生物技术通报

ZIP蛋白在植物中的功能分析

李素贞, 陈茹梅

2018, 34(11): 1-7. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0464

摘要 ( 547 )

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锌和铁是植物生长发育所必需的微量营养元素,在植物的光合作用、呼吸作用以及许多生化反应中起着非常重要的作用。植物体内锌铁处于平衡状态才能保证其正常的生长发育,而锌铁调控转运体ZIP对于锌铁吸收、转运及体内平衡的调节有重要作用。目前,对于植物中ZIP家族基因的研究有一定进展。对植物ZIP基因的表达、蛋白定位、酵母互补实验、过表达及基因敲除等研究结果进行综述,揭示了ZIP蛋白在植物发育过程中的作用。了解ZIP对于锌铁吸收、转运及体内平衡中的作用有助于通过转基因改良及常规育种将ZIP蛋白应用于农业生产上。

植物NAC转录因子功能研究进展

王春雨, 张茜

2018, 34(11): 8-14. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0443

摘要 ( 655 )

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NAC（NAM、ATAF1、ATAF2和CUC2）转录因子家族是植物基因组中最大的转录因子家族之一,也是植物特有的转录因子。在多种陆生植物基因组中已经有超过100个成员被发现和鉴定。植物NAC转录因子具有多种功能,对植物的生长发育调控、植物的逆境胁迫应答、调控植物的抗病性、参与植物次生生长调控以及激素信号转导等生理过程中具有重要作用。就NAC转录因子的基本结构特征和最新的研究进展进行综述,以期为相关研究提供参考。

水稻黄绿叶突变体研究进展

李素贞, 杨文竹, 陈茹梅

2018, 34(11): 15-21. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0465

摘要 ( 381 )

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叶绿素是植物光合作用的重要色素,叶绿素的合成决定植物的光合效率,并且直接影响作物的产量和品质。叶绿素的合成及分解代谢是一个非常复杂的过程,在此过程中有较多的基因参与,其中任何一个基因发生突变都有可能影响叶绿素的合成及分解,从而使叶片表现出各种叶色变化或者会影响植物的生长。叶色突变体研究是探明叶绿体发育过程中基因功能的有效途径。因此,发掘和鉴定叶色突变基因,开展与叶绿素相关基因的定位、克隆及功能研究均具有重要的理论意义和应用价值。综述了水稻黄绿叶突变体的研究进展,旨在为研究水稻叶绿素生物合成途径和光合作用机制提供理想的材料,同时还可作为标记性状在杂种优势中进行利用。

玉米矮杆基因研究进展

王文秀, 王磊

2018, 34(11): 22-26. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0444

摘要 ( 563 )

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玉米已成为我国种植面积最大的农作物,提高玉米的种植密度是提高玉米产量的重要技术手段。玉米的株型改良成为玉米遗传育种研究的重点之一。合理株型和抗倒伏能力是影响玉米产量的重要农艺性状,也是衡量优良玉米品种的重要指标之一。通过玉米矮化基因的分离及研究,开发相应的分子标记,培育出矮化或半矮化玉米植株,从而改善玉米株型结构,增加种植密度,提高群体光合效能,提高玉米产量。主要从玉米矮化育种的概况、玉米矮化基因遗传特点、玉米矮化基因的表型以及激素对玉米矮化的影响等方面的研究进行了总结和概述,为玉米矮化基因的开发利用及分子机制的阐明提供新的信息。

甜高粱在镉胁迫下的生理生化和应答机理研究进展

李建钢, 刘瑞媛, 彭丹妮, 李文建, 董喜存, 马建忠

2018, 34(11): 27-35. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0536

摘要 ( 303 )

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生活垃圾、化肥、农药、制造业及采矿业的发展造成了土壤重金属的污染。系统总结了甜高粱在镉胁迫下的生理生化机制、耐受性及分子机理,其中生理生化机制主要是镉胁迫对甜高粱种子萌发和幼苗生长、抗氧化物酶活、光合参数、超微结构和微量元素吸收的影响,而甜高粱对镉的耐受性包括外排机理和内部耐受性,外排机理主要是常见的重金属外排蛋白黄色条状蛋白、重金属ATP酶4、植物镉抗性蛋白1和多效型耐药蛋白8,内部耐受性主要有重金属的螯合、液泡区室化重金属。耐受性分子机理主要依赖谷胱甘肽途径的调节,晚期胚胎丰富蛋白和自然抗性相关巨噬蛋白的表达。此外,甜高粱对镉的吸收积累和转运相关蛋白的研究,主要指镉进入植物的主要过程和镉在植物体的积累顺序、相关的细胞膜锌铁离子转运蛋白和自然抗性相关转运蛋白的转运。最后,对甜高粱用于生物修复的优点进行了说明和展望,并提出了存在的问题和今后研究的方向,以期为今后甜高粱的育种及培育出高效修复镉污染的甜高粱新品种提供依据。

植物亚硝基谷胱甘肽还原酶在胁迫反应中的作用研究

夏金婵

2018, 34(11): 36-41. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0514

摘要 ( 408 )

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信号分子一氧化氮（Nitric oxide,NO）参与植物的许多生理反应过程,例如：萌发、气孔的关闭、侧根的发育以及生物与非生物的胁迫反应过程等,主要的调控形式是与半胱氨酸上的硫基发生可逆的S-亚硝基化作用。NO的半衰期很短,这限制了它在细胞中的生理功能,与胞内含硫基的分子形成的S-亚硝基硫醇（S-nitrosothiols,SNOs）的化学性质稳定,在植物的生长发育及抗逆过程中SNOs参与NO的运输、扩散、储存以及蛋白的翻译后修饰过程。谷胱甘肽（Glutathione,GSH）与NO发生S-亚硝基化作用形成S-亚硝基谷胱甘肽（S-nitrosoglutathione,GSNO）,GSNO作为NO的储存与转运形式,可以把NO转到靶蛋白上,使靶蛋白发生亚硝基化。亚硝基谷胱甘肽还原酶（S-Nitrosoglutathione reductase,GSNOR）是生物体中的一类保守蛋白,通过还原亚硝基谷胱甘肽从而调节细胞内NO及亚硝基硫醇（S-nitrosothiols,SNOs）水平,保护机体免受亚硝化的胁迫,间接的调控的细胞的氧化状态。GSNO是一个天然的NO储存库,GSNOR是调节机体亚硝基化水平的关键基因。主要对GSNOR参与的植物生长发育、生物与非生物胁迫等过程进行了概述,探讨GSNOR在植物生长发育及胁迫反应中的作用机制,将有助于我们对NO生理功能的了解,旨在为将来GSNOR的研究提供理论参考和思路。

植物内生细菌修复重金属污染土壤作用机制研究进展

张萌萌, 曹立东, 王仁卿, 孙瑞莲

2018, 34(11): 42-49. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0593

摘要 ( 435 )

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内生细菌生活在植物组织内部,长期以来与宿主植物形成了紧密的共生关系。内生细菌在重金属吸收、耐受和解毒方面具有优良的特性,为修复重金属污染土壤提供了有效的新方案。综述了内生细菌强化植物修复重金属污染土壤的作用机制,包括内生细菌通过产生植物生长调节激素,分泌ACC脱氨酶和几丁质酶等,促进宿主植物在重金属胁迫条件下的生长;通过改变重金属的生物有效性/毒性,减轻植物重金属毒害;通过与植物形成联合修复体,加强植物抗重金属毒性的能力。分析了近几年超富集植物内生细菌多样性及其影响因素,探讨了联合修复过程中影响内生细菌强化修复效果的主要因素,包括内生细菌的来源、活性和环境胁迫等各种生物因素和非生物因素,并对内生细菌与植物联合修复的研究方向进行展望,涉及内生细菌自身存活原因和如何耐受重金属的机制研究,植物内生细菌的行为动力学和代谢,以及内生细菌、植物及土壤之间的生态互作效应等,以期推动内生细菌大规模应用于植物修复重金属污染土壤。

锌指蛋白6（ZBED6）研究进展

解文雅, 张传海, 潘登科, 贺晓云

2018, 34(11): 50-55. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0449

摘要 ( 451 )

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锌指蛋白6（ZBED6）基因是新发现的一个转录调控因子,与肌肉的生长发育密切相关,可调控胰岛素样生长因子2（Insulin-like growth factor 2,IGF2）在内的多种基因的表达,为哺乳动物特有,序列高度保守。IGF2作为重要的生长调节因子,内含子3区域可与ZBED6结合,ZBED6的结合可抑制IGF2表达,进而调控细胞的增殖分化和肌肉的生长发育。总结了目前对ZBED6基因的生理功能研究进展,已有研究表明ZBED6可抑制IGF2的表达,促进骨骼肌、心脏、肝脏、肾脏等器官的生长发育,降低脂肪沉积,体内蛋白质、脂质等生物大分子的代谢过程也随之发生变化,ZBED6在糖尿病、癌症的发展过程中均发挥着重要的调控作用。此外,还总结了影响ZBED6表达的多种因素,包括碱基突变、DNA甲基化、组蛋白修饰以及回文序列等。最后,展望了ZBED6的实际应用潜力,其作为一个与肌肉生长发育密切相关的转录因子,可通过敲除ZBED6促进肌肉生长,为瘦肉型动物的遗传育种提供了新的思路。

环状RNA的特征及其在畜禽中的研究进展

徐海冬, 冷奇颖, PATRICIAAdu-Asiamah, 王章, 李婷, 张丽

2018, 34(11): 56-69. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0403

摘要 ( 334 )

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环状RNA（circRNA）是一类新发现的内源性非编码RNA,为共价键形成的闭合环形结构RNA分子。circRNA在真核生物体内广泛存在,主要来源于外显子或内含子,具有种类丰富、保守性强、细胞组织表达特异性、稳定性高等特点。目前研究表明,circRNA的形成方式包括剪接体套索驱动环化和内含子配对驱动环化,期间会有多种顺式原件和反式原件调控circRNA的形成。circRNA可通过多种方式发挥其生物学功能,circRNA与RNA结合蛋白结合调控基因表达及蛋白质翻译,circRNA与miRNA结合发挥miRNA海绵功能,circRNA可编码功能性蛋白,circRNA还可参与细胞通讯和信号转导。畜禽的经济性状及疾病防控是畜牧学关注的重点,目前研究发现,circRNA广泛地参与了家畜的疾病发生及防控、繁殖繁育、肌肉发育、脂肪沉积、神经发育等生理过程,在家畜的疾病发生防控和肉奶产量品质等经济性状中具有重要的研究价值。对circRNA的特征、形成机制、主要生物学功能及其在畜禽中的研究进展进行综述,旨在为circRNA在畜禽的研究提供一定的依据及参考,为开发新的分子遗传标记提供新的思路,为丰富畜禽品系选育提供新的技术和方法。

miR-155研究进展

李聪聪, 赵金艳, 吴姣, 徐秋良

2018, 34(11): 70-82. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0331

摘要 ( 989 )

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microRNAs（miRNAs）是进化上保守且广泛存在于真核生物中的一类非编码单链小RNA,大小约为19-25个核苷酸,主要通过抑制靶基因的表达或翻译来发挥转录后调控作用。miR-155是microRNAs家族中的重要成员,由于其具有多功能的特点而颇受关注,人们对其开展了广泛而又深刻的研究。大量研究结果表明miR-155的功能广泛,它参与机体造血细胞的发育分化、免疫细胞的发育分化、炎症反应、免疫应答、肌肉发育以及脂肪分化等许多生物过程,并在肝癌、淋巴癌、乳腺癌、胰腺癌和肺癌等多种癌组织或细胞株中呈现高表达,与肿瘤的发生、侵袭和转移密切相关,而且,随着研究的不断深入,miR-155极有可能成为一个新的肿瘤标志物以及肿瘤基因治疗的新靶点。miR-155在各种生命过程中扮演着无可替代的角色,并在相关信号通路的调节中发挥着不可或缺的作用,是个典型的重要的多功能miRNA。就miR-155的主要特点以及相关功能研究进展予以综述,旨在讨论miR-155在机体生命活动中发挥的重要作用,为多种疾病的治疗提供新思路和新方法。

基于微藻培养处理畜禽养殖废水的研究进展

马浩天, 李润植, 张宏江, 杭伟, 崔红利

2018, 34(11): 83-90. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0484

摘要 ( 557 )

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当前规模化畜禽养殖业排放含有大量氮磷、重金属和有机污染物的粪污废水,导致生态环境遭受严重的污染,治理畜禽废水的任务迫在眉睫。由于传统畜禽废水处理方式及应用存在较多不足,基于微藻生物技术处理废水的研究得到越来越多的关注。微藻是一种广泛存在于水体中的单细胞生物,具有高效的脱氮除磷及纳污能力,其主要利用同化作用吸附污水中的氮,通过磷酸化作用吸附、沉降磷,依靠细胞膜上的官能团对重金属进行富集。基于以上生理基础,大多数微藻的氮磷吸附率和重金属富集率可以高达80%。目前微藻对畜禽废水污染组分的处理的研究主要集中在氮磷、重金属,实际应用方式多为高效藻类塘、活性藻、固定化技术、光生物反应器等。但是微藻处理畜禽废水仍存在分子机理研究较少,生产实际经验不足等问题。基于微藻处理畜禽废水的机理,通过综述若干微藻去除氮磷、重金属等污染物的效率,总结国内外微藻废水处理技术的研究及存在问题,展望了微藻废水工程发展前景。

生物除磷系统中积磷小月菌研究进展

刘成, 姜天翼, 王静, 陈文兵, 王珊珊, 钟传青

2018, 34(11): 91-96. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0485

摘要 ( 435 )

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水体中磷元素超标是引起水体富营养化的重要原因,而强化生物除磷（Enhanced biological phosphorus removal,EBPR）是污水除磷最行之有效的方法。聚磷菌（Phosphate accumulating organisms,PAOs）在EBPR中发挥重要作用,本文首先概述了典型PAOs在EBPR的作用和机理：厌氧条件下,典型PAOs分解Poly-P合成聚羟基烷酸（Polyhydroxyalkanoates,PHA）;好氧条件下,利用分解PHA产生的能量超量吸收磷合成Poly-P。其次评述了积磷小月菌在EBPR中的作用和机理：积磷小月菌作为PAOs的一种,在PAOs中所占比例较多,且有超强的磷去除能力,研究表明积磷小月菌体内存在PHA,但合成系统与典型PAOs不同;另外,积磷小月菌可直接利用葡萄糖作为碳源,这是典型PAOs不具备的,其超强除磷能力与积磷小月菌有效的磷转运能力和其Poly-P合成代谢能力有关。探讨并总结积磷小月菌在强化生物除磷系统中的作用和机理对进一步研究如何提高积磷小月菌的除磷效果有重要理论意义与应用价值。

利用CRISPR/Cas9技术定点敲除烟草多酚氧化酶基因NtPPO1

姚恒, 杨大海, 白戈, 谢贺

2018, 34(11): 97-102. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0560

摘要 ( 501 )

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植物多酚氧化酶具有多种重要的生理功能。为研究烟草中多酚氧化酶基因功能,从GenBank中挑选一个烟草多酚氧化酶基因（基因登录号为XM_016608009.1）,命名为NtPPO1。NtPPO1编码序列经PCR扩增、克隆测序验证后,采用CRISPR/Cas9技术定点敲除NtPPO1,并利用实时荧光定量PCR检验基因敲除效果。研究表明烟草NtPPO1全长1 746 bp,存在2种可变剪切方式。经测序与分析发现,T₂突变体中的NtPPO1序列在靶位点处发生了1个、2个碱基的缺失突变与1个碱基的插入突变。实时荧光定量PCR检测结果显示,与对照相比,T₂突变体中NtPPO1表达水平显著下降。烟株外观显示NtPPO1突变体与野生型对照之间无明显差异。

基于SRAP和SSR标记构建的杏扁遗传连锁图谱

王晓燚, 孔德晶, 艾鹏飞

2018, 34(11): 103-110. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0594

摘要 ( 345 )

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以杏扁品种‘龙王帽’授粉‘优一’获得98个F₁代单株为作图群体,采用SRAP和SSR标记进行连锁图谱的构建。采用Join Map 4.0软件进行连锁分析,分别构建了‘龙王帽’和‘优一’的分子连锁框架图,共获得132个SRAP标记和17个SSR标记。其中父本遗传图谱涉及8个连锁群,包含53个SRAP标记和9个SSR标记,图谱总长为694.8 cM,标记间平均图距为11.21 cM,平均每个连锁群上有7.75个标记位点,连锁群平均长度为86.85 cM;母本遗传图谱涉及8个连锁群,包含79个SRAP标记和8个SSR标记,图谱总长为924.8 cM,标记间平均图距为10.63 cM,平均每个连锁群上有10.87个标记位点,连锁群平均长度为115.6 cM。

橡胶树ADC1的克隆、表达及生物信息学分析

侯岚菲, 杨洪, 邓治, 代龙军, 门中华, 李德军

2018, 34(11): 111-119. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0498

摘要 ( 334 )

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精氨酸脱羧酶（Arginine decarboxylase,ADC）是高等植物多胺合成的重要酶。为对橡胶树ADC基因表达模式及生物信息学进行分析,采用PCR和测序技术从橡胶树中克隆了一个ADC基因（HbADC1）,获得的HbADC1序列长2 594 bp,开放阅读框为2 175 bp,编码724个氨基酸。生物信息学预测HbADC1理论分子量和等电点分别为77.7 kD和5.14。进化分析表明,HbADC1与大戟科植物木薯、麻风树的ADC聚为一支。qRT-PCR分析表明,HbADC1表达无组织特异性,在雌花中表达量最高,茎尖、雄花、叶片、树皮和胶乳次之。HbADC1在不同发育时期叶片中的表达存在变化,稳定期表达量最低,淡绿期最高,说明HbADC1可能参与橡胶树叶片发育过程。此外,HbADC1表达受伤害、低温、干旱、高盐、过氧化氢及乙烯调控,表明HbADC1可能参与橡胶树逆境胁迫和乙烯应答过程。

苦碟子中对香豆酰转移酶基因克隆分析与功能验证

李天真, 周威, 殷华, 张同存, 刘涛

2018, 34(11): 120-126. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0340

摘要 ( 331 )

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苦碟子含有绿原酸等多种酚酸类化合物,该类化合物具有抗氧化和清除自由基等生物活性。对香豆酰转移酶（Hydroxycinnamoyltransferase,HCT）是此类化合物生物合成途径中的关键酶。本研究以苦碟子叶片为实验材料,采用转录组测序、序列分析以及RT-PCR的方法,获得一条对香豆酰转移酶基因,命名为IsHCT（GenBanK：MH151086）。序列分析表明该基因长1 320 bp,编码439个氨基酸。通过氨基酸序列比对及生物信息学分析发现,IsHCT氨基酸序列含有两个保守结构域,属于BAHD家族中的HCT酶类。系统发育进化树结果表明,该序列与菊苣的CiHCT的同源性最高,序列相似性高达95%。通过在大肠杆菌中过表达IsHCT和来源于拟南芥的对香豆酰辅酶A连接酶（At4CL）,并在发酵培养基中饲喂底物咖啡酸和奎尼酸,在发酵液中检测到绿原酸的合成,表明IsHCT能够催化咖啡酰辅酶A与奎尼酸合成绿原酸,具有对香豆酰转移酶功能。

木通红喀木虱线粒体基因组的测定与序列分析

金巧, 刘霞, 甘志凯

2018, 34(11): 127-135. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0717

摘要 ( 294 )

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为保护木通等药用植物资源,了解其生物学性质,寻找其生理生化特性,以木通红喀木虱Cacopsylla coccinea为研究对象,测定了该研究对象的线粒体基因组并分析了其序列特征。采用PCR扩增、基因克隆等技术成功测得木通红喀木虱全线粒体基因组,全长为14 832 bp,共编码37个基因,包括13 个蛋白质编码基因、22个转运RNA基因,2个核糖体 RNA基因和一个富含AT的非编码区。以木通红喀木虱、枸杞木虱和脉斑银木虱三种昆虫为材料,采用比较基因组学和生物信息学方法,分析木虱科线粒体基因组的分子组成特征。主要组成特征：（1）三种昆虫基因组大小相似;（2）木通红喀木虱线粒体trnV基因发生重排;（3）脉斑银木虱间隔区最长,而枸杞木虱重叠区为最大;（4）三种昆虫AT含量基本相似,均约为70%;（5）三种昆虫存在碱基不对称,其中H-链和L-链上的第3个密码子位点AT的含量远高于其它位点;（6）三种昆虫线粒体基因组中nad5、nad6和cob基因的碱基置换率均小于1,说明它们受到负选择作用。

苏云金芽胞杆菌aiiA的5'端侧翼序列的克隆与功能鉴定

陈少威, 吴程, 苏月华, 蔡斌斌, 谢盼盼, 杨梅

2018, 34(11): 136-143. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0439

摘要 ( 340 )

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为了研究苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）N-酰基高丝氨酸内酯酶（N-acylhomoserine Lactonase,AiiA蛋白）表达调控机制,确定aiiA的启动子区域。本研究克隆了aiiA的5'端侧翼区（aP_-1930--1）,以gfp作为报告基因,分段克隆aiiA的5'侧翼区,鉴定启动子活性,并对aiiA启动子序列中的碱基对-150和-142之间的2个连续的TATA盒进行定点突变。结果显示,侧翼序列aP_-295--101和aP_-295--1可作为启动子,实现GFP在大肠杆菌中的异源表达,启动子序列aP_-295--101比aP_-295--1活性更强,aP_-101--1序列不能启动GFP表达。定点突变pET28a-aP_-295--101-gfp载体2个TATA盒显著降低GFP表达。表明-295--1bp为aiiA的启动子区,-429--296与-100--1序列是aiiA的负调控序列。-150--142 bp区域的2个TATA盒对aiiA的5'侧翼区域的启动子活性起关键的作用。

来源于Alicyclobacillus sp.A4葡萄糖异构酶的克隆表达及转化应用研究

戴晨霞, 曹慧方, 罗会颖, 姚斌, 柏映国, 徐波

2018, 34(11): 144-151. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0408

摘要 ( 344 )

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葡萄糖异构酶在体外可以将D-葡萄糖异构化为D-果糖,是商业制备高果糖浆的关键酶。本研究从嗜热菌Alicyclobacillus sp.A4中克隆了葡萄糖异构酶（A4GI）基因,并在大肠杆菌BL21中成功进行了表达。利用His-tag蛋白纯化磁珠对粗酶液进行纯化,并对已纯化的重组A4GI进行详细的酶学性质及转化率的测定。结果表明：A4GI的最适温度和pH分别为65℃和pH 7.5,该酶在pH 6.0-11.0之间很稳定,在pH 6.0-11.0缓冲液中37℃处理1 h后,剩余酶活99% 以上。最适反应条件下,重组酶对D-葡萄糖的K_m与V_max值为99.8 mM与3.75 µmol/min/mg。在不同浓度的葡萄糖转化实验中,A4GI的转化率在一定底物浓度范围内随底物浓度增加呈现升高的趋势,在底物葡萄糖浓度为 3 M时达到52.7% 的最高转化率,因此可以实现在高浓度葡萄糖下进行高效转化,降低后期浓缩的生产成本,具有较好的工业应用潜力。

BLM解旋酶基因的克隆、表达载体构建及表达研究

赵佳福, 许厚强, 宋书弦, 段志强, 陈祥

2018, 34(11): 152-159. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0461

摘要 ( 296 )

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克隆获得BLM基因全长CDS区,研究其在细胞中的表达情况。从人前列腺癌PC3细胞中提取总RNA,反转录成cDNA,采用分段克隆的方法获得BLM全长CDS区,将其定向插入到原核表达载体pET-32a和真核表达载体pEGFP-N3,构建pET-32a-BLM和pEGFP-N3-BLM。将获得的重组质粒转化BL21（DE3）感受态细胞或转染PC3细胞,通过SDS-PAGE、Western blotting、荧光定位观察等方法研究人BLM解旋酶在细胞中的表达或定位。BLM解旋酶的原核表达结果显示,不同IPTG浓度对BLM解旋酶的表达量影响不大,低温有助于其表达量的提高。Western blotting检测发现,构建的人BLM解旋酶重组原核和真核表达载体分别能在大肠杆菌细胞和PC3细胞中表达出分子量约为179 kD 的蛋白质,与预期分子量大小一致。荧光共定位结果显示,人BLM解旋酶主要定位在细胞核。成功克隆了人BLM解旋酶全长CDS区,且构建的重组表达载体pET-32a-BLM和pEGFP-N3-BLM能在相应的宿主细胞中正确表达。

AFB1和ZEN对HepG2细胞体外联合毒性效应及机制研究

任亚林, 李耘, 吴静

2018, 34(11): 160-167. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0588

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基于HepG2肝癌细胞,从关键凋亡基因、早期损伤指标及细胞凋亡等方面研究黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）和玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）联合肝毒性效应并探究其可能的作用机制。结果显示,1-10 μg/mL的AFB1和ZEN复合作用于细胞主要表现为协同联合效应,同时随着浓度升高,由弱拮抗效应逐步转变为增毒效应直至强协同效应;早期凋亡指针ROS随暴露时间延长升高,而GSH和MMP水平则呈现逐步下降趋势,同时0-3 h变化最为显著;随时间延长,Bax/Caspase-3表达量的比值升高,CYP1A2、CYP3A4和CYP2A6总体趋势均下调,但随时间延长该趋势更为显著;AFB1和ZEN诱导细胞联合肝毒性通过Bax,Caspase-3以及CYP450等基因互动调控实现。

鲤在低温胁迫下肝胰腺转录组测序分析

刘思嘉, 田菲, 张存芳, 乔志刚, 赵凯

2018, 34(11): 168-178. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0503

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检测低温耐受与低温敏感鲤品种低温胁迫下的差异表达基因,探究鲤低温适应的分子应答过程。低温胁迫后对松浦镜鲤及荷包红鲤肝胰腺进行转录组测序,并对表达差异基因进行功能、通路富集分析。通过差异表达分析,共获得10 521个差异表达基因,其中5 246个基因仅在低温耐受品种发生表达变化。功能、通路富集分析将差异基因显著富集在包括糖酵解/糖质新生代谢途径在内的144个代谢途径。选取5个基因进行qRT-PCR验证,定量结果与RNA-seq结果相关性达0.89。研究结果表明低温胁迫会显著改变鲤肝胰腺的转录活动,编码糖酵解/糖质新生途径的多个关键酶基因在低温耐受品种的表达量显著高于低温敏感品种,推测这些基因功能有助于其长期低温适应。

少棘蜈蚣抗菌肽Scolopin 2-NH2的抗菌作用机制研究

卢佳, 邓秋萍, 任文华

2018, 34(11): 179-190. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0476

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旨在探究抗菌肽Scolopin-2（S-2）及其酰胺化修饰产物Scolopin-2-NH2（S-2-N）的二级结构、抗菌活性及其理化性质,并从细胞水平和分子水平揭示其抗菌作用机制。按最小抑菌浓度测定法检测抗菌肽S-2/S-2-N对4种菌株的抗菌活性;用不同条件处理S-2/S-2-N,测定其理化性质;用圆二色谱仪检测抗菌肽S-2/S-2-N的二级结构;以S-2-N/S-2处理大肠杆菌,用流式细胞仪检测二者穿透细胞膜的效率及菌体细胞膜完整性;通过流式细胞术和RT-PCR技术分析S-2-N/S-2对细菌细胞周期及细胞内DNA复制和修复相关基因的影响。除了具有和母体肽S-2相似的耐热性、耐酸碱性及抵抗离子强度和消化酶的能力,S-2-N还具有更强的抗菌活性;流式细胞仪检测结果显示,短时间内（30 min）二者均能引起一定程度的细胞膜损伤,但抗菌肽S-2-N穿透细胞膜的效率更高;流式细胞术及RT-PCR技术分析结果显示,S-2-N/S-2抑制了大肠杆菌细胞周期的进行,下调了基因dnaA、dnaB、dnaG和SSB的表达,同时促进了RecA和RecN的表达。抗菌肽S-2经酰胺化修饰后,具有比母体肽更强的抗菌活性。二者的抗菌作用机制为：破坏细菌细胞膜,结合细菌DNA和RNA、影响DNA的二级结构,阻滞细菌细胞周期的进行、影响细菌细胞内与DNA复制和修复相关基因的表达。

结核分枝杆菌拟核结合蛋白Lsr2阻遏调控rv1057基因转录的研究

付加芳, 张佩佩, 宗工理, 王新圆, 刘萌, 曹广祥

2018, 34(11): 191-197. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0566

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探讨结核分枝杆菌拟核结合蛋白Lsr2是否是rv1057基因转录的阻遏蛋白。利用凝胶阻滞迁移试验分析Lsr2在体外与rv1057启动子片段的特异性结合能力;通过lacZ报告基因和荧光定量PCR检测rv1057启动子区域的不同突变形式对转录的影响;启动转录的能力;通过蛋白质免疫印迹法检测目标基因rv1057的表达。统计学处理采用t检验。Lsr2结合rv1057启动子;Lsr2与已知的阻遏蛋白TrcR都能结合rv1057启动子;缺失Lsr2结合位点的rv1057启动子能够在结核分枝杆菌生长周期中持续启动rv1057基因的转录;野生型菌株H37Rv生长早期（24 h）lsr2基因转录水平较低,而在H37Rv生长中期（48 h）、后期（120 h）lsr2基因的相对表达量变化倍数显著提高,差异具有统计学意义（t值分别为24.44、16.86,P<0.05）;H37Rv菌株和lsr2基因缺失菌株中trcR基因在生长早期（24 h）的相对表达量显著高于生长中期（48 h）、生长后期（120 h）的trcR表达量,差异具有统计学意义（t值分别为6.79、10.16,P<0.05）。Lsr2是rv1057基因转录的阻遏蛋白,Lsr2和TrcR均可调控rv1057 基因的表达。Lsr2在结核分枝杆菌生长周期的中后期大量表达并阻遏rv1057的转录,TrcR则在结核分枝杆菌生长周期的早期阻遏rv1057的转录。

响应面法优化蛹虫草蛋白超声波辅助提取工艺及其营养评价

侯若琳, 刘鑫, 项凯凯, 陈磊, 郑明锋, 傅俊生

2018, 34(11): 198-204. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0516

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以蛹虫草为材料,采用响应面分析法对蛹虫草蛋白超声波辅助提取工艺参数进行优化,并对所提取蛹虫草蛋白氨基酸组成与营养价值进行分析。蛹虫草蛋白超声波辅助提取的最优条件为：料液比1∶50、pH=8.57,150 W功率下超声30 min,然后关闭超声波,置于35℃条件下继续搅拌提取72 min,此条件下蛋白质提取率达到85.6%,是不超声对照组蛋白提取率的1.68倍,与模型预测值相对误差为±0.77%。在最优工艺条件下所提取的蛹虫草蛋白含必需氨基酸占总氨基酸的比值为44.4%,必需氨基酸与非必需氨基酸的比值为79.84%,均大于世界粮食与农业组织和世界卫生组织的推荐值,表明所提蛹虫草蛋白质具有较高的营养价值,为蛹虫草蛋白的高效提取及蛹虫草的保健食品开发提供了参考。

猪PEDV与PDC_oV二重RT-PCR检测方法的建立

孔维欢, 王晶晶, 万鹏程, 石国庆

2018, 34(11): 205-209. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0365

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旨在建立能同时检测出猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）和猪丁型冠状病毒（Porcine delta corona virus,PDC_OV）的二重RT-PCR检测方法。根据GenBank已收录发表的PEDV和PDC_OV基因序列设计2对特异性引物,首先运用RT-PCR反应技术,通过PEDV和PDC_OV病毒的目的基因的单项扩增,对反应条件进行优化。然后通过特异性试验、敏感性试验以及临床样品的检测验证确定二重RT-PCR方法的建立。结果显示,目的基因PEDV-M扩增的片段大小是750 bp,PDC_OV-N扩增的片段大小是372 bp;能够同时检测出PEDV和PDC_OV目的基因,却检测不到PRV、CSFV、PPV三种病毒;体系优化扩增PEDV-PDC_OV混合核酸浓度下限为100 pg/μL;能够初步诊断出临床疑似病毒感染的病例。结果表明,成功的建立PEDV-PDC_OV二重RT-PCR检测方法,此方法敏感性高、特异性强,是一种能够快速有效的检测出猪PEDV-PDC_OV单病毒感染或多病毒混合感染的临床诊断方法。

1株产生洛伐他汀杂色曲霉的筛选、鉴定和发酵优化条件

许楚旋, 王嘉琦, 蒋冬花

2018, 34(11): 210-215. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0453

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从不同生境收集的自然发酵样品中分离纯化获86株曲霉纯菌株;用薄层层析法（TLC）和高效液相色谱法（HPLC）测定曲霉各菌株发酵液中洛伐他汀（Lovastatin）含量进行筛选;获1株较高产Lovastatin的编号为A-8曲霉菌株,产量为58 g/L。根据形态特征和ITS基因序列,鉴定A-8菌株为杂色曲霉。单因素实验初步优化了A-8曲霉菌株发酵条件和培养基配方,结果表明A-8菌株产生Lovastatin较适宜的发酵条件为：温度28℃、初始pH 5.2、摇床转速180 r/min、接种量为10%;培养基配方为：乳糖为碳源、含量为100 g/L,蛋白胨为氮源、含量为12 g/L,碳源/氮源为15∶1.5;在该条件下A-8曲霉菌株发酵产生Lovastatin的水平最高,可达130.04 μg/mL,比优化前提高了约2.24倍。A-8曲霉菌株是较有潜力的工业菌株。

抗CD52单克隆抗体HPLC-肽图分析方法的建立

乔玉玲, 黄铮, 秦海艳, 宋兰兰, 陈继军, 安晨, 叶星, 毛晓燕

2018, 34(11): 216-222. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0424

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建立高效液相色谱（HPLC）-肽图分析方法,用于抗人CD52单克隆抗体的专属性鉴别。抗CD52单抗样品经盐酸胍变性、DTT还原,释放出的游离半胱氨酸残基进行烷基化。超滤置换酶切缓冲液后进行胰蛋白酶酶切并终止。色谱条件：采用Eclipse XDB-C18 4.6×250 mm 5 μm（Aglient）色谱柱,0.1%TFA水溶液与0.1%TFA乙腈溶液为流动相,梯度洗脱,检测波长为214 nm,柱温为30℃;质谱条件：分析时长135 min;检测方式正离子,TOF;MS+扫描范围350-1 500 Da;Product Ion+扫描范围100-1 500 Da;质谱分辨率40 000;Exceeds,150 Cps。CD52单抗重链CDR1、CDR3、轻链CDR1对应肽段由质谱鉴定出。HPLC-肽图方法专属性验证显示辅料制剂及异种抗体对检测结果无干扰;精密度验证结果显示目标峰的峰面积RSD%均在1.7%-7.6%之间。且目标峰的保留时间RSD%均在0.1%-0.2%之间,小于5%的可接受标准;耐用性结果显示,3 μg胰蛋白酶、37℃和18 h的酶切条件是最合适的样品处理条件。基于CDR相关肽段鉴别的HPLC-肽图分析方法可定性鉴定出抗CD52单抗,方法学验证结果显示该方法适用于抗人CD52单抗的专属性鉴别并可用于质量控制及批检验放行。

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2018, 34(11): 300-300.

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