生物技术通报

植物长链非编码RNA研究进展

谭玉荣, 王丹, 高璇, 刘进平

2018, 34(10): 1-10. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0167

摘要 ( 335 )

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长链非编码RNA（Long noncoding RNAs,lncRNAs）指长度大于200个核苷酸,但含有1个少于100个氨基酸开放阅读框（Open reading frame,ORF）的RNA。根据lncRNAs相对于邻近蛋白质编码基因的位置可粗略地分为长链非编码自然反义转录本（Long noncoding natural antisense transcripts,lincNATs）、内含子lncRNAs（Intronic lncRNAs）、启动子lncRNAs（Promoter lncRNAs）和长链基因间ncRNAs（Long intergenic ncRNAs,lincRNAs）。lncRNAs可作为与其互作分子的招募者、系结者、引导者、诱捕者和信号分子,通过表观遗传调控、转录调控、转录后调控和翻译调控而发挥其功能。现有的研究表明,lncRNAs在植物春化作用诱导开花、固氮豆科植物根瘤的形成、花粉发育和雄性不育、光形态建成、Pi吸收、侧根发育、生长素运输和发育信号输出、抗病性、非生物胁迫反应等方面具有调控功能。对lncRNAs的研究不仅为理解植物生长发育调控具有重要意义,也可将ncRNAs作为作物品种改良的潜在工具。近年来,植物lncRNAs研究突飞猛进,对长链非编码RNA的分类、鉴定和研究、分子作用机制及其功能进行全面综述,旨在为给研究者提供参考。

淡紫拟青霉次级代谢产物的研究进展

郝泽婷, 郝晓慧, 阎婧, 谢丙炎, 梁丽琴

2018, 34(10): 11-17. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0049

摘要 ( 459 )

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淡紫拟青霉是子囊菌门、肉座菌目、蛇形虫草科、Purpureocillium属的一种丝状真菌。它是一种广谱性很强的生防菌,不仅对植物寄生线虫、蚜虫、红蜘蛛、温室粉虱和切叶蚁等有很好的防治作用,而且对多种植物病原真菌、细菌乃至病毒也有抑制作用。淡紫拟青霉分泌的几丁质酶与丝氨酸蛋白酶能够降解线虫表皮的蛋白质和几丁质组成成分,利于侵入并破坏细胞成分;也能内生于植物,产生效应物对其它真菌产生拮抗作用;也能定殖于植物根际,产生次级代谢产物,对真菌、线虫等产生抑杀作用。目前对淡紫拟青霉次级代谢产物的研究主要有非核糖体肽类、生物碱及聚酮化合物等的合成调控、活性作用和分子结构确定。淡紫拟青霉所产的非核糖体肽类化合物有白灰制菌素A和B,生物碱有拟青霉酰胺,聚酮化合物有Acremoxanthone C和Acremonidin A。综述了淡紫拟青霉次级代谢产物的研究进展,讨论了淡紫拟青霉次级代谢产物的研究意义,最后展望了淡紫拟青霉的研究前景,以期为相关研究者了解淡紫拟青霉提供参考。

奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌耐药性研究进展

赵艳坤, 刘慧敏, 王帅, 蔡建星, 王成, 陈贺

2018, 34(10): 18-25. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0317

摘要 ( 310 )

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金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）是奶牛乳房炎（Bovine mastitis）最主要致病菌之一。抗菌药物在奶牛乳房炎治疗中的作用无可替代,但随着严重依赖甚至过度使用抗菌药物,S.aureus耐药性等问题日益凸显,我国现阶段尤为严重。近年来,耐药菌株、耐药谱逐渐变宽,耐药水平不断提高,使其耐药性越来越强,耐药机制变得复杂,耐药基因种类繁多,导致乳房炎源S.aureus广谱耐药性和多重耐药性现象已经十分严重,甚至出现超级耐药细菌-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA）,为奶牛乳房炎治疗带来极大困难。S.aureus耐药性不仅对奶牛养殖业和乳房炎防治造成影响,同时直接或间接威胁人类健康。因此,监测S.aureus耐药性及变迁情况,探明其具体耐药机制是解决问题的关键。目前,S.aureus可通过产生修饰酶、改变抗菌药物的作用靶点、降低细胞壁的通透性等不同作用机制,对β-内酰胺类、氨基糖胺类、四环素类、大环内酯类、林可胺类和喹诺酮类等抗菌药物产生不同程度的耐药,但基因编码的分子耐药机制尚未明确。综述了奶牛乳房炎中S. aureus耐药性及其分子耐药机制,讨论了明确S .aureu耐药机制的意义及存在的问题,以期为奶牛乳房炎临床合理用药及有效防治提供思路和依据。

微生物降解石油污染物机制研究进展

华涛, 李胜男, 邸志珲, 周博, 曾文炉, 周启星, 李凤祥

2018, 34(10): 26-34. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0156

摘要 ( 532 )

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石油污染是当前紧迫的水环境问题,研究石油污染物降解机制有助于探索石油污染修复技术路径。重点介绍了微生物降解石油污染物过程中的微生物种类、降解机制和反应机理,即具有代表性的细菌、真菌和藻类,石油烃的有氧降解（链烷烃、环烷烃和芳香烃）和厌氧降解（脱氢羟基化、延胡索酸盐加成）。并对微生物降解石油组分的影响因素进行了讨论,具体包括：烃类结构（支链多结构越复杂,越难降解）、微生物种类（混合菌的生化降解能力更强）、环境因子（pH、温度、盐度、含氧量和营养物质）,进一步指出了生物修复技术应用于石油污染修复治理研究中的优缺点。此外,还对现有微生物降解技术的应用做了简要概述,归纳总结现有研究中存在的问题,尝试性的提出了今后生物降解石油污染物的研究重点,即生物降解石油的机制还需进一步明确,并重点分析了生物电化学方法在降解去除石油污染物方面可行性。综述石油烃生物降解机制和反应机理,以期为生物修复水体石油污染提供参考和借鉴作用。

细菌素及其潜在新应用的研究进展

毛雯, 田露, 龚国利

2018, 34(10): 35-40. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0354

摘要 ( 392 )

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细菌素是一种由微生物核糖体合成的抗菌肽,一般作为食品防腐剂使用。近年来,科学家挑选少数的细菌素进行深入的研究,开辟了细菌素新的研究领域,并拓宽了其应用范围。随着遗传学和纳米技术的快速发展,细菌素极有可能发展成为下一代新型抗生素、新型载体分子,肿瘤治疗的药物等。同时,科学家发现一些细菌素具有调节群体感应的功能,这一发现表明细菌素具有应用到新领域的可能。目前,革兰氏阴性菌产生的细菌素主要用于细菌素翻译修饰研究,而革兰氏阳性菌（主要是乳酸菌）产生的细菌素主要进行细菌素应用方面的研究。当前,细菌素的应用正从食品领域扩展至人类健康方面。综述了细菌素的功能及其作用效果,并且详细描述了其从食品领域到人类健康方面的应用,表明了细菌素的重要性,旨在为进一步研究细菌素在食品防腐、人类疾病防治和生物防治等领域奠定基础。

高粱组织培养技术研究进展

彭祥, 张德春

2018, 34(10): 41-48. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0235

摘要 ( 408 )

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高粱是全球第五大谷类作物,是食品、饲料和加工业的原料,也是一种潜在的能源作物,具有重要的应用价值。然而,通过基因工程技术对高粱进行遗传改良却十分困难,其主要原因是缺乏高效的组织培养体系。结合近年来的研究,从基因型、外植体、培养基、植物激素等影响高粱组织培养的主要因素进行综述,重点讨论了促进高粱再生的策略,并提出解决高粱组培再生困难的两大研究方向：一是深入研究植物再生的遗传及表观遗传机制;二是根据各基因型的代谢特点,进一步优化培养条件,旨为建立高效的高粱组织培养体系提供参考。

分子倒置探针技术的研究进展及应用

罗志梅, 张永彪, 鄢纯, 韩圆圆, 呼锐, 刘继强

2018, 34(10): 49-57. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0367

摘要 ( 514 )

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分子倒置探针技术是一项新发展起来的用于目标序列捕获的分子生物学技术,该技术通过设计特异的探针对已知的特定目的基因组序列进行捕获,将目标序列DNA富集后再利用芯片杂交或测序进行检测。此技术有助于研究人员对大样本中的基因组重要区域进行研究,避免了全基因组研究费用高、分析困难等问题。并且,分子倒置探针技术弥补了杂交捕获技术、PCR捕获技术等分子捕获手段的不足,为动植物及病原菌重要DNA片段的研究提供强有力的技术支持。目前,分子倒置探针技术广泛应用于单核苷酸多态性（SNP）分型、外显子测序、拷贝数变异、杂合性丢失、体细胞突变、DNA甲基化和可变剪接等方面的研究。由于其特异性强、重复性好、操作简单、费用低廉,并对DNA完整度要求不高,适用于福尔马林石蜡包埋样本分析等特点,分子倒置探针技术的应用越来越广泛。然而,分子倒置探针技术在探针设计及数据分析软件研发等方面仍存在一些不足,还需要进一步的优化完善。为促进相关领域学者全面了解该技术,综述了分子倒置探针技术的基本原理、发展历程、技术特点及在疾病研究领域的应用,讨论了分子倒置探针技术的价值及存在的问题。

藻类诱变育种技术研究进展

付峰, 隋正红, 孙利芹, 毕璐萍, 丁丽君, 陈奇

2018, 34(10): 58-63. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0094

摘要 ( 431 )

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藻类诱变育种技术是指利用物理和化学因素诱发藻体产生遗传变异,在短时期内获得有价值的突变体的育种方法。藻类是水生生态系统中主要的初级生产者,与人类生活及经济发展有着密切的关系,是发展“蓝色农业”的基础。诱变育种已经成为提高藻类育种效率,获得新种质的一个重要手段,广泛应用在生物活性物质含量高的微藻、生物能源微藻及一些大型的经济海藻中。在藻类育种中常用的诱变技术主要包括物理和化学诱变技术。物理诱变辐射源包括紫外线、γ射线、重离子束及常压室温等离子体等,化学诱变剂主要包括甲基磺酸乙酯和亚硝基胍等。主要介绍了上述诱变技术的诱变机理和生物学效应,总结了诱变技术在藻类育种中的研究进展及应用前景,以期推动藻类诱变育种的发展。

环介导等温扩增技术作为基因快速诊断方法的研究与展望

袁向芬, 吕继洲, 吴绍强, 王巧黎, 赵宏

2018, 34(10): 64-70. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0412

摘要 ( 355 )

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环介导等温扩增技术（LAMP）是一种新型分子诊断技术,具有灵敏度高、反应快速等优点,且仅利用简单的恒温水浴设备即可实现对特异性靶基因的高效扩增,在分子诊断领域具有巨大潜力。近几年来LAMP技术在分子诊断领域的研究非常广泛,涉及细菌、病毒、寄生虫的检测及食品转基因成分检验等诸多方面,受到越来越多学者认可,有研究者认为其可作为PCR的替补技术应用于临床基因诊断工作中。然而由于目前该技术缺乏规范化且成熟配套的上下游技术措施,如快速简单的核酸抽提技术、完善的应用体系和方案、防止交叉污染的有效措施及小型便携的检测设备等,因此在现场即时诊断领域的推广应用较为缓慢。为发挥利用LAMP技术在快速基因诊断方面的优越性,科研人员针对LAMP技术开发应用存在的问题开展了大量研究工作。立足于临床基因快速诊断的技术需求,对影响LAMP技术应用的核酸物质的快速抽提、LAMP检测体系的优化完善、结果判定、假阳性结果的规避、结果确诊及现场诊断一体化平台设计应用等领域的发展现状、需要攻克的难点及未来的应用展望进行综述,以期为未来的研究和开发指明方向,促进LAMP技术的不断完善及临床推广应用。

环化荧光蛋白生物探针荧光寿命成像研究进展

周加胜, 王鹏, 周黄梅, 许金铭, 张三军

2018, 34(10): 71-80. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0212

摘要 ( 373 )

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环化荧光蛋白探针作为一种新型的基因编码生物探针,是由荧光蛋白和对探测物有特异性响应的结合域蛋白构成的。由于其独特的构造方式使其在对探测物检测时具有较高的灵敏度和较大的动态范围,引起了越来越多科学家的兴趣,已发展成为监测生命活动的一种强有力工具。目前越来越多基于环化荧光蛋白技术开发的生物探针被广泛的应用于生物成像、药物筛选、细胞代谢物检测等领域,并发挥出了越来越大的作用。但是,这类探针目前仍然存在着开发工作量大,部分发光强度较弱及测量方法受限等问题,解决这些问题还需要科学家们不断的努力。对环化荧光蛋白生物探针进行综述,主要介绍了环化荧光蛋白生物探针的设计方法,已有探针的种类和基本性质,现阶段的发展状况以及存在的问题。另外,介绍了多种检测方法在环化荧光蛋白生物探针上面的使用,特别是近期出现的荧光寿命成像技术在其应用上的进展,比较了这些检测方法的优劣,旨在从多方面阐述环化荧光蛋白生物探针的发展现状,以便能给相关研究者提供一些参考和启发。

一种快速检测岷江百合总RNA样本中基因组DNA残留的方法

杜文凯, 袁素霞, 胡凤荣

2018, 34(10): 81-86. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0364

摘要 ( 241 )

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总RNA样本中残留基因组DNA会严重影响qRT-PCR的准确性。为了检测RNA样本中的DNA残留,依据持家基因TIP41-like的部分内含子序列设计了1对基因组DNA残留检测引物：LDRG-F：5'-CTCTTTTATGACGAGGTTGGTA-3'及LDRG-R：5'-CAGGGAAATCGGTCAGTGTT-3'。利用这对引物对3种不同RNA提取试剂盒提取的总RNA样本以及2种不同第1链cDNA合成试剂盒合成的cDNA样本进行PCR扩增检测,能高效快速地检测岷江百合总RNA以及cDNA样本中有无基因组DNA残留。

抗艰难梭菌毒素纳米抗体在乳酸乳球菌中重组表达及其功能分析

武国松, 李杉

2018, 34(10): 87-91. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0287

摘要 ( 312 )

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本研究旨在构建表达抗艰难梭菌毒素的纳米抗体重组乳酸乳球菌。所述的抗体为免疫羊驼后从外周血中分离的天然缺失轻链的纳米抗体（分别命名为E3、AA6）。构建重组质粒pNZ8148- E3-AA6,转化乳酸乳球菌NZ9000后诱导表达,SDS-PAGE及Western blot检测到32 kD的目的蛋白。利用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白E3-AA6,BCA试剂盒测定其浓度。通过细胞变圆实验以及CCK8实验鉴定其功能,E3-AA6能够抑制艰难梭菌毒素TcdB的毒性。本实验成功构建了重组表达载体pNZ8148- E3-AA6,通过NICE系统实现了二价抗体的表达,为治疗艰难梭菌引发的感染提供了新的治疗途径。

代谢工程法强化恶臭假单胞菌利用木质素积累PHA的能力

高庆龙, 陈升宝, 田文佳, 张学铭, 马玉超

2018, 34(10): 92-99. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0244

摘要 ( 355 )

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采用代谢工程方法强化恶臭假单胞菌利用木质素积累PHA的能力,为提高木质素转化效率和PHA的高效、低成本生产提供研究思路和技术基础。将PHA解旋酶编码基因phaZ的上下游片段插入pK18mobsacB,构建了敲除载体pK18PHAC1C2;将来源于R. jostii RHA1的过氧化物酶编码基因dypB插入pVLT33,构建了表达载体pVLTpelBDYPB。以P. putida QSR1为出发菌株,利用同源重组的方法敲除了木质素解旋酶编码基因phaZ;进而通过异源表达的方法在该突变株中引入过氧化物酶DyPB;分析各基因修饰菌株的生长情况和PHA积累量。成功构建了phaZ基因缺失突变株P. putidaQSRZ6和DyPB表达菌株P. putida QSRZ6B。在限制氮源的情况下,以葡萄糖为碳源培养48 h,与出发菌株QSR1相比,QSRZ6的生长量和PHA积累量分别提高了29%和80%。在以木质素为碳源积累PHA的过程中,与QSR1相比,QSRZ6的生长量和PHA积累量分别提高了48%和182%;与QSRZ6和QSR1相比,QSRZ6B的PHA积累量分别提高了13%和218%,达到了140 mg/L。phaZ基因的缺失和异源表达过氧化物酶使菌株利用木质素积累PHA的能力得到增强,表明代谢工程是一种有效的调控木质素转化和PHA积累的有效方法。

甜高粱作为反刍动物饲料的最佳收获期的研究

王楠, 陈诚轩, 谢鹏, 李晓, 李超, 唐三元, 谢旗

2018, 34(10): 100-107. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0679

摘要 ( 424 )

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甜高粱作为一种新兴的青贮饲料在世界范围内正在规模性推广。为了探究品种和收获期对甜高粱生物量和品质的影响,我们测定了甜高粱品种（Keller、ST008和H310）、高丹草（A60）和糖粒两用高粱（E048）在不同生育时期的全株生物量及各种营养成分的含量,并进行比较分析。结果表明：甜高粱在整个生育时期的生物量和营养成分不断发生变化,全株干物质、糖锤度和无氮浸出物含量呈逐渐上升的趋势;粗蛋白含量、粗脂肪含量、粗灰分含量和纤维素含量等营养成分含量呈逐渐下降趋势。甜高粱（Keller、ST008和H310）的干物质、糖锤度和无氮浸出物高于糖粒两用高粱（E048）和高丹草（A60）;高丹草（A60）的粗蛋白含量、纤维素含量、半纤维素的含量、酸性洗涤纤维含量高于甜高粱（Keller、ST008、H310）和糖粒两用高粱（E048）。甜高粱H310的生物量、粗蛋白、粗灰分和粗脂肪含量显著高于玉米青贮301和玉米青饲2号。综合各因素,甜高粱在拔节期到乳熟期这段时间生物量高、品质好,为最佳收获期。另外可以得出,甜高粱可以作为优质的青贮饲料部分替代青贮玉米,与青贮玉米混合喂饲牛/羊。

野大豆多功能根际促生菌的筛选鉴定和促生效果研究

郭英, 杨萍, 张丹雨, 刘莹莹, 马莲菊, 卜宁

2018, 34(10): 108-115. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0437

摘要 ( 426 )

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为获得野大豆根际促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria,PGPR）并明确其促生特性,采用选择培养方法从沈阳沈北新区蒲河沿岸生长的野大豆根瘤及根际土壤中分离筛选固氮菌与解磷菌,进行形态学、生理生化指标和16S rDNA分子生物学鉴定。采用Touch-Up PCR（上升PCR）的方法扩增固氮酶nifH结构基因,对菌株的解磷、分泌3-吲哚乙酸（IAA）的能力及ACC脱氨酶的活性进行测定分析,筛选出优良菌株进行盆栽大豆的促生作用研究。结果得到12株野大豆PGPR 菌,经鉴定分别归属于芽孢杆菌属（Bacillus）、伯克霍尔德菌属（Burkholderia）、根瘤菌属（Rhizobium）、詹森氏菌属（Janthinobacterium）、鞘氨醇单胞菌（Phingomonas）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、假单胞菌属（Pseudomonas）和根癌农杆菌属（Agrobacterium）;其中 2株可解有机磷,11株可解无机磷,3株具分泌IAA能力,5株具ACC脱氨酶活性。盆栽试验表明：3株菌（GD11、GD17、GD58）可使大豆幼苗株高增长,5株菌（GD9、GD11、GD17、GD30、GD58）可使根长增长;6株菌可提高大豆幼苗的茎干重、叶干重、根干重。野大豆根瘤和根际土壤含有多功能根际促生菌,其在农业生产上具有潜在的应用价值。

马铃薯疮痂病拮抗菌的筛选鉴定及防治效果初探

李玉聪, 李滨影, 油心怡, 刘宇豪, 周波, 林榕姗

2018, 34(10): 116-121. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0417

摘要 ( 395 )

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马铃薯疮痂病是马铃薯的主要病害之一,利用生物手段进行防治正逐渐引起人们的重视。为得到对马铃薯疮痂病病原菌具有较强拮抗作用的优良菌株,以病原菌Streptomyces bottropensis AMCC400023为靶标菌株,从山东省高密市马铃薯种植地采集的土壤中分离得到拮抗菌株,并采用平板对峙生长法和牛津杯试验法进行初筛和复筛,得到了1株具有较强拮抗作用的菌种1-3-4,其抑菌圈直径达19.74 mm,且其在盆栽试验中防治效果约为40.27%与48.66%。根据菌株1-3-4的16S rDNA序列分析结果,结合其培养形态特征和生理生化特性,将其鉴定为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）。盆栽防效测定试验结果显示,菌株1-3-4对于马铃薯疮痂病具有较好的防治作用,具有良好的应用前景。

冬凌草毛状根的优化培养及其提取物的肿瘤细胞增殖抑制活性检测

陈婉琪, 张鸿, 王进峰, 陈俊杰, 林晓文, 罗结华, 许源, 陈艳芳, 陆幸妍

2018, 34(10): 122-128. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0207

摘要 ( 283 )

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探究并建立冬凌草毛状根的优化培养方案并检测其提取物的抗肿瘤活性。用发根农杆菌ATCC11325及ATCC15834诱导冬凌草外植体生成毛状根,并探究培养基种类、蔗糖浓度等条件对冬凌草毛状根生长的影响,测定其生长曲线;超声法制备毛状根粗提物,大孔吸附树脂进一步纯化粗提物获得提取物,用高效液相色谱法检测冬凌草甲素含量;提取物配制成不同浓度试液作用于癌细胞株BEL-7402、A-549、SGC-7901和HGC,用CCK-8法测定细胞存活率。仅ATCC15834可诱导冬凌草从叶柄和茎部切口处长出不定根,叶片外植体未见不定根萌发,不定根遗传鉴定符合毛状根特征。毛状根在含3%蔗糖B5培养基中增殖率最高,其生长曲线近似“S”型,25 d达到对数中期,70 d达到平台期,其冬凌草甲素含量分别为0.0171%、0.0022%。当毛状根提取物含量为1 mg/mL时,对四种癌细胞生长的抑制率均达95%以上。以ATCC15834侵染冬凌草叶柄和茎部外植体诱导出的冬凌草毛状根提取物在含3%蔗糖的B5培养基中摇瓶培养25 d再继代培养70 d得率最高;冬凌草毛状根提取物中含有冬凌草甲素,且能有效抑制体外培养肿瘤细胞生长。

中华大蟾蜍EDF-1重组蛋白的原核表达、纯化及抗血清的制备

刘怡君, 贾宇坤, 王玲芳, 刘虹杏, 杨仙玉

2018, 34(10): 129-134. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0291

摘要 ( 308 )

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通过实验获得中华大蟾蜍（Bufo gargarizans）内皮分化相关因子-1（Endothelial differentiation related factor-1,EDF-1）重组蛋白及高效价抗血清。在前期研究工作中已克隆中华大蟾蜍EDF-1的开放阅读框（Open reading frame,ORF）（GenBank登录号K F769459）,但因密码子的偏好性使中华大蟾蜍原有密码子在原核细胞中发生识别困难,重组蛋白原核表达未能成功。本文对中华大蟾蜍的EDF-1的ORF进行密码子优化,委托公司合成并插入原核表达载体,构建重组质粒pET-28b-EDF-1-Bufo。将重组质粒转入大肠杆菌（E. coli）感受态细胞BL21（DE3）,使用IPTG诱导重组蛋白表达,钴胶纯化重组蛋白,纯化的重组蛋白免疫小鼠制备鼠抗重组中华大蟾蜍EDF-1的抗血清,然后通过Western-blot和ELISA检测抗血清的特异性及其效价。重组中华大蟾蜍EDF-1得到良好表达,抗血清特异性良好,效价为1∶8 000。为进一步研究EDF-1的生物学功能奠定基础,同时为研发抑制内皮细胞分化相关的抗肿瘤药物提供重要参考。

三疣梭子蟹C型溶菌酶在毕赤酵母中的表达及其抑菌活性

王强厚, 陶妍, 崔旭, 颜倩倩, 张亚莉

2018, 34(10): 135-142. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0241

摘要 ( 289 )

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C型溶菌酶是存在于各种生物组织中的重要的先天性免疫蛋白,是开发天然抑菌剂的良好候选者。以甲壳类动物三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）C型溶菌酶成熟肽为研究对象,首先通过RT-PCR克隆其编码基因“ptlyC”;以pPICZαA为表达载体,构建重组表达载体pPICZαA-ptlyC,电转至毕赤酵母（Pichia pastoris）X-33后,通过高浓度的博来霉素筛选到高拷贝酵母转化子;在28℃、250 r/min和pH6.0的条件下,经1%的甲醇诱导表达72 h,得到含重组ptlyC的培养液上清;经固化金属离子亲和层析（IMAC）纯化,得到分子量约为25.3 kD的纯化产物。通过菌落计数法证明含重组ptlyC的培养液上清具有抑制革兰氏阳性的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的活性;通过琼脂糖凝胶扩散法证明纯化的重组ptlyC具有抑制革兰氏阴性的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和沙门氏菌（Salmonella lignieres）的活性。

新疆阿勒泰冷水鱼屎肠球菌耐药性及耐药机理研究

肖何, 张艳, 王永瑞, 倪永清

2018, 34(10): 143-149. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0339

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对分离自新疆阿勒泰冷水鱼的屎肠球菌进行耐药性、耐药基因和毒力因子分析从而对冷水鱼的安全性进行评估。采用纸片法检测屎肠球菌对12种抗生素的敏感性及PCR检测相关耐药基因、毒力因子分布。13株分离自冷水鱼肠道的屎肠球菌对12种抗生素均未表现出耐药性,但是有11株对环丙沙星表现中介（中度敏感）,2株对链霉素表现中介（中度敏感）。13株屎肠球菌都携带环丙沙星耐药基因gyrA,其中有2株同时携带环丙沙星耐药基因parC。13株屎肠球菌中有1株菌携带四环素耐药基因tetK基因,1株菌仅携带tetL基因,4株同时携带tetM和tetL基因。13株屎肠球菌对毒力因子的检测结果均呈阴性。新疆冷水鱼肠道屎肠球菌的耐药及毒力因子的分析显示冷水鱼的消费对消费者并无安全隐患。

重组中东呼吸综合征病毒刺突蛋白S1亚基及其编码DNA接种小鼠的抗血清水平研究

张倩倩, 刘康泰, 韩宗晟, 李荣贵

2018, 34(10): 150-156. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0273

摘要 ( 257 )

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人工合成了大小为2 253 bp刺突蛋白的S1亚基的基因片段,构建了含有中东呼吸综合征冠状病毒刺突蛋白S1亚单位（MERS-Co V S1）编码基因的重组表达质粒Peak13CD5LS1TEVhIgGFc,转染重组质粒至HEK293E细胞后,筛选出了可稳定表达重组融合蛋白的阳性克隆细胞株,进行了刺突蛋白亚单位融合蛋白（S1-Fc）的重组表达和纯化,获得了大小约为122 kD的重组S1-Fc融合蛋白,Western blotting验证重组蛋白为目的蛋白;将重组质粒Peak13CD5LS1TEVhIgGFc、重组S1-Fc融合蛋白以及Peak13CD5LS1TEVhIgGFc联合S1-Fc融合蛋白分别接种小鼠,以纯化的重组S1-Fc融合蛋白作为抗原,利用Western blotting及ELISA分别检测了小鼠的抗S1血清滴度及特异性。结果发现,3种方法接种的小鼠中均存在特异性抗S1血清。其中,接种重组S1-Fc融合蛋白和接种S1-Fc融合蛋白联合重组质粒的小鼠在首次接种就产生高滴度抗S1血清,而只接种重组质粒的小鼠在3次接种后才产生了特异性抗S1血清。两种含重组S1-Fc融合蛋白的接种方法诱导小鼠产生的抗S1血清滴度基本一致,均显著高于仅接种重组质粒的小鼠的抗S1血清,证明短期内重组S1-Fc蛋白接种更快速高效。

一株黄色杆菌的分离鉴定及对邻苯二甲酸酯的降解研究

王嘉翼, 樊双虎, 任超, 王俊欢, 杨婷, 贾阳, 李先军, 闫艳春

2018, 34(10): 157-164. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0393

摘要 ( 346 )

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邻苯二甲酸酯（PAEs）是环境中普遍存在的有机污染物,具有环境雌激素效应,对人体健康和生态安全造成严重威胁。菌株YC-JY1分离自受石油长期污染的土壤中,可以利用邻苯二甲酸二丁酯（DBP）作为唯一的碳源进行生长;经16S rDNA 鉴定,确定其属于黄色杆菌属（Xanthobactersp.）。菌株YC-JY1降解DBP的最适条件为30℃,pH 7.0,无NaCl添加;在此条件下,100 mg/L DBP 在5 d内能被完全降解。随着DBP浓度的升高,菌株YC-JY1在5 d内对200 mg/L - 400 mg/L DBP的降解率在94%以上;通过底物谱实验发现,菌株YC-JY1对其它邻苯二甲酸酯具有广泛的利用能力,其中邻苯二甲酸二戊酯（DPeP）,邻苯二甲酸二己酯（DHP）的降解率均在90%以上;通过高效液相色谱-质谱联用确定DBP中间代谢产物为邻苯二甲酸单丁酯（MBP）,邻苯二甲酸（PA）。由此推断,在菌株YC-JY1的作用下,DBP的起始代谢途径为DBP首先水解为MBP,继而水解为PA。

橡胶树胶孢炭疽菌NADPH氧化酶功能研究

郭云峰, 安邦

2018, 34(10): 165-171. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0344

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由病原真菌胶孢炭疽菌引起的炭疽病害是造成海南省橡胶减产的主要原因之一。研究橡胶树胶孢炭疽菌致病力的分子机制能为其病害防治提供理论依据。采用同源重组原理、运用原生质体转化法构建了橡胶树胶孢炭疽菌NADPH氧化酶编码基因的敲除突变株,并对其生长发育及致病力等生理表型进行分析。结果表明,在橡胶树胶孢炭疽菌中,存在3个编码NADPH氧化酶的基因CgNoxA、CgNoxB、CgNoxC,以及一个编码NADPH氧化酶调节蛋白的基因CgNoxR。PCR分析表明成功构建了这4个基因的敲除突变株。与野生型菌株相比,这4个敲除突变株的产孢能力、致病力均有不同程度的变化。其中CgNoxA敲除突变株的产孢能力严重受损;CgNoxR敲除突变株的孢子萌发过程明显异常;CgNoxB敲除突变株对橡胶树叶片的致病力显著下降。染色观察表明,CgNoxA和CgNoxB参与调控胶孢炭疽菌菌丝中超氧阴离子代谢过程。上述结果表明,NADPH氧化酶在调控胶孢炭疽菌的孢子萌发及致病力过程中起着重要作用。

来源于嗜热真菌Talaromyces leycettanus JCM12802 的类膨胀素基因鉴定及功能探究

顾源, 寻子琦, 郑菲, 涂涛, 姚斌, 罗会颖

2018, 34(10): 172-181. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0234

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挖掘新颖的类膨胀素基因,丰富类膨胀素基因资源,探究其功能,加深我们对类膨胀素及其作用机制的认识,促进其工业应用。通过RT-PCR的方法从嗜热真菌Talaromyces leycettanus JCM12802中克隆得到了一个1 196 bp的类膨胀素基因Tlexlx1,并与大多数真菌来源的膨胀素相比,TlEXLX1缺少一个N端的CBM结构域。TlEXLX1与来源于Penicilliopsis zonata的假定蛋白ASPZODRAFT_140583具有最高的序列相似性81%,与Penicillium digitatum Pd1 来源的Expansin-like protein 1相似性为56%。同时构建野生型TlEXLX1和含有 TlSWO1的N端CBM区的突变型CBM-TlEXLX1重组质粒并在毕赤酵母中表达纯化,并对其基本性质进行分析。该基因含有1个内含子（83 bp）,编码370个氨基酸和一个终止密码子。TlEXLX1推导氨基酸序列包括一个22个氨基酸的N端信号肽序列,一个类GH45结构域和一个类膨胀素结构域。结果表明,重组蛋白TlEXLX1和融合蛋白CBM-TlEXLX1具有较高的葡聚糖酶活性（地衣多糖：7.2 U/mg和17.2 U/mg;大麦葡聚糖：4.4 U/mg和9.4 U/mg）和微弱的微晶纤维素水解活性。以地衣多糖为底物时,二者的最适作用温度和pH一致（60℃和6.0）。TlEXLX1可以破坏微晶纤维素整齐光滑的表面结构,与商业纤维素酶有一定的协同效果。获得新型的类膨胀素蛋白,有一定的水解活性,在木质纤维素降解等工业中存在潜在的应用价值。

芒果炭疽病菌侵染过程中致病基因的表达分析

苏初连, 康浩, 梅志栋, 杨石有, 刘晓妹, 蒲金基, 张贺

2018, 34(10): 182-186. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0295

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为研究芒果胶孢炭疽菌在侵染过程中致病相关基因的差异表达。采用实时荧光定量PCR的方法,分析病菌侵染芒果叶片和果实过程中PL、PG等11个基因的表达量变化。研究发现,病原菌侵染叶片时,PG和PL基因均持续高效表达,SIN3P基因表达较低,其余基因在侵染6 h时表达量较高,随后下降;病原菌侵染果实时,PL、PG、SDH、ECH等基因高效表达,其余基因则有升有降。说明致病基因在胶孢炭疽菌侵染芒果不同组织时表达有差异,在侵染的不同时段也不同程度地发挥功能。

苏云金芽胞杆菌G03菌株的比较基因组分析

姚萌, 王奎, 束长龙, 杜立新, 李海涛, 丁明月, 刘荣梅

2018, 34(10): 187-193. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0859

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苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）对包括鳞翅目、鞘翅目在内的多种昆虫具有特异高效的毒杀活性,并且对非靶标生物安全,是目前研究最多、应用最广的生防微生物。G03是一株对鳞翅目害虫高效的Bt菌株,属于鲇泽亚种,目前已经用于害虫防治。为了进一步分析其与目前市场上防治鳞翅目害虫用的较多的Btk（B. thuringiensis subsp. kurstaki）菌株HD1之间的差别,明确其遗传学特点,本研究测定了G03基因组,与其他实验室常用菌株进行了基因组比较,重点分析了杀虫相关基因的特点。分析结果显示,G03菌株含有HD1不具有的cry1Ca、cry1Da基因,使其在虫害控制方面更有优势;与HD1相比,G03含有较少的噬菌体、转座子相关基因,这显示G03基因组可能有更好的遗传稳定性,使其在发酵中更稳定。相关研究结果对今后该菌株改良及应用都具有重要的指导意义。

基于分子结构与生物信息学等多维度特征的定向进化改造甲基对硫磷水解酶

任天雷, 杨海泉, 许菲

2018, 34(10): 194-200. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0221

摘要 ( 282 )

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甲基对硫磷水解酶作为环境友好绿色催化剂,可降解甲基对硫磷等在土壤中残留的有机磷农药,这使得如何提高甲基对硫磷水解酶的水解效率成为酶工程中备受关注的问题。基于分子结构与生物信息学等多维度特征,确定了催化活性中心周围的9个关键位点。构建了一个含1 500个突变体的筛选文库,进行定向进化。经过两轮筛选,最终确定2株催化效率提高的突变体,L258V和L273M。其催化效率常数k_cat/K_m值分别为134.1（mmol/L）^-1·s^-1和166.5（mmol/L）^-1·s^-1,与野生酶相比较分别提高了27.3%和58.1%。这种通过半理性设计构建定向进化文库的方法,不仅有效的提高了甲基对硫磷水解酶的筛选效率,更为酶的改造提供了新的思路。

粟酒裂殖酵母中Atp11在线粒体中功能的研究

苏茹月, 丁萍, 商巾杰

2018, 34(10): 201-206. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0308

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ATP是由ATP合酶复合体催化合成的,在线粒体呼吸过程中起着重要作用。旨在研究粟酒裂殖酵母中Atp11（SPAC3A12.12）在线粒体中的功能。利用同源重组的方法构建Δatp11突变体,观察Δatp11缺失菌在以甘油为唯一碳源的非发酵培养基上的表型;通过生物信息学分析发现Atp11的N端含有一段由24个氨基酸残基组成的线粒体定位序列（MTS）,为确定Atp11在细胞内的定位,在Atp11的C端添加一个GFP标签,观察绿色荧光在细胞内的位置;运用Western blotting检测atp11的缺失对线粒体基因组编码蛋白稳态性的影响。研究结果表明,Δatp11突变体在非发酵培养基上表现出生长缺陷,是线粒体呼吸缺陷菌;GFP绿色荧光定位实验结果证实了Atp11定位于线粒体中;Western blotting 检测结果显示atp11的缺失导致Cob1、Cox1、Cox2、Cox3和Atp6蛋白的表达量显著降低。综上所述,粟酒裂殖酵母Atp11定位于线粒体且是线粒体呼吸链正常发挥功能所必须的。

水胁迫下沙漠小球藻蛋白质组学分析

谭君, 牟云, 周光普, 周永顺, 徐杰, 高剑峰

2018, 34(10): 207-216. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0423

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通过研究小球藻（Chlorella sp.）在干旱胁迫下的蛋白质组变化,从蛋白质表达水平解释小球藻对干旱胁迫的响应机理。以20%的PEG 6000胁迫处理0、6、12、18、24和30 d,提取小球藻总蛋白,利用双向电泳和质谱鉴定技术分析差异蛋白。共鉴定29个差异蛋白,按功能可分为7类：光合作用、能量合成和转化、物质代谢、抗氧化、转运和细胞结构、抗逆和功能未知蛋白质。这些蛋白的表达变化影响着沙漠小球藻的油脂积累,对干旱胁迫应答起到了至关重要的作用,并直接或间接地参与了沙漠小球藻细胞内的光合作用和油脂合成。

抗菌肽在洗发液中防腐效能及安全性评价初探

桂银雪, 杨娜, 滕达, 王秀敏, 毛若雨, 郝娅, 滕国新, 王建华

2018, 34(10): 217-224. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0288

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防腐剂是化妆品中防止微生物污染的重要成分。为获得高效防腐且无毒副作用的洗发液防腐剂,实验选取4种抗菌肽进行MIC测定,筛选出针对个革兰氏阴性菌和阳性菌杀菌效果较好的两个抗菌肽N2和NZ2114。通过体外抗菌试验和细胞水平及小鼠皮肤刺激性实验对两种抗菌肽的防腐效果和安全性能进行测定和评估。实验结果表明,N2和NZ2114在低浓度（分别为40 和20 µg/mL）下即具有快速高效的杀菌效果,并且高浓度（128 µg/mL）下,细胞存活率大于85%,具有低细胞毒性。ROS水平和小鼠皮肤刺激性实验证明,N2和NZ2114不会对皮肤细胞造成损伤,并且具有一定程度的抗氧化作用。本实验结果为抗菌肽作为高效安全的洗发液防腐剂提供参考依据。

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2018, 34(10): 300.

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