氧化葡萄糖酸杆菌中5-葡萄糖酸脱氢酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

生物技术通报 ›› 2014, Vol. 0 ›› Issue (9): 157-163.

氧化葡萄糖酸杆菌中5-葡萄糖酸脱氢酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

李翎,许琳,魏淼,李艳,严明

南京工业大学生物与制药工程学院，南京 211816

收稿日期:2014-02-08 出版日期:2014-09-15 发布日期:2014-09-07
作者简介:李翎，女，硕士研究生，研究方向：基因工程与工业生物催化；E-mail：421247797@qq.com
基金资助:
国家重点基础研究发展计划（“973”计划）（2011CBA00804），国家高技术研究发展计划（“863”计划）（2012AA022101），江苏高校优势学科建设工程资助项目

Cloning，Expression and Characterization of Gluconate 5-dehydrogenase from Gluconobacter oxydans

Li Ling, Xu Lin,Wei Miao, Li Yan, Yan Ming

College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211816

Received:2014-02-08 Published:2014-09-15 Online:2014-09-07

摘要/Abstract

摘要： 根据NCBI上的报道的基因序列设计引物，以氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacteroxydans）H24的基因组为模板，获得5-葡萄糖酸脱氢酶（Ga5DH）基因，将其与表达载体pET-28a连接，构建重组质粒pET-28a-Ga5DH，并转化大肠杆菌Rosetta进行表达。SDS-PAGE检测结果显示，表达蛋白的分子大小为26.5kD，纯化后酶活达7.83U/mg。酶学性质分析表明，该酶的最适反应温度为40℃，最适pH为11。在pH9-11的缓冲中保温8h，酶活力仍有80%以上的残余。该酶对多种有机溶剂具有良好的耐受性。

关键词: 5-葡萄糖酸脱氢酶, 氧化葡萄糖酸杆菌, 表达, 酶学性质

Abstract: Guconate 5-dehydrogenase gene from Gluconobacter oxydans H24 was amplified with primes designed based on NCBI database published sequence information. Ga5DH was cloned and expressed in Escherichia coli Rosetta strain. Results showed that the molecular mass of the enzyme was 26.5 kD by SDS-PAGE gel analysis. After purification, the enzyme activity could reach 7.83 U/mg. It was suggested that the recombinant protein had a maximum activity at 40℃, pH 11. The characterization of purified enzyme indicated that Ga5DH was highly resistant to organic solvents.

Key words: Gluconate 5-dehydrogenase, Gluconobacter oxydans, Expression, Enzymatic properties

李翎,许琳,魏淼,李艳,严明. 氧化葡萄糖酸杆菌中5-葡萄糖酸脱氢酶基因的克隆、表达及酶学性质分析[J]. 生物技术通报, 2014, 0(9): 157-163.

Li Ling, Xu Lin,Wei Miao, Li Yan, Yan Ming. Cloning，Expression and Characterization of Gluconate 5-dehydrogenase from Gluconobacter oxydans[J]. Biotechnology Bulletin, 2014, 0(9): 157-163.

参考文献

［1］Adachi O, Shinagawa E, Matsushita K, et al. Crystallization and properties of 5-keto-D-gluconate reductase from Gluconobacter sub-oxydans［J］. Agricultural and Biological Chemistry, 1979, 43（1）：75-83.
［2］Silberbach M, Maier B, Zimmermann M, et al. Glucose oxidation by Gluconobacter oxydans：characterization in shaking-flasks, scale-up and optimization of the pH profile［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2003, 62（1）：92-98.
［3］Hanke T, N?h K, Noack S, et al. Combined fluxomics and transcriptomics analysis of glucose catabolism via a partially cyclic pentose phosphate pathway in Gluconobacter oxydans 621H［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2013, 79（7）：2336-2348.
［4］Klasen R, Bringer-Meyer S, Sahm H. Biochemical characterization and sequence analysis of the gluconate：NADP 5-oxidoreductase gene from Gluconobacter oxydans［J］. Journal of Bacteriology, 1995, 177（10）：2637-2643.
［5］Elfari M, Ha SW, Bremus C, et al. A Gluconobacter oxydans mutant converting glucose almost quantitatively to 5-keto-D-gluconic acid［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2005, 66（6）：668-674.
［6］Matzerath I, Kl?ui W, Klasen R, et al. Vanadate catalysed oxidation of 5-keto-D-gluconic acid to tartaric acid：the unexpected effect of phosphate and carbonate on rate and selectivity［J］. Inorganica Chimica Acta, 1995, 237（1）：203-205.
［7］袁建锋, 吴绵斌, 林建平, 等. 基于 5-酮基-D-葡萄糖酸生物制造 L-（+）-酒石酸的研究进展［J］. 现代化工, 2013, 33（9）：13-16.
［8］Merfort M, Herrmann U, Bringer-Meyer S, et al. High-yield 5-keto-d-gluconic acid formation is mediated by soluble and membrane-bound gluconate-5-dehydrogenases of Gluconobacter oxydans［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, 73（2）：443-451.
［9］Ameyama M, Chiyonobu T, Adachi O. Purification and properties of 5-ketogluconate reductase from Gluconobacter liquefaciens［J］. Agricultural and Biological Chemistry, 1974, 38（7）：1377-1382.
［10］Galante E, Lanzani GA, Sequi P. Variations of 2-ketogluconate and 5-ketogluconate oxidoreductases during growth in Acetobacter suboxydans［J］. Enzymologia, 1966, 30（4）：257-264.
［11］Zhang Q, Peng H, Gao F, et al. Structural insight into the catalytic mechanism of gluconate 5-dehydrogenase from Streptococcus suis：Crystal structures of the substrate-free and quaternary complex enzymes［J］. Protein Science, 2009, 18（2）：294-303.
［12］Kubota K, Miyazono K, Nagata K, et al. Crystallization and preliminary X-ray analysis of 5-keto-D-gluconate reductase from Gluconobacter suboxydans IFO12528 complexed with 5-keto-D-gluconate and NADPH［J］. Acta Crystallographica Section F：Structural Biology and Crystallization Communications, 2010, 66（12）：1680-1682.
［13］Ge X, Zhao Y, Hou W, et al. Complete genome sequence of the industrial strain Gluconobacter oxydans H24［J］. Genome Announcements, 2013, 1（1）. doi：10.1128/genomeA.00003-13.
［14］王嘉乐, 魏东芝, 林金萍. 氧化葡萄糖酸杆菌胞内脱氢酶 Gox0525 的酶学性质研究［J］. 中国医药工业杂志, 2011, 42（10）：742-746.
［15］Green M R, Sambrook J. Molecular cloning：a laboratory manual［M］. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012.
［16］Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］. Analytical Biochemistry, 1976, 72（1）：248-254.

[1]	林红妍, 郭晓蕊, 刘迪, 李慧, 陆海. 转录组分析转录因子AtbHLH68调控细胞壁发育的分子机制[J]. 生物技术通报, 2023, 39(9): 105-116.
[2]	娄慧, 朱金成, 杨洋, 张薇. 抗、感品种棉花根系分泌物对尖孢镰刀菌生长及基因表达的影响[J]. 生物技术通报, 2023, 39(9): 156-167.
[3]	杨志晓, 侯骞, 刘国权, 卢志刚, 曹毅, 芶剑渝, 王轶, 林英超. 不同抗性烟草品系Rubisco及其活化酶对赤星病胁迫的响应[J]. 生物技术通报, 2023, 39(9): 202-212.
[4]	陈中元, 王玉红, 代为俊, 张艳敏, 叶倩, 刘旭平, 谭文松, 赵亮. 柠檬酸铁铵对悬浮HEK293细胞转染的影响机制探究[J]. 生物技术通报, 2023, 39(9): 311-318.
[5]	王佳蕊, 孙培媛, 柯瑾, 冉彬, 李洪有. 苦荞糖基转移酶基因FtUGT143的克隆及表达分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(8): 204-212.
[6]	李博, 刘合霞, 陈宇玲, 周兴文, 朱宇林. 金花茶CnbHLH79转录因子的克隆、亚细胞定位及表达分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(8): 241-250.
[7]	付钰, 贾瑞瑞, 何荷, 王良桂, 杨秀莲. 两种砧木楸树嫁接苗生长差异及转录组比较分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(8): 251-261.
[8]	王帅, 冯宇梅, 白苗, 杜维俊, 岳爱琴. 大豆GmHMGR基因响应外源激素及非生物胁迫功能研究[J]. 生物技术通报, 2023, 39(7): 131-142.
[9]	孙明慧, 吴琼, 刘丹丹, 焦小雨, 王文杰. 茶树CsTMFs的克隆与表达分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(7): 151-159.
[10]	梅欢, 李玥, 刘可蒙, 刘吉华. 小檗碱桥酶高效原核表达及生物合成l-SLR的研究[J]. 生物技术通报, 2023, 39(7): 277-287.
[11]	赵雪婷, 高利燕, 王俊刚, 沈庆庆, 张树珍, 李富生. 甘蔗AP2/ERF转录因子基因ShERF3的克隆、表达及其编码蛋白的定位[J]. 生物技术通报, 2023, 39(6): 208-216.
[12]	张路阳, 韩文龙, 徐晓雯, 姚健, 李芳芳, 田效园, 张智强. 烟草TCP基因家族的鉴定及表达分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(6): 248-258.
[13]	杨洋, 朱金成, 娄慧, 韩泽刚, 张薇. 海岛棉与枯萎病菌的互作转录组分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(6): 259-273.
[14]	李帜奇, 袁月, 苗荣庆, 庞秋颖, 张爱琴. 盐胁迫盐芥和拟南芥褪黑素含量及合成相关基因表达模式分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(5): 142-151.
[15]	李敬蕊, 王育博, 解紫薇, 李畅, 吴晓蕾, 宫彬彬, 高洪波. 甜瓜PIN基因家族的鉴定及高温胁迫表达分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(5): 192-204.