基因，并与表达载体pHY300PLK连接，转入表达宿主Bacillus subtilis CCTCC M 2016536中，重组菌在TB培养基中培养48 h后MTSase酶活达到17.5 U/mL；在此基础上对重组菌发酵条件进行优化，通过单因素实验（氮源种类、氮源复配、氮源浓度、碳源种类、葡萄糖浓度、初始pH、诱导温度）和正交实验（氮源浓度、葡萄糖浓度、初始pH、诱导温度）确定其摇瓶发酵产酶的最适培养基和培养条件为：氮源（工业蛋白胨∶棉籽粉=3∶1）48.0 g/L、葡萄糖为10.0 g/L、培养基初始pH为7.0，最适培养温度为30℃；在此条件下，MTSase的酶活可达41.5 U/mL，是优化前的2.4倍。

红笛鲷（Lutjanus sanguineus）CD8基因的克隆与诱导表达

黄郁葱,梁秀全,蔡双虎,鲁义善,简纪常,吴灶和

2017, 33(7): 169-178. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0095

摘要 ( 254 )

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探讨红笛鲷（Lutjanus sanguineus）CD8基因的基本特性。应用同源克隆和cDNA末端快速扩增（Rapid amplification of cDNA ends，RACE）技术克隆了红笛鲷CD8α和CD8β基因，并分析了其在不同组织的表达分布及免疫刺激物诱导后的表达模式。结果显示，CD8α cDNA序列全长1 576 bp，编码225个氨基酸。红笛鲷CD8β基因cDNA序列全长为1 486 bp，编码210个氨基酸。氨基酸序列分析结果显示，CD8α和CD8β均由信号肽、免疫球蛋白超家族（Immunoglobulin superfamily，IgSF）可变区、铰链区、跨膜区和胞浆区组成。荧光定量PCR（Real time quantitative PCR，qRT-PCR）分析显示红笛鲷CD8α和CD8β基因在胸腺表达量最高，其次为中肾、鳃、肠、皮肤、脾和头肾。红笛鲷头肾淋巴细胞体外经LPS、ConA和PolyI﹕C刺激8 h后CD8α和CD8β表达量显著上调（P<0.01）。哈维氏弧菌疫苗刺激24 h后鳃、头肾、脾脏、和肠的表达量上升。

三倍体雌性虹鳟性腺发育过程中lc3b 基因的表达分析

黄天晴,王星然,王彦娜,孙慧智,韩英

2017, 33(7): 179-184. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1166

摘要 ( 221 )

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旨在证明细胞自噬与三倍体雌性虹鳟性腺败育的关系。利用RT-PCR 扩增虹鳟自噬基因lc3b（Microtubule associated protein 1 light chain 3 beta，lc3b）的编码区序列，通过透射电镜观察三倍体雌性虹鳟不同发育阶段性腺中自噬小体的形态，结合不同发育阶段性腺中lc3b 基因和蛋白的表达，来证明细胞自噬的发生。结果表明，在200 dpf-270 dpf（Days post fertilization，dpf）这个发育阶段，lc3b 基因以及自噬蛋白LC3B-II / LC3B-I的表达处于相对较高的水平，在这个时期内，都观察到了自噬体结构的存在。这些结果证明了性腺细胞自噬为三倍体雌性虹鳟性腺败育的主要原因之一。

鲍曼不动杆菌外膜蛋白34的表达纯化及其生物活性分析

安志远,苏建荣

2017, 33(7): 185-194. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0102

摘要 ( 279 )

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通过基因克隆方法制备鲍曼不动杆菌ATCC 19606（Acinetobacter baumannii ATCC 19606）外膜蛋白34（Outer membrance protein 34，Omp34），并分析其生物结构及对HEK293细胞的凋亡作用。采用PCR方法扩增鲍曼不动杆菌ATCC19606 Omp34基因，并将其克隆到表达载体pET28a（+）以构建重组质粒pET28a（+）-Omp34，转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导蛋白表达并用镍柱亲和层析纯化蛋白，使用L-精氨酸和还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）可使Omp34蛋白正确复性，生物信息预测Omp34生物结构，利用圆二色谱（Circular dichroism CD）技术测定Omp34的二级结构，通过流式细胞术和Western blot检测Omp34对HEK293细胞的凋亡作用。成功构建表达载体pET28a（+）-Omp34，并在原核表达体系中高效表达，通过复性得到可溶蛋白。生物信息预测Omp34为β桶状蛋白，圆二色谱证实Omp34结构为β折叠结构，其中α-螺旋含量为12%、β-折叠为39%、β-转角为22%、无规则卷曲为27%。复性的Omp34可使HEK293细胞发生凋亡。通过分子克隆技术成功获得了鲍曼不动杆菌外膜蛋白34，并解析出其二级结构，证实其可以导致HEK293细胞凋亡，这为将来进一步研究鲍曼不动杆菌外膜蛋白34的生物学功能及其耐药机制奠定了基础。

斑点叉尾鮰C型溶菌酶在毕赤酵母中的表达及其抑菌活性

冯亚东,陶妍,李雯,崔旭,王强厚

2017, 33(7): 195-202. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0094

摘要 ( 298 )

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C型溶菌酶是存在于各种生物组织中的数种溶菌酶成员中的一员，是重要的细胞内免疫蛋白，具有稳定的空间结构和显著的抑菌功能，被认为是良好的食品保鲜剂和饲料添加剂。为了开发鱼类来源的C型溶菌酶，研究建立了基于毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统的斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）C型溶菌酶的制备方法。首先通过PCR获得5'和3'端分别添加Xho I和Xba I酶切位点的编码斑点叉尾鮰C型溶菌酶的cDNA（cflyC），其编码由127个氨基酸残基组成的多肽；将该cflyC与表达载体pPICZαA连接以构建重组表达载体pPICZαA-cflyC；转化至毕赤酵母X-33后，通过不同浓度的博来霉素和对酵母基因组DNA的PCR鉴定，筛选得到高拷贝的酵母转化子；经0.5％甲醇诱导，在pH6.0、29℃、250 r/min下培养144 h，得到的表达产物经固化金属离子亲和层析（IMAC）纯化，得到重组蛋白；经Tricine-SDS-PAGE分析，表明重组蛋白的分子量为15.1 kD；进一步通过MALDI-TOF-TOF质谱鉴定，证明该重组蛋白为预期的重组cflyC。通过福林酚法测得重组cflyC的表达量为2.75 mg/L。琼脂糖凝胶扩散法和酶活力测定证明，重组cflyC对枯草芽孢杆菌具有抑菌活性。本研究首次实现了斑点叉尾鮰C型溶菌酶在毕赤酵母中的重组DNA表达，为其大规模制备奠定了基础。

四个罗氏沼虾抗病选择系抗病力比较分析

李玉锋,戴习林,袁新程,周迅,胡彦杰,丁福江

2017, 33(7): 203-209. doi:10.13560/J.cnki.biotech.bull.1985.2017-0096

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采用荧光定量PCR方法，对4个罗氏沼虾抗病选择系的4个抗病力基因（热休克蛋白70（HSP70）Se-GPx、CAT、SOD）表达量分析。通过感染溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus），对比4个选择系之间HSP70、Se-GPx、CAT及SOD表达量的差异，结合4个选择系成活率，来对比4个抗病选择系抗病力强弱。结果表明，A、B两个抗病选择系的肝胰腺HSP70 mRNA的相对表达量明显高于C、D两个抗病选择系（P<0.05）。感染96 h内Se-GPx、CAT、SOD表达量变化显著，在4个选择系不同时间表达量也不相同，但是总体变化趋势是A、B选择系高于C、D选择系。结合4个选择系感染溶藻弧菌一周的成活率分别为65.0%、65.8%、51.7%及53.3%，可得出结论A、B两个抗病选择系抗病力高于C、D两个选择系。

抗肿瘤多肽9R-P201诱导下的肝癌HepG2细胞转录组测序分析

刘文荣,丁若凡,张一鸣,李宇鹏,李玲,郭志云

2017, 33(7): 210-215. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0053

摘要 ( 256 )

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旨在探索多肽9R-P201处理肝癌HepG2细胞后基因融合、单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）突变、可变剪接等事件，并分析差异表达基因所参与的生物学进程与信号通路，以期解析多肽9R-P201在转录组水平对肝癌细胞的调控。通过转录组测序检测9R-P201处理肝癌HepG2细胞前后基因差异表达情况，tophat-fusion软件检测基因融合，SAMTOOLS软件检测SNP位点，rMATS软件鉴定可变剪接，使用基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析方法对差异表达基因进行功能富集分析。结果共检测到可变剪接事件276个、SNP位点5 557个、基因融合事件45个；同时共得到显著差异表达基因 403个，其中上调269个而下调134个，基因的功能富集分析结果显示差异表达基因显著富集细胞生长、迁移等肿瘤相关生物进程，并参与多条与癌症相关的信号通路。研究表明在9R-P201诱导HepG2细胞后，导致表达差异基因显著与肿瘤生物学进程和通路相关，并发生了大量可变剪接、SNP突变、基因融合等事件，这暗示着该多肽有望作为后续肝癌介入治疗潜在药物分子。

肝癌细胞HepG2中p53调控miRNA-3661的生物信息分析与功能验证

李宇鹏,张一鸣,胡海碧,康成宇,李牧洲,郭志云

2017, 33(7): 216-223. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.20170005

摘要 ( 249 )

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对已在前期实验中通过Dox诱导肝癌细胞HepG2 DNA损伤发现的受p53调控的hsa-miR-3661进行生物信息学分析，并通过分子生物学实验对其功能进行了验证，为miR-3661在肝肿瘤中的调控机制的研究提供理论基础。获取miR-3661结构与序列信息；预测靶基因，使用DAVID进行miRNA靶基因功能富集分析；分析miR-3661的p53结合位点，通过基因间的相互作用构建调控网络；进行细胞增殖实验验证miR-3661抑制肿瘤功能。结果表明，miR-3661序列保守，启动子区存在p53结合位点，暗示p53与hsa-miR-3661存在直接调控；预测靶基因1 009个，369个显著富集于细胞周期调控、细胞增殖、细胞凋亡等肿瘤相关生物学过程（P<0.05），主要参与了癌症信号通路、MAPK信号通路与ErbB信号通路（P<0.05）；通过268组基因间的相互作用数据构建了p53、hsa-miR-3661和靶基因的调控网络，从系统生物学角度分析了参与多个肿瘤生物进程的关键靶基因；在实验中证实过表达miR-3661可以显著抑制肝癌细胞HepG2的增殖过程（P-value= 0.001 46）。miR-3661受p53直接调控，其靶基因显著富集于多种肿瘤相关生物进程与信号通路，过表达miR-3661可显著抑制肝癌细胞增殖。

PDSW联合热疗对胃癌细胞和组织中COX-2、Bcl-2表达的影响

唐辉蓉,崔进,张家骅,代佑果,李为明,廖陈

2017, 33(7): 224-230. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-0691

摘要 ( 232 )

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旨在探讨生理性深层海水（PDSW）联合热疗对人胃癌SGC-7901细胞和组织中COX-2和Bcl-2表达的影响，明确其在人胃癌SGC-7901体外和体内的抗癌作用。通过在体外培养人胃癌SGC-7901细胞株，随机分为实验组、对照组和空白组，实验组加PDSW，对照组加生理盐水，空白组不做其他处理，分别在37℃、40℃和43℃热疗温度下培养。同时，将SGC-7901细胞注射至裸鼠皮下，建立移植瘤模型，随机分为5组，至肿瘤长至直径为1 cm时，分别进行 H2O+RT、H2O +40℃、H2O +43℃、PDSW+40℃、PDSW+43℃处理，用实时荧光定量PCR检测细胞和组织中COX-2和Bcl-2基因表达情况，Western blot检测COX-2和Bcl-2蛋白的表达情况。结果显示，在SGC-7901细胞中和裸鼠皮下移植瘤的组织中，热疗均能降低COX-2、Bcl-2基因及蛋白的表达，同时，与生理盐水组相比，PDSW联合热疗处理下，细胞和组织中COX-2、Bcl-2表达量显著下降。PDSW联合热疗能抑制胃癌SGC-7901细胞中COX-2、Bcl-2基因和蛋白的表达，从而有效抑制胃癌细胞的增殖。

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2017, 33(7): 300.

摘要 ( 94 )

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