生物技术通报 ›› 2024, Vol. 40 ›› Issue (2): 55-64.doi: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0841
朱恬仪1,2(
), 孔桂美1,2(), 焦红梅1,2, 郭停停1,2, 乌日汗1,2, 刘翠翠1,2, 高成凤1,2, 李国才1,2()
收稿日期:2023-08-29
出版日期:2024-02-26
发布日期:2024-03-13
通讯作者:
孔桂美，女，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：病原微生物；E-mail: gmkong@yzu.edu.cn；作者简介:朱恬仪，女，硕士研究生，研究方向：病原生物学；E-mail: 15705273927@163.com
基金资助:
ZHU Tian-yi1,2(), KONG Gui-mei1,2(), JIAO Hong-mei1,2, GUO Ting-ting1,2, WU Ri-han1,2, LIU Cui-cui1,2, GAO Cheng-feng1,2, LI Guo-cai1,2()
Received:2023-08-29
Published:2024-02-26
Online:2024-03-13
摘要：
【目的】鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii, AB）是引起医院内感染的重要条件致病菌之一，耐药性AB是目前防治的棘手问题。细菌外排泵是引起耐药性的重要原因之一，拟通过PCR检测鲍曼不动杆菌耐药结节分化家族（resistance-nodulation-division,RND）外排泵基因adeLFGH的分布，探索其与耐药性的关系；建立adeG耐药基因模型，利用CRISPR/Cas9系统对其进行靶向敲除的初步研究。【方法】运用肉汤微量稀释法检测耐药性分布；PCR筛查13株临床分离多重耐药鲍曼不动杆菌adeLFGH外排泵基因并分析其分布；扩增RND外排泵关键基因adeG并构建耐药细菌模型；设计特异性sgRNA，利用CRISPR/Cas9系统进行靶向敲除,药敏实验检测其敲除效果。【结果】13株临床鲍曼不动杆菌对多黏菌素E敏感，对左氧氟沙星耐药率较低，仅为38.5%，对头孢他啶的耐药率为92.3%，对妥布霉素耐药率为84.6%，对其他临床常见药物耐药率均为100%。13株多重耐药鲍曼不动杆菌adeLFGH携带率为100%。药敏实验结果显示adeG模型耐药菌株的哌拉西林、替卡西林/克拉维酸以及哌拉西林/他唑巴坦由敏感转为耐药，氯霉素、美罗培南、米诺环素由敏感转为中介。特异性sgRNA介导CRISPR/Cas9系统靶向敲除效率不同。pCas9-sgRNA1（adeG）靶向后哌拉西林/他唑巴坦的耐药性得到了逆转，对妥布霉素、四环素、多西环素、米诺环素的耐药性也有不同程度的降低；pCas9-sgRNA2（adeG）和pCas9-sgRNA3（adeG）使哌拉西林/他唑巴坦由耐药恢复到了中介，但对其他药物的耐药性逆转效果并不显著。【结论】特异性 CRISPR/Cas9 系统可以特异性敲除耐药基因，提示可为耐药菌的治疗提供新的思路和方法。
朱恬仪, 孔桂美, 焦红梅, 郭停停, 乌日汗, 刘翠翠, 高成凤, 李国才. CRISPR/Cas9介导的adeG基因敲除大肠杆菌细菌模型的建立[J]. 生物技术通报, 2024, 40(2): 55-64.
ZHU Tian-yi, KONG Gui-mei, JIAO Hong-mei, GUO Ting-ting, WU Ri-han, LIU Cui-cui, GAO Cheng-feng, LI Guo-cai. Establishment of A Bacterial Model of CRISPR/Cas9 Mediated adeG Gene Knockout in Escherichia coli[J]. Biotechnology Bulletin, 2024, 40(2): 55-64.
| 引物名称 Name of primer | 引物序列 Sequence of primer（5'-3'） | 退火温度 Annealing temperature/℃ | 长度 Size of production/bp | 参考文献 Reference |
|---|---|---|---|---|
| adeF-F | GGTGTCGACCAAGATAAACG | 55 | 207 | [ |
| adeF-R | GTGAATTTGGCATAGGGACG | |||
| adeG-F | GGTGCCCAACAAGATGGCTT | 58 | 770 | This study |
| adeG-R | ATCGCGTAGTCACCAGATCC | |||
| adeH-F | TGTTGTCCTCACTCATGGGA | 60 | 458 | This study |
| adeH-R | TAGATCCGCTGTTGCTGCGTT | |||
| adeL-F | CGAAAGGTAAAGCTGTACCGCC | 60 | 542 | This study |
| adeL-R | CGACCGACCTGTAGATTTGG | |||
| TadeG-F | AAGGTGCCCAACAAGATGGCTT | 57 | 3 399 | This study |
| TadeG-R | AACCTCCTTAATGATCGTGTGGG | |||
| sgRNA1-F | AAAACTCGCTGTTTGCTTGAGATTG | 60 | 28 | This study |
| sgRNA1-R | AAACCAATCTCAAGCAAACAGCGAG | |||
| sgRNA2-F | AAAACCATAGTTACGTAAGTAGGTC | 55 | 28 | This study |
| sgRNA2-R | AAACGACCTACTTACGTAACTATGG | |||
| sgRNA3-F | AAAACCACCGCGACCGAAATTGTGA | 62 | 28 | This study |
| sgRNA3-R | AAACTCACAATTTCGGTCGCGGTGG | |||
| DocF | GAAACAAGCGCTCATGAGCCCG | 60 | 524 | This study |
表1 本实验使用引物
Table 1 Primers used in this study
| 引物名称 Name of primer | 引物序列 Sequence of primer（5'-3'） | 退火温度 Annealing temperature/℃ | 长度 Size of production/bp | 参考文献 Reference |
|---|---|---|---|---|
| adeF-F | GGTGTCGACCAAGATAAACG | 55 | 207 | [ |
| adeF-R | GTGAATTTGGCATAGGGACG | |||
| adeG-F | GGTGCCCAACAAGATGGCTT | 58 | 770 | This study |
| adeG-R | ATCGCGTAGTCACCAGATCC | |||
| adeH-F | TGTTGTCCTCACTCATGGGA | 60 | 458 | This study |
| adeH-R | TAGATCCGCTGTTGCTGCGTT | |||
| adeL-F | CGAAAGGTAAAGCTGTACCGCC | 60 | 542 | This study |
| adeL-R | CGACCGACCTGTAGATTTGG | |||
| TadeG-F | AAGGTGCCCAACAAGATGGCTT | 57 | 3 399 | This study |
| TadeG-R | AACCTCCTTAATGATCGTGTGGG | |||
| sgRNA1-F | AAAACTCGCTGTTTGCTTGAGATTG | 60 | 28 | This study |
| sgRNA1-R | AAACCAATCTCAAGCAAACAGCGAG | |||
| sgRNA2-F | AAAACCATAGTTACGTAAGTAGGTC | 55 | 28 | This study |
| sgRNA2-R | AAACGACCTACTTACGTAACTATGG | |||
| sgRNA3-F | AAAACCACCGCGACCGAAATTGTGA | 62 | 28 | This study |
| sgRNA3-R | AAACTCACAATTTCGGTCGCGGTGG | |||
| DocF | GAAACAAGCGCTCATGAGCCCG | 60 | 524 | This study |
图1 pCas9-sgRNA（adeG）质粒构建图
Fig. 1 Construction of pCas9-sgRNA（adeG）plasmid
图2 adeLFGH PCR电泳图
Fig. 2 PCR gel electrophoresis of adeLFGH A: adeL; B: adeF; C: adeG; D: adeH. M: DL 2000 marker; 1: AB13; 2: AB7;3: AB31; 4: AB29; 5: AB19; 6: AB18; 7: AB32; 8: AB15; 9: AB14; 10: AB21;11: AB2; 12: AB34; 13: AB26
| 菌株 Strain | 药物及折点Drugs and breakpoints/（μg·μL-1） | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| PRL | TIC | CAZ | TET | MEM | PE | GEN | TOP | CIP | LVX | ||
| （32-64） | （32-64） | （16） | （8） | （4） | （≥4） | （8） | （8） | （2） | （4） | ||
| 17978 | <4（S） | <4（S） | 2（S） | <0.5（S） | <0.5（S） | <0.5（S） | <0.5（S） | <0.5（S） | <0.5（S） | <0.5（S） | |
| AB13 | >256（R） | >256（R） | >128（R） | >128（R） | 128（R） | <0.5（S） | >128（R） | >128（R） | >32（R） | <2（S） | |
| AB7 | >256（R） | >256（R） | >128（R） | >128（R） | 128（R） | <0.5（S） | >128（R） | >128（R） | 32（R） | 4（I） | |
| AB31 | >256（R） | >256（R） | >128（R） | >128（R） | 128（R） | <0.5（S） | >128（R） | >128（R） | 32（R） | 4（I） | |
| AB29 | >256（R） | >256（R） | 64（R） | >256（R） | 64（R） | <0.5（S） | 128（R） | <2（S） | 32（R） | 32（R） | |
| AB19 | >256（R） | >256（R） | >128（R） | 256（R） | 64（R） | <0.5（S） | >128（R） | <2（S） | >32（R） | 8（R） | |
| AB18 | >256（R） | >256（R） | 128（R） | 256（R） | 32（R） | <0.5（S） | >128（R） | >128（R） | 16（R） | 4（I） | |
| AB32 | >256（R） | >256（R） | >128（R） | 256（R） | 32（R） | <0.5（S） | >128（R） | >128（R） | 8（R） | <2（S） | |
| AB15 | >256（R） | >256（R） | 8（S） | >256（R） | 64（R） | <0.5（S） | >128（R） | >128（R） | 32（R） | 8（R） | |
| AB14 | >256（R） | >256（R） | >128（R） | 256（R） | 64（R） | <0.5（S） | >128（R） | >128（R） | 32（R） | 4（I） | |
| AB21 | >256（R） | >256（R） | 64（R） | >256（R） | 128（R） | <0.5（S） | >128（R） | >128（R） | 32（R） | 4（I） | |
| AB2 | >256（R） | >256（R） | >128（R） | 128（R） | 64（R） | <0.5（S） | >128（R） | >128（R） | 32（R） | 4（I） | |
| AB34 | >256（R） | >256（R） | 128（R） | >256（R） | 64（R） | <0.5（S） | >128（R） | >128（R） | 32（R） | 8（R） | |
| AB26 | >256（R） | >256（R） | >128（R） | 256（R） | 32（R） | <0.5（S） | >128（R） | >128（R） | 32（R） | 8（R） | |
表2 ATCC 17978和13株鲍曼不动杆菌对临床常见抗菌药物的药敏结果
Table 2 Sensitivity results of ATCC 17978 and 13 strains of A. baumannii to common clinical antibiotics
| 菌株 Strain | 药物及折点Drugs and breakpoints/（μg·μL-1） | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| PRL | TIC | CAZ | TET | MEM | PE | GEN | TOP | CIP | LVX | ||
| （32-64） | （32-64） | （16） | （8） | （4） | （≥4） | （8） | （8） | （2） | （4） | ||
| 17978 | <4（S） | <4（S） | 2（S） | <0.5（S） | <0.5（S） | <0.5（S） | <0.5（S） | <0.5（S） | <0.5（S） | <0.5（S） | |
| AB13 | >256（R） | >256（R） | >128（R） | >128（R） | 128（R） | <0.5（S） | >128（R） | >128（R） | >32（R） | <2（S） | |
| AB7 | >256（R） | >256（R） | >128（R） | >128（R） | 128（R） | <0.5（S） | >128（R） | >128（R） | 32（R） | 4（I） | |
| AB31 | >256（R） | >256（R） | >128（R） | >128（R） | 128（R） | <0.5（S） | >128（R） | >128（R） | 32（R） | 4（I） | |
| AB29 | >256（R） | >256（R） | 64（R） | >256（R） | 64（R） | <0.5（S） | 128（R） | <2（S） | 32（R） | 32（R） | |
| AB19 | >256（R） | >256（R） | >128（R） | 256（R） | 64（R） | <0.5（S） | >128（R） | <2（S） | >32（R） | 8（R） | |
| AB18 | >256（R） | >256（R） | 128（R） | 256（R） | 32（R） | <0.5（S） | >128（R） | >128（R） | 16（R） | 4（I） | |
| AB32 | >256（R） | >256（R） | >128（R） | 256（R） | 32（R） | <0.5（S） | >128（R） | >128（R） | 8（R） | <2（S） | |
| AB15 | >256（R） | >256（R） | 8（S） | >256（R） | 64（R） | <0.5（S） | >128（R） | >128（R） | 32（R） | 8（R） | |
| AB14 | >256（R） | >256（R） | >128（R） | 256（R） | 64（R） | <0.5（S） | >128（R） | >128（R） | 32（R） | 4（I） | |
| AB21 | >256（R） | >256（R） | 64（R） | >256（R） | 128（R） | <0.5（S） | >128（R） | >128（R） | 32（R） | 4（I） | |
| AB2 | >256（R） | >256（R） | >128（R） | 128（R） | 64（R） | <0.5（S） | >128（R） | >128（R） | 32（R） | 4（I） | |
| AB34 | >256（R） | >256（R） | 128（R） | >256（R） | 64（R） | <0.5（S） | >128（R） | >128（R） | 32（R） | 8（R） | |
| AB26 | >256（R） | >256（R） | >128（R） | 256（R） | 32（R） | <0.5（S） | >128（R） | >128（R） | 32（R） | 8（R） | |
图3 13株鲍曼不动杆菌对临床常见抗菌药物的耐药百分比
Fig. 3 Resistance rates of 13 strains of A. baumannii to common clinical antibiotics
图4 adeG-E.coli质粒构建PCR鉴定 M: DL 5000 Marker；1：阴性对照；2-3：adeG-E.coli 单克隆
Fig. 4 PCR identification of constructed adeG-E.coli plasmid M: DL 5000 Marker；1：negative control；2-3：adeG-E.coli monoclone
图5 DH5α与adeG-E.coli药敏比较 1：氯霉素；2：磷霉素；3：呋喃妥因；4：环丙沙星；5：氨曲南；6：亚胺培南；7：庆大霉素；8：美罗培南；9：妥布霉素；10：四环素；11：多西环素；12：米诺环素；13：哌拉西林；14：替卡西林/克拉维酸；15：哌拉西林/他唑巴坦；16：头孢他啶；17：头孢吡肟；18：左氧氟沙星
Fig. 5 Comparison of adeG-E.coli and DH5α sensitivity to drug 1: Chloramphenicol. 2: Fosfomycin. 3: Furantoin. 4: Ciprofloxacin. 5: Amtronam. 6: Imipenem.7: Gentamicin. 8: Meropenem. 9: Tobramycin. 10: Tetracycline. 11: Doxycycline. 12: Minocycline. 13 Piperacillin. 14: Ticacillin/Clavulanic acid. 15: Piperacillin/Tazobactam. 16: Ceftazidime. 17: Cefepime. 18: Levofloxacin
| 药物 Drug | 折点 Breakpoints/mm | DH5α抑菌圈直径 Antibacterial circle diameter of DH5α /mm | adeG-E.coli抑菌圈直径 Antibacterial circle diameter of adeG-E.coli /mm | 耐药性变化 Changes in drug resistance |
|---|---|---|---|---|
| Chloramphenicol | 13-17 | 20 | 16 | S→I |
| Fosfomycin | 13-15 | 40 | 32 | S→S |
| Furantoin | 15-16 | 33 | 31 | S→S |
| Ciprofloxacin | 22-25 | 40 | 30 | S→S |
| Amtronam | 18-20 | 33 | 28 | S→S |
| Imipenem | 20-22 | 31 | 26 | S→S |
| Gentamicin | 13-14 | 22 | 26 | S→S |
| Meropenem | 20-22 | 26 | 22 | S→I |
| Tobramycin | 13-14 | 23 | 23 | S→S |
| Tetracycline | 12-14 | 19 | 17 | S→S |
| Doxycycline | 11-13 | 18 | 16 | S→S |
| Minocycline | 13-15 | 15 | 13 | S→I |
| Piperacillin | 18-20 | 28 | 0 | S→R |
| Ticacillin/Clavulanic acid | 15-19 | 28 | 0 | S→R |
| Piperacillin/Tazobactam | 18-20 | 26 | 17 | S→R |
| Ceftazidime | 18-20 | 28 | 23 | S→S |
| Cefepime | 19-24 | 34 | 25 | S→S |
| Levofloxacin | 17-20 | 35 | 33 | S→S |
表3 DH5α与adeG-E.coli药敏变化
Table 3 Changes in the sensitivity of DH5α and adeG-E.coli to drugs
| 药物 Drug | 折点 Breakpoints/mm | DH5α抑菌圈直径 Antibacterial circle diameter of DH5α /mm | adeG-E.coli抑菌圈直径 Antibacterial circle diameter of adeG-E.coli /mm | 耐药性变化 Changes in drug resistance |
|---|---|---|---|---|
| Chloramphenicol | 13-17 | 20 | 16 | S→I |
| Fosfomycin | 13-15 | 40 | 32 | S→S |
| Furantoin | 15-16 | 33 | 31 | S→S |
| Ciprofloxacin | 22-25 | 40 | 30 | S→S |
| Amtronam | 18-20 | 33 | 28 | S→S |
| Imipenem | 20-22 | 31 | 26 | S→S |
| Gentamicin | 13-14 | 22 | 26 | S→S |
| Meropenem | 20-22 | 26 | 22 | S→I |
| Tobramycin | 13-14 | 23 | 23 | S→S |
| Tetracycline | 12-14 | 19 | 17 | S→S |
| Doxycycline | 11-13 | 18 | 16 | S→S |
| Minocycline | 13-15 | 15 | 13 | S→I |
| Piperacillin | 18-20 | 28 | 0 | S→R |
| Ticacillin/Clavulanic acid | 15-19 | 28 | 0 | S→R |
| Piperacillin/Tazobactam | 18-20 | 26 | 17 | S→R |
| Ceftazidime | 18-20 | 28 | 23 | S→S |
| Cefepime | 19-24 | 34 | 25 | S→S |
| Levofloxacin | 17-20 | 35 | 33 | S→S |
图6 pCas9-sgRNA（adeG）质粒构建
Fig. 6 Construction of pCas9-sgRNA（adeG）plasmid M: DL 2000 marker; 1: pCas9-sgRNA1（adeG）; 2: pCas9-sgRNA2（adeG）;3: pCas9-sgRNA3（adeG）
图7 pCas9-sgRNA（adeG）对部分药敏纸片结果 A-13：哌拉西林；A-14：替卡西林/克拉维酸；A-15：哌拉西林/他唑巴坦；B-9：妥布霉素；B-10：四环素；B-11：多西环素；B-12：米诺环素
Fig. 7 Results of pCas9-sgRNA（adeG）on some drug sensitivity paper slides A-13: Piperacillin. A-14: Ticacillin/Clavulanic acid. A-15: Piperacillin/Tazobactam. B-9: Tobramycin. B-10: Tetracycline. B-11: Doxycycline. B-12: Minocycline
| 菌株Strain | 抑菌圈直径Antibacterial circle diameter /mm | 耐药性变化Changes in drug resistance |
|---|---|---|
| adeG-E.coli | 17 | - |
| pCas9-sgRNA1（adeG） | 25 | R→S |
| pCas9-sgRNA2（adeG） | 20 | R→I |
| pCas9-sgRNA3（adeG） | 20 | R→I |
表4 pCas9-sgRNA在哌拉西林/他唑巴坦中的药敏变化（与adeG-E.coli相比）
Table 4 Drug sensitivity changes of pCas9-sgRNA in piperacillin/tazobactam（compared to adeG-E.coli）
| 菌株Strain | 抑菌圈直径Antibacterial circle diameter /mm | 耐药性变化Changes in drug resistance |
|---|---|---|
| adeG-E.coli | 17 | - |
| pCas9-sgRNA1（adeG） | 25 | R→S |
| pCas9-sgRNA2（adeG） | 20 | R→I |
| pCas9-sgRNA3（adeG） | 20 | R→I |
| 药物Drug | 抑菌圈直径Antibacterial circle diameter /mm | ||
|---|---|---|---|
| adeG-E.coli | pCas9-sgRNA1（adeG） | ||
| Tobramycin | 15 | 20 | |
| Tetracycline | 20 | 26 | |
| Doxycycline | 18 | 22 | |
| Minocycline | 19 | 24 | |
表5 pCas9-sgRNA1（adeG）的部分药敏变化（与adeG-E.coli相比）
Table 5 Partial drug sensitivity changes of pCas9-sgRNA1（adeG）（compared to adeG-E.coli）
| 药物Drug | 抑菌圈直径Antibacterial circle diameter /mm | ||
|---|---|---|---|
| adeG-E.coli | pCas9-sgRNA1（adeG） | ||
| Tobramycin | 15 | 20 | |
| Tetracycline | 20 | 26 | |
| Doxycycline | 18 | 22 | |
| Minocycline | 19 | 24 | |
图8 pCas9-sgRNA（adeG）质粒靶向adeG 基因型鉴定
Fig. 8 Identification of pCas9-sgRNA（adeG）plasmid targeted adeG gene M: DL 5000 marker; 1: adeG-E.coli; 2: pCas9; 3: pCas9-sgRNA1（adeG）;4: pCas9-sgRNA2（adeG）; 5: pCas9-sgRNA3（adeG）
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