黑曲霉嗜热β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的克隆表达及其魔芋降解产物分析

生物技术通报 ›› 2014, Vol. 0 ›› Issue (6): 181-186.

黑曲霉嗜热β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的克隆表达及其魔芋降解产物分析

倪玉佳¹, 周旻昱², 欧阳嘉^1，3, 郑兆娟¹, 勇强¹

（1.南京林业大学化学工程学院，南京 210037；2.南京林业大学森林资源与环境学院，南京 210037；3.江苏省生物质绿色燃料与化学品重点实验室，南京 210037）

收稿日期:2013-11-20 出版日期:2014-06-25 发布日期:2014-06-25
作者简介:倪玉佳，女，硕士研究生，研究方向：生物化工；E-mail：523869088@qq.com
基金资助:
国家林业公益性行业科研专项（201404615），教育部新世纪优秀人才支持计划（NCET-11-0988），江苏省杰出青年基金（BK2012038），江苏省高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）

Cloning，Expression of Thermostable β-mannanase and the Preparation of Mannooligosaccharide

Ni Yujia¹,Zhou Minyu²,Ouyang Jia^1，3,Zheng Zhaojuan¹,Yong Qiang¹

（1. College of Chemical Engineering, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037；2. College of Forest Resource & Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037；3. Jiangsu Key Lab of Biomass-based Green Fuels and Chemicals, Nanjing 210037）

Received:2013-11-20 Published:2014-06-25 Online:2014-06-25

摘要/Abstract

摘要： 根据毕赤酵母密码子偏好性优化设计合成一段来自黑曲霉BK01的嗜热β-甘露聚糖酶基因，通过构建表达载体pPICZαA-man线性化后电转化入不同的毕赤酵母宿主，获得最佳重组菌KM71-MAN，其发酵罐发酵酶活最高达2 318.85 IU/mL。表达产物纯化后的分子量约为40 kD，最适反应温度为80℃，最适pH为5.0。该酶在70℃（pH5.0）保温44 h仍能保留43%的酶活力且在pH3.0-7.0范围内保温70 h（50℃）酶活力仍能保留85%以上。利用发酵罐所产重组酶酶解魔芋胶制备甘露低聚糖，产物以甘露二糖和甘露六糖为主，甘露低聚糖得率为55.6%。该重组β-甘露聚糖酶具有良好的热稳定性和pH稳定性，在魔芋制备甘露低聚糖中具有较好的应用潜能。

关键词: β-甘露聚糖酶, 密码子偏好性, 毕赤酵母, 酶学性质, 低聚甘露糖

Abstract: According to the Pichia pastoris’s codon preference, a DNA sequence encoding Aspergillus niger BK01 thermophilic β-mannanase gene was designed and synthesized. Firstly, it was inserted into pPICZαA and resulted in recombinant expression vector pPICZαA-man. Then, pPICZαA-man was linearized and transformed into different hosts by electrotransformation. An optimal recombinant stain KM71-MAN was obtained by screening activity. Using recombinant strain KM71-MAN, recombinant mannanase was overexpressed and its activity in the culture medium reached 2 318.85 IU/mL in a 3 L fermentor. Recombinant enzyme had an apparent molecular size of about 40 kD by SDS-PAGE, and optimal activity at pH 5.0 and 80℃. It was highly thermostable, retaining 43% of enzyme activity after 44 h of exposure at 70℃ and pH 5.0. Moreover, it remained over 85% activity from pH 3.0 to pH 7.0 after treating at 50℃ for 70 h. Using this crude enzyme, the main hydrolysis products yielded from konjak gum were mannobiose and mannohexaose and the yield of mannooligosaccharides was 55.6%. The recombinant enzyme exhibited good thermal and pH stability, which indicated that the recombinant yeast has potential value in preparation of konjac gum mannooligosaccharides.

Key words: β-mannanase, Codon preference, Pichia pastoris, Enzymatic properties, Mannooligosaccharide

倪玉佳, 周旻昱, 欧阳嘉, 郑兆娟, 勇强. 黑曲霉嗜热β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的克隆表达及其魔芋降解产物分析[J]. 生物技术通报, 2014, 0(6): 181-186.

Ni Yujia,Zhou Minyu,Ouyang Jia,Zheng Zhaojuan,Yong Qiang. Cloning，Expression of Thermostable β-mannanase and the Preparation of Mannooligosaccharide[J]. Biotechnology Bulletin, 2014, 0(6): 181-186.

参考文献

[1] Dhawan S, Kaur J. Microbial mannanases：An overview of production and applications[J] . Critical Reviews in Biotechnology, 2008, 27（4）：197-216.
[2] 张婕, 赵敏.β-甘露聚糖酶的研究进展[J] . 黑龙江医药, 2011, 24（2）：248-250.
[3] 王爱华, 陶宁. 浅谈甘露低聚糖的保健功能及应用[J] . 安徽农业科学, 2006, 34（13）：3249-3250.　
[4] 杨艳燕, 李小明, 李顺意, 等. 魔芋低聚糖对小鼠血糖含量和抗氧化能力的影响[J] . 中草药, 2001, 32（2）：142-144.
[5] 徐春梅, 邬敏辰, 李剑芳, 等. 魔芋葡甘露聚糖的酶水解工艺条件[J] . 食品与生物技术学, 2008, 27（3）：121-124.
[6] Ghose TK. Measurement of cellulase activities[J] . Pure and Appl Chem, 1987, 59（2）：257-268.
[7] 赵翔, 霍克克, 李育阳.毕赤酵母的密码子用法分析[J] . 生物工程学报, 2000, 16（3）：308-311.
[8] 王玮, 文湘华. 木质素过氧化物酶LiPH2合成基因在毕赤酵母中的表达[J] . 环境科学学报, 2009, 29（9）：1793-1799.
[9] 章如安, 杨晟, 邱荣德, 等. 巴斯德毕赤酵母表达体系研究及进展[J] . 微生物学通报, 2000, 27（5）：371-373.
[10] Cos O, Serrano A, Montesinos JL, et al. Combined effect of the methanol utilization（Mut）phenotype and gene dosage on recombinant protein production in Pichia pastoris fed-batch cultures[J] . Journal of Biotechnology, 2005, 116（4）：321-335.
[11] 陈小兵, 乔宇, 丁宏标, 等. 里氏木霉RUT-C30内切β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的分泌表达[J] . 农业生物技术学报, 2007, 15（1）：142-146.
[12] 朱劼, 邬敏辰. 黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶的酶学特性[J] . 食品与生物技术学报, 2007, 27（3）：21-25.
[13] Yu HY, Sun YM, Wang WJ, et al. Purification and properties of Bacillus subtilis SA-22 Endo-1, 4-β-D-mannanase[J] . Chinese Journal of Biotechnology, 2003, 19（3）：327-331.
[14] Qiao Y, Chen XB, Ding HB, et al. Heterologous expression and characterization of man gene from Bacillus subtilis in Pichia pastoris[J] . Frontiers of Biology in China, 2008, 3（1）：26-31.

[1]	赵思佳, 王晓璐, 孙纪录, 田健, 张杰. 代谢工程改造毕赤酵母生产赤藓糖醇[J]. 生物技术通报, 2023, 39(8): 137-147.
[2]	尹明华, 余锾媛, 肖心怡, 王玉婷. 江西铅山红芽芋叶绿体基因组特征及系统发育分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(6): 233-247.
[3]	董聪, 高庆华, 王玥, 罗同阳, 王庆庆. 基于联合策略提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的酵母表达[J]. 生物技术通报, 2023, 39(6): 316-324.
[4]	赵赛赛, 张小丹, 贾晓妍, 陶大炜, 刘可玉, 宁喜斌. 高产硝酸盐还原酶Staphylococcus simulans ZSJ6的复合诱变选育及其酶学性质研究[J]. 生物技术通报, 2023, 39(4): 103-113.
[5]	杨俊钊, 张新蕊, 赵国柱, 郑菲. 新型GH5家族多结构域纤维素酶的结构与功能研究[J]. 生物技术通报, 2023, 39(4): 71-80.
[6]	赵昕, 杜玉瑶, 殷子扬, 毛淑红. 胆固醇7α-羟化酶在毕赤酵母中的异源表达[J]. 生物技术通报, 2023, 39(10): 304-310.
[7]	王雨辰, 丁尊丹, 关菲菲, 田健, 刘国安, 伍宁丰. 耐热漆酶ba4基因鉴定与酶学性质分析[J]. 生物技术通报, 2022, 38(8): 252-260.
[8]	毛国涛, 王杰, 王凯, 王方园, 曹乐言, 张宏森, 宋安东. 水生栖热菌漆酶TaLac的性质分析及对孔雀石绿染料的脱除[J]. 生物技术通报, 2022, 38(4): 261-268.
[9]	王玥, 高庆华, 董聪, 罗同阳, 王庆庆. 密码子优化的吡喃糖氧化酶基因在毕赤酵母中的表达[J]. 生物技术通报, 2022, 38(4): 269-277.
[10]	常晴, 束月蓉, 王文韬, 蒋昊, 延泉德, 钱政, 高雪纯, 吴金鸿, 张勇. 来自Yeosuana marina sp. JLT21内切型海藻酸裂解酶的异源表达及酶学表征[J]. 生物技术通报, 2022, 38(2): 123-131.
[11]	王小桃, 邹杭, 吴怡, 向省维, 吕华, 刘超兰, 林家富, 王欣荣, 褚以文, 宋涛. Paraglaciecola hydrolytica中新型β-琼胶酶Aga2的异源表达及酶学性质分析[J]. 生物技术通报, 2022, 38(11): 258-268.
[12]	岑潇龙, 雷曦, 马诗云, 陈倩茹, 黄遵锡, 周峻沛, 张蕊. 金黄色葡萄球菌透明质酸裂解酶HylS的异源表达与特性研究[J]. 生物技术通报, 2022, 38(1): 157-167.
[13]	杨威, 伍茜, 程建国, 罗燕, 王印, 杨泽晓, 姚学萍. 林麝干扰素α基因克隆、表达及转录调控分析[J]. 生物技术通报, 2022, 38(1): 194-204.
[14]	田嘉慧, 封佳丽, 卢俊桦, 毛林静, 胡著然, 王莹, 楚杰. 一色齿毛菌漆酶LacT-1的分离纯化与性质研究[J]. 生物技术通报, 2021, 37(8): 186-194.
[15]	廖兆民, 蔡俊, 林建国, 杜馨, 王常高. 黑曲霉葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中的表达及产酶条件的优化[J]. 生物技术通报, 2021, 37(6): 97-107.