生物技术通报

植物线虫病害：我国粮食安全面临的重大挑战

彭德良

2021, 37(7): 1-2.

摘要 ( 516 )

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植物寄生线虫基因组学研究进展

彭焕, 赵薇, 姚珂, 蒋陈, 黄文坤, 孔令安, 郑经武, 彭德良

2021, 37(7): 3-13. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0710

摘要 ( 713 )

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植物寄生线虫是农作物主要病原物之一,每年造成作物大幅度减产和严重的经济损失。植物寄生线虫基因组学研究在揭示植物线虫与寄主互作分子机制和作物抗线虫品种的培育中发挥着不可替代的作用。随着高通量测序技术的广泛应用,多种重要的植物寄生线虫的基因组被破解和报道。在此基础上,通过比较基因组学进一步揭示了植物寄生线虫的起源和进化,功能基因组学的研究也取得了一系列重要的进展。本文对目前已报道的植物寄生线虫基因组的研究进展进行总结,在各基因组的基本特征、染色体组变异、串联重复序列、基因表达调控与基因协同表达、水平基因转移、效应蛋白发现和功能研究及基因家族扩张等方面进行综述,以期为植物线虫致病分子机制研究及防控新策略制定提供参考。

寄主对大豆孢囊线虫抗性相关基因功能研究进展

韩少杰, 郑经武

2021, 37(7): 14-24. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0627

摘要 ( 626 )

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大豆在我国国民经济中扮演着重要角色,目前我国是全球最大的大豆消费国、进口国,且进口大豆数量逐年递增。大豆孢囊线虫病是威胁全球主要大豆产地的重要病害,每年全球范围内造成超过数十亿美元经济损失,防控形势严峻。抗性品种的种植是防控大豆孢囊线虫病最经济有效的措施。然而,单一抗性品种的过度使用及大豆孢囊线虫生理小种不断演化,导致抗性降低,威胁大豆产业安全。随着生物技术的发展,大豆孢囊线虫抗性机制研究不断深入,在遗传学、转录组学、蛋白功能等相关方面的研究取得了长足进展。本文综述了已知的大豆主要抗性位点（Rhg1和Rhg4）的抗性机制及囊泡运输、植物激素通路与大豆孢囊线虫抗性产生的关系,讨论了相关功能蛋白对大豆抗性的意义以及研究方向上可能存在的问题,最后展望了该领域的后续研究。相关的研究将有利于充分发掘大豆优良抗性基因,为抗大豆孢囊线虫转基因大豆新种质创制奠定理论基础,服务于我国大豆产业的长久安全发展。

植物响应寄生线虫侵染机制的研究进展

邓苗苗, 郭晓黎

2021, 37(7): 25-34. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0669

摘要 ( 476 )

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植物寄生线虫（plant parasitic nematode,PPN）是一类重要的植物病原物,它们分布广泛,适应性强,通过与寄主植物建立长期、稳定的寄生关系对粮食作物、园艺作物以及森林植物构成严重危害。其中,根结线虫（root-knot nematode,RKN）和孢囊线虫（cyst nematode,CN）是影响最大研究最多的2类定居型植物内寄生线虫,其侵染方式、取食细胞的形成及繁殖方式等存在很多差异,导致这两种PPNs在侵染植物后会对寄主产生多种不同的影响。近年来在线虫抗病基因克隆、效应蛋白作用机制、寄主响应等方面取得了大量研究进展。本文将对CNs和RKNs与植物互作的机理进行概括总结,主要从寄主抗病基因、线虫分泌蛋白以及植物激素响应3个方面侧重比较CNs和RKNs之间存在的差异,并对相关理论研究结果在线虫防治中的潜在应用进行展望。

植物寄生线虫对化感信号的识别及机制

李春杰, 王从丽

2021, 37(7): 35-44. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0514

摘要 ( 602 )

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寄主根部及其根际微生物释放的化感信号物质是植物寄生线虫寻找、定位和侵染植物的重要线索。目前,寻找植物寄生线虫预侵染阶段的化感信号物质以及相关的分子靶标研究,以期开发植物源和线虫源杀线虫剂是线虫学家的国际研究热点和前沿。本文重点综述了植物寄生线虫对化感信号识别机制的国内外研究进展。首先定义了植物寄生线虫对化感信号的识别或者趋化性,列出了近些年所报道的主要化感信号物质;对经济上最重要的两种植物寄生线虫（根结线虫和大豆孢囊线虫）的趋化性进行了比较;再进一步以模式秀丽隐杆线虫的化感功能为基础,论述了植物寄生线虫趋化性的分子调控研究进展;讨论了植物寄生线虫化感信号转导的潜在机制及其研究意义和难度;最后,对植物寄生线虫化感信号识别机制的重要研究方向及前景进行总结和展望。

腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor Thorne,1945）生物学研究进展

赵洪海, 梁晨, 张浴, 段方猛, 宋雯雯, 史倩倩, 黄文坤, 彭德良

2021, 37(7): 45-55. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0600

摘要 ( 676 )

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腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor Thorne,1945）是世界上重要的植物病原线虫和我国全国农业植物检疫性有害生物,为害甘薯、马铃薯、大蒜等多种地下结实作物,在许多杂草和真菌上也能生长和繁殖。腐烂茎线虫喜凉怕热、喜湿怕干,主要通过寄主作物的无性繁殖材料传播和扩散。在不同作物上,它的田间持续存活、侵染和损害表现存在明显差异,但相关原因和机制不甚明确。本文综述了腐烂茎线虫的地理分布、寄主范围、生殖发育、侵染循环、环境适应能力及其存活寄生相关分子机制,指出了需要深入探讨的主要问题,有望为这种危险性有害生物的预警防控研究和实践提供新的思路和有用参考。

植物激素对植物寄生线虫取食位点建立与发育的影响

黄文坤, 于敬文, 贾建平, 彭德良

2021, 37(7): 56-64. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0332

摘要 ( 489 )

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根结线虫（Meloidogyne spp.）和孢囊线虫（Heterodera spp.）是对农业生产危害最大的两类内寄生线虫。线虫入侵植物后,通过在取食位点形成巨细胞或合胞体汲取营养、完成生活史。植物通过控制生长素、乙烯、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸等植物激素水平,与侵入体内的线虫建立起良好的互作关系。本文从线虫取食位点建立与形成、植物激素相关基因在线虫取食位点的表达与调控方式、植物激素对线虫取食位点建立与形成的影响等方面进行综述,对植物激素在线虫取食位点的协同作用相关问题及最新研究进行探讨,以揭示植物激素对植物寄生线虫取食位点建立与发育的影响,为深入开展作物线虫病害的综合治理提供参考。

非编码RNA在生防菌-植物线虫-寄主互作中的研究进展

陈立杰, 杨帆, 范海燕, 赵迪, 王媛媛, 朱晓峰, 刘晓宇, 段玉玺

2021, 37(7): 65-70. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0501

摘要 ( 468 )

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植物线虫是世界农业上危害最严重且最难防治的病原物之一,可以寄生多种植物,每年造成数十亿美元损失。生防菌可以激发植物的一些抗病基因表达,从而激活某些免疫途径,对植物线虫的侵染、发育产生抑制作用。这种特性使植物-生防菌-线虫三者构成全新的生物调控关系,成为植物免疫研究的新模型。非编码RNA是生物学领域热点研究内容,其可能参与了植物线虫和其他生物如生防微生物等调控植物免疫的反应。本文综述了miRNA、lncRNA和circRNA等在微生物、植物线虫与寄主互作过程中研究现状;阐述了miRNA作为新兴的基因表达转录后调节因子在影响植物发育、调控植物免疫反应上的作用;进一步介绍了假单胞菌诱导植物体内的miRNA和lncRNA产生变化,从而使这些非编码RNA参与到生防菌激活植物免疫反应的过程;最后展望了生防菌调控植物免疫抵抗线虫侵染研究发展方向。

4-香豆酸辅酶A连接酶响应大豆孢囊线虫胁迫的潜在功能

王惠, 张顺斌, 金贺, 王晗, 张耕华, 夏诗宁, 陈井生, 段玉玺

2021, 37(7): 71-80. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0378

摘要 ( 471 )

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大豆孢囊线虫是大豆产区病虫害防治策略的重要目标之一,大豆孢囊线虫的防控也一直是线虫领域研究热点之一。大豆孢囊线虫侵染不仅会造成大豆地下部分损伤,也使得地上部分受损从而影响其产量,因此需对大豆孢囊线虫的抗性机制进行分析以达到防控的目的。大豆孢囊线虫成功寄生宿主植物需对其细胞壁进行降解融合,形成为其生长发育提供唯一营养来源的合胞体。而阻碍大豆孢囊线虫移动和合胞体建立的细胞壁抗性是大豆抵御大豆孢囊线虫的关键,其中木质素是细胞壁发挥抗性的重要成分。木质素的生物合成主要包括莽草酸代谢途径、苯丙烷代谢途径和木质素合成的特异途径,4-香豆酸辅酶A连接酶（4-coumarate-Coenzyme A ligase,4CL）作为连接苯丙烷代谢途径和木质素特异合成途径的重要转折酶,决定了木质素的合成,其很可能是响应大豆孢囊线虫胁迫的重要调控因子。本文从线虫入侵需要细胞壁降解融合建立合胞体出发,围绕木质素导致的细胞壁抗性展开讨论,分析了4CL在细胞壁抗性中的响应机制,为进一步探索大豆孢囊线虫胁迫机制提供科学依据。

植物寄生线虫钙网蛋白的研究进展

魏英, 罗萌, 戴良英, 彭德良, 刘敬

2021, 37(7): 81-87. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0583

摘要 ( 422 )

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植物寄生线虫是一类专性活体寄生物,主要寄生植物根部,严重影响植物生长发育,给我国农业生产造成巨大的损失。钙网蛋白是一种定位于真核细胞内质网中的多功能蛋白,具有3个功能结构域：N-功能域、P-功能域、C-功能域。迄今已发现的植物寄生线虫钙网蛋白主要来自于南方根结线虫、禾谷孢囊线虫、水稻干尖线虫、香蕉穿孔线虫、马铃薯茎线虫和松材线虫等。本文通过对植物寄生线虫钙网蛋白的结构特点、体内转录位点、抑制防御反应和促进寄生等方面进行了综述,以加深对钙网蛋白在线虫侵染植物过程中功能的了解,为植物线虫病害防治方法提供理论基础。

线虫效应子MgMO237及互作蛋白OsCRRSP55在水稻中的共响应基因鉴定

李治文, 刘培燕, 陈建松, 廖金铃, 林柏荣, 卓侃

2021, 37(7): 88-97. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0508

摘要 ( 530 )

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前期研究表明拟禾本科根结线虫效应子MgMO237与水稻OsCRRSP55蛋白互作,抑制水稻对根结线虫的防卫反应。植物CRRSPs蛋白参与植物的生物和非生物胁迫响应,因此研究MgMO237与OsCRRSP55相互作用对下游基因表达的影响可为阐明水稻对根结线虫的防卫反应机制提供理论依据。生物信息学分析表明OsCRRSP55蛋白有N端信号肽,没有跨膜结构域,具两个DUF26结构域及一保守基序C-X8-C-X2-C。RT-qPCR分析显示OsCRRSP55在水稻根中表达,且在拟禾本科根结线虫侵染7 d后的根结中表达显著上调。水杨酸和茉莉酸显著提高水稻OsCRRSP55及其启动子结合转录因子OsWRKY47的表达。转录组测序结果显示茉莉酸响应基因OsERF87在MgMO237转基因植株中表达显著下调,而RT-qPCR检测发现OsERF87在OsCRRSP55转化水稻原生质体中表达显著上调,表明茉莉酸响应基因OsERF87是OsCRRSP55和MgMO237的共响应基因。该结果表明拟禾本科根结线虫效应子MgMO237可能通过水稻OsCRRSP55蛋白调控茉莉酸激素信号传导,从而抑制植物对线虫的防卫反应。

苜蓿滑刃线虫线粒体基因组及其系统发育研究

薛清, 杜虹锐, 薛会英, 王译浩, 王暄, 李红梅

2021, 37(7): 98-106. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0628

摘要 ( 449 )

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苜蓿滑刃线虫（Aphelenchoides medicagus）是一种兼性植物寄生线虫,可在多种真菌上完成生活史,同时对大豆和苜蓿具有弱寄生性。本研究采用Illumina平台对苜蓿滑刃线虫进行低覆盖全基因组测序,从获得的全基因组序列中提取线粒体基因,并利用“种子”序列进行组装;同时对其中富含AT的非编码部分进行PCR扩增与Sanger测序,将扩增与组装的结果进行拼接,共获得14 411 bp的线粒体基因组。基因注释结果显示,苜蓿滑刃线虫共有蛋白编码基因12个,tRNA基因22个,rRNA基因2个,其基因构成和排列与贝西滑刃线虫（A. besseyi）、松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）及拟松材线虫（B. mucronatus）完全相同。基于氨基酸序列的系统发育显示,苜蓿滑刃线虫与贝西滑刃线虫互为姐妹群,且与松材线虫、拟松材线虫处在高度支持的滑刃线虫科单系中。本研究表明,低覆盖全基因组测序法可以成功组装出线粒体基因组的大部分序列,证明了利用该方法获取线虫线粒体全基因组序列的可行性。

马铃薯腐烂茎线虫Dd-mel-26基因的克隆与功能分析

高波, 马娟, 李秀花, 李焦生, 王容燕, 陈书龙

2021, 37(7): 107-117. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0599

摘要 ( 386 )

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为更深入地了解马铃薯腐烂茎线虫并寻找具有RNAi应用价值的靶标基因资源,本研究从马铃薯腐烂茎线虫基因库中选取了一个潜在致死基因底物特异性适配体基因Dd-mel-26。利用RACE技术对该基因进行了克隆,并通过生物信息学、荧光定量PCR技术以及dsRNA体外浸泡诱导线虫靶基因沉默的方法对该基因进行了功能分析。结果显示,Dd-mel-26基因的cDNA全长为1 594 bp,包含一个1 158 bp的开放阅读框,预测编码一个含385个氨基酸的蛋白质,分子量为43.52 kD,等电点为5.4。基因组结构中包含10个外显子和9个内含子序列。Dd-MEL-26蛋白属于MATH-BTB蛋白家族,不具有信号肽,预测其在细胞核中与相关的蛋白互作从而行使其功能。系统进化分析结果显示Dd-MEL-26蛋白与植物寄生线虫聚为一组,且与象耳豆根结线虫（Meloidogyne enterolobii）的亲缘关系最近。通过dsRNA体外浸泡法将该基因沉默后显著地增加了线虫的繁殖量和垂直迁移力。因此,Dd-mel-26基因在一定条件下可以正调控马铃薯腐烂茎线虫的繁殖和垂直移动,但将该基因做为RNAi靶标从而实现对该线虫的防治可能需要更加深入的研究。

不同基因型腐烂茎线虫群体杂交后代分子特征比较

倪春辉, 李惠霞, 李文豪, 刘永刚, 徐雪芬, 韩变

2021, 37(7): 118-126. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0576

摘要 ( 385 )

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为了明确不同基因型腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）是否具有生殖隔离及杂交后代的变异程度,选用1条3-4龄幼虫与5条雄虫,将不同基因型群体进行生物学杂交,对F1代数量、ITS-rDNA序列及其二级结构比对分析。结果表明,杂交产生F1代数量普遍较少,不同基因型杂交组合F1代线虫数量≤6条/处理,部分组合的后代仅为1条。因F1代数量较少,11个杂交组合中获得5个F1代群体的ITS-rDNA序列,不同基因型杂交F1代与其亲本ITS-rDNA序列均存在0-86 bp的碱基差异,且其二级结构与亲本也有差异,核糖体ITS-RFLP结果呈现丰富的多态性,系统发育分析发现部分F1代群体与父本亲缘关系较近,部分与母本较近。不同基因型群体未发现生殖隔离,杂交F1代的变异主要出现在ITS1区H9螺旋区域,且变异程度与亲本间的差异呈正比。本研究通过模拟试验分析了腐烂茎线虫不同群体扩散后可能产生的杂交代基因型分化,研究结果对于腐烂茎线虫遗传多样性研究和防治实践均具有参考价值。

大豆孢囊线虫生防菌株Myrothecium verrucaria ZW-2发酵条件优化及活性物质分析

陈倩, 张露源, 陈伯昌, 吴海燕

2021, 37(7): 127-136. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0454

摘要 ( 443 )

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疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria）ZW-2菌株对大豆孢囊线虫具有（Heterodera glycines）明显的杀线虫活性,为了确定该菌株的最优发酵条件以及代谢产物,采用4因素3水平的正交试验进行了发酵条件优化以及代谢组学分析。结果表明：菌株ZW-2以Czapek培养基为基础培养基,最佳培养温度为28℃,摇床转速为180 r/min,装瓶量为100 mL,培养基pH为8,最佳碳源和氮源为蔗糖和硝酸钠。经代谢组学分析,根据代谢物质荷比、精确分子量及一级碎片离子得分等信息共筛选出20种差异代谢物,包括酰胺类化合物和脂肪族化合物。菌株ZW-2上述试验结果为进一步开发利用该菌株提供重要的理论和应用价值。

淡紫紫孢菌亲环蛋白PlCYP6 互作蛋白的筛选

刘娟, 朱春晓, 肖雪琼, 莫陈汨, 王高峰, 肖炎农

2021, 37(7): 137-145. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0010

摘要 ( 392 )

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以淡紫紫孢菌中参与盐胁迫响应的亲环蛋白PlCYP6 为研究对象,采用免疫沉淀联合质谱分析及酵母双杂交等技术筛选淡紫紫孢菌中与PlCYP6 互作的蛋白。结果显示,受PlCYP6 特异钓取的482 个蛋白的功能主要涉及细胞代谢。其中,乙醇脱氢酶1（alcohol dehydrogenase I,ADH1）与PlCYP6 直接互作,且PlCYP6 的WD40 repeat 结构域为二者间互作的关键区域。同时,PlCYP6 和ADH1 均受NaCl 胁迫诱导表达。上述研究结果表明,ADH1 为PlCYP6 的候选互作蛋白,这为进一步解析淡紫紫孢菌响应盐胁迫机制奠定了基础。

水稻抗潜根线虫基因OsRAI1的克隆及功能分析

山草梅, 叶蕾, 张连虎, 况卫刚, 孙晓棠, 马建, 崔汝强

2021, 37(7): 146-155. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0362

摘要 ( 550 )

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水稻潜根线虫病是江西省水稻生产上危害严重的病害之一。前期通过对水稻细尖潜根线虫侵染抗/感病水稻品种的根部组织进行比较转录组分析,筛选出差异表达上调基因OsRAI1。本研究克隆获得OsRAI1全长,通过蛋白结构预测、亚细胞定位对其功能进行分析,通过IPTG诱导,对OsRAI1蛋白表达条件进行了优化。结果表明,OsRAI1基因ORF全长1 065 bp,编码354个氨基酸,属于bHLH转录因子家族。该蛋白为亲水性蛋白,分子量37.90 kD,pI值4.86,脂肪系数68.33,总平均亲水性（GRAVY）-0.415,为非跨膜蛋白。蛋白互作预测显示该蛋白可能是通过两个蛋白间HLH区域相互结合作用。亚细胞定位结果表明该蛋白在细胞核中表达。可溶性蛋白在0.6 mmol/L IPTG 16℃诱导18 h后表达量最高。本研究结果为进一步阐明水稻抗潜根线虫分子机制奠定基础。

土壤生物熏蒸对蔬菜根结线虫及土壤线虫群落的影响

金娜, 王学艳, 刘倩, 彭德良, 彭焕, 简恒

2021, 37(7): 156-163. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0670

摘要 ( 499 )

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根结线虫是威胁农业生产的重要病原物。在田间研究了甘蓝生物熏蒸对番茄根结线虫的防治效果,并利用悬浮离心法分离土壤线虫,评价生物熏蒸对土壤线虫群落的影响。结果表明：甘蓝熏蒸可以降低根结线虫对番茄的危害,在定植60和90 d时防治效果分别达58.6%和45.8%,防效与化学农药噻唑膦相当。此外生物熏蒸可以增加土壤中的食细菌类线虫和捕食/杂食类线虫数量,降低土壤食真菌类线虫和植物寄生类线虫数量,增加土壤自由生活线虫丰富度指数MI,降低植物寄生线虫成熟度指数PPI和PPI/MI指数,说明甘蓝生物熏蒸对植物寄生线虫有一定的抑制作用,降低了土壤受到干扰的次数和强度,对土壤生态环境起到了积极作用。研究结果表明甘蓝生物熏蒸可以有效防治蔬菜根结线虫,是一种对生态环境友好的绿色防控技术。

植物源与微生物源生物制剂复配防治根结线虫病

舒洁, 张仁军, 梁应冲, 陈雅琼, 张娟, 郭建, 陈穗云

2021, 37(7): 164-174. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0408

摘要 ( 478 )

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番茄根结线虫病严重影响农业生产,利用植物源和微生物源两种不同的生物制剂复配防治番茄根结线虫病,试图探索出适应绿色农业生产需求的一种新的可能性。通过稀释涂布平板法从土壤分离出3株12 h内对根结线虫二龄幼虫（second-stage juveniles,J2）抑杀率分别达89.23%、87.95%、88.97%的生防菌株SJ5、SJ17、SJ19,经16S rDNA扩增测序鉴定分别为耐冷假单胞菌（Pseudomonas psychrotolerans）、黏金黄杆菌（Chryseobacterium gleum）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。通过平板抑菌圈法证明3种生防菌之间、生防菌与苦参印楝素之间无拮抗现象,适宜复配。盆栽实验初步验证,发酵48 h的3种生防菌发酵液（有效活菌数≥3.0 亿个/mL）与苦参印楝素稀释液（1 000 倍）复配制剂处理组对根结线虫病的防效达67.75%,与化学农药（氟吡菌酰胺、噻唑膦）处理组相比防效无显著性差异,且番茄株高、茎围、苗和根部的生物量均显著性增加,盆栽试验结论初步发现复配方案具有防治番茄根结线虫病害应用潜力。

蔬菜根结线虫生防芽胞杆菌的筛选及作用机理研究

张洁, 夏明聪, 朱文倩, 梁娟, 孙润红, 徐文, 武超, 杨丽荣

2021, 37(7): 175-182. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0409

摘要 ( 492 )

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芽胞杆菌是一类重要的植物病害生防因子。为挖掘防治蔬菜根结线虫的芽胞杆菌优良菌株,从根结线虫病抑制性土壤中分离到62株芽胞杆菌,测定不同菌株发酵滤液对二龄幼虫的致死作用和卵孵化的抑制作用初筛生防菌,然后利用室内盆栽试验测定生防菌株的防治效果,结果发现NB-04菌液灌根处理根结指数最低,防治效果达61.6%。进一步通过形态特征和16S rDNA序列比对,将NB-04菌株鉴定为甲基营养型芽胞杆菌Bacillus methylotrophicus。此外,测定了该菌株发酵滤液对根结线虫卵囊过氧化氢酶、乙酰胆碱酯酶和羧酸酯酶的活性以及卵囊总糖和总蛋白含量的影响,探讨其生防机理。结果显示NB-04菌株发酵滤液能够显著降低根结线虫卵囊过氧化氢酶、乙酰胆碱酯酶和羧酸酯酶的活性以及卵囊总糖和总蛋白含量。本研究为生物杀线剂的开发及利用提供依据。

松材线虫和拟松材线虫双重RPA检测研究

方圆, 吴迅, 林宇, 王海燕, 吴慧平, 鞠玉亮

2021, 37(7): 183-190. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0579

摘要 ( 531 )

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旨在建立一种以重组酶聚合酶扩增技术（RPA）为基础的快速检测方法,用于松材线虫和拟松材线虫的同步检测鉴定。根据松材线虫和拟松材线虫ITS区差异序列,分别设计松材线虫和拟松材线虫特异性上游引物Bx-rpa-F、Bm-rpa-F和两者通用下游引物Bxm-rpa-R。优化3条引物在反应体系中的最佳配比,建立双重RPA检测体系,并对其特异性和灵敏度进行分析。研究结果显示,双重RPA在37℃恒温条件反应30 min,即可完成对松材线虫和拟松材线虫核酸的同步扩增。Bx-rpa-F/Bm-rpa-F/Bxm-rpa-R对松材线虫的扩增片段为346 bp,对拟松材线虫的扩增产物为189 bp,且三者配比为5∶3∶8时,双重RPA扩增效果最好。双重RPA对松材线虫和拟松材线虫具有较高的检测特异性,对松材线虫的检测极限为10 pg/μL,相当于1/100条线虫,对拟松材线虫的检测极限为100 pg/μL,相当于1/10条线虫,其灵敏度低于常规PCR技术,但其满足对单条线虫检测的需求。双重RPA从松木样品中同步检测到松材线虫和拟松材线虫,操作简便、检测效率高、特异性强、灵敏度高、对仪器设备要求低,为松材线虫的检疫鉴定提供新方法。

2021, 37(7): 191-191.

摘要 ( 114 )

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