生物技术通报

梁文星;

2012, 0(04): 1-6.

摘要 ( 178 )

PDF (608KB) ( 1072 )

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植物mRNA的降解对于维持其生化和细胞学的功能都是必需的,而且这种降解要根据植物发育和外界环境的变化进行及时的调整。与酵母和哺乳动物相比,人们对植物mRNA的降解机制了解较少。对近几年来该领域的研究进展进行总结,包括参与植物mRNA降解的酶类和基因芯片技术的应用,以及mRNA降解的生物学意义等。

内源小RNAs的生物合成及其在植物发育中的作用

刘震西;蓝兴国;康瑞霞;李玉花;

2012, 0(04): 7-13.

摘要 ( 92 )

PDF (243KB) ( 749 )

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在真核生物中,具有20-30个核苷酸的小RNAs能够在DNA或RNA水平上广泛调控复杂生理进程。介绍植物中3种主要内源小RNAs:microRNAs、trans-acting siRNAs和heterochromatic siRNAs的生物合成及其在植物发育中的作用。

多种外源因素对转基因植物抗性影响的研究进展

胡琼;张海松;

2012, 0(04): 14-18.

摘要 ( 108 )

PDF (187KB) ( 391 )

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病毒病对植物的危害在近些年日益严重,培育抗病毒转基因植物是众多防治方法中较为有效的一种。转基因植物在不同机制介导下会产生抗性,尤其是病毒基因介导的抗性试验最为普遍。众多研究证明,抗性受多种因素作用且表现为不同水平。对插入序列来源、转录后hpRNA长度、茎环比和拷贝数等多个因素在近些年的研究进展进行了综述,重点对各自在转基因植物抗性产生中的特点及影响程度进行了分析,并对其他因素进行了展望。

高等植物己糖激酶基因研究进展

张超;王彦杰;付建新;王晓庆;王玮然;董丽;

2012, 0(04): 19-26.

摘要 ( 308 )

PDF (698KB) ( 1351 )

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己糖激酶(HXK)具有催化己糖磷酸化的作用,是植物体呼吸代谢过程中的关键酶之一。近十几年的研究发现,HXK在植物的糖感知和糖信号转导过程中扮演重要的角色。目前GenBank已登录28种高等植物的HXK同源基因,其在不同物种中均以多基因家族形式存在。HXK基因家族多数成员包括9个外显子,编码492-522个氨基酸。HXK亚细胞定位研究发现,植物HXK家族成员主要分布于线粒体,少数成员存在于细胞质、叶绿体和质体基质中。植物HXK基因家族大部分成员在不同器官或组织中均有表达,但是拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtHKL3和水稻(Oryza sativa)OsHXK10仅在花中表达。高等植物部分HXK不仅影响植物生长发育,还调控植物激素信号转导以及调节植物花青素合成途径中相关基因表达。应用MEGA 4.0软件对18个物种HXK基因氨基酸序列构建系统进化树,HXK基因序列聚为7小支,聚类关系能反映不同基因结构和功能的差异。

细菌脂肪酶分泌的研究进展

郑小梅;伍宁丰;范云六;

2012, 0(04): 27-34.

摘要 ( 186 )

PDF (1501KB) ( 1011 )

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细菌脂肪酶是一类重要的工业用酶,其分泌系统有着严谨的机制。革兰阳性细菌利用Sec-转运系统使脂肪酶跨过质膜完成分泌;革兰氏阴性细菌的外泌蛋白通过Sec-转运系统、Tat-转运系统或其他机制跨越内膜后,还必须利用Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型与Ⅴ型分泌系统来完成跨外膜分泌。详细介绍细菌脂肪酶分泌主要依赖的Sec-或Tat-跨内膜的转运系统及革兰氏阴性细菌的Ⅰ型、Ⅱ型与Ⅴ型自分泌系统的3种不同分泌方式。细菌脂肪酶分泌的研究对人们认识其分泌机制,并利用基因工程的手段提高其外泌产量等具有重要的指导意义。

水生无脊椎动物金属硫蛋白研究进展

谭树华;袁志栋;钟彩良;

2012, 0(04): 35-40.

摘要 ( 146 )

PDF (228KB) ( 563 )

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金属硫蛋白在水生无脊椎动物中分布广泛、容易被诱导,在水环境生态响应研究中具有重要意义。对水生无脊椎动物金属硫蛋白分类和特性、MT的诱导及影响因素、基因克隆与表达等方面取得的进展进行概述;并对其金属离子调节功能及其在水环境重金属污染监测、重金属污染生物治理和水产养殖等方面的应用潜力进行展望,提出研究中的不足和今后的研究方向。

鱼类细胞自噬研究进展

周广舟;张璐;卢延克;司灿;徐苏丽;

2012, 0(04): 41-44.

摘要 ( 149 )

PDF (161KB) ( 530 )

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自噬是广泛存在于真核生物中的生命现象,对于细胞的生长、分化、发育和维持细胞内环境稳态等方面具有重要意义。尽管对于作为低等脊椎动物的鱼类细胞自噬研究起步较晚,但近几年围绕其自噬的诱导、自噬相关基因表达及调控、鱼类病原诱导的自噬,特别是以斑马鱼为试验模型开展的自噬与发育调控关系等研究都取得了一些进展,就此进行综述。

酶法催化降解2,4,6-三硝基甲苯的研究进展

夏云婷;张宗棋;王妮莎;辛宝平;刘晓晴;

2012, 0(04): 45-50.

摘要 ( 90 )

PDF (233KB) ( 629 )

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2,4,6-三硝基甲苯(TNT)作为一种广泛使用的含能材料,发挥巨大作用的同时也给环境带来了严重的污染,对人类健康构成一定威胁。目前国内外的TNT处置主要有物理、化学、生物及酶法等方法,其中酶法作为一种新兴的方法,显示了良好的应用潜力,受到研究者的广泛关注,。比较了各类处理方法的优缺点,重点介绍近年来涉及TNT降解的酶学研究进展,并对酶法在TNT废水处理和土壤修复中的应用前景进行展望。

水稻白叶枯病候选抗性基因SHNLR的RGAs克隆及分析

张颖;王长春;胡海涛;张维林;严成其;杨玲;

2012, 0(04): 51-57.

摘要 ( 111 )

PDF (1304KB) ( 451 )

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旨在从含有疣粒野生稻抗白叶枯病基因的新种质SH5、SH76基因组中克隆抗病基因。利用RGAs法得到1个NBS-LRR类同源基因,暂命名为SHNLR(登录号为JF934724)。结果表明,SHNLR的开放阅读框长度为3 105 bp,编码1 034个氨基酸,含有CC、NB-ARC与LRR结构域,具备CC-NBS-LRR类植物抗病基因的结构特征。BLASTn和BLASTp比对显示SHNLR是单拷贝基因,未发现同源性较高且功能已知的基因,仅NBS保守域序列与番茄Prf基因的相似度最高。对SHNLR基因电子定位,发现其位于水稻第11号染色体的长臂末端,但与11号染色体上已定位或克隆的8个白叶枯病抗性基因具有不同序列或处于不同的位置。半定量RT-PCR分析表明,SHNLR在抗病新种质叶片中的表达明显受到白叶枯病菌Zhe173的诱导。因此推测SHNLR可能是1个与抗白叶枯病相关的R基因。

甘菊CMO同源基因的分离与表达分析

牛雅静;王淑慧;黄河;戴思兰;

2012, 0(04): 58-62.

摘要 ( 107 )

PDF (799KB) ( 387 )

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利用半嵌套巢式PCR结合RACE技术从菊科植物甘菊[Chrysanthemum lavandulifolium(Fisch.ex Trautv.)Makino]中分离得到了一个长度为1 450 bp的片段。序列分析结果表明,其开放阅读框全长1 140 bp,编码379个氨基酸残基;在GenBank比对并进行系统进化分析可知,该片段为CMO同源基因,命名为ClCMO。利用不同胁迫处理进行分析发现,在非胁迫条件下ClCMO基因在甘菊茎、叶、花叶中均有表达信号,在根中没有表达;其可以响应干旱、高盐胁迫和脱落酸(ABA)的诱导,不响应冷热胁迫,并且其表达在水杨酸(SA)诱导下受抑制。这些结果表明,ClCMO基因是提高植物耐干旱、高盐能力的有效基因资源。

金银花黄酮醇合成酶基因全长克隆及其序列分析

乔中全;何钢;王晓明;王薇薇;

2012, 0(04): 63-68.

摘要 ( 101 )

PDF (1948KB) ( 562 )

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根据已知的其它物种黄酮醇合成酶cDNA保守序列设计引物,用RT-PCR技术从金银花叶片中扩增获得黄酮醇合成酶基因部分cDNA序列,再用RACE技术获得其两端序列。序列拼接得到完整的1 248 bp的黄酮醇合成酶基因,根据获得的序列,设计引物扩增获得1 001 bp的开放阅读框,编码333个氨基酸。序列分析显示,金银花黄酮醇合成酶与烟草、马铃薯和桔梗的同源性分别为86%、83%和80%,与其它物种的同源性也在80%左右,表明不同物种中黄酮醇合成酶基因具有高度同源性。

地黄扩展蛋白基因RgExpA1的克隆与表达分析

臧亚超;孙鹏;杨太新;李先恩;

2012, 0(04): 69-73.

摘要 ( 97 )

PDF (787KB) ( 410 )

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采用RT-PCR方法对9个地黄扩展蛋白基因在地黄不同组织器官、不同发育时期的表达特点进行了分析,在此基础上用RACE方法克隆了主要在根中表达的RgExpA1基因的全长,并对该基因编码氨基酸的功能位点、拼接方式以及与同源基因的进化关系作了初步分析。

拟南芥甲基结合蛋白基因AtMBP11启动子在种子形成和萌发中的功能鉴定

冀芦沙;于守超;赵燕;肖庆振;王曰文;

2012, 0(04): 74-79.

摘要 ( 126 )

PDF (962KB) ( 404 )

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为研究拟南芥甲基结合蛋白基因AtMBP11在种子形成和萌发过程中的调控模式,克隆拟南芥AtMBP11启动子,将其替换植物表达载体pBI121的35S启动子序列,转入拟南芥基因组中。转基因拟南芥后代卡那霉素抗性发生分离,选取具有3 1分离比的后代自交,产生纯合的具有单拷贝插入的后代。转基因后代GUS染色结果表明,新克隆的MBP启动子控制基因在种子、花药和花粉中高效表达。通过对AtMBP11核心启动子缺失分析表明,G-box元件是主要功能元件。

烟草蛋白酶抑制剂基因的电子克隆及生物信息学分析

林世锋;王仁刚;任学良;

2012, 0(04): 80-86.

摘要 ( 112 )

PDF (1192KB) ( 368 )

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蛋白酶抑制剂可以增强植物对病虫害的抵抗能力,为了深入研究蛋白酶抑制剂在烟草中的作用机制,利用生物信息学的方法,成功获得了烟草品种K326中的4种蛋白酶抑制剂cDNA序列(NtPI-1、NtPI-2、NtPI-3和NtPI-4)并对其进行了序列分析。它们编码的氨基酸序列都具有典型的马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅰ家族功能结构域,属于马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅰ家族成员。序列分析表明,4种蛋白酶抑制剂基因cDNA序列均具有完整的开放读码框,依次编码128、95、94和72个氨基酸残基,它们的氨基酸序列一致性在31%-38%之间。系统树分析表明,烟草品种K326中的4种蛋白酶抑制剂分散在进化树的不同位置,形成不同亚群。

中国传统菊花品种‘小林静’再生及转化体系的建立

姜宁宁;付建新;戴思兰;

2012, 0(04): 87-92.

摘要 ( 92 )

PDF (209KB) ( 394 )

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以中国传统菊花品种‘小林静’叶片为外植体,建立了‘小林静’较好的再生体系及遗传转化体系。结果表明,‘小林静’叶盘最适不定芽分化培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/LNAA,不定芽分化率为92.76%,平均再生不定芽数为2.376 7个;试管苗最佳生根培养基为1/2MS,生根率达100%。移栽采用灭菌的蛭石,再生苗移栽成活率达90%以上。采用根癌农杆菌C58C1介导的叶盘转化法进行‘小林静’的遗传转化试验,农杆菌OD600=0.5-0.6,侵染10 min后,将叶片外植体接种到MS+2.0 mg/L 6-BA+1.5mg/L NAA的培养基中黑暗共培养2 d,之后转接到附加10 mg/L硫酸卡那霉素和400 mg/L羧苄青霉素的分化筛选培养基中进行转化细胞的筛选,待长出抗性芽后转接至生根培养基中进行培养,最终建立了菊花品种‘小林静’的遗传转化体系。

云南松SSR-PCR反应体系的建立与优化

张瑞丽;许玉兰;王大玮;吕学辉;何承忠;段安安;

2012, 0(04): 93-97.

摘要 ( 81 )

PDF (577KB) ( 488 )

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为了建立适宜云南松SSR-PCR的反应体系和扩增程序,利用近缘种火炬松的引物,采用正交设计L16(45)对云南松SSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物)在4个水平上进行优化,筛选出各反应因素的最佳水平,建立了适于云南松的SSR反应体系。在10μL的反应体系中,模板DNA的用量为30.0 ng,TaqDNA聚合酶的用量为1.0 U,Mg2+的浓度为2.0 mmol/L,dNTPs浓度为0.4 mmol/L,引物的浓度为0.2μmol/L。扩增程序为:94℃预变性4 min;94℃变性45 s,48℃退火30 s,72℃延伸30 s,30个循环;72℃延长10 min,4℃保存。最后利用1个居群对该体系进行稳定性验证,结果可用于云南松SSR标记的研究。

纳米器件对叶蛋白提取的影响

罗芳;熊劲松;谢致平;

2012, 0(04): 98-102.

摘要 ( 102 )

PDF (186KB) ( 387 )

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从植物中提取蛋白质包括机械破碎和离心等一系列步骤,蛋白质在提取液中的溶解度直接影响蛋白提取率和产量。结果表明,用纳米器件处理过的提取液能显著提高叶蛋白的提取率,提升幅度为10%-30%。利用正交试验研究不同提取条件下纳米器件对蛋白可溶性的影响,结果显示浸泡时长(纳米器件浸泡在提取液中的时长)是最关键的已测因素。此外,植物样品的破碎程度也是影响叶蛋白提取率的关键因素之一。

内蒙古白绒山羊IGF-IR基因cDNA克隆及组织表达特异性分析

宝梅英;赵荷雅;杨娇馥;鲍文蕾;李彬;杨军;侯鑫;王志钢;

2012, 0(04): 103-107.

摘要 ( 113 )

PDF (1253KB) ( 358 )

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旨在克隆内蒙古白绒山羊IGF-IR基因并分析其基本表达模式。采用RT-PCR克隆基因,将得到的IGF-IR基因cDNA片段的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。半定量RT-PCR进行组织特异性表达检测。获得了内蒙古白绒山羊IGF-IR基因3'端编码区2 118 bp的cDNA序列(JN200823),编码705个氨基酸残基。核苷酸序列与牛的IGF-IR(XM606794.3)基因同源性为98%,相应的氨基酸序列同源性为99%。SMART分析表明,推导出的编码蛋白具有跨膜域,酪氨酸激酶催化域。半定量RT-PCR检测表明,IGF-IR基因在绒山羊脑、胰腺、肝、肾组织中均有表达。

柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3基因在毕赤酵母中的表达及分析

孔春林;韩红玉;李洋;董辉;姜连连;李婷;赵其平;朱顺海;黄兵;

2012, 0(04): 108-112.

摘要 ( 90 )

PDF (842KB) ( 390 )

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旨在真核表达系统中高效表达柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3(Eimeria tenellacalcium-dependent protein kinase-3,EtCDPK3),获得有活性的天然蛋白,利用毕赤酵母表达系统对该基因进行了表达。将EtCDPK3基因连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,构建重组质粒pPIC9K-EtCDPK3。重组质粒通过电击转化入酵母细胞GS115后,用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选,获得含重组质粒的酵母表达细胞。重组酵母细胞在含1%甲醇的BMMY培养基中诱导产生目的蛋白,培养收集1-4 d的部分上清。经SDS-PAGE检测,所表达的蛋白相对分子质量约为49 kD。Western blotting表明,该蛋白能与兔抗EtCDPK3血清特异性结合。结果表明,柔嫩艾美耳球虫CDPK3基因在毕赤酵母中成功地进行了表达。

美洲大蠊3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及表达

龙高群;王赟;张春林;

2012, 0(04): 113-117.

摘要 ( 119 )

PDF (990KB) ( 316 )

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旨在通过5'-RACE获得美洲大蠊3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的全长cDNA序列,进行生物信息学分析,构建原核表达载体,诱导重组蛋白表达,为进一步研究其功能奠定基础。通过3'-RACE技术,PCR扩增获取编码美洲大蠊GAPDH蛋白的全长cDNA序列;采用生物信息学方法推导出该序列编码的氨基酸序列及其理化性质;预测信号肽、蛋白疏水性、可溶性、跨膜区结构、二级结构、三级结构,并构建系统发育树;构建原核表达载体pET28a-GAPDH,IPTG诱导重组蛋白表达,并用His-tag抗体Western blotting验证。结果显示,美洲大蠊GAPDH基因,其完整阅读框含999个碱基,编码332个氨基酸。序列分析显示,该蛋白与家蚕GAPDH相似性为89%,具有GAPDH保守功能域,经IPTG诱导获得重组蛋白。

不同培养条件对鸡胚胎生殖细胞Oct4启动子DNA甲基化的影响

王娟;焦飞;于媛;潘效红;马云;

2012, 0(04): 118-121.

摘要 ( 90 )

PDF (401KB) ( 416 )

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旨在在体外通过胚胎生殖细胞(EGC)和细胞外基质共同构建一个EGC的小生境(niche)模型,通过比较Oct4DNA甲基化的变化,研究niche中特有的表观遗传效应对胚胎生殖细胞自我更新的影响。构建EGC细胞标准培养方案(对照组)和改良培养方案(试验组),采用甲基化特异性PCR(MS-PCR)技术、RT-PCR技术,对比分析两种培养方案中Oct4启动子的甲基化状态,判断基因表达与其CpG岛甲基化的关系,分析DNA甲基化模式与EGC细胞自我更新的关系。结果显示,试验组可扩增出Oct4的非甲基化扩增产物,而对照组为其甲基化扩增产物,试验组Oct4表达水平明显高于对照组。试验组EGC生长状态明显好于对照组。试验表明,在改良培养条件下,Oct4基因启动子DNA甲基化程度较低,且与基因表达水平呈负相关,更有利于维持胚胎生殖细胞的自我更新状态。

一株絮凝菌的鉴定、絮凝基因定位及其絮凝剂成分分析

陈俊;詹志钢;陈哲;王涛;杨之帆;

2012, 0(04): 122-126.

摘要 ( 103 )

PDF (715KB) ( 411 )

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从武汉市综合废水处理的活性污泥中筛选得到一株絮凝剂产生菌株MBF03,其絮凝率达到90%以上,絮凝效果稳定。通过16S rDNA鉴定,该菌为泛菌属,扫描电镜结果显示为杆状。通过质粒转化与质粒消除试验,初步证实了MBF03菌的絮凝基因位于染色体上。提取该菌所产的絮凝剂,进行紫外、红外分析,结果表明,该絮凝剂主要成分是胞外多糖类物质,不含蛋白质和核酸。

产生物表面活性剂芽孢杆菌培养条件的优化

解舒涵;何连芳;张玉苍;

2012, 0(04): 127-134.

摘要 ( 96 )

PDF (1524KB) ( 313 )

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为了提高生物表面活性剂的表面活性,通过单因素及正交试验对已筛选的产生物表面活性剂芽孢杆菌的培养基及培养条件进行了优化,优化后的培养基成分为可溶性淀粉20 g/L,氯化铵2 g/L,KH2PO46 g/L,K2HPO42 g/L,MgSO4.7H2O 0.3 g/L,NaCl 2 g/L,CaCl20.08 g/L,EDTA 0.4 g/L。培养条件为4%接种量,种龄16 h,初始pH7,培养温度37℃,摇床转速160 r/min,发酵48 h。优化发酵条件后,发酵液表面张力由初始67.5 mN/m降低至24.8 mN/m,生物表面活性剂产量达到1.08 g/L。

DN-AMPK腺病毒载体的构建及其在小鼠成肌细胞系C2C12肌管分化中的影响

杨成红;邓思思;臧奕;

2012, 0(04): 135-140.

摘要 ( 147 )

PDF (1306KB) ( 764 )

相关文章 | 计量指标

在研究AMPK的调控网络时,通常利用过表达显性失活突变型AMPK(dominant negative AMPK,DN-AMPK)作为研究手段来验证AMPK在某些重要生理病理调节通路中的关键作用。旨在利用Ad5腺病毒载体体系构建Ad-DN-AMPK表达载体,并在成肌细胞系C2C12中检测无活性AMPK高表达后对C2C12细胞分化为肌管细胞的影响。通过构建AMPKα1(D159A)和AMPKα2(K45R)的腺病毒表达载体,在HEK293细胞中成功包装并扩增出完整的腺病毒,待其感染能力基本稳定后,将腺病毒感染C2C12,利用激光定量成像仪检测其感染滴度,感染效率能高达100%,并且能够持续表达6 d。DN-AMPK高表达后,AMPK常用激活剂A769662(SN-5)不能激活AMPK,表现为AMPK下游蛋白活性丧失,如ACC磷酸化无变化。通过实时定量PCR的方法,检测DN-AMPK对C2C12分化为肌管细胞的影响,结果表明过表达DN-AMPK能够促进C2C12细胞分化为肌管细胞的标记蛋白(Myod和Myogenin)的表达,即促进C2C12分化为肌管细胞。

乙酰胆碱受体α4β2亚型在非洲爪蟾卵母细胞中的表达

于海鹏;李宝珠;房立丛;沈立姿;朱晓鹏;胡远艳;张本;长孙东亭;罗素兰;

2012, 0(04): 141-145.

摘要 ( 121 )

PDF (540KB) ( 765 )

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通过建立乙酰胆碱受体α4β2亚型(α4β2 nAChR)在非洲爪蟾卵母细胞中的表达模型,以便以α4β2 nAChR为作用靶点进行药物筛选。将乙酰胆碱受体亚基基因α4、β2体外转录获得的cRNA,通过显微注射的方法注入非洲爪蟾卵母细胞,并对该受体的表达情况进行检测。结果显示,乙酰胆碱受体α4β2亚型在蛙卵细胞中获得了有效表达,记录到典型的ACh配体门控的离子通道内向电流。

应用PCR-DGGE技术分析BKS-2型糖尿病模型小鼠盲肠内容物微生物菌群结构

魏婷婷;胡芳;杜彩贺;张仁敏;周东蕊;张红琳;陆祖宏;

2012, 0(04): 146-151.

摘要 ( 160 )

PDF (771KB) ( 841 )

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通过对BKS-DB 2型糖尿病小鼠盲肠内容物微生物群落结构的分析,探讨基因突变模型鼠肠道微生物群落与糖尿病发生的相关性。提取BKS-DB 2型糖尿病小鼠与同窝对照小鼠盲肠内容物细菌总DNA,PCR扩增16S rRNA基因V3区,DGGE方法检测扩增产物,并挑选特异条带测序,对图谱作UPGAMA聚类分析,运用SPSS软件分析多样性。结果显示,UPGAMA聚类分析表明,对照组样本之间相似度0.66-0.91,糖尿病组样本之间相似度0.61-0.88,两组之间最高相似度为0.51。特异性条带测序后经比对与Parabacteroides菌属亲缘关系最近。SPSS统计分析糖尿病组和健康对照组小鼠的DGGE条带数、多样性指数(H’)、丰富度(R)和优势度(D)的差异性显著,具有统计学意义(P<0.05)。糖尿病组小鼠与对照组小鼠的盲肠内容物微生物群落多样性存在差异,糖尿病对肠道微生物的多样性有影响。

口虾蛄性腺组织蛋白质双向电泳体系的建立及优化

莫海波;田燚;湛垚垚;赵丽娜;刘海映;

2012, 0(04): 152-157.

摘要 ( 97 )

PDF (1049KB) ( 425 )

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旨在通过口虾蛄雄性、雌性性腺组织蛋白质双向电泳技术体系的优化,获得雄性、雌性口虾蛄性腺蛋白质的表达图谱。结果表明,不同的蛋白提取方法,上样前处理方法,上样量,聚焦时间及雌、雄性口虾蛄性腺蛋白表达图谱存在一定的差异。雌性、雄性口虾蛄用Tris-HCl提取后用丙酮沉淀方法提取蛋白质、不经上样缓冲液处理、上样量为10μg时,得到较好图谱。对图谱分析发现在pH4-6.5范围内,雌性口虾蛄性腺可溶性蛋白质种类多于雄性。雄性口虾蛄蛋白质点相对于雌性较少,且蛋白质大部分分布于酸性端。经过蛋白质双向电泳体系的优化,能显著提高双向电泳图谱的分辨率,为进一步研究口虾蛄性别差异表达蛋白的筛选,后续的口虾蛄蛋白质组学研究提供技术保障。

转基因玉米Bt176液相芯片检测方法的建立

程涛;王慧煜;黄新;余多慰;韩雪清;

2012, 0(04): 158-164.

摘要 ( 94 )

PDF (1183KB) ( 574 )

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为建立转基因玉米Bt176的液相芯片检测方法,根据已公布的转基因玉米Bt176外源插入基因CaMV35S启动子序列,外源基因3'端与玉米基因组DNA连接区序列,同时以玉米特异Zein内源基因序列为参照,利用Primer Premier5.0等软件设计特异性引物和探针。将探针与荧光编码微球偶联后,与PCR产物杂交反应,用液相芯片检测仪(Bio-plex 200)检测荧光信号。检测结果显示,该方法具有高特异性及灵敏度,各条探针之间无交叉反应,最低检测限可达0.01%。初步建立了检测转基因玉米Bt176的液相芯片技术,为其他转基因作物的快速高通量检测提供了借鉴和经验。

苏云金芽孢杆菌Cry1A(b)抗虫基因LAMP检测方法的建立与应用

周琳华;肖维威;吴永彬;蔡翠霞;康文杰;刘唐书;马文丽;

2012, 0(04): 165-169.

摘要 ( 103 )

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以转基因玉米MON810为模板,针对Cry1A(b)抗虫基因核酸保守序列设计特异性引物,建立LAMP检测体系。对该体系的可行性、灵敏性、特异性进行分析,并应用于转基因产品的检测。研究结果显示该方法快速简单、灵敏度特异性高、结果可视化,可应用于转基因产品中Cry1A(b)基因的初步筛选。

肝癌相关抗原SMP30重组基因的构建、表达及分子伴侣共表达系统的探索

黄朋;范升龙;凌敏;贺菽嘉;周素芳;

2012, 0(04): 170-175.

摘要 ( 133 )

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旨在通过应用基因工程的方法构建、表达和纯化肝癌相关抗原SMP30,研究共表达分子伴侣提高基因工程蛋白表达的可溶性及效率。PCR扩增SMP30 cDNA序列,用基因工程技术构建重组表达质粒,转化E.coliBL21(DE3)pLysS宿主菌。表达蛋白经Ni-NTA亲和柱纯化获得HIS-SMP30融合蛋白;分别将4种表达不同分子伴侣的质粒(pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pTf16)转入E.coliBL21(DE3)中;然后再将重组质粒转入含有分子伴侣质粒的细胞中,进行分子伴侣与重组质粒的共表达,SDS-PAGE检测目的蛋白的表达量与可溶性分析。经优化表达条件后,目的蛋白以包涵体形式表达,目的蛋白占总蛋白的60%以上;纯化后纯度高达95%以上;诱导共表达后,目的蛋白在上清含量极少,不到总表达目的蛋白的10%。成功构建出高效表达的SMP30重组质粒;加入到诱导表达体系中的4种分子伴侣质粒不能有效的促进可溶性蛋白的表达,pTf16共表达系统能增加目的蛋白表达量。

人自身抗原SSA52的酵母重组分泌表达及其斑点免疫金渗滤法的建立

杨湘越;宋涛;兰小鹏;

2012, 0(04): 176-180.

摘要 ( 108 )

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人自身抗原SSA52通常采用组织提取法或原核表达获得,存在诸多问题。通过基因克隆技术,在毕赤酵母中表达人自身抗原SSA52,并建立斑点免疫金渗滤法。采用RT-PCR扩增SSA52基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-SSA52。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清液用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blot)鉴定,并建立斑点免疫金渗滤法(dot immuogold filtration assay,DIGFA),进行初步临床应用对比研究。结果显示,RT-PCR产物约为1 400 bp,与预期1 428 bp接近,pPIC9k-SSA52重组阳性克隆测序结果与基因库核酸数据库报道完全一致,双酶切鉴定正确,表达产物SSA52的相对分子质量约52 kD。Western blot法证实表达产物具有天然SSA52分子的免疫原性,阴性对照菌未见目的表达条带。DIGFA与欧蒙酶免疫斑点法的阳性符合率为95.2%(120/126),阴性符合率为94.0%(47/50),总符合率为94.9%(167/176);两种方法检测结果无统计学显著差异(P>0.05)。说明SSA52在毕赤酵母中分泌表达成功,建立的DIGFA简便、快速、准确。

特异性表达siRNA的新型乙肝核酸药物的研究

杨磊;曹以诚;高强;葛洪;

2012, 0(04): 181-185.

摘要 ( 124 )

PDF (619KB) ( 547 )

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旨在研究靶向于HBsAg的肝脏特异性siRNA,实现核酸药物高靶向性、高特异性基因治疗乙肝。通过重组PCR的方法构建靶向于HBsAg的肝脏特异性表达的siRNA的核酸药物。将目标载体转染HepG2 2.2.15细胞,用ELISA的方法测定转染细胞培养液内HBsAg的含量。PCR鉴定和测序确定重组PAAV-MCS载体PApoE1-ApoE2-hAAT-siHBsAg-U1 3'Box构建成功。重组质粒对HepG2 2.2.15细胞分泌的HBsAg所产生的抑制作用自转染后5 d达到高峰,抑制率达到(30±0.28)%(P<0.01),siRNA特异性表达单元能显著降低HepG2 2.2.15细胞HBV DNA的拷贝数。成功构建的肝脏特异性、siRNA高表达的核酸药物可以有效地抑制HBV基因的表达和复制,为乙肝的进一步治疗研究做了关键性工作。

宿主特异性差异导致沙门氏菌在猪体内定植对特定基因要求的不同

胡健;

2012, 0(04): 186-188.

摘要 ( 118 )

PDF (130KB) ( 390 )

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<正>自1885年Salmon等分离得到猪霍乱沙门氏菌以来,目前已检出沙门氏菌血清型2 500余种。沙门氏菌(salmonella)属的成员可感染多种动物和人,大部分具有很强的致病性。其中许多血清型菌能在人和动物之间交叉感染。目前,人们利用全身性疾病小鼠模型对沙门氏菌的致病性做了大量的研究。常用的小鼠模型与体外细胞培养分析相结合,这一

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