生物技术通报

植物JAZ蛋白的功能概述

孙程, 周晓今, 陈茹梅, 范云六, 王磊

2014, 30(6): 1-8.

摘要 ( 1044 )

PDF (1810KB) ( 2487 )

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茉莉酸作为重要的植物激素，在植物生长、繁殖和抗逆等诸多方面起重要的作用。茉莉酸途径的抑制因子JAZ（Jasmonate ZIM-domain，JAZ）蛋白（JAZs）是调节茉莉酸（JA）激素应答的关键因子，在没有JA存在时，JAZs抑制DNA-结合转录因子活性，从而调控JA应答基因转录；当有JA存在时，JAZs和冠菌素不敏感1（Coronatine insensitive 1，COI1）依赖JA分子发生互作，复合体被SCF^COI1识别并进入26S蛋白酶解途径降解，释放的转录因子启动JA应答基因转录。随着研究的深入，发现JAZs可以与许多转录因子互作，不仅调控了JA信号响应，还参与了其他激素信号通路。对JAZs的互作机制进行描述，阐述JAZs在植物激素调控网络中的作用。

植物SVP基因的研究进展

刘世男, 林新春

2014, 30(6): 9-13.

摘要 ( 269 )

PDF (1204KB) ( 1558 )

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SHORT VEGETATIVE PHASE（SVP）是重要开花抑制基因，主要在营养阶段表达。SVP基因参与花分生组织的形成，并调节开花途径中的整合因子FLOWERING LOCUS T（FT）、SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1（SOC1）和FLOWERING LOCUS C（FLC）的表达，从而调控开花时间。SVP的表达受光照、温度等因素的影响。就国内外对SVP基因及同源基因的一些研究进展进行综述，并探讨其未来的研究方向。

高等植物硝酸盐转运蛋白的功能及其调控机制

贾宏昉, 张洪映, 刘维智, 崔红, 刘国顺

2014, 30(6): 14-21.

摘要 ( 312 )

PDF (1594KB) ( 1372 )

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硝酸盐是植物从土壤中吸收的重要无机氮素形态。植物为适应含有不同浓度NO₃^-的土壤环境，进化出了高亲和硝酸盐转运系统（HATS）和低亲和硝酸盐转运系统（LATS），两个基因家族NRT1和NRT2家族分别参与了LATS和HATS的NO₃^-的吸收和转运。近年来，随着分子生物学技术和植物基因组学的快速发展，研究人员克隆出了大量参与硝酸盐吸收和转运的基因，并对这些基因的功能进行了深入研究，逐渐形成了复杂的硝酸盐调控网络。综述了植物中硝酸盐转运蛋白基因的克隆、表达及调控，并对进一步的研究作了展望，这些结果对于理解植物硝酸盐吸收的调控机制具有重要作用。

植物激素脱落酸受体及其信号转导途径研究进展

曹婧, 兰海燕

2014, 30(6): 22-28.

摘要 ( 322 )

PDF (1938KB) ( 2501 )

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脱落酸是广泛存在于植物体的多功能激素，通过与体内受体及随后的复杂信号网络互作进而调节植物生长发育、抵御环境胁迫。脱落酸受体的筛选和鉴定一直备受关注，并已取得较大突破，其信号转导机制也再次成为人们研究的热点。对脱落酸受体的鉴定以及介导的信号转导途径方面最新进展进行了综述并展望，以期对相关研究领域提供参考。

拟南芥NDR1基因介导的广谱抗病性研究进展

龚前园, 张超, 李为民, 张永强

2014, 30(6): 29-33.

摘要 ( 230 )

PDF (1922KB) ( 1041 )

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抗病基因的研究是抗病育种及防治植物病害的基础。拟南芥NDR1（Non-race-specific disease resistance 1）基因，编码一个质膜定位蛋白，在R基因介导的抗性中具有重要作用。NDR1能与CC-NB-LRR（卷曲螺旋核酸结合或富亮氨酸重复）类抗病蛋白相互作用。以拟南芥抗病基因NDR1及其蛋白结构的研究进展为基础，综述了NDR1的广谱抗病性和抗病分子机理。

植物矮化突变体的来源及矮化机理研究进展

白丽君, 尹淑霞

2014, 30(6): 34-39.

摘要 ( 310 )

PDF (1246KB) ( 1738 )

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植物矮化是一种重要的农艺学性状，是生命科学领域研究的重要内容之一，矮化研究是植物育种工作的热点。矮化来源分为诱变矮化和自发矮化，其中诱变矮化中的物理诱变研究的内容分类详细，在航天诱变领域取得了有效的研究成果。植物矮化机理的研究主要集中于植物内源激素，主要是赤霉素、油菜素内酯，也有少量关于生长素的研究。针对不同种类植物具体详细的矮化机理，还没有明确的分类和细化的研究。总结了植物矮化突变体的来源及矮化机理。

EPSP合酶的研究进展

徐杰, 蒋世云, 傅凤鸣, 耿鹏飞, 黄凯

2014, 30(6): 40-50.

摘要 ( 452 )

PDF (2223KB) ( 1300 )

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5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSP合酶）是莽草酸途径中的第六位酶，参与合成芳香族氨基酸以及部分次生代谢的产物，同时EPSP合酶不仅是除草剂草甘膦、抗菌素、抗寄生虫药物的作用靶酶，而且也是促进生物体内莽草酸积累的重要调控位点。近年来，随着分子生物学技术的快速发展和对EPSP合酶的深入研究，EPSP合酶基因在耐草甘膦转基因作物、医药卫生等方面被广泛应用。对EPSP合酶的研究进展进行综述及展望。

细菌胞外多糖的特性及应用研究

李明源, 王继莲, 魏云林, 季秀玲

2014, 30(6): 51-56.

摘要 ( 375 )

PDF (1265KB) ( 1515 )

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不论是在自然或病理条件下，多数细菌均被胞外多糖所包被，胞外多糖对细菌的粘附及在竞争环境中的存活和生长都具有重要作用。近年来细菌胞外多糖以其独特的生物学活性和广阔的应用前景而备受人们关注。系统介绍了细菌胞外多糖的结构性质、特性及生理功能，重点阐述了几种多糖的应用现状，并对今后细菌胞外多糖在工业上的发展趋势进行了展望，为深入开发利用多糖功能菌资源，进一步扩展其在工业领域上的应用奠定理论基础。

乙酰肝素酶及在肿瘤治疗中的应用

王靖, 朝格图, 李蓓, 王志钢

2014, 30(6): 57-61.

摘要 ( 286 )

PDF (1232KB) ( 722 )

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乙酰肝素酶（Heparanase，Hpa）是哺乳动物体内唯一能够裂解硫酸乙酰肝素蛋白多糖的酶。通过破坏细胞外基质及基底膜结构的完整性，释放胞外基质上的各种生长因子，与肿瘤的转移、侵袭密切相关。目前的研究表明Hpa在大多数中晚期肿瘤中都有表达，尤其在恶性肿瘤中异常高表达，而Hpa表达的下调可以抑制肿瘤细胞的转移，可以作为一种抗肿瘤转移相关靶点用于中晚期肿瘤的治疗。综述了Hpa的结构与功能、对肿瘤转移的促进作用及在肿瘤治疗中的应用情况。

液质联用在多肽及蛋白质定性方面的研究进展

范学海, 朱颐申, 陈兰婷, 李文惠, 韦萍

2014, 30(6): 62-66.

摘要 ( 205 )

PDF (1268KB) ( 1393 )

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随着液质联用技术的不断发展，液相色谱—质谱联用系统广泛应用于药物分析、食品分析、环境分析等多方面，该技术将液相色谱的高分离能力与质谱强大的结构鉴定功能相结合，具备了高分离度、高灵敏度、高选择性以及提供丰富结构信息等一系列优点。这些优点决定了液相色谱—质谱联用系统将在越来越多地相关领域得到应用，尤其是近年来在生物大分子方面开展了大量研究，结合这些研究对液质联用技术在多肽及蛋白质定性方面进行了系统归纳。

未培养技术在瘤胃产甲烷菌群研究中的应用

王兴文, 王加启, 赵圣国, 李发弟, 卜登攀

2014, 30(6): 67-74.

摘要 ( 222 )

PDF (1254KB) ( 636 )

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瘤胃中的产甲烷菌为严格厌氧微生物，很难通过分离培养的方法进行研究。现已经培养并公布的瘤胃产甲烷菌只有4种，成千上万种类的瘤胃产甲烷菌不能培养出来。未培养技术的发展与应用突破了传统分离培养检测方法的限制，使瘤胃产甲烷菌的研究有了较大的进展。综述了实时定量PCR、16S rDNA文库、DGGE和高通量测序技术等6项具有代表性的未培养技术及其在瘤胃产甲烷菌研究中的应用，为以后瘤胃产甲烷菌的研究提供方法上的参考。

EvaGreen实时荧光定量PCR检测猪圆环病毒2型方法的建立

蔡晔, 饶品彬, 吴海港, 姜永厚

2014, 30(6): 75-80.

摘要 ( 219 )

PDF (2060KB) ( 584 )

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根据GenBank中的猪圆环病毒2型（PCV2）ORF4基因序列设计一对特异性引物，通过常规PCR扩增PCV2的ORF4基因，并将其纯化的PCR产物克隆入pMD18-T载体中，构建重组质粒。应用该重组质粒进行EvaGreen实时荧光定量PCR，建立了PCV2 DNA的标准曲线，并进行熔解曲线分析。结果显示：建立的EvaGreen实时荧光定量PCR特异性强，与其他非靶标病毒基因不发生交叉反应；灵敏度高，最高可检测到10拷贝/μL的病毒量；重复性好，3个浓度的批间和批内的变异系数均小于2.5%；对118份临床样品进行检测，阳性样品25份，阳性率为21.2%，检测结果与普通PCR相符率为99.2%，其中一份样品经荧光PCR检测为PCV2阳性，普通PCR检测为阴性。结果表明，建立的EvaGreen实时荧光定量PCR方法具有特异性强、敏感度高、重复性好、简便快捷等特点，可用于临床PCV2感染的早期诊断以及分子流行病学调查。

环介导等温扩增联合横向流动试纸条快速检测创伤弧菌检测方法的建立

王耀焕, 王瑞娜, 周前进, 陈炯

2014, 30(6): 81-87.

摘要 ( 242 )

PDF (2529KB) ( 1072 )

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环介导等温扩增技术（LAMP）与横向流动试纸条（LFD）检测联合应用，建立了一种新的快速、便捷的创伤弧菌检测方法。针对创伤弧菌的外膜蛋白TolC基因设计6条特异性引物和1条异硫氰酸荧光素（FITC）标记的探针。生物素标记的LAMP扩增产物能够特异性地与FITC标记的探针杂交，杂交产物经LFD检测。优化后的扩增温度和时间为63℃反应35 min，加上细菌基因组DNA提取步骤，完成检测仅需要80 min。LAMP-LFD方法可特异性地检出创伤弧菌，对哈维氏弧菌等9种水产品常见病原菌的检测均呈阴性；对纯细菌培养物的检测灵敏度为3.7×10² CFU/mL或7.4 CFU/反应，是利用外引物建立的常规PCR检测的100倍。结果表明，该方法能够准确、快速、灵敏地检出创伤弧菌，可应用于创伤弧菌污染的水产品的检测。

质谱非标记定量分析小麦抗条锈病近等基因系蛋白质变化

黄宇, 冯晶, 饶力群, 徐世昌, 潘映红

2014, 30(6): 88-95.

摘要 ( 252 )

PDF (1631KB) ( 1050 )

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利用基于液相色谱串联Orbitrap质谱（Q Exactive）的非标定量（Label-free）技术，对小麦抗病单基因近等基因系Taichung29*6/Yr10和背景品种Taichung29叶片的蛋白质表达进行了比较分析。经MASCOT软件搜库，在两个样品中共同鉴定到2 257个蛋白，其中有准确定量信息的蛋白共1 549个，含量变化大于2倍的差异蛋白有102个。对102个差异表达蛋白进行了Gene Ontology（GO）功能注释和分析，发现他们多数定位于细胞基质和核糖体等细胞器，具备结合、催化等功能，主要参与代谢、细胞过程、应激等生物学进程，其中超氧化物歧化酶、甲硫氨酰氨肽酶、溶酶体-β-葡萄糖苷酶和铁蛋白等可能与小麦抗病单基因近等基因系Taichung 29*6/Yr10的抗病性有一定相关性。

小麦新抗源CH5383抗条锈病基因的遗传分析及分子定位

詹海仙, 畅志坚, 李光蓉, 贾举庆, 郭慧娟, 张晓军, 李欣, 乔麟轶, 杨足君

2014, 30(6): 96-100.

摘要 ( 246 )

PDF (1568KB) ( 518 )

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CH5383是新育成的源于中间偃麦草的渗入系，对小麦条锈病和白粉病均表现免疫。为明确其抗性来源、遗传方式和抗病基因在染色体上的位置，将CH5383的系谱材料及其与高感条锈病品种（系）杂交的F₁、F₂和F_2：3家系群体进行条锈病抗性鉴定。结果表明，CH5383对条锈病的抗性源于中间偃麦草，对条锈病生理小种CYR32的抗性由一对显性核基因控制，将此基因暂时命名为YrCH5383。从476对SSR引物中筛选到3对引物Xgwm108、Xbarc206和Xbarc77与抗病基因连锁，遗传距离分别是8.2 cM、10.7 cM和13.6 cM。根据这两对标记在染色体上的位置，将抗病基因定位到3B染色体的长臂上。3B染色体的长臂还未见有正式命名的抗条锈病基因的报道，推测YrCH5383可能是一个源于中间偃麦草的新抗条锈病基因。

青花菜及其近缘种亲缘关系SRAP标记分析

荆赞革, 裴徐梨, 唐征, 张小玲, 罗天宽, 刘庆, 朱世杨

2014, 30(6): 101-105.

摘要 ( 200 )

PDF (1430KB) ( 636 )

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利用SRAP分子标记技术，对青花菜与其近缘种进行遗传多样性分析。28对SRAP引物共产生302条谱带，其中多态性谱带203条，多态率为67.22%，表明种质间存在较高的多态性。相似系数分析表明，其变异范围为0.461 5-0.900 6，平均遗传相似系数为0.693 6。‘绿地’和‘矮抗青’之间的亲缘关系最远，遗传相似系数为0.461 5；‘Wzvcst-09-224’和‘Wzvcst-09-225’亲缘关系最近，遗传相似系数为0.900 6。聚类分析可将16个材料分为两大类，第Ⅰ类包括芸薹属甘蓝种蔬菜，第Ⅱ类为芸薹属白菜种。揭示了青花菜及其近缘变种间具有部分相似的遗传基础，亲缘关系较近。结果表明，同一地域或来源的材料间具有较为相近的遗传背景，亲缘关系相对较近。研究结果有助于青花菜与其近缘种间种质资源分类和优异基因利用，加速青花菜新品种选育进程。

滑桃树种子化学组分对其内生菌影响的研究

吴欣

2014, 30(6): 106-110.

摘要 ( 225 )

PDF (2023KB) ( 419 )

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Streptomyces sp. WXC菌株是从滑桃树（Trewia nudiflora L.）种子中分离到的一株内生菌。提取植物种子的化学成分，对其进行溶剂分组，检测各组分对内生放线菌S. sp. WXC的生长、代谢和活性化合物的影响，结果表明，滑桃树种子水溶性提取物Water ext.对S. sp. WXC的生长、次生代谢产物和活性化合物都有明显的促进作用。

敲减FST基因对猪成纤维细胞中相关基因表达的影响

孙亚蒙, 张冬杰, 汪亮, 张旭, 尹雪, 刘娣

2014, 30(6): 111-114.

摘要 ( 219 )

PDF (1763KB) ( 524 )

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旨在获得敲减FST基因的猪胎儿成纤维细胞，并探讨对相关基因表达的影响。将构建成功并鉴定准确的发夹RNA真核表达载体FR1-shRNA利用脂质体转染至猪胎儿成纤维细胞中，并进行G418筛选，获得稳定转染细胞株，并利用Real-time检测了相关基因表达的变化。结果表明，在稳定转染的细胞株中，FST基因的表达受到显著抑制，结果导致了ActivinRⅡA、Myostatin和Bmp4基因的表达出现下调趋势，并且极显著地降低MyoD基因的表达。

毕赤酵母高密度培养表达鸡α-干扰素的工艺研究

姜正军, 刘树海, 王茂超, 程全明, 黄金

2014, 30(6): 115-119.

摘要 ( 353 )

PDF (2102KB) ( 504 )

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考察了10 L罐规模条件下pH、温度、装液量以及碳源流加模式对毕赤酵母高密度培养表达鸡α-干扰素的影响，确定了最优的生产工艺：在pH5.5、28℃、40%装液量条件下，当初始碳源耗尽的情况下，进行甘油和甲醇混合（流加体积速率比为20∶1）脉冲流加，产物鸡α-干扰素抗病毒活性最高，可达3×10⁶ IU/mL。将该工艺在50 L发酵罐规模条件下进行放大，重复20批，结果表明此过程重复性较好，且目的蛋白表达量稳定，具有工业化生产的实际应用价值。

不同诱导条件下家蝇（Musca domestica）三龄幼虫免疫相关基因的表达研究

修江帆, 魏川川, 陈明明, 吴建伟

2014, 30(6): 120-127.

摘要 ( 220 )

PDF (2647KB) ( 632 )

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旨在研究在不同诱导条件下家蝇三龄幼虫先天性免疫基因的表达情况。采用冷刺激、热刺激及革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌注射诱导12 h后提取家蝇三龄幼虫总RNA。根据GenBank公布的家蝇磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因、攻击素（Attacin）、天蚕素（Cecropin）、防御素（Defensin）、双翅肽（Diptericin）、溶菌酶（Lysozyme）、热休克蛋白（Heat shock protein，HSP）及家蝇抗真菌肽（MAF-1）基因序列进行RT-PCR反应，以GAPDH基因为内参照，分析在不同诱导条件下家蝇三龄幼虫先天性免疫基因的表达情况。结果显示，不同条件诱导下，家蝇免疫相关基因表达显现较大差异，微生物诱导比物理刺激诱导后家蝇免疫相关基因表达水平高；真菌、阳性菌诱导后家蝇免疫相关基因表达量最高，阴性菌次之；冷刺激诱导最低。微生物及物理刺激均能激活家蝇的免疫系统，在不同条件刺激下，家蝇幼虫机体免疫应激反应不同。

草鱼细胞系CIK酵母双杂交cDNA文库的构建及初步应用

闫秀英, 谢吉国, 李杰, 丁燏, 吴灶和, 鲁义善, 简纪常

2014, 30(6): 128-133.

摘要 ( 224 )

PDF (2515KB) ( 515 )

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旨在探索草鱼呼肠孤病毒与宿主细胞蛋白质间的相互作用，运用SMART技术构建了草鱼肾组织细胞系CIK（Ctenopharyngodon idellus kidney）的酵母双杂交cDNA文库。提取CIK细胞总RNA后，分离纯化mRNA，然后以mRNA为模板，反转录合成cDNA第一链，再在DNA聚合酶作用下，通过长距离PCR，扩增双链cDNA。利用SMART技术，通过同源重组的方法，在酵母株Y187中构建了草鱼CIK细胞全长cDNA文库。经检测，未扩增文库的转化率为1.6×10⁵，文库容量为2.4×10⁶，插入的双链cDNA片段的长度为250-2 000 bp，文库滴度为7×10⁷ CFU/mL，重组率为98%，此文库具有良好的cDNA片段多态性和完整性。利用构建的CIK酵母双杂交文库，以草鱼呼肠孤病毒的VP7和VP5蛋白作为诱饵进行筛选试验，得到VP7相互作用蛋白的阳性菌落，未得到VP5相互作用蛋白的阳性菌落。草鱼CIK细胞酵母双杂交cDNA文库的构建为研究草鱼呼肠孤病毒与宿主细胞间的互作机制提供了重要研究工具。

中华绒螯蟹EsSox21b-like基因干扰载体的构建及原核表达制备dsRNA

刘志强, 陈洁, 邱高峰

2014, 30(6): 134-138.

摘要 ( 228 )

PDF (1957KB) ( 864 )

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Sox（SRY-related HMG-box）基因是一类重要的转录因子，在动物的性别分化与决定、器官的发生等方面具有重要的调控作用。旨在利用RNA干扰技术证实该基因的功能，将EsSox21b-like基因617 bp的片段克隆至含有两个T7启动子的L4440载体上，构建了EsSox21b-like-L4440干扰载体，将该重组载体转化至RNaseⅢ缺陷型的HT115菌株中，经IPTG诱导菌株体内转录，获得了EsSox21b-like正义和反义单链RNA，经过变性、退火形成大量双链RNA（EsSox21b-like-dsRNA），能满足以后应用RNA干扰试验对于EsSox21b-like基因功能的研究。

三角帆蚌四核苷酸重复微卫星的开发及特征分析

韩学凯, 李家乐, 王照旗, 白志毅

2014, 30(6): 139-144.

摘要 ( 210 )

PDF (1333KB) ( 484 )

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用磁珠富集法和生物素标记（ATAC）₅为探针构建了三角帆蚌基因微卫星富集文库。利用PrimerSelect软件对得到的微卫星序列进行引物设计并合成得到43对引物，初筛后发现有20对引物可以扩增出稳定、清晰的目的产物带。荧光标记这20对引物，然后用36只洞庭湖三角帆蚌扩增，发现17对引物呈现多态性。17个微卫星位点等位基因数的范围为6-28。期望杂合度（He）、观测杂合度（Ho）的范围分别为0.677 6-0.946 4、0.638 9-1.000 0。多态信息含量（PIC）在0.630-0.929之间。统计分析结果显示，其中有12个微卫星位点满足Hardy-Weinberg平衡条件。与本实验室之前开发的二核苷酸重复微卫星相比，该17对四核甘酸重复微卫星具有更高多态性，且更易于采用聚丙烯酰胺凝胶电泳等传统方法分析基因型，有利于节约成本，从而为三角帆蚌群体遗传分析、亲子鉴定等技术提供了准确、价格低廉的微卫星标记。

磁珠富集法分离刀鲚微卫星标记

邓平平, 施永海, 张根玉, 张之文, 张海明, 陆根海, 刘永士,

2014, 30(6): 145-149.

摘要 ( 206 )

PDF (1393KB) ( 728 )

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利用磁珠富集法分离微卫星序列，以开发长江刀鲚微卫星分子标记。将长江刀鲚基因组DNA经限制内切酶Mse I酶切，回收400-1 000 bp片段，安装接头，构建长江刀鲚全基因组PCR文库。用生物素标记的微卫星探针（CA）₁₂与其杂交，磁珠富集含有微卫星序列的 DNA片段。将洗脱所得片段进行PCR扩增，然后进行克隆。经过菌落PCR检验后挑选出118个阳性克隆进行测序，其中97条含有微卫星序列。用设计合成59对微卫星引物对30尾养殖长江刀鲚进行引物的多态性筛选，得到9对多态性引物。

海参溶菌酶枯草芽孢杆菌基因工程菌构建

孙璐, 刘志文, 邹丹, 李丹, 潘博, 丛丽娜

2014, 30(6): 150-154.

摘要 ( 260 )

PDF (2208KB) ( 772 )

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通过基因重组等技术构建重组海参溶菌酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌，并对此基因工程菌进行生长曲线的测定和稳定性分析。结果表明，海参溶菌酶基因特异引物在400 bp处扩增出特异性条带，与预期的海参溶菌酶基因大小一致；重组表达质粒pHT43-SjLys经双酶切验证得8 000 bp和400 bp左右的片段；重组海参溶菌酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌与原始菌株WB600相比生长趋势基本一致，外源基因的插入对菌体的生理代谢未造成太大影响；在无选择压力的条件下，重组质粒的稳定性良好，连续传5次后的遗传稳定性为94%，并且提取质粒和双酶切验证后发现工程菌没有发现重排或丢失现象。表明重组海参溶菌酶基因工程菌pHT43-SjLys/WB600构建成功。

溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统分子伴侣护航蛋白VscO的基因克隆及其生物信息学分析

, 庞欢瑛, 周泽军, 丁燏, 黄郁葱, 吴灶和, 简纪常

2014, 30(6): 155-161.

摘要 ( 235 )

PDF (2705KB) ( 914 )

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克隆了溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）ZJ03株Ⅲ型分泌系统（T3SS）分子伴侣护航蛋白（Chaperone escort protein）vscO基因，并对其进行生物信息学分析。结果表明，vscO基因全长462 bp，编码153个氨基酸，理论分子量约为18.43 kD，pI值为9.22。细胞定位分析显示vscO基因位于外周质，不存在信号肽，无跨膜区。vscO基因具有转录起始区-35区和-10区，以及翻译识别信号SD序列（Shine-Dalgarno sequence）。该氨基酸序列含有多种活性位点，如蛋白激酶C磷酸化位点等。系统进化树发现溶藻弧菌的VscO蛋白与副溶血弧菌聚为同一亚族。VscO亚基三维结构模型显示其与副溶血弧菌T3SS 的YscO蛋白有相似构型。信号通路分析推测VscO位于T3SS的针状样结构上。蛋白网络互作图谱发现VscO与10种T3SS蛋白具有相邻关系。本研究结果将为溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统护航机制的研究奠定基础。

油茶内生拮抗细菌Y13的定殖能力及其对土著细菌的影响

王瑞芹, 周国英, 刘君昂, 李冬琴, 孟庆敏

2014, 30(6): 162-167.

摘要 ( 210 )

PDF (1692KB) ( 695 )

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采用抗利福平标记法，定期取样、平板稀释法回收等方法，检测拮抗菌株Y13在油茶叶片内的定殖能力；以平板培养及16S rDNA法分析菌株Y13对油茶叶片内土著细菌种群的影响，为油茶炭疽病的生态治理提供理论依据。结果表明，菌株Y13在油茶健株和病株叶内均能稳定定殖，接种30 d时仍分别能检测到6.60×10³CFU/g和3.56×10³ CFU /g的标记菌株；油茶叶片内可培养内生细菌主要属于5个属的7个已知种，分别为芽孢杆菌属（Bacillus）、赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus）、克雷伯菌属（Klebsiella）、鞘氨醇菌属（Sphingomonas）和假单胞菌属（Pseudomonas），以芽孢杆菌属和赖氨酸芽孢杆菌属为优势属。菌株Y13对不同处理油茶叶片内的群落结构和数量有明显的影响，能促进土著细菌群体的多样性，同时能够显著提高油茶叶片内的枯草芽孢杆菌数量，有利于抑制油茶炭疽病病原菌的增长。

红树林土壤微生物宏基因组文库的构建及两种新颖的 β-葡萄糖苷酶基因的鉴定

麦志茂, 苏宏飞, 李丽珍, 张偲

2014, 30(6): 168-172.

摘要 ( 217 )

PDF (2072KB) ( 658 )

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宏基因组技术是挖掘微生物新酶的重要途径。通过构建红树林土壤微生物Fosmid文库，共获得了约100 000个阳性克隆，该文库外源插入片段平均长度约为30 kb，文库容量达3 Gb。通过对文库中10 000个克隆进行功能筛选，获得了17个具有β-葡萄糖苷酶活性的克隆。对其中2个表达β-葡萄糖苷酶的克隆进行亚克隆，获得2个新颖的β-葡萄糖苷酶的基因，分别命名MhGH3和bgl66。生物信息学分析表明，MhGH3基因由1 992个碱基对组成，bgl66基因由2 025个碱基对组成。在氨基酸水平上，MhGH3和bgl66编码的蛋白质与GenBank 数据库中已知β-葡萄糖苷酶的一致性分别为64%和55%。

嗜热绿色糖单孢菌木聚糖酶XyN10A基因在毕赤酵母中的分泌表达及其酶学性质研究

玉王宁, 刘伟娜, 郑菲, 厚凌宇, 王晓宇, 梁迪, 王伟轩,, 张朔, 柳静言, 金一, 谢响明

2014, 30(6): 173-180.

摘要 ( 201 )

PDF (2603KB) ( 545 )

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木聚糖酶（Xylanase）可降解自然界中大量存在的木聚糖类半纤维素，由于其在饲料、食品、造纸等领域的广泛应用，越来越受到人们的关注。利用分子生物学技术首次成功构建了一株高效表达嗜热绿色糖单孢菌（Saccharomonospora viridis）木聚糖酶SviXyN10A的重组工程菌，建立了SviXyN10A的毕赤酵母表达体系，实现了SviXyN10A在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的分泌表达，并对表达产物进行了诱导表达及纯化，以及酶学性质的研究。结果表明，重组木聚糖酶SviXyn10A用甲醇诱导2 d后酶活即达到7.53 IU / mL，最适反应温度为70℃，pH7.0。pH作用范围较广（pH5.0-9.0），具有较强的热稳定性和耐碱性，几乎没有纤维素酶活性，故可以应用在很多工业领域，尤其是在纸浆造纸行业具有很大的潜在应用价值。

黑曲霉嗜热β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的克隆表达及其魔芋降解产物分析

倪玉佳, 周旻昱, 欧阳嘉, 郑兆娟, 勇强

2014, 30(6): 181-186.

摘要 ( 232 )

PDF (2519KB) ( 594 )

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根据毕赤酵母密码子偏好性优化设计合成一段来自黑曲霉BK01的嗜热β-甘露聚糖酶基因，通过构建表达载体pPICZαA-man线性化后电转化入不同的毕赤酵母宿主，获得最佳重组菌KM71-MAN，其发酵罐发酵酶活最高达2 318.85 IU/mL。表达产物纯化后的分子量约为40 kD，最适反应温度为80℃，最适pH为5.0。该酶在70℃（pH5.0）保温44 h仍能保留43%的酶活力且在pH3.0-7.0范围内保温70 h（50℃）酶活力仍能保留85%以上。利用发酵罐所产重组酶酶解魔芋胶制备甘露低聚糖，产物以甘露二糖和甘露六糖为主，甘露低聚糖得率为55.6%。该重组β-甘露聚糖酶具有良好的热稳定性和pH稳定性，在魔芋制备甘露低聚糖中具有较好的应用潜能。

黑曲霉（AS0006）产纤维素酶的纯化研究

张欢, 曹焱鑫, 蒋林, 王晓明, 刘齐, 董晓莹, 寇巍

2014, 30(6): 187-191.

摘要 ( 193 )

PDF (2206KB) ( 786 )

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利用实验室中黑曲霉菌株AS0006进行粗酶发酵，对产出的纤维素酶液进行不同饱和度（NH₄）₂SO₄的分级沉淀，经过Sephadex G-25、Sephadex G-100分离纯化后，得到两种内切酶（EG）组分、一种外切酶（CBH）组分。通过酶活性及电泳检测发现，两种EG酶组分的相对分子质量分别为29.63 kD、37.49 kD，CBH酶组分相对分子质量为56.51 kD。相较原始粗酶液，EG回收率可达18.07%、纯化倍数为3.46，CBH回收率可达12.96%、纯化倍数为4.14，β-葡萄糖苷酶（CB）回收率可达22.37%、纯化倍数为3.58。

细菌脂肪酶在大肠杆菌细胞表面的功能性展示

徐丽香, 王作镇, 舒正玉, 武海龙, 刘艳如, 李欣, 黄建忠

2014, 30(6): 192-198.

摘要 ( 294 )

PDF (2231KB) ( 615 )

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细胞表面展示技术已广泛应用于突变文库的高通量筛选，有力地促进了蛋白质工程的发展。以来自于铜绿假单胞菌的自转运蛋白Est A的羧基端结构域作为锚定区，构建脂肪酶LipA与EstA羧基端结构域的融合基因，并将融合基因插入到改造后的pACYC-Duet表达载体中，获得表面展示载体pBCCB-X1。将载体pBCCB-X1分别导入到大肠杆菌JK321和大肠杆菌UT5600菌株中，以IPTG诱导融合基因的表达。分别用三丁酸甘油酯定性检测和pNPO定量检测诱导表达后的全细胞脂肪酶的水解活性。试验结果表明，脂肪酶LipA在大肠杆菌JK321和大肠杆菌UT5600细胞表面均得到功能性展示，水解活性分别为（2.8±0.1）U/OD和（2.6±0.06）U/OD。脂肪酶LipA在大肠杆菌细胞表面的功能性展示，为后续高通量筛选LipA突变基因文库，奠定了坚实的基础。

根癌农杆菌介导的赭曲霉遗传转化体系的建立

, 崔倩, 李洁, 刘晓光

2014, 30(6): 199-204.

摘要 ( 204 )

PDF (2420KB) ( 545 )

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赭曲霉在工业上用于甾体C-11α羟基化。为了对现有赭曲霉生产菌株进行遗传改造，以农杆菌LBA4404作为侵染菌株，以赭曲霉（TCCC41060）作为受体菌株，以潮霉素B基因作为筛选标记，成功建立了根癌农杆菌介导的赭曲霉遗传转化体系并对其转化效率的主要影响因素，如农杆菌浓度、孢子浓度、共培养时间和温度等进行了分析。在最佳条件下，转化效率可以达到57个转化子/10⁸个分生孢子。随机挑选的8个阳性转化子10代连续培养结果表明所获得的转化子能稳定遗传。该遗传转化体系的建立为赭曲霉菌株的定向遗传改造提供了重要的操作平台。

毕赤酵母表面展示棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶催化合成APG的工艺条件优化

胡霞艳, 刘端玉, 郑穗平

2014, 30(6): 205-210.

摘要 ( 237 )

PDF (2403KB) ( 865 )

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使用毕赤酵母细胞表面展示棘孢曲霉的β-葡萄糖苷酶作为全细胞催化剂，以葡萄糖为底物，在水-醇双相体系中逆水解合成C6-C10烷基糖苷。讨论了含水量、葡萄糖添加量、全细胞催化剂添加量、乙酸-乙酸钠缓冲液pH值和温度等主要因素对反应的影响，并与商品酶苦杏仁β-葡萄糖苷酶、Novozym188进行比较。结果表明，Novozym188不适合逆水解合成APG，苦杏仁β-葡萄糖苷酶反应所需时间短，但最终转化率不如全细胞催化剂。在 5 mL反应体系中，合成HG的最优条件：葡萄糖0.1 g，全细胞催化剂0.05 g，10% pH 3.0 buffer；合成OG的最优条件：葡萄糖0.2 g，全细胞催化剂0.05 g，15% pH3.0 buffer；合成DG的最优条件：葡萄糖0.2 g，全细胞催化剂0.2 g，20% pH 3.0 buffer；放置55℃ 200 r/min 恒温振荡器中，反应时间为72 h，HG和DG的最大产率分别为11.69%和3.58%，而OG的产率则在96 h到达最大值6.34%。

优化易错PCR条件以提高毕赤酵母GAP启动子文库突变效率

秦秀林, 钱江潮, 储炬

2014, 30(6): 211-217.

摘要 ( 340 )

PDF (2376KB) ( 806 )

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高效的随机突变策略对于构建含有丰富突变体的启动子文库至关重要。为了建立一个突变率适中并能获得较多有益突变子的易错PCR（error-prone PCR，EP-PCR）条件，实现毕赤酵母GAP启动子的高效突变，对EP-PCR反应条件进行了优化。考察了模板浓度、反应循环数和Mg²⁺浓度对EP-PCR的产物得率和突变率的影响后，确定了适于GAP启动子突变的EP-PCR条件：模板浓度、反应循环数和Mg²⁺浓度分别为1 ng/μL、25和10 mmol/L。优化EP-PCR条件后，GAP启动子突变率为1.1%，连续进行3轮EP-PCR后突变率可达到4.0%。利用优化后EP-PCR对GAP启动子进行随机突变，筛选了250个突变子，获得5个启动子强度高于野生型GAP启动子的突变体，有益突变达到了2%，可用于构建GAP启动子文库。

人转录因子hASH4的表达纯化及其DNA结合活性

苏琢磊, 楼田甜, 王远东, 季朝能

2014, 30(6): 218-224.

摘要 ( 269 )

PDF (2780KB) ( 680 )

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hASH4蛋白所属的HLH转录因子家族在调节基因表达，调控细胞周期，决定细胞分化中起了重要作用。有研究表明hASH4蛋白可能与皮肤的分化发育有着密切的关系，但具体机制不明。成功构建了pET28b-hASH4表达质粒，并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。经过对温度、时间、IPTG浓度等表达条件的优化，确定在37℃下1 mmol/L IPTG诱导表达4 h可达到最佳表达效果，并通过亲和层析和弱阳离子交换层析纯化蛋白，得到了电泳纯的目的蛋白。通过非放射性凝胶滞留试验发现hASH4蛋白单体只具有非特异性的DNA结合活性，而不具有特异性的DNA结合活性，推进其在体内的转录因子功能可能需先形成异源二聚体或多聚体才能进一步特异性结合DNA进而作用于下游基因。研究结果为hASH4蛋白的功能和作用方式提供了线索，并为其进一步的结晶条件筛选、晶体结构解析和功能研究奠定基础。

转染RNF6基因对肝癌细胞IRS-2表达的影响

巩健, 宋健

2014, 30(6): 225-228.

摘要 ( 224 )

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构建环指蛋白6（RNF6）真核表达载体，并探讨其对胰岛素受体底物1（IRS-2）表达的影响。以人cDNA为模板，PCR扩增RNF6 全长编码基因，并将其克隆至载体pcDNA3.1-CHA中，将重组质粒转染肝癌细胞株HepG2，利用Real time-PCR、Western blot检测细胞内IRS-2 mRNA水平及蛋白表达情况。携带RNF6目的基因的质粒转染HepG2细胞48 h后IRS-2的mRNA表达降低，为对照组的37%，显著低于对照组，差异有统计学意义（P﹤0.01）。 RNF6引起IRS-2的表达下调，这一过程可能由于泛素化导致胰岛素信号转导通路障碍。

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