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2019年 第35卷 第6期    刊出日期：2019-06-26

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研究报告

利用CRISPR/Cas9系统建立内生链霉菌SAT1的基因簇敲除体系

田文佳, 窦桂铭, 王莎, 孙靖雅, 马玉超

2019, 35(6):  1-8.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-1080

摘要 ( 424 )   HTML   PDF (3335KB) ( 673 )  

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hyBl（hygB-like）基因簇是内生链霉菌SAT1中的次级代谢基因簇,经分析它与潮霉素B基因簇具有52%的相似性,可能在SAT1抑制栗疫菌（Cryphonectria parasitica）的过程中发挥主要作用。为了深入研究该菌的抑菌机制和hyBl基因簇的功能,以hyBl为目标,利用CRISPR/Cas9技术建立SAT1的基因簇敲除体系。在实验过程中,通过protospacer的筛选、敲除载体的构建、接合转移供体菌、Ca²⁺和Mg²⁺的选择以及接合时间等多个条件的探索,建立了SAT1的基因簇敲除体系。最终以E. coliET12567（pUZ8002/pCRISPomyces2-CB）为供体菌,在MS培养基（含10 mmol Mg²⁺）上接合16-18 h,成功获得突变株SAT1△hyBl（缺失14 kb 的hyBl基因簇）。突变株对栗疫菌的抑制带宽较野生株降低了77%,这说明该基因簇指导合成的次级代谢产物在抑制栗疫菌方面具有重要的功能。本研究证明了利用CRISPR/Cas9系统可以对内生链霉菌SAT1进行基因簇编辑,也为深入研究该菌的抑菌机制、基因工程法验证未知基因簇功能提供了良好的技术支撑。

基于CRISPR/Cas9加工番茄α-Man突变体的构建

张圆圆, 邵冬南, 崔百明

2019, 35(6):  9-16.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0134

摘要 ( 387 )   HTML   PDF (4560KB) ( 384 )  

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为培育成熟果实软化程度低,货架期长的番茄植株,以加工番茄甘露糖苷酶基因（α-Man）为编辑对象,设计由番茄U6启动子驱动、长21 bp的guide RNA（gRNA）指导hCas9核酸酶,靶向编辑α-Man的第1个外显子。首先构建基于CRISPR/Cas9系统的植物表达载体,并通过农杆菌介导的遗传转化获得加工番茄转基因株系,然后取转基因番茄叶片基因组DNA,利用限制性内切酶法结合PCR扩增对α-Man编辑位点附近的DNA片段进行检测及测序分析。结果表明,14株转基因番茄植株有2株检测到突变现象。α-Man突变体TA克隆测序结果显示有2种编辑类型,一种表现为52 bp的缺失突变;另一种表现为单碱基突变。实现了对番茄α-Man的编辑。

桃PpNAC72的克隆及表达分析

武肖琦, 冯涛, 刘艳军, 焦思鹏, 孙攀, 杨静慧

2019, 35(6):  16-23.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0891

摘要 ( 319 )   HTML   PDF (5219KB) ( 233 )  

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旨在从桃树‘津柳早红’中克隆PpNAC72,并分析其在不同发育时期的表达情况,初步探究该基因在桃生长中的功能。采用RT-PCR技术从桃果实中克隆得到PpNAC72序列,并对其进行定量表达分析以及生物信息学分析。结果显示,桃PpNAC72（GenBank：MH627940）开放阅读框序列为1 050 bp,编码349个氨基酸,其等电点为8.34,有1个NAM结构域,具有典型的NAC家族结构特征。氨基酸同源性分析表明,PpNAC72与已报道的其他植物NAC蛋白具有较高的相似性,其中,与甜樱桃的NAC蛋白同源性最高。荧光定量PCR结果表明,PpNAC72在桃树各器官中均有不同程度的表达,果实中表达量最高;在不同时期的表达量也有明显变化,在桃果实生长中后期表达量最高。PpNAC72作为转录因子可能参与桃的成熟。

文冠果果实转录组测序及分析

赵阳阳, 郭雨潇, 张凌云

2019, 35(6):  24-31.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-1101

摘要 ( 358 )   HTML   PDF (2508KB) ( 465 )  

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为了研究文冠果果实转录组中功能基因表达情况,采样RNA-seq技术对文冠果不同发育时期果实进行测序分析。结果显示：两个时期样品材料测序组装后共获得68 298个Unigene序列,有24 691个Unigene得到注释,占36.15%;GO数据库注释显示14 766条Unigene分为细胞组分、分子功能及生物学过程3大类54个功能组;KOG数据库中注释到的13 994条Unigene功能系统分为25类;以KEGG代谢途径数据库为依据,可将8 284个文冠果果实转录组Unigene分为127个代谢通路;在文冠果果实转录组中发现11 732个SSR位点,其中最多的为单核苷酸SSR,占60.85%。本研究为文冠果果实分子生物学研究提供了一定的基础和参考。

遮阴与施磷对金荞麦生长及荧光参数的影响

王锐洁, 关萍, 刘筱, 杨淑君, 姬拉拉, 邓小红, 王健健

2019, 35(6):  32-38.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0079

摘要 ( 300 )   HTML   PDF (1615KB) ( 341 )  

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研究遮阴与施磷对金荞麦（Fagopyrum dibotrys（D.Don）Hara）生长及叶绿素荧光参数的影响,为种植金荞麦时光照与磷的设置奠定理论基础。设定3个遮阴强度（不遮阴;轻度遮阴,遮阴40%-45%;重度遮阴,遮阴90%-95%）及2个磷素添加试验（不添加;添加14.4 g/pot）。遮阴增加金荞麦形态指标（如叶面积、株高、根长等形态指标）,以及叶绿素含量和叶绿素荧光参数,但降低了叶厚;施磷增加金荞麦叶片数、叶面积、株高、生物量积累、光化学淬灭系数（qP）等指标;与对照相比,在施磷条件下,遮阴40%-45%比遮阴90%-95%对金荞麦的形态、生物量及实际光合效率（Yield）的促进作用大。在实际生产中采取适当遮阴和施磷有利于金荞麦降低光系统损伤,促进形态指标生长,提高产量。

小桐子SnRK1蛋白激酶α亚基基因的克隆及原核表达分析

王海波, 郭俊云, 田雪莲

2019, 35(6):  39-47.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0948

摘要 ( 361 )   HTML   PDF (6310KB) ( 266 )  

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植物蔗糖非发酵-1型相关蛋白激酶1（Sucrose non-fermenting-1 related protein kinase 1,SnRK1）与酵母SNF1及哺乳动物AMPK同属进化上保守的SNF1蛋白激酶家族,参与响应由胞内低能量/低糖状态所引起的信号转导过程。基于小桐子基因组数据,利用生物信息学方法鉴定到小桐子SnRK1蛋白激酶α亚基基因,并克隆到该基因的全长cDNA序列,命名为JcSnRK1α。结果表明,该cDNA序列全长1 700 bp,完整开放阅读框1 545 bp,编码514个氨基酸,分子量为58.8 kD,理论等电点为8.57。基因结构显示,其包含11个外显子与10个内含子。具有包含T-loop区域的激酶结构域、自抑制调控结构域UBA及激酶相关结构域KA1。另外,在该基因启动子序列中鉴定到TATA框、CAAT框及响应高温、低温、干旱、创伤、赤霉素等应答元件。qRT-PCR分析显示,小桐子JcSnRK1α基因具有器官表达特异性,在茎与根中表达量较高,而在叶片中表达量相对较低,同时,在茎与根中都属于低温诱导表达基因,分别在低温胁迫3 h与0.5 h达到最大表达量,较对照提高2.04与3.16倍。构建其原核表达载体pGEX-4T-1-JcSnRK1α,并在Rosetta中诱导表达,得到84.8 kD的蛋白条带,与理论融合蛋白的分子量一致。本研究为开展小桐子JcSnRK1α基因的功能鉴定以及其在信号转导与逆境应答中的机制奠定了基础。

天山雪莲SikCML7的克隆及表达分析

刘兆书, 刘元元, 秦玉杰, 毕权, 王赛赛, 祝建波

2019, 35(6):  48-54.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-1056

摘要 ( 324 )   HTML   PDF (3241KB) ( 245 )  

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类钙调素蛋白（Calmodulin-like protein）是高等植物中最重要的Ca²⁺感受器之一,该家族蛋白参与植物对环境的适应过程。为了探究类钙调素蛋白是否参与到植物对逆境条件的响应过程,以天山雪莲低温转录组为依据,克隆获得SikCML7,生物信息学分析表明SikCML7的开放阅读框（ORF）为450 bp,编码149个氨基酸,含有4个钙结合区域（EF-hands）。系统进化树分析表明SikCML7与拟南芥AtCML9进化亲缘性较为接近。实时定量PCR结果显示,天山雪莲在经过不同低温（4℃/-2℃）、干旱和盐胁迫处理后,SikCML7的表达均呈上调趋势,但在冷害胁迫和冻害胁迫条件下的表达模式差异巨大,对干旱和盐胁迫也有一定的响应。SikCML7参与了天山雪莲对低温、干旱和盐胁迫响应的过程。

钙依赖蛋白激酶CPK14在花粉管生长中的功能分析

周利明, 卢鑫蕊, 马声葳, 房玮

2019, 35(6):  55-61.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0219

摘要 ( 326 )   HTML   PDF (4096KB) ( 328 )  

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旨在揭示钙依赖蛋白激酶CPK14在花粉管极性生长中的生物学功能。利用基因芯片数据绘制花粉高量表达CPK的表达图谱。去除CPK14位于C端的自抑制区及Ca²⁺结合区,保留完整的激酶区及N端可变区,构建组成激活型（CA）的CPK14（CA-CPK14）。利用基因枪技术在烟草花粉中进行瞬时表达,比较分析全长CPK14、CA-CPK14及GFP对照之间的花粉管表型差异。通过CA-CPK14与GFP-RIC4ΔC（活性ROP1的标记物）共同表达试验,分析CA-CPK14对ROP1活性的影响。结果显示,CPK家族中存在8个花粉高量表达成员（其中包括CPK14）,它们在花粉中高量表达而在其他组织中表达较少。CPK14过量表达可以造成花粉管顶端的膨大,而持续激活且不受Ca²⁺调控的CA-CPK14则抑制花粉管萌发及生长。ROP1是花粉管生长的调控关键因子,CA-CPK14的表达可以抑制活性ROP1的标记物（GFP-RIC4ΔC）在花粉管顶端的积累与分布,说明CPK14在ROP1所介导的花粉管生长调控机制中发挥一定的作用。

不同氮源及氮浓度对耐高盐真眼点藻生长、脂类积累及脂肪酸组成的影响

赵伟, 李涛, 吴华莲, 陈浩, 刘德海, 向文洲, 吴后波

2019, 35(6):  62-68.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0009

摘要 ( 298 )   HTML   PDF (2190KB) ( 286 )  

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真眼点藻纲（Eustigmatophyceae）微藻可以积累高含量的EPA具有重要的开发利用价值。为了探究不同氮源及氮浓度对一株耐高盐真眼点藻（Eustigmatos sp.）的生长、脂类积累及脂肪酸组成的影响,实验以BG-11为基础培养基,选用三种不同类型氮源（硝酸钠、尿素、碳酸氢铵）,每种氮源设置三种氮浓度（3.5 mmol/L、5.9 mmol/L、17.6 mmol/L）,跟踪测定真眼点藻培养过程生物质浓度、总脂含量、脂类分级及脂肪酸组成的变化情况。结果显示：在以碳酸氢铵为氮源,氮浓度为17.6 mmol/L条件下真眼点藻的生物质浓度最高（7.07 g/L）;三种氮源3.5 mmol/L组真眼点藻的总脂积累量均高于5.9 mmol/L组和17.6 mmol/L组,在3.5 mmol/L条件下,真眼点藻在以尿素为氮源的实验组中获得最高总脂产量（4.18 g/L）,其次为硝酸钠（4.07 g/L）,最低为碳酸氢铵（3.42 g/L）。氮胁迫可以使真眼点藻的中性脂比例增加,3.5 mmol/L组的中性脂比例均高于5.9 mmol/L组和17.6 mmol/L组,在3.5 mmol/L条件下,真眼点藻在尿素组、碳酸氢铵组和硝酸钠组的中性脂含量分别为79.0% TL（TL为total lipid的简写）、77.0% TL和75.7% TL;真眼点藻的脂肪酸组成主要有C14∶0（豆蔻酸）、C16∶0（棕榈酸）、C16∶1（棕榈油酸）、C18∶1（油酸）、C18∶2（亚油酸）、C20∶4（花生四烯酸）和C20∶5（EPA）,其中C16∶1的含量占51% TFA（TFA为total fatty acid的简写）,在以硝酸钠为氮源的处理组中,17.6 mmol/L条件下C20∶5（EPA）的百分含量最高,为7.18% TFA,尿素氮源次之（6.20% TFA）,最小为碳酸氢铵（4.82% TFA）。该研究显示真眼点藻（Eustigmatos sp.）是一株极具开发潜力的微藻。

两种地衣共生藻对铜和锌的耐受性及吸附特性研究

吉米拉木·加马力, 美合日班·阿不力米提, 古海尼沙·买买提, 艾尼瓦尔·吐米尔

2019, 35(6):  69-75.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0018

摘要 ( 295 )   HTML   PDF (2036KB) ( 170 )  

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重金属污染生物修复中,藻类对重金属的吸附潜力引起诸多研究者的关注。为了探讨从地衣体分离培养的地衣共生藻对重金属Cu²⁺、Zn²⁺吸附特性及其耐受性的差异,以2种地衣共生藻为研究材料,采用Evan’s blue染色法、BCO和双硫腙分光光度法测定地衣共生藻细胞活率,培养液及藻体内的Cu²⁺、Zn²⁺含量。结果显示：不同浓度Cu²⁺、Zn²⁺胁迫下,2种地衣共生藻的细胞活力及重金属吸附特性有所差异,对Cu²⁺胁迫的耐受性及吸附性为：P.E>B;Zn²⁺胁迫下,培养至9d时耐受为：P.E > B,随着培养时间的延长P.E的细胞活力急剧下降并低于B,但吸附率还是处于P.E > B;并且2种地衣共生藻对Zn²⁺胁迫的耐性及吸附性明显高于Cu²⁺。研究发现,来自菌藻共生的特殊生物-地卷属地衣的两种藻类比一些自由生长的藻类对铜和锌胁迫具有较高的耐受性及吸附性。

木糖酸氧化途径在枯草芽孢杆菌的构建及转化乙醇酸的研究

凌翓, 纪明华, 段海燕, 史吉平, 孙俊松

2019, 35(6):  76-82.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0038

摘要 ( 355 )   HTML   PDF (3605KB) ( 479 )  

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通过过表达外源基因,旨在获得一株生产乙醇酸的食品安全菌。通过构建质粒在枯草芽孢杆菌A164S中过表达来自大肠杆菌的木糖酸降解途径,并用高效液相色谱对产物进行检测。诱导质粒表达后,重组枯草芽孢杆菌菌株成功地将木糖酸转化为乙醇酸,摩尔转化率达到42.54%。同时,枯草芽孢杆菌自身因存在非特异的醛缩酶及乙二醛脱氢酶,能够在只表达木糖酸脱水酶YjhG的情况下获得生物转化木糖酸的能力。成功构建了一株可利用木糖酸生产乙醇酸的枯草芽孢杆菌,并发现了可能的YjhH同工酶的存在。

大肠杆菌乙醇工程菌mglB基因的敲除对混合糖发酵木糖利用效率的影响

许琼丹, 王永泽, 王金华, 赵筱

2019, 35(6):  83-90.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0962

摘要 ( 342 )   HTML   PDF (3241KB) ( 286 )  

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为明晰葡萄糖非PTS转运系统相关基因对木糖利用效率的影响,探讨葡萄糖PTS和非PTS转运系统是否对木糖利用存在协同影响,以大肠杆菌工程菌SZ470和SZ470P为出发菌株,通过RED同源重组技术敲除葡萄糖转运基因mglB,构建mglB单缺陷菌SZ470M和ptsG/mglB双缺陷菌SZ470PM。比较四株菌的混合糖（3%葡萄糖+2%木糖）发酵情况以及木糖转运代谢相关基因的转录水平。实验结果表明,SZ470M相较于出发菌株SZ470,其发酵性能无明显变化;SZ470PM的木糖消耗速度为0.37 g/L,乙醇产量为23.25 g/L,转化率为82.6%,相比于出发菌株SZ470P分别提高了32%,9.8%和5.8%。基因转录水平的分析也表明菌株SZ470P和SZ470PM的木糖转运与代谢基因的转录水平上调。综上,ptsG和mglB基因的双敲除对木糖利用效率的提高有协同影响,为促进木质纤维素作为发酵原料时木糖的高效利用提供理论依据。

聚乙烯醇降解细菌筛选及其降解特性

刘亚兰, 段梦洁, 林晓珊, 张毅

2019, 35(6):  91-98.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-1045

摘要 ( 327 )   HTML   PDF (3311KB) ( 330 )  

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从聚乙烯醇泡棉的堆肥降解过程中筛选出可以有效降解聚乙烯醇的菌株,并研究其对聚乙烯醇的降解效果和降解特性。将聚乙烯醇泡棉经过3年的堆肥降解,利用傅里叶转换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR）检测泡棉的分子结构变化;采用Finley法从降解后的聚乙烯醇泡棉中筛选降解效果较好的菌株,通过菌落形态和细胞染色以及16S rRNA基因序列比对进行鉴定;通过紫外分光光度计检测菌株在降解聚乙烯醇材料过程中的菌体浓度变化和聚乙烯醇降解程度,并将筛选菌株对两种醇解度的聚乙烯醇降解效果进行对比。结果表明,经过3年的堆肥降解,聚乙烯醇泡棉分子结构中出现了新的羧基和羟基;筛选得到了四株菌,即Bacillus sp.DG01、Bacillus sp.DG02、Paenibacillus sp.DG03、Paenibacillus sp.DG04。这4株筛选菌株对3.0 g/L PVA1788的降解率分别为67.27%、74.99%、56.74%和59.70%,对3.0 g/L PVA1799的降解率分别为58.27%、54.47%、43.32%和46.59%。PVA泡棉在堆肥降解过程中发生了明显的基团变化,4株菌的生长与聚乙烯醇的降解过程呈耦联关系,且4株菌株整体上对较低醇解度的PVA降解效果更好。

锑胁迫对斑马鱼酶活性的影响研究

岳鑫, 杨爱江, 徐鹏, 胡霞, 朱桓毅, 包欣

2019, 35(6):  99-106.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-1084

摘要 ( 320 )   HTML   PDF (3963KB) ( 759 )  

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研究重金属锑胁迫下,分析生物体内各类酶活性的变化,了解生物对锑胁迫的响应机制。以斑马鱼为受体研究对象,探究不同浓度锑溶液（0、10、20、30和40 mg/L）和不同时间（24、48、96和144 h）培养下,斑马鱼体内不同酶活性的变化情况。研究结果表明,培养24 h时,不同浓度锑对斑马鱼体内除碱性磷酸酶以外的7种酶活性均有明显的抑制作用。随着锑胁迫时间增加,斑马鱼体内三磷酸腺苷酶、过氧化氢酶活性呈现先降低后增加的变化趋势;过氧化物酶、超氧化物歧化酶、乙酰胆碱酯酶、乳酸脱氢酶和酸性磷酸酶活性呈现“锯齿形”变化趋势;碱性磷酸酶酶活性呈现先增加后降低的变化趋势。综上分析表明锑对斑马鱼体内自由基调节、兴奋传导、能量代谢、物质运输、机体生长和免疫防御等生命过程都有明显的影响。

荧光假单胞菌2P24中RstA蛋白的功能鉴定

李谛音, 何永兴, 韩建庭, 李坤, 王志平, 李妙慧

2019, 35(6):  107-113.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0097

摘要 ( 326 )   HTML   PDF (3238KB) ( 192 )  

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探究荧光假单胞菌2P24中OmpR家族转录因子RstA的功能,明确其对EmhABC外排泵的调控作用及机制。利用共适应分析预测RstA的潜在功能;采用同源重组技术构建rstA、emhABC基因缺失菌株ΔrstA和ΔemhABC,检测野生型、ΔrstA、ΔemhABC对多种抗生素的敏感性;通过qRT-PCR和β-半乳糖苷酶实验检测emhABC在野生型和ΔrstA菌株中的转录、表达水平;表达纯化His-RstA蛋白并经凝胶阻滞实验检测RstA蛋白与emhABC基因启动子区域的结合活性。结果显示,RstA同EmhABC存在共适应性,并预测RstA与多种抗生素胁迫环境的适应相关;ΔrstA和ΔemhABC对多种抗生素耐受性下降;与野生株相比,突变株ΔrstA中emhABC的转录、表达水平均下降超过3倍;成功表达纯化His-RstA蛋白,经凝胶阻滞实验显示重组His-RstA蛋白可与emhABC基因启动子区域特异性结合。OmpR家族转录因子RstA通过结合在emhABC上游启动子区域正向调控EmhABC的表达,并影响荧光假单胞菌2P24的多重耐药性。

党参多糖对Ana-1巨噬细胞和小鼠的免疫调节作用

史宝忠, 胡建燃, 李平, 徐凯

2019, 35(6):  114-118.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0889

摘要 ( 324 )   HTML   PDF (2845KB) ( 247 )  

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以中药党参为材料,研究其多糖成分对小鼠巨噬细胞Ana-1和小鼠的免疫活性的影响。通过MTT实验,检测党参多糖对Ana-1细胞增殖的影响。利用ELISA实验,检测不同浓度的党参多糖对Ana-1细胞释放TNF-α和IL-1β的影响。用不同剂量的党参多糖灌胃小鼠,分别测定小鼠脾脏指数、淋巴细胞增殖活力以及血清中TNF-α和IL-1β的含量。体外实验结果显示党参多糖不影响Ana-1细胞的增殖,却显著提高TNF-α和IL-1β的分泌,并呈浓度依赖关系。体内实验结果显示：与对照组相比,党参多糖中、高剂量组小鼠胸腺指数、淋巴细胞增殖指数以及血清中TNF-α和IL-1β的含量均显著增高,呈剂量依赖关系。因此,党参多糖能够有效提高小鼠巨噬细胞Ana-1的免疫活力,增强小鼠的免疫功能。

冻存密度对外周血单个核细胞冻存效果的影响

林科佳, 刘赴平, 马冬磊, 胡锐, 魏宗科, 谭毅

2019, 35(6):  119-124.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0646

摘要 ( 495 )   HTML   PDF (1437KB) ( 791 )  

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探讨冻存密度对外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）冻存效果的影响。设定新鲜PBMC组（F组）及3个PBMC冻存密度组即2.0×10⁷/mL（A组）,4.0×10⁷/mL（B组）,6.0×10⁷/mL（C组）。通过对冻存前后的PBMC活率及复苏后多种细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-induced killer,CIK）的扩增倍数、淋巴细胞亚群、体外杀伤效率进行比较,验证其冻存效果。结果显示,冻存前F组与冻存后A组、B组、C组的细胞活率分别为（96.0±0.3）%、（95.6±0.4）%、（94.7±0.2）%和（94.9±0.4）%,B组与C组显著低于A组,P<0.05;细胞扩增14 d后,F组与A组、B组、C组细胞扩增倍数分别为（156.4±18.2）倍、（160.2±28.4）倍、（126.1±19.8）倍和（110.4±11.3）倍,B组与C组显著低于F组（P<0.05）;PBMC冻存前复苏后淋巴细胞亚群结果无显著差异。与F组相比,A组、B组、C组细胞扩增14 d后,CD3+、CD3+ CD4+、CD3+ CD8+、CD3-CD56+、CD3+CD56+淋巴细胞亚群无显著差异（P>0.05）,体外杀伤效率无显著差异（P>0.05）。过高的冻存密度会影响PBMC冻存效果而间接影响细胞的复苏应用,而过低的冻存密度则增加冻存体积而大大提高冻存成本,因此,选择合适的细胞冻存密度是细胞库或细胞银行必须要考虑的问题。

小分子前体物对巴弗洛霉素A1生物合成的影响

周剑, 孙菲, 方志锴, 江红

2019, 35(6):  125-130.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-1001

摘要 ( 313 )   HTML   PDF (2166KB) ( 200 )  

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通过研究小分子前体物对巴弗洛霉素A1生物合成的影响,寻找提高巴弗洛霉素A1发酵产量的有效方法。主要考察了不同前体物对巴弗洛霉素A1生物合成的影响,以及有效前体物的最佳添加浓度和添加时间点。结果显示,缬氨酸是巴弗洛霉素A1合成的最佳前体,36 h时添加0.2%缬氨酸,巴弗洛霉素A1产量高达285.5 mg/L,比对照组提高了78.4%。前体物的供给能显著影响巴弗洛霉素A1的生物合成,补加缬氨酸能有效提高巴弗洛霉素A1的发酵产量。

滩羊微卫星标记多态性及与体尺性状关联分析

李标, 张瑞莹, 王小琪, 张存芳, 段子渊

2019, 35(6):  131-137.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0073

摘要 ( 322 )   HTML   PDF (2040KB) ( 451 )  

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滩羊是我国特有的蒙古羊品种,肉质鲜美但生长缓慢。通过筛选的29个高多态性微卫星标记,对宁夏盐池滩羊种羊场基础母羊群体用随机抽样法检测了96个成年个体,测量了体重和体尺数据,分析了其微卫星标记遗传多样性、群体遗传结构及分子标记与表型的相关关系。结果显示,微卫星标记平均等位基因数9.5,平均有效等位基因数4.5,平均期望杂合度0.72,平均观测杂合度0.64,平均多态信息含量0.69;滩羊基础母羊群体保持了丰富的遗传多样性;关联分析结果显示MAF33与滩羊的体高、胸深显著相关,BMS1788与荐高、胸围显著相关,而BL41、BMS835、BOVILS56、MAF33和BMS500与管围极显著关联。这些标记对未来滩羊的分子辅助育种有所帮助。

综述与专论

雄性不育中花粉壁的研究进展

张江江, 常丽, 赵立宁, 李德芳

2019, 35(6):  138-146.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0814

摘要 ( 397 )   HTML   PDF (2333KB) ( 619 )  

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花粉壁是花粉重要的组成元件,在花粉发育和受精等过程中起作用。雄性不育研究中已发现许多与花粉壁相关的发育过程。绒毡层的降解、胼胝质的凋亡、初生外壁形成和降解以及花粉内壁发育等都与雄性不育间存在某种关联。本文主要根据雄性不育的有关报道,对涉及花粉壁发育的相关内容进行归纳。旨在找出花粉壁发育的一般规律,为雄性不育中花粉壁的功能研究及机理解析提供理论支撑。

重金属对植物种子萌发胁迫及缓解的机制

李桂玲, 王琦, 王金水, 贾峰

2019, 35(6):  147-155.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0938

摘要 ( 461 )   HTML   PDF (1113KB) ( 334 )  

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重金属元素一般为植物生长的非必需元素,具有较强的毒性,极易被植物吸收积累,降解困难,且能通过食物链危害人类健康。综述了近年来重金属对植物种子萌发过程中形态学指标、生理生化指标以及分子水平上的影响,主要包括重金属对植物种子萌发、幼苗生长、淀粉酶酯酶等水解酶活性、抗氧化酶活性、可溶性糖与脯氨酸含量及在细胞遗传毒性效应和蛋白基因表达水平上的影响,并总结了缓解植物重金属毒害的方法及治理措施,探讨了目前该领域研究中存在的问题,以及治理植物重金属毒害的研究方向,旨在为重金属污染研究与治理工作提供参考。

非洲猪瘟病毒结构蛋白在病毒感染过程中的作用

欧云文, 刘俐君, 代军飞, 马炳, 张永光, 张杰

2019, 35(6):  156-163.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0968

摘要 ( 475 )   HTML   PDF (1087KB) ( 990 )  

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非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的一种急性、烈性、出血性的猪传染性疫病,给疫情发生国家（地区）的养猪业带来严重的经济损失。ASFV作为双股DNA病毒,含有150-167个开放阅读框（ORFs）,编码200余种蛋白质,其中结构蛋白约50种。结构蛋白作为病毒颗粒的主要组分,在病毒吸附、侵入和复制等感染过程中起着重要作用。综述了ASFV结构蛋白在病毒感染中的作用,以期为ASFV结构蛋白的进一步研究提供参考。

原核生物转录组研究的现状与进展

刘梦, 圆冷艳, 翟立翔, 何丽芳, 李师翁

2019, 35(6):  164-171.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0070

摘要 ( 394 )   HTML   PDF (1114KB) ( 434 )  

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

转录技术在原核生物转录组研究上的突破,已经显示出其在揭示原核生物生命过程的分子机制上独特的优势。对原核生物的转录组研究开始于致病菌,近年来,通过转录组学分析原核生物对污染物的降解机制已成为研究热点。通过多组学整合分析,对降解菌的代谢机理、作用机制及转录相关基因进行深入探究。综述了原核生物转录组研究的现状及进展,即介绍了响应重金属及芳香族化合物、石油烃等有机污染物的降解菌种类及其转录组特征;重点关注了致病菌的转录组研究,包括人类、动植物致病菌的种类、性质及其转录组特征;并对原核生物的转录组研究在未来的发展和应用进行了展望,旨在为原核生物在环境污染治理和致病菌引起的人类和动植物疾病的防控奠定重要理论基础。

嗜盐菌生物合成聚羟基脂肪酸酯（PHAs）的研究进展

张梦颖, 李雅慧, 詹元龙, 刘长莉

2019, 35(6):  172-177.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0843

摘要 ( 425 )   HTML   PDF (1403KB) ( 477 )  

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微生物体内积累的聚羟基脂肪酸酯（PHAs）是一种可降解的生物塑料,利用微生物合成绿色环保的PHAs替代石化塑料可减少白色污染。嗜盐菌合成PHA可省略繁琐的灭菌和无菌条件培养的苛刻条件,较其他微生物更具有经济效益和竞争性。结合目前国内外嗜盐菌合成PHA的研究进展,对嗜盐菌合成的PHA进行分类,并对由嗜盐菌合成PHA的影响因素进行总结分析。同时,对嗜盐菌合成PHA的发展前景进行了展望。

m6A RNA甲基化在肿瘤发生发展中的作用

龙文林, 郭辉, 盛杰, 宋如晦, 徐瑶

2019, 35(6):  178-186.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-1082

摘要 ( 426 )   HTML   PDF (1708KB) ( 523 )  

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

m6A 甲基化是于1974年首次被发现的一种RNA分子上的甲基化修饰,近年来已成为生命科学领域的研究热点。m6A修饰在哺乳动物细胞中是动态可逆的,是类似于DNA和组蛋白修饰的另一种表观遗传调控。这种RNA化学标记是由m6A“Writers”的蛋白质产生,可以被m6A“Erasers”（即去甲基酶）逆转。此外,“Readers”可以识别含m6A的mRNA,并相应地调节下游基因的表达。m6A RNA甲基化参与了RNA生命周期的各个阶段,从RNA加工、核输出、翻译调控到RNA降解,表明m6A具有影响RNA代谢相关多方面的功能。最近的研究表明,在不同的组织、细胞系和时空模型中,m6A的修饰是一个复杂的调控网络,m6A甲基化与肿瘤的发生和发展密切相关。主要围绕m6A的分子调控机制、生理意义及其在几种人类肿瘤中的研究进展进行综述,旨在为癌症的早期临床诊断和靶向治疗提供新的思路。

无岩藻糖修饰曲妥珠单抗的研究进展

雷莎莎, 朱红雨, 张国华, 徐明波, 杨仲璠, 姚文兵

2019, 35(6):  187-195.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-1049

摘要 ( 338 )   HTML   PDF (1894KB) ( 417 )  

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乳腺癌是女性常见癌症中致死率最高的恶性肿瘤疾病之一,严重危害女性的生命健康。其中,以HER2阳性乳腺癌发病率和致死率最高。曲妥珠单抗在治疗HER2阳性乳腺癌上具有显著的临床疗效,然而由于患者耐药性的产生、HER2表达异常、用药成本高等原因,曲妥珠单抗在实际临床使用过程中存在极大的局限性。研究发现敲除抗体Fc段寡糖的核心岩藻糖可明显提高曲妥珠单抗的ADCC效应,改善其临床疗效。综述了如何敲除曲妥珠单抗的核心岩藻糖、无岩藻糖修饰曲妥珠单抗的临床优势以及提高其ADCC效应的其他Fc段改造方法。

右旋糖酐酶开发及应用研究进展

常国炜, 黄曾慰, 黎志德, 梁达奉

2019, 35(6):  196-204.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-1021

摘要 ( 517 )   HTML   PDF (1889KB) ( 371 )  

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右旋糖酐酶是一类能特异性催化右旋糖酐中α-1,6-糖苷键水解的酶,其作用底物——右旋糖酐则是蔗糖经某些微生物发酵生成的高分子葡萄糖聚合物。右旋糖酐被广泛应用于医药、食品、材料等领域,但也给口腔健康、制糖生产等带来不良影响。随着人们对右旋糖酐、右旋糖酐水解物及其他多糖研究的深入,右旋糖酐酶发挥着越来越重要的作用,但右旋糖酐酶制剂的整体开发水平仍不高,应用深度仍有限。综述了右旋糖酐酶菌种构建、发酵、纯化、固定化、酶学性质表征、酶活性增强等多个方面的开发研究,以及右旋糖酐酶在制糖、食品、医药、材料等领域的应用研究进展,其中包括本团队在开发和应用方面的研究成果,讨论了在开发和应用过程中存在的问题,并对未来的开发和应用研究方向进行了展望。

技术与方法

三种重要水果褐腐病菌快速检测试纸的研制

林惠娇, 杨华卫, 古恒森, 蒋湘, 张海磊, 刘昱辰, 周而勋

2019, 35(6):  205-212.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-1006

摘要 ( 328 )   HTML   PDF (5503KB) ( 677 )  

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以水果上3种重要的褐腐病菌,即美澳型核果褐腐菌（Monilinia fructicola）、核果褐腐菌（M. laxa）和仁果褐腐菌（M. fructigena）为检测对象,研究开发适用于口岸水果检疫的快速检测试纸。以硝酸纤维素膜为固相载体,以病菌翻译延长因子基因（Translation elongation factor 1-alpha,EF-1α）为检测靶标,生物素标记的PCR扩增产物为检测标记物,采用DNA-DNA杂交方式对3种褐腐病菌进行试纸法快速检测。分别以褐腐病菌DNA和本研究构建的EF-1α重组质粒DNA为阳性标准品检验试纸的特异性和灵敏度。试验结果表明,本研究开发的检测试纸能够同时特异地检出以上3种褐腐病菌,整个检测流程（包括DNA提取和扩增过程）在2 h内即可完成,最低检测限达到10 fg/µL。其特异性强、灵敏度高、稳定性好,且检测结果可肉眼判定,无需依赖昂贵设备,便于向基层检疫实验室推广使用。

高效严谨型大肠杆菌Targetron基因打靶系统的构建

陈相好, 刘芳, 王彩霞, 陈峥宏, 洪伟, 蔡梦迪, 张峥嵘, 綦廷娜, 廖永慧, 谷俊莹, 崔古贞

2019, 35(6):  213-220.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0883

摘要 ( 359 )   HTML   PDF (3418KB) ( 311 )  

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构建高效严谨型大肠杆菌Targetron基因打靶系统。将来源于pET28a的T7-lac操纵子与来源于pSY6的II型内含子组装构建大肠杆菌IPTG诱导型Targetron质粒系统。以lacZ基因为例,选择lacZ-635s和lacZ-1063a两个位点为靶位点,利用构建的IPTG诱导型Targetron系统进行基因打靶,通过分析诱导前和诱导后II型内含子在靶位点的插入效率,验证大肠杆菌IPTG诱导型Targetron系统严谨性和打靶效率。最后,通过优化诱导剂浓度及诱导时间,建立高效严谨的诱导型大肠杆菌Targetron基因打靶系统。在没有IPTG诱导时,II型内含子在两个位点均不能插入,打靶效率均为0;当加入0.5 mmol/L IPTG诱导45 min时,其在lacZ-635s位点的打靶效率提高到90.8±5.5%,在lacZ-1063a位点的打靶效率提高到92.6±2.4%。成功建立高效严谨型大肠杆菌Targetron基因打靶系统,旨为II型内含子的机理研究及应用奠定基础。

ATP合成菌株的构建及用于联合生产S-腺苷甲硫氨酸

江林林, 吴磊, 许海霞, 黄坚丽, 张永进, 徐期, 杨勇

2019, 35(6):  221-226.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0977

摘要 ( 368 )   HTML   PDF (3570KB) ( 273 )  

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为降低S-腺苷甲硫氨酸的生产成本,构建了同时表达腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶3种酶的重组大肠杆菌菌株用于ATP的合成,并对ATP的转化条件进行了优化,优化后的反应体系为：腺苷30 mmol/L,乙酰磷酸二锂盐135 mmol/L,硫酸镁5 mmol/L,硼砂50 mmol/L,菌体2 g/L（湿重）,反应液初始pH7.5,反应温度为35℃,反应时间为3 h,反应转化率可以达到99%以上。按照上述反应体系进行5 L放大,反应结束后再投入65 mmol/L D,L-甲硫氨酸和50 g/L（湿重）表达腺苷甲硫氨酸合成酶的重组大肠杆菌菌体,并补加15 mmol/L硫酸镁,转化18 h S-腺苷甲硫酸浓度能达到8.7 g/L,转化率达到72.5%。

其他

目录

2019, 35(6):  227-227. 

摘要 ( 124 )   HTML   PDF (345KB) ( 216 )  

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封面

2019, 35(6):  228-228. 

摘要 ( 126 )   HTML   PDF (21192KB) ( 127 )  

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