生物技术通报

基因编辑——擎起“人定胜天”的先进技术

谷峰

2020, 36(3): 0.

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基于CRISPR-Cas13家族的RNA编辑系统及其最新进展

陈敏洁, 唐桂月, 洪香娜, 郝沛, 江静, 李轩

2020, 36(3): 1-8. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-1204

摘要 ( 781 )

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存在于细菌和古菌中的获得性免疫系统CRISPR-Cas目前已被广泛应用到生物技术领域,尤其是靶向DNA的CRISPR-Cas9技术。然而CRISPR-Cas系统靶向RNA的技术还处于初步应用阶段。VI型CRISPR-Cas系统（CRISPR-Cas13）的发现,揭示了RNA引导的RNA靶向性。CRISPR-Cas13是目前CRISPR-Cas家族中唯一只靶向ssRNA的系统,为RNA靶向和RNA编辑奠定了基础。根据Cas13系统发育已证明将VI型CRISPR-Cas系统分为4种亚型（A-D）。主要对目前最新的靶向RNA技术的CRISPR-Cas13家族的分类以及防御机制进行了综述,介绍了 CRISPR-Cas13 技术的应用以及基于CRISPR-Cas13家族的RNA编辑系统的最新研究进展。最后,对目前CRISPR-Cas13 RNA编辑技术体系存在的问题进行了分析和对未来的发展进行展望。

基因组编辑技术在马铃薯精准分子育种中的应用及研究展望

叶明旺, 李灿辉, 龚明

2020, 36(3): 9-17. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-1272

摘要 ( 503 )

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基因组编辑技术经过近十年的快速发展,已成为基因功能研究及精准分子育种强有力的工具。该技术主要是通过造成靶位点双链DNA断裂,引发机体的修复机制,从而在特定位点引入DNA的插入或缺失突变。目前,随着国家实行的马铃薯主粮化战略,人们对于马铃薯品种的需求更加的多样化,而基因组编辑技术将会为马铃薯的定向遗传改良和精准分子育种提供一条高效快捷的技术实现途径。综述了3类主流基因组编辑技术的原理,回顾了基因组编辑技术在马铃薯品种改良和精准分子育种中的应用,讨论了基因组编辑对于马铃薯精准分子育种的意义和目前存在的问题,并对基因组编辑技术在马铃薯精准分子育种中的应用进行了展望,旨在为该技术在以后的马铃薯精准分子育种中的应用提供借鉴和新思路。

鳞翅目昆虫基因编辑技术研究进展

程英, 靳明辉, 萧玉涛

2020, 36(3): 18-28. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0875

摘要 ( 545 )

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鳞翅目昆虫种类繁多,遗传多样性极高,通过基因编辑对其基因功能进行研究,解析其遗传及生理生化调控机理是一种高效实用的方法。鳞翅目昆虫基因编辑技术主要有3种：锌指核酸酶（Zinc finger nucleases,ZFNs）技术、转录激活因子样效应蛋白核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases,TALENs）技术和CRISPR/Cas 技术,其原理是在基因组特定位点制造 DNA 双链断裂,从而激活机体自身的 DNA 损伤修复机制,在此过程中产生插入、删除等多种突变类型。就此3种主要基因编辑技术的原理及应用于重要鳞翅目昆虫如家蚕、斜纹夜蛾、棉铃虫等基因编辑研究进展进行简要综述,为鳞翅目昆虫功能基因组研究、昆虫生理生化、昆虫行为学研究及建立害虫绿色防控体系提供参考。最后,对基因编辑技术在鳞翅目昆虫中的应用现状做简要总结,对建立鳞翅目昆虫适用的基因编辑技术及应用前景进行展望。

精准高效外源DNA整合技术研究进展

吴志胜, 傅高惠, 罗文骏, 刘俊杰, 陈慧芳, 白银山

2020, 36(3): 29-37. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-1207

摘要 ( 445 )

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精准高效整合技术是将外源DNA片段插入到目的细胞基因组特定位置的一项转基因技术。早期通过细胞基因组与外源DNA同源序列发生重组来完成靶向整合的目的。伴随基因编辑技术发展,特别是CRISPR/Cas9技术的出现,精准高效的外源DNA整合技术日益成熟,广泛应用到功能基因组学、转基因动物及遗传疾病治疗的研究中。围绕基因编辑研究进展、引导RNA修饰技术、单碱基整合技术、转座子技术和外源DNA整合效率等方面对精准靶向和高效整合技术进行综述。

CRISPR技术在生物学与医学中的研究进展

杨悦, 高郡茹, 杨柳

2020, 36(3): 38-44. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0147

摘要 ( 450 )

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作为一项新兴技术,CRISPR近年来发展迅速,其在疾病检测、模式生物构建、基因治疗领域的研究硕果累累。由于CRISPR技术原理简单、操作简易,并可与多种技术结合等优点,使之在医药、农业、环境等领域的应用具有巨大潜力。此外,除了经典的CRISPR/Cas9系统,科学家还发现了多种其他类型的CRISPR/Cas系统。同时,基于Cas9蛋白开发的单碱基编辑器（BE）和可对RNA进行编辑的CRISPR/Cas13a系统也使CRISPR的应用范围得到了极大地扩展,将对CRISPR技术的最新进展及其在生物学、医学等领域的应用进行综述。

动物转基因高效表达策略研究进展

赵旭东, 黄永志, 毕延震, 董发明

2020, 36(3): 45-53. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0989

摘要 ( 479 )

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外源基因在动物体内、细胞内表达时,常由于各种原因导致基因沉默。目前,主要有两种策略用于打破该瓶颈：一是利用友好位点;二是优化外源基因顺式作用元件。利用友好位点就是通过定点整合技术将外源基因插入至活性转录区域;优化外源基因顺式作用元件即采用合适的启动子、增强子、内含子、染色质开放元件、核基质附着区等元件,构建出高效表达载体。对相关策略进行概述,为动物基因工程育种提供参考。

哺乳动物手工克隆的研究进展

韩梅, 袁超, 郭婷婷, 吴怡, 岳耀敬, 杨博辉

2020, 36(3): 54-61. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0008

摘要 ( 370 )

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体细胞核移植技术（Somatic cell nuclear transfer,SCNT）基本上分为传统克隆（Traditional cloning,TC）和手工克隆（Handmade cloning,HMC）。虽然随着SCNT的推进,科研人员已经利用TC成功克隆出多种动物,但这种方法需要使用昂贵的显微操作仪,并且克隆效率较低。因此,TC逐渐被新方法HMC替代,HMC是一种通过手工操作将体细胞与两个去核的半卵母细胞融合、激活,并在培养系统中培养后产生胚胎的方法。HMC不仅操作程序简单、不需要显微操作仪、成本较低,还可以提高囊胚率,使克隆技术向生产应用又迈进了一大步。主要对HMC的操作程序、表观遗传重编程异常和HMC重编程异常修复进行了综述,并对HMC进行了展望,以期能够更好地将其应用到生产中去。

CRISPR /Cas9基因编辑技术在山羊和绵羊中的应用研究进展

宋绍征, 陆睿, 张婷, 何正义, 吴赵曼秋, 成勇, 周鸣鸣

2020, 36(3): 62-68. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0068

摘要 ( 764 )

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CRISPR /Cas9系统是近年来新兴的一种基因编辑技术,可将特定DNA基因序列敲除、插入或定点突变,具有快捷、高效、精准、特异性高等特点,广泛地应用于遗传育种、生物医药和基因工程等研究领域。山羊和绵羊是重要的经济家畜动物和实验动物,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对羊进行遗传修饰,将加速品种改良,提高动物生产性能,获得更加优质的农副产品。主要对CRISPR /Cas9基因编辑技术的概述、作用机理及在羊乳“人源化”改造、提高肉品质、改善毛纤维质量等方面的应用研究进展及发展前景作简要阐述,以期为相关科研人员提供参考。

基于CRISPR/Cas系统的生物传感策略研究进展

胡孝林, 王良婷, 顾玮, 罗阳

2020, 36(3): 69-77. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0932

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CRISPR/Cas9系统是继锌指核酸内切酶、类转录激活因子效应物核酸酶之后的第三代基因组定点编辑工具,因其具有特异性切割双链DNA的能力,被广泛应用于基因编辑、生物传感等领域。Cas12a（Cpf1）、Cas13a（C2c2）等蛋白“附属切割”活性的发现,拓展了CRISPR/Cas系统在生物传感中的应用。近年来,研究人员开发出一系列快速、超敏、高特异性的生物传感系统用于分子检测,如SHERLOCK,DETECTR等。本文主要综述了基于CRISPR/Cas系统的生物传感策略的研究进展,并展望了其未来发展的方向。

CRISPR/Cas9系统中的脱靶效应及检测技术研究进展

张晨, 雷展, 李凯, 商颖, 许文涛

2020, 36(3): 78-87. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0871

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聚类规则间隔的短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）及其相关蛋白（Cas9蛋白）已经成为精确编辑基因组的强大工具。CRISPR/Cas9系统源自于细菌和古生菌的免疫机制,结构简单、易于设计,仅需改变单引导RNA（single-guide RNA,sgRNA）上的一小段序列即可快速实现对不同基因位点的编辑。与锌指核酸酶（Zinc finger nucleases,ZFN）和转录激活因子样效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases,TALEN）技术相比,CRISPR/Cas9系统基因编辑效率更高、特异性更强。但在应用过程中不可避免的脱靶事件严重限制了CRISPR/Cas9系统的进一步发展,因此本篇文章就CRISPR/Cas9系统的脱靶类型、影响因素、降低策略以及脱靶检测技术进行综述。

稻香相关基因OsBADH2在“吉粳88”中的基因编辑研究

周岩, 郭嘉, 胡玉锋, 魏健, 李毅丹

2020, 36(3): 88-94. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0740

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近年来稻米的香味品质受到消费市场的格外重视。水稻OsBADH2基因是影响稻米香味的重要基因,选择优质粳稻品种,针对该基因进行基因编辑,有望创制出香味品质优异的粳稻材料。本研究通过分析OsBADH2基因外显子序列的保守性,选择了3个特异性靶点,分别构建了U6启动子驱动的包含不同靶点的gRNA表达盒,并将其连入植物基因编辑表达载体。利用基因枪介导的瞬时转化体系,对非香型粳稻品种“吉粳88”进行遗传转化,T₀代共获得847株再生材料。经高分辨率溶解曲线（High Resolution Melting,HRM）分析和测序验证,24株T₀代材料的OsBADH2基因编辑靶点发生了不同类型的编辑。在T₁代材料中获得了7类不含转基因成分,且OsBADH2基因靶点纯合的基因编辑后代材料。本研究结果表明基于基因枪介导的瞬时转化体系,转化再生过程中省略了抗性筛选过程,并辅以高效的HRM检测,能够在T₁代即获得位点发生纯合编辑且无转基因成分的基因编辑后代材料。本研究获得的OsBADH2基因编辑的“吉粳88”后代材料也为培育香味品质改良的粳稻品种提供了新材料。

BE3型胞嘧啶碱基编辑器在谷氨酸棒杆菌中的开发用

黄华媚, 白立宽, 刘叶, 李俊维, 王猛, 花尔并

2020, 36(3): 95-101. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0956

摘要 ( 432 )

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碱基编辑技术结合了CRISPR/Cas系统的靶向特异性与碱基脱氨酶的催化活性,因其不产生双链DNA断裂、不需要外源DNA模板、不依赖同源重组修复,自开发以来,便受到研究者的追捧,在哺乳动物细胞、植物、微生物等领域相继得到开发与应用。为了进一步丰富碱基编辑系统在谷氨酸棒杆菌中的应用,将鼠源胞嘧啶脱氨酶（rAPOBEC1）与nCas9蛋白融合,实现了在谷氨酸棒杆菌中C到T的编辑,编辑比例较低（0-20%）;在上述融合蛋白C端添加UGI蛋白,构建BE3型胞嘧啶碱基编辑器,抑制体内的DNA碱基切除修复机制,显著的提高了碱基编辑效率,使得C到T的碱基编辑效率高达90%;为了简化操作,将双质粒碱基编辑系统优化为单质粒碱基编辑系统,并显著提高转化效率;最后通过单质粒碱基编辑系统对基因组中其他位点的编辑测试,进一步证明了BE3型碱基编辑器在谷氨酸棒杆菌中的高效性,同时发现该碱基编辑器具有较宽的编辑窗口（PAM上游-11到-19位）,有助于覆盖更多的基因组靶标位点,为谷氨酸棒杆菌的基因组改造提供了更多的工具选择。

CRISPR/Cas9慢病毒系统敲除胰岛β细胞PKA C-α的研究

何士俊, 万毅虹, 章嘉雯, 蔡秀潮, 刘静文, 刘叔文, 姚新刚

2020, 36(3): 102-109. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0534

摘要 ( 369 )

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利用CRISPR/cas9系统建立稳定敲除PKA C-α基因的INS-1细胞株,研究PKA C-α在胰岛β细胞中的功能。设计2个长25 bp且分别靶向PKA C-α基因的exon 5和exon 7的sgRNA,将其克隆至LentiCRISPRv2-sgRNA质粒并转染至293T细胞中制备sgRNA-Cas9慢病毒,慢病毒感染INS-1细胞,嘌呤霉素筛选出阳性细胞并采用有限稀释法筛选单克隆细胞,Western blotting印记法检测单克隆细胞中PKA C-α蛋白的表达水平,测序确认单克隆细胞中PKA C-α基因的突变位点。WB实验证实靶向Exon 5的sgRNA可成功敲除PKA C-α基因,得到稳定敲除PKA C-α基因的细胞株,测序结果表明该细胞株的PKA C-α基因发生1 bp碱基插入突变,并且敲除PKA C-α基因的INS-1细胞胰岛素分泌能力下降。本实验利用CRISPR/Cas9系统成功敲除INS-1细胞中的PKA C-α基因,为研究PKA C-α在胰岛β细胞中的功能奠定了基础。

构建基于CRISPR/Cas9技术敲除ALOX5的质粒

梅芬, 李瑞玮, 张娟娟, 左荣霞, 邹云莲, 沈涛, 撒亚莲

2020, 36(3): 110-114. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0270

摘要 ( 474 )

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旨在利用CRISPR/Cas9技术构建敲除花生四烯5-脂氧合酶基因（Arachidonate 5-lipoxygenase gene,ALOX5）的重组质粒。设计合成3对靶向敲除ALOX5第六外显子的sgRNA,将其分别插入到CRISPR/Cas9质粒骨架pX458载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α后挑取克隆,通过测序评估重组质粒是否构建成功。将构建好的重组质粒转染293T细胞,在荧光显微镜下观察转染效果,挑取转染成功的细胞,用试剂盒提取转染细胞基因组DNA,PCR扩增含敲除位点的DNA片段,用测序技术获得核苷酸序列,用DNAStar软件分析转染细胞中ALOX5基因敲除情况。测序结果表明2对双链sgRNA寡核苷酸已插入质粒,且序列正确,靶向ALOX5 基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5构建成功。其在293T细胞中的转染效率约为50%,用一代测序法未检测到sgRNAs的切割效果。初步表明利用CRISPR/Cas9技术成功构建靶向ALOX5 基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5。

利用CRISPR/Cas9技术构建大鼠L2细胞α-ENaC基因敲除稳定细胞株

王松, 李鹏程, 白朝辉, 许宏鑫, 应研敏, 张墨, 白义春

2020, 36(3): 115-123. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0919

摘要 ( 398 )

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利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建大鼠L2细胞α-ENaC基因敲除的细胞株,研究α-ENaC基因对细胞增殖的影响。构建敲除α-ENaC基因的CRISPR/Cas9表达载体和筛选报告载体,通过转染和嘌呤霉素筛选获得单克隆细胞株,Western Blot、测序确定突变的细胞株,CCK-8检测突变细胞株的增殖活力。成功构建靶向α-ENaC基因第一外显子的CRISPR/Cas9表达载体和筛选报告载体,嘌呤霉素筛选后,挑选8个单细胞克隆中有两个单细胞克隆α-ENaC蛋白表达下降,一个单细胞克隆α-ENaC蛋白不再表达,测序结果显示3个单细胞克隆分别为2个单等位基因突变和1个双等位基因突变,且未发现脱靶现象。突变细胞株的增殖活力降低,其中双等位基因突变细胞株增殖活力降低更为显著。因此,利用CRISPR/Cas9结合SSA-RPG报告载体成功获得了α-ENaC基因敲除的L2细胞株,α-ENaC与细胞增殖有关。

不同植茶年限茶树根际土壤细菌多样性及群落结构研究

许广, 王梦姣, 邓百万, 郭苗苗

2020, 36(3): 124-132. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0862

摘要 ( 562 )

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运用传统培养法和高通量测序技术研究不同植茶年限（5年、10年、20年）茶树根际土壤细菌的多样性、结构和组成,并分析茶树土壤理化性质与细菌群落的相关性,为改善茶树的土壤和提高茶树产量提供参考。结果表明：两种方法均指出不同植茶年限下的根际细菌群落结构存在显著性差异,5年和10年茶树细菌多样性显著高于20年茶树细菌;培养法得出厚壁菌门（Firmicutes）和芽孢杆菌属（Bacillus）为优势门属,高通量测序技术得出酸杆菌门（Acidobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和Candidatus_Udaeobacter属为优势门属;总氮（TN）、总钾（TK）、总磷（TP）、pH是影响茶树细菌群落的关键理化因子;随着植茶年限增加,要采取措施防止土壤酸化,适当增施氮肥和磷肥。

外源硫对镉胁迫下马齿苋光合性状和矿质元素吸收的影响

王竹承, 刘辉, 李荣华

2020, 36(3): 133-140. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0672

摘要 ( 348 )

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从光合反应系统揭示外源硫（S）诱导马齿苋镉（Cd）耐受性的生理机制,为外源S缓解重金属毒害提供理论依据。采用营养液培养,研究外源S供体（NH₄）₂SO₄对100 mg/L Cd胁迫下马齿苋叶片光合色素、光合特性、叶绿素荧光参数和矿质营养元素的影响。结果表明,Cd胁迫可显著降低马齿苋叶片中叶绿素a和叶绿素b含量;净光合速率、蒸腾速率、气孔导度均显著降低,而胞间二氧化碳浓度上升,表明非气孔因素是Cd胁迫诱导马齿苋光合抑制的主要因素;同时,PSⅡ实际光化学效率（Ф_PSII）、电子传递效率（J）、化学猝灭系数（q_P）显著下降,而非化学猝灭系数（q_N）显著上升,表明Cd胁迫影响马齿苋PSⅡ反应系统的正常运行。外施400 mg/L（NH₄）₂SO₄显著提高马齿苋叶片叶绿素a含量、叶绿素b含量和叶绿素a/b比值,增强马齿苋叶片光合作用和PSⅡ原初光化学反应量子效率。对5种与光反应系统密切相关的矿质元素含量进行分析发现,Cd处理显著增加马齿苋叶片中的Ca和Fe含量,显著抑制马齿苋对Mg、Mn和Cu的吸收。Cd胁迫下马齿苋叶片的变黄与Mg、Mn的亏缺有关,而与Fe缺乏无关;添加外源S可显著提升马齿苋叶片中Ca、Mg、Fe、Cu和Mn含量,从而增强Cd胁迫下马齿苋叶片的PSII反应系统功能。

杨树根际解无机磷细菌Mp1-Ha4的鉴定及其解磷机理

韩雪娇, 曾庆伟, 赵玉萍

2020, 36(3): 141-147. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0952

摘要 ( 330 )

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解无机磷细菌能够溶解土壤中的难溶性磷酸盐,增加土壤有效磷含量,促进植物生长。以一株杨树根际土壤中筛选得到的解无机磷细菌Mp1-Ha4为研究对象,利用分子生物学的方法对该菌株进行鉴定,测定了其对磷酸钙、磷酸铝和磷酸铁的解磷能力,并对该菌株9 d内的磷酸钙溶解动力学进行了研究。结果表明,解无机磷细菌Mp1-Ha4为一株西地西菌Cedecea sp.,其对磷酸钙的溶解能力远强于对磷酸铝和磷酸铁的溶解能力。在NBRIP液体培养基中,该菌株对磷酸钙的溶解能力达到了497.4 mg/L,在其对磷酸钙解磷过程中,培养基pH及可滴定酸度与解磷量分别呈显著负、正相关。高效液相色谱分析显示,该菌株在解磷过程中分泌了大量有机酸,主要包括α-酮戊二酸,酒石酸和苹果酸。分泌有机酸,降低环境pH可能是解无机磷细菌西地西菌（Cedecea sp.）Mp1-Ha4溶解难溶性磷酸盐的主要机制,同时该菌株对磷酸钙的高效溶解作用使其具有较大的研究和应用前景。

嗜酸乳杆菌S-层蛋白联合抗生素对Escherichia coli和Staphylococcus aureus的抑制作用研究

张晓晖, 王毅, 李慧芳, 高佳丽

2020, 36(3): 148-152. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0559

摘要 ( 379 )

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旨在检测嗜酸乳杆菌S-层蛋白以及S-层蛋白与抗生素联用对大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑制作用。采用液体发酵培养法获得嗜酸乳杆菌菌体,LiCl法提取S-层蛋白粗提物,凝胶过滤层析法纯化S-层蛋白,分别用E.coli和S.aureus处理Caco-2细胞2 h后,考察S-层蛋白在不同浓度和不同作用时间条件下对E.coli和S.aureus的抑制作用,并考察S-层蛋白联合抗生素对E.coli和S.aureus的抑制作用,实验分组：（1）空白对照;（2）嗜酸乳杆菌组;（3）S-层蛋白组;（4）抗生素组;（5）嗜酸乳杆菌+抗生素组;（6）S-层蛋白+抗生素组。结果显示,液体发酵得到嗜酸乳杆菌菌体,提取并纯化得到S-层蛋白;S-层蛋白对E.coli和S.aureus有很好的抑制效果,具有浓度依赖性,高浓度下抑制率达到42.2%和31.7%,差异极显著（P<0.01）,且在E.coli和S.aureus作用的短时间内干预效果明显,0 h时的抑制率分别达到59.3%和48.4%;S-层蛋白联合抗生素的抑菌率分别达到81.7%和79.3%,差异极显著（P<0.01）,效果优于单独使用抗生素。嗜酸乳杆菌S-层蛋白具有较强的抑菌作用,可以与抗生素联用,有望开发称为一种新型的抗菌药物。

人源溶菌酶在大肠杆菌中的表达与复性研究

张春晨, 胡双艳, 阮海华

2020, 36(3): 153-161. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0680

摘要 ( 426 )

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人源溶菌酶（Human lysozyme,HLZ）是一种糖苷水解酶,具有抗菌消炎的作用,其作为抗生素的替代品,已经被广泛应用于食品业、畜牧业和医疗等领域。如何获得高产量、高活性、高纯度的人源溶菌酶一直是亟待解决的技术问题。优化人源溶菌酶编码基因密码子,提高其在大肠杆菌中的适应度和表达量;将优化的基因克隆至大肠杆菌表达质粒pET21a,并将其在大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中诱导表达;利用8 mol/L尿素溶液对包涵体进行溶解变性后,探究一步透析、梯度透析和梯度稀释3种复性方式以及复性液中谷胱甘肽氧化还原对（GSSG/GSH）、精氨酸、甘油等复性物的浓度对重组人源溶菌酶复性的效果,获得最佳的复性方案。研究结果表明：37℃诱导温度下,利用0.5 mmol/L IPTG成功诱导了分子量约为14.7 kD的重组人源溶菌酶的表达,包涵体表达量约为380 mg/L（湿重）。包涵体经一步透析、梯度透析和梯度稀释3种复性方式复性后,测得比活力值分别为147 U/mg、335 U/mg、176 U/mg,表明最佳复性方法为梯度透析复性法。进一步探索了复性液中GSSG/GSH比值、精氨酸浓度、甘油浓度对人源溶菌酶复性效果的影响,表明当复性液中同时添加浓度比为1∶2的GSSG/GSH、4 mmol/L精氨酸和6%甘油时,复性后人源溶菌酶的最佳比活力值为1 170 U/mg,显著高于3种复性物均不加时溶菌酶335 U/mg的比活力值,但低于溶菌酶标准品1 732 U/mg的比活力值。成功地将人源溶菌酶基因在大肠杆菌中表达,并通过包涵体复性体系成功获得高活性重组人源溶菌酶。

烟草水提物对果蝇寿命及有关基因转录的影响

白谨铭, 赵子翔, 秦嘉晨, 刘鉴辉, 梁爱博

2020, 36(3): 162-167. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0644

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探究烟草的水浸泡液对果蝇寿命与衰老情况的影响以及其中的分子机制。取羽化12 h内的新生W¹¹¹⁸系雄果蝇,分别培养于添加不同浓度烟草浸出液的培养基中处理,每日统计果蝇死亡情况;每7日提取对照组与最高浓度处理组果蝇全RNA,通过Real-time PCR检测过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、去泛素化酶（Rpn11）和去乙酰化酶（Sirt6）等与寿命有关基因的表达水平变化。结果显示,烟草影响使雄果蝇寿命显著缩短,且影响随烟草提取液浓度增加影响逐渐增大;烟草影响下果蝇的抗氧化基因出现显著上调,泛素化调节基因与去乙酰化基因等表达水平的变化均出现显著改变。表明烟草对果蝇的寿命情况有不利影响,可能通过引起氧化胁迫导致果蝇早衰。

小鼠精原细胞分化的蛋白质组学研究

李堃, 刘悦, 黄鹏, 杨智昉, 胡茜, 张颖, 李志宏, 吕叶辉, 梁乐

2020, 36(3): 168-176. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0640

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对小鼠睾丸中未分化（Undifferentiated）和分化中（Differentiating）的两类精原细胞进行定量蛋白质组研究,探讨两类精原细胞蛋白质组的表达差异,探索与精原细胞分化相关的蛋白质。利用Thy1和c-Kit两个特异抗体结合的磁珠分选技术,分别将生后7 d雄性小鼠睾丸中的Thy1+细胞和c-Kit+细胞分别作为未分化和分化中的精原细胞分选出来,其中Thy1阳性细胞3组,c-Kit阳性细胞4组,分别代表了未分化精原细胞和分化中的精原细胞。采用高效液相色谱串联质谱方法（LC-MS/MS）分析两类细胞蛋白表达差异。并且对两类细胞的差异蛋白进行基因本体（Gene ontology,GO）功能注释、KEGG代谢通路和聚类分析。质谱分析共鉴定了3 228种蛋白,其中有256种蛋白在两类细胞中表达差异。其中,差异蛋白的富集分析发现,在生物过程方面,注释结果显示差异蛋白主要在代谢过程（Primary metabolic process）,细胞代谢过程（Cellular metabolic process）,分子代谢过程（Macromolecule metabolic process）和氮化合物代谢过程（Nitrogen compound metabolic process）中富集;在细胞组分方面,蛋白主要富集在细胞（Cell part）、细胞内组分（Intracellular part）和细胞器（Intracellular organelle）中;在分子功能方面,鉴定到的蛋白主要参与蛋白结合（Protein binding）、核苷结合（Nucleotide binding）、水解酶活性（Hydrolase activity）和核酸结合过程（Nucleic acid binding）。基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路注释结果显示：88个蛋白质在KEGG通路分析数据库中有功能注释,共参与了18条代谢通路,其中,最主要的代谢通路是剪接体（Spliceosome）和泛素介导的蛋白水解作用（Ubiquitin mediated proteolysis）。获得小鼠睾丸中未分化和分化中的两类精原细胞蛋白质组表达谱,揭示精原细胞分化的蛋白质组的组成、筛选出差异蛋白。

重组白介素2对红鳍东方鲀的血液生化指标及免疫指标的影响

保明秀, 藏林, 张红斌, 刘福君, 荆笛, 王秀利

2020, 36(3): 177-182. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0916

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为研究重组白介素2（Recombinant interleukin-2,r IL-2）对红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）血液生化指标及免疫指标的影响,选用体重为（205.9±30.5）g的红鳍东方鲀进行了重组白介素2的免疫应答实验。设计r IL-2免疫剂量为2.5、5、7.5、10 μg,并在免疫后的4 h、8 h和12 h进行采血。结果表明：经r IL-2免疫后红鳍东方鲀血清中尿素氮含量在各个浓度组的8 h时间点显著高于同组内其它时间点（P<0.05）,4 h时间点甘油三酯含量有随着免疫浓度增加而增加的趋势,谷草转氨酶活性在8 h时间点要显著高于其他时间点（P<0.05）,2.5 μg、5 μg浓度组过氧化氢酶的活性在4 h时间点显著高于其他各组（P<0.05）,对免疫球蛋白的含量也有显著影响。本研究发现,r IL-2的免疫可引起血液生化指标和免疫指标的变化,尤其是超氧化物歧化酶和谷草转氨酶的变化较为显著（P<0.05）,可在一定程度上促进红鳍东方鲀的免疫反应。

军曹鱼催乳素受体PRLR1基因的克隆及其在不同盐度条件下mRNA 表达差异

黄宝松, 李金凤, 张野, 曹丹煜, 卢晓颖, 陈刚, 王忠良

2020, 36(3): 183-192. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0813

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催乳素受体通过结合催乳素,能调节鱼体渗透压。为研究催乳素受体1（PRLR1）在高盐水体和低盐水体中对军曹鱼（Rachycentron canadum）的渗透调节作用,利用cDNA末端快速扩增（RACE-PCR）技术,获得了军曹鱼PRLR1全长cDNA序列。该基因全长为2 629 bp,包含1 953 bp的开放阅读框ORF,可编码650个氨基酸。氨基酸序列包含了2个纤维连接蛋白3型结构域（FN3）、保守的WS区和box1。采用qRT-PCR技术,检测不同盐度（10‰、30‰和35‰）条件下鳃、肠、体肾中PRLR1基因mRNA表达情况。结果显示,PRLR1基因在军曹鱼的各个组织中均有表达,其中鳃表达量最高,其次是肌肉、体肾和肠,而在胃、脾、脑和心脏中则微量表达。低盐组、正常组和高盐组中,PRLR1基因的表达量均为鳃最高;肠次之;体肾最低。随着盐度提高,PRLR1基因的鳃、肠和体肾组织表达量变化规律均呈逐步下降趋势。以上结果反映了军曹鱼PRLR1在渗透压器官中的功能差异性,说明PRLR1在军曹鱼渗透压调节上具有重要作用。

牛奶过敏原β- 乳球蛋白的重组制备及磁微粒化学发光检测法的建立

杭鑫茹, 耿荣庆, 钱林

2020, 36(3): 193-198. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0661

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运用原核系统表达牛奶β-乳球蛋白（Bos d5）蛋白,建立一种纳米磁微粒化学发光方法用于检测牛奶组分过敏原β-乳球蛋白特异性Ig E抗体的含量。通过优化合成牛奶β-乳球蛋白基因,与质粒重组导入Rosetta原核表达菌株中表达目标蛋白,纯化的重组蛋白采用生物素标记后,在化学发光平台上进行过敏原项目检测。获得纯度﹥85%的22.5 kD重组牛β-乳球蛋白,将生物素化的重组蛋白用于牛奶β-乳球蛋白纳米磁微粒检测试剂盒,检测临床110例血清样本,和Phadia进行方法学比对阳性符合率为88.9%,阴性符合率97.3%,总符合率94.5%,P<0.001,χ²=84.238,Kappa=0.874,其与Phadia参照试剂盒同样具有良好的检测能力。原核表达系统中获得的重组牛奶过敏组分β-乳球蛋白具有较好的免疫活性,开发的免疫诊断试剂盒具备良好的性能,可用于临床辅助诊断。

2020, 36(3): 199-199.

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2020, 36(3): 200-200.

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2020, 36(3): 201-201.

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