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2015年 第31卷 第7期    刊出日期：2015-07-16

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综述与专论

生物技术与我国猕猴桃育种

井赵斌, 雷玉山, 李永武

2015, 31(7):  1-10.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.036

摘要 ( 338 )   HTML   PDF (1097KB) ( 1029 )  

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猕猴桃是原产我国的重要果树之一。随着现代生物技术的发展，以野生和实生选优为主的传统猕猴桃育种方法与以基因组学和转基因为核心的分子育种技术相比，挑战和机遇并存。与其他果树相比，猕猴桃生物技术及其转基因研究较为滞后。就现代生物技术在猕猴桃遗传育种中的方法、应用及研究进展进行了综述，并对我国猕猴桃育种现状进行浅析，旨在为我国猕猴桃育种和产业发展提供方法参考及思路借鉴。

植物耐盐碱基因工程研究进展

郭文芳, 农万廷, 李刚强, 刘德虎

2015, 31(7):  11-17.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.002

摘要 ( 309 )   HTML   PDF (1274KB) ( 943 )  

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随着全球人口的增加，可利用耕地面积的减少，越来越严重的粮食危机使地球上的盐渍化土地的开发利用开始受到关注。人们正在通过各种途径改良盐渍化土地、培育高耐盐碱的农作物新品种。介绍了植物的耐盐碱机制以及植物耐盐碱基因工程目前的研究概况和未来的发展方向。

植物组蛋白乙酰基转移酶的研究进展

夏德安, 刘春娟, 吕世博, 张彦妮, 刘奕佳, 马旭俊

2015, 31(7):  18-25.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.003

摘要 ( 506 )   HTML   PDF (1089KB) ( 1220 )  

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组蛋白乙酰化是一个动态的、可逆的过程，包括组蛋白乙酰化和去乙酰化两个过程。组蛋白乙酰基转移酶催化组蛋白乙酰化，与组蛋白去乙酰化酶共同作用来调节组蛋白乙酰化状态。组蛋白乙酰化状态影响染色质的结构，进而影响基因的转录，在植物的生长、发育和胁迫反应过程中具有十分重要的调节作用。对组蛋白乙酰基转移酶的细胞内分布、分类、底物特异性以及在发育和胁迫反应中的功能进行了综述。

体细胞直接重编程为神经元和神经干细胞

周桢宁

2015, 31(7):  26-32.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.037

摘要 ( 251 )   HTML   PDF (1269KB) ( 961 )  

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体细胞直接重编程是由已分化细胞类型不经过诱导型多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)中间阶段，直接转换为另一种细胞类型的重编程过程。体细胞直接重编程避免了iPSC技术存在的重编程效率低下、引入致癌基因等多种缺陷，并为细胞替换治疗和个性化医药研发设想贡献了新的实现途径。现代医学对于诸如神经退行性疾病、神经遗传疾病和外伤导致的神经细胞受损等一些神经系统疾病一直没有有效的治疗手段。而体细胞直接重编程为治疗这些疾病提供了另一种治疗途径，因此体细胞直接重编程为神经细胞相关领域迅速成为研究热点。回顾了体细胞重编程为诱导型神经元(Induced neurons，iNs)和诱导型神经干细胞(Induced neural stem cells，iNSCs)的最新研究进展，并探讨iNs和iNSCs在临床应用上的各自优势、局限性及应用前景。

长链非编码RNA与肿瘤和干细胞

万波, 廖世奇, 袁红霞, 马梅兰, 朱剑, 曾家豫

2015, 31(7):  33-39.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.004

摘要 ( 280 )   HTML   PDF (1109KB) ( 790 )  

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人类基因组包含20 000多种蛋白质编码基因，只占总基因的2%左右，而90%以上的转录子是长链非编码RNA(Long non-coding RNAs，lncRNAs)。lncRNAs是广泛存在于哺乳动物基因组中的长度在200-100 000 nt之间，且不具有蛋白质编码功能的转录本。研究发现其在许多类型的肿瘤中存在异常表达，具有潜在的致癌或抑癌作用，并作为重要的调控分子参与各种生物学过程，与肿瘤的发生、发展密不可分。此外，lncRNAs在维持干细胞全能性、调控干细胞基因表达、调节干细胞自我更新和分化等方面发挥了至关重要的作用，是继microRNA后肿瘤研究的新热点。针对lncRNAs在肿瘤和干细胞生物学中的功能及相关机制作一综述，旨在为肿瘤的诊断、治疗、预后等方面提供新思路。

鱼类腌制品加工过程微生物群落多样性研究进展

吴燕燕, 钱茜茜, 李来好 , 杨贤庆, 马海霞

2015, 31(7):  40-44.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.005

摘要 ( 275 )   HTML   PDF (1077KB) ( 748 )  

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鱼类腌制品是中国的一种传统加工水产品，由于其易保存、风味特殊、营养丰富，深受大众喜爱。然而腌制加工过程中微生物种类复杂，对制品的品质有较大的影响。结合国内外最新研究阐述了传统腌制鱼和微生物发酵快速腌制鱼中的微生物群落变化、微生物多样性最新研究技术及应用，并在此基础上提出了鱼类腌制品加工过程微生物群落多样性的研究方向，为揭示影响鱼类腌制过程的微生物作用机制及生产优化控制提供理论依据。

技术与方法

基于高通量测序技术检测全基因组DNA甲基化水平的方法

马浪浪, 梁振娟, 先新, 罗仕文, 李清超, 梁黔云

2015, 31(7):  45-50.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.007

摘要 ( 380 )   HTML   PDF (1092KB) ( 1180 )  

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DNA甲基化的研究最近几年一直是表观遗传学研究的重点。有关DNA甲基化水平检测的方法大体上有十几种，随着第二代测序技术的发展，实现了在全基因组水平上对甲基化状态进行检测。目前，基于第二代高通量测序进行全基因组DNA甲基化水平检测的方法主要有BSP-seq(亚硫酸氢盐修饰结合直接测序法)、MeDIP-seq(甲基化DNA免疫共沉淀测序法)、MBD-seq(甲基化DNA富集结合高通量测序法)。就这3种方法在原理、流程、优缺点、优化使用及后期需要用到的部分生物信息学资源等方面的研究进展作一综述，旨在为研究者在采用高通量测序方法研究DNA甲基化模式时提供一些思路。

红豆杉分布与培育技术研究进展

刘新星, 余响华, 刘学端

2015, 31(7):  51-57.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.008

摘要 ( 297 )   HTML   PDF (1062KB) ( 812 )  

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红豆杉培育技术的发展，对提高红豆杉林种植面积、缓解紫杉醇药源紧缺的难题，具有非常重要的现实意义。介绍了中国红豆杉的基本生物学特性及其林业分布状况；综述了近10年来红豆杉培育技术的研究进展，包括传统的播种和扦插技术、现代林业培育技术路线与方法方面的最新研究成果，重点论述了以组培为基础的无性繁殖技术在红豆杉林业培育中的应用；提出红豆杉林业育种领域亟待加强的方面，为推广红豆杉林业培育技术、扩大种植面积提供借鉴和参考。

西瓜枯萎病菌的快速检测与鉴定

曹月霞, 凌键, 谢丙炎, 杨宇红

2015, 31(7):  58-63.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.009

摘要 ( 275 )   HTML   PDF (1241KB) ( 677 )  

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通过西瓜枯萎病菌与其他专化型枯萎病菌及瓜类几种重要病原菌的比较基因组分析，获得了西瓜枯萎病菌的基因组特异序列。在此基础上，设计出特异引物，筛选可扩增出西瓜枯萎病菌特异性DNA条带的引物。将特异性引物和尖孢镰刀菌专化型的通用引物W106R/W106S结合，建立双重PCR检测体系。该双重PCR检测体系可以在一次PCR反应中快速、准确的检测出西瓜枯萎病菌，为通过分子方法快速鉴定西瓜枯萎病菌提供技术支持。

多重PCR技术快速检测烤后烟叶转基因成分

余婧, 郭玉双, 林世锋, 余世洲, 赵杰宏

2015, 31(7):  64-68.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.010

摘要 ( 248 )   HTML   PDF (2428KB) ( 525 )  

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为提高烟叶转基因成分检测效率，建立了烤后烟叶中3种外源基因成分的多重PCR检测技术体系，通过优化该反应体系中的Mg²⁺、dNTP、rTaq酶、引物浓度及退火温度等参数，实验最适条件为将4对相等摩尔浓度引物预先按1:1:1:1(V/V)混合，在Mg²⁺为1.5 mmol/L、dNTP为125 μmol/L、rTaq酶 1 U、混合引物1 μmol/L，DNA 100 ng，退火温度65℃，循环数35个的反应条件下，在一次PCR反应中便可同时检测烟草内源基因NR，外源基因35S启动子、NOS终止子、NPT II筛选标记基因。优化后的反应体系能够有效地检测出转基因烤后烟叶百分比含量为0.9%(V/V)的转基因成分。

黔产宽叶缬草ISSR反应体系的建立与优化

钱志瑶, 周道堂, 黄秀平, 周镁, 陈祖云, 覃容贵

2015, 31(7):  69-75.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.011

摘要 ( 252 )   HTML   PDF (2480KB) ( 421 )  

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旨在建立稳定、可靠的宽叶缬草ISSR反应体系。以10个水平单因素试验为基础，应用L₁₆(4⁵)正交设计对反应体系中4个主要因子在 4个水平上进行组合优化，并采用直观法、极差法和方差法对试验结果进行分析；利用优化的反应体系，筛选引物以及最佳退火温度；同时，以9份不同产地宽叶缬草样品对反应体系进行稳定性检测。结果显示，宽叶缬草25 μL ISSR最佳反应体系为：2.5 μL 10×Taq Buffer，2.0 mmol/L Mg²⁺，0.28 mmol/L dNTPs，0.3 μmol/L引物，1.75 U Taq DNA聚合酶，60 ng DNA 模板，ddH₂O补齐；影响大小依次是：Mg²⁺ >引物>dNTPs>Taq DNA聚合酶；确定了各引物的最佳退火温度以及筛选出扩增条带清晰稳定的17条ISSR引物；稳定性实验表明，该体系稳定可靠。优化出宽叶缬草ISSR最佳反应体系并筛选出理想的引物。

研究报告

拟南芥AMP1负调控植物对高盐胁迫的反应

夏金婵, 何金环

2015, 31(7):  76-82.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.012

摘要 ( 248 )   HTML   PDF (1355KB) ( 555 )  

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高盐胁迫严重影响植物的生长发育及农作物产量，因此鉴定盐胁迫响应相关基因至关重要。拟南芥的AMP1编码一个推测的谷氨酸羧肽酶，参与植物的生长发育、光形态建成与种子休眠。研究证明了AMP1的一个新功能，它的缺失提高了缺失突变体amp1的抗高盐胁迫的能力，研究证明amp1突变体的强抗高盐胁迫表型一方面是由于在高盐胁迫下amp1突变体比野生型中积累了更多的甜菜碱和脯氨酸降低了突变体细胞的水势，另一方面高盐胁迫条件下amp1突变体中高盐胁迫响应的下游基因RD29A，以及AHA3的表达量也高于野生型，后者可促进Na⁺的外排；高盐条件能够对植物造成氧化胁迫，研究发现AMP1的缺失还上调了抗氧化相关基因ZAT10/12的表达量，进而降低了在高盐胁迫条件下amp1突变体内过氧化物的积累水平，减轻对细胞的损伤和生长的抑制，这些都提高了amp1突变体的抗高盐胁迫的能力。以上结果证明在拟南芥中AMP1负调控植物对高盐胁迫的反应过程。

甜高粱琥珀酸半醛脱氢酶SbSSADH基因克隆及原核表达

王龙海, 杨泽伟, 朱莉, 黄大昉, 郎志宏

2015, 31(7):  83-90.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.013

摘要 ( 283 )   HTML   PDF (2560KB) ( 825 )  

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γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)代谢旁路是 TCA循环的一个代谢支路，广泛存在于动植物和微生物中，植物GABA代谢旁路与植物生物和非生物胁迫响应相关。琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)是GABA旁路的一个关键酶，对GABA途径在生物体内发挥功能起着至关重要的作用。通过检索MaizeGDB和Gramene数据库获得甜高粱SbSSADH基因信息，利用同源克隆的方法获得了甜高粱SbSSADH基因。序列分析结果表明，SbSSADH基因与玉米、甘蔗在核酸序列的相似度为94.77%，但前端约200 bp的信号肽部分差异较大。通过以pET-28a为表达载体构建SbSSADH原核表达系统，Rosetta菌株为表达菌，表达出约50 kD的SSADH蛋白，将纯化的蛋白进行酶活分析，纯化蛋白具有琥珀酸半醛脱氢酶活性，并且受酶抑制剂ATP和AMP的抑制。

小桐子肌醇半乳糖苷合成酶3的基因克隆及其生物信息学分析和功能初步验证

王海波, 邹竹荣, 龚明

2015, 31(7):  91-100.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.014

摘要 ( 227 )   HTML   PDF (3834KB) ( 514 )  

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旨在研究可溶性糖在小桐子抗冷性形成中的作用机制及其相关抗冷基因工程的应用。克隆了小桐子肌醇半乳糖苷合成酶家族成员3基因(JcGS3)的全长cDNA，序列长1 053 bp，包含完整的开放阅读框1 008 bp，编码由335个氨基酸组成的酶蛋白(理论分子量为38 kD、等电点为5.44，含有典型的DxD基序)。对其相应基因组序列中启动子区域进行分析，鉴定到了TATA框、CAAT框、CRT/DRE低温响应元件以及ABA应答元件等。进一步将其在酵母中表达，发现该基因的表达能够显著提高其重组酵母菌的低温抵抗能力。

绿色杜氏藻DHDDS基因生物信息学分析及表达研究

潘益芳, 龚一富, 俞凯, 朱帅旗, 王何瑜

2015, 31(7):  101-108.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.015

摘要 ( 306 )   HTML   PDF (2164KB) ( 744 )  

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绿色杜氏藻是一种能产生重要次生代谢产物类胡萝卜素的单细胞绿藻，脱氢多萜醇焦磷酸合成酶(dehydrodolichyl diphosphate synthase，DHDDS)是其在类胡萝卜素合成途径中的相关酶。旨在研究DHDDS基因表达与类胡萝卜素含量之间的关系。提取绿色杜氏藻总RNA，通过转录组测序获得DHDDS基因全长，对该基因进行生物信息学分析；并用不同浓度甲基茉莉酸(MeJA)处理绿色杜氏藻，采用实时定量PCR研究该基因转录差异。结果显示，绿色杜氏藻DHDDS基因全长2 211 bp，含有一个1 740 bp长的开放阅读框(ORF)，编码579个氨基酸序列。DHDDS蛋白质理论等电点为7.63，相对分子质量为62 472.7 Da。预测结果表明，DHDDS蛋白不含信号肽，也不存在跨膜区域，该蛋白定位于细胞质基质。氨基酸序列比对结果显示，绿色杜氏藻DHDDS蛋白与小球藻的同源性最高(59%)。实时定量PCR结果表明，经100 μmol/L MeJA处理的绿色杜氏藻DHDDS表达水平最高，具有极显著差异；在该浓度下，类胡萝卜素含量均高于其他浓度组。且DHDDS基因的表达与类胡萝卜素含量呈一定的相关性。绿色杜氏藻DHDDS是一种定位于细胞质基质中的酶，其与绿色杜氏藻类胡萝卜素合成途径有关。在一定浓度范围的MeJA诱导下，低浓度的MeJA对其表达起促进作用，高浓度MeJA对其表达有抑制作用，且其表达与类胡萝卜素含量呈一定的相关性。

莱茵衣藻BBS1基因RNAi载体的构建及应用

陈利红, 李丽丽, 高利芬, 周俊飞, 李甜甜, 彭海

2015, 31(7):  109-114.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.016

摘要 ( 455 )   HTML   PDF (2452KB) ( 928 )  

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巴德-毕氏综合症(Bardet-Biedl syndrome，BBS)是一种由多种基因突变造成、与原生纤毛功能缺失相关的疾病，包含12种致病基因，分别为BBS1-12。旨在通过对衣藻BBS1基因进行RNAi干扰来研究其在衣藻中的功能。首先搭建衣藻快捷简单的RNAi骨架载体；再用RT-PCR克隆莱茵衣藻BBS1基因的一段cDNA 序列于中间载体pEASY-T1上；测序后通过两次酶切连接到RNAi骨架载体上，经菌液PCR、酶切和测序验证，成功构建BBS1基因的RNAi干涉载体。经基因枪介导法转化莱茵衣藻CC503，转基因衣藻具有明显不同于对照的表现型，趋光性发生了改变。

卵形鲳鲹耐低温候选基因△6FAD全长cDNA 序列的克隆与表达分析

韩洪波, 王忠良, 陈刚, 汤保贵, 张健东, 黄建盛, 周晖, 施纲, 潘传豪

2015, 31(7):  115-123.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.017

摘要 ( 293 )   HTML   PDF (2615KB) ( 555 )  

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采用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术克隆了卵形鲳鲹△6脂肪酸去饱和酶(△6FAD)的cDNA全长序列，并对其基因和蛋白序列结构特征进行了生物信息学分析，同时采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术分析了该基因在不同温度条件下的表达差异及低温下的时序表达模式。结果显示，卵形鲳鲹△6FAD基因cDNA序列全长1 908 bp，其中开放阅读框为1 329 bp，3'非编码区431 bp，5'非编码区135 bp，共编码442个氨基酸；其编码蛋白属于疏水性蛋白，无信号肽特征，含有大量蛋白质二级结构和该家族典型的组氨酸富集区及细胞色素b₅结构域。系统进化分析表明，卵形鲳鲹△6FAD基因与尖吻鲈、军曹鱼的△6FAD基因在进化关系上最为接近，其次是大菱鲆、蓝鳍金枪鱼和点带石斑鱼，但与斑马鱼、小鼠和人△6FAD基因进化关系较远。实时荧光定量PCR结果表明，该基因的表达与环境温度和胁迫时间存在明显相关性，其表达水平在降温过程中随温度降低而先缓慢下降后又迅速升高，在不同的低温环境下表现出不同的时序表达模式：13℃时，随时间延长该基因的表达量呈现先降低后又升高至原来水平的变化趋势，16℃和19℃时则表现出一种随时间延长逐渐降低的反馈式调节方式。

日本鳗鲡I型Cathelicidin基因的克隆与原核表达

张东玲, 喻达辉

2015, 31(7):  124-131.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.018

摘要 ( 255 )   HTML   PDF (2469KB) ( 642 )  

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Cathelicidin是目前发现的一个最大抗菌肽家族，具有多重生物学功能。旨在探索和利用鱼类Cathelicidin抗菌机制和潜在的生物学功能。应用RACE-PCR技术获得日本鳗鲡I型Cathelicidin(AjCathI)基因的cDNA全长序列。AjCathI的cDNA全长为842 bp，开放阅读框为570 bp，编码189个氨基酸。氨基酸序列分析表明，AjCathI靠近C端有4个保守的半胱氨酸序列，抗菌成熟肽与香鱼(Plecoglossus altivelis)抗菌成熟肽相似性最高，同源性为65.57%。进化分析表明，AjCathI与其它鱼类亲缘关系较近，处于同一个分支上。将AjCathI基因克隆至pET-28a载体，转化Escherichia coli BL21(DE3)宿主菌进行表达。结果表明，AjCathI以包涵体形式表达，经鎳柱纯化、Western blot验证和透析复性，获得高纯度的重组蛋白。

黄鳝转铁蛋白受体1基因的克隆及表达分析

江翱, 李伟

2015, 31(7):  132-137.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.019

摘要 ( 201 )   HTML   PDF (2364KB) ( 542 )  

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旨在研究黄鳝转铁蛋白受体1基因的功能及其组织表达特异性，采用同源克隆结合RACE技术从黄鳝肝脏中分离其转铁蛋白受体1基因，用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析，用半定量RT-PCR技术研究各组织中TfR1表达水平。结果表明，克隆获得黄鳝TfR1，GenBank注册序列号为KF819396。该cDNA全长2 839 bp，5' UTR长134 bp，3' UTR长380 bp，编码一个长774个氨基酸的多肽链。氨基酸多序列比对结果表明，黄鳝TfR1基因推断的氨基酸序列同其他鱼类的同源性较高，达55.68%-68.41%；而同哺乳动物的TfR1基因同源性较低。半定量RT-PCR分析表明，黄鳝TfR1基因转录本在不同组织表达量有明显差异；在血细胞中表达量最高，而在肾脏、脾脏和小肠中表达中等，在肝脏、胃、皮肤、脑、心脏和肌肉中表达量很低。

拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因原核表达条件的优化

彭银辉, 蔡小辉, 熊向英, 刘旭佳, 黄国强

2015, 31(7):  138-142.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.020

摘要 ( 273 )   HTML   PDF (2098KB) ( 720 )  

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旨在优化拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因原核表达条件。克隆拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因成熟肽片段，与pET-28a表达载体连接后，转入到大肠杆菌BL21(DE3)中，通过优化条件进行诱导表达。结果显示，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.2 mmol/L、37℃条件下培养4 h 后表达量最大，分子大小与预期值相符。融合蛋白主要以包涵体形式高效表达，通过HisTrap HP柱子使其得到进一步纯化。Western blot 分析表明，该融合蛋白可与鼠抗His-tag 单克隆抗体发生特异性结合。说明通过优化表达条件，获得拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因原核表达表达产物。

溶藻弧菌转运蛋白TolB的免疫原性与免疫保护性

庞欢瑛, 周泽军, 张燕飞, 李静, 邱明生, 丁燏, 简纪常, 吴灶和

2015, 31(7):  143-149.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.021

摘要 ( 292 )   HTML   PDF (2298KB) ( 551 )  

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旨在研究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901转运蛋白TolB作为疫苗候选抗原的可能性，根据已发表的全基因组序列，设计特异性引物PCR扩增tolB的基因全长序列。序列分析显示，该基因(GenBank登录号JQ846501)全长1 353 bp，共编码450个氨基酸残基。BLAST分析发现，溶藻弧菌tolB基因与其他已知弧菌的tolB具有较高的同源性，序列保守，可作为共同抗原候选蛋白。用原核表达的tolB蛋白免疫SPF级小鼠，制备多克隆抗体，ELISA效价达1∶40 000。免疫印迹表明鼠抗tolB血清能与诱导后的重组蛋白发生特异反应。为进一步研究tolB对石斑鱼(Epinephelus awoara)的免疫保护性，用TolB蛋白两次免疫石斑鱼，ELISA 检测发现，免疫石斑鱼血清的抗体效价在第4周达到峰值(1∶2 048)。攻毒实验结果表明TolB对石斑鱼的免疫保护率为76%。结果表明，溶藻弧菌转运蛋白TolB具有较好的免疫原性和免疫保护性，可作为弧菌亚单位疫苗的候选抗原。

绵羊精子赤道膜蛋白片段1(SPESP1)的克隆、原核表达及纯化

马媛媛, 程飞跃, 邢万金

2015, 31(7):  155-160.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.023

摘要 ( 231 )   HTML   PDF (2380KB) ( 652 )  

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旨在克隆绵羊Spesp1 cDNA并表达，得到纯化的GST-SPESP1融合蛋白。以绵羊睾丸组织总cDNA为模板，根据GenBank公布的绵羊基因组序列设计引物，PCR扩增得到Spesp1 cDNA，构建原核表达重组载体pGEX-Spesp1，将其转化到E.coli BL21中表达，并优化其表达条件，利用SDS-PAGE切胶纯化法得到纯化的融合蛋白，用Western blot鉴定所得融合蛋白。结果表明，经测序，克隆得到的Spesp1 cDNA序列与GenBank中预测的cDNA序列对比有两个碱基不同，并造成一个氨基酸的差异。在E.coli BL21中成功表达重组融合蛋白，其最优表达条件为：37℃、4 h、0.005% IPTG终浓度，SDS-PAGE和Western blotting中，融合蛋白位于约64 kD处并可以被抗GST和抗羊SPESP1的抗体识别，与预计相符，表明融合蛋白成功表达。成功纯化得到GST-SPESP1融合蛋白，为研究SPESP1在精卵细胞膜融合中的功能奠定了基础。

柔嫩艾美耳球虫保守蛋白CHP559基因克隆与真核表达

翟颀, 黄兵, 董辉, 赵其平, 朱顺海, 梁思婷, 李莎, 杨斯涵, 韩红玉

2015, 31(7):  161-168.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.024

摘要 ( 248 )   HTML   PDF (2026KB) ( 522 )  

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为构建柔嫩艾美耳球虫保守蛋白EtCHP559基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559，并转染DF-1细胞进行表达。利用5' RACE技术克隆获得了柔嫩艾美耳球虫EtCHP559基因全长cDNA序列，该基因全长为1 746 bp，ORF为104-1 327 bp，编码407个氨基酸，编码蛋白的分子量约为46 kD，并利用生物信息学分析该基因编码蛋白的性质、结构等特征，发现该蛋白含有跨膜结构和信号肽。通过RT-PCR扩增得到含完整开放阅读框的基因片段，并将其与真核表达载体pcDNA3.1-flag连接，构建了真核重组表达质粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559，所构建的真核重组表达质粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559经过PCR和双酶切鉴定，可见一条大小约为1 224 bp的目的条带；重组质粒转染DF-1细胞后，免疫印迹检测可见大小约为47 kD的目的蛋白条带，间接免疫荧光实验显示在DF-1细胞中检测到绿色荧光。这些研究结果表明已成功获得了EtCHP559的全长序列，并成功构建了EtCHP559的真核重组表达质粒，在真核细胞DF-1中获得表达，为深入研究EtCHP559的功能奠定了基础。

油茶根际溶磷菌的分离、鉴定及溶磷能力研究

刘小玉, 付登强, 陈良秋, 杨伟波, 李东霞, 符海泉

2015, 31(7):  169-173.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.025

摘要 ( 357 )   HTML   PDF (1421KB) ( 750 )  

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采用传统的微生物分离培养法，对油茶根际溶磷细菌进行了分离，共筛选得到17株溶磷细菌。利用透明圈法对油茶根际土壤中具有溶磷能力的细菌进行初筛；采用钼锑抗比色法测定发酵液的可溶性磷含量，对解磷菌株进行复筛，得出菌株6-Y-09溶磷活性最强。根据进行菌落形态特征、生理生化特征、16S rDNA序列和系统发育分析等研究，初步鉴定菌株 6-Y-09为洋葱伯克霍尔德菌。该菌株在后续微生物菌肥研制中具有较大潜力，为通过生物途径改善油茶磷素供应，促进油茶生长提供了优良的菌株资源。

诱导烟草悬浮细胞氧爆发的海绵共附生真菌HMP-F66的筛选与鉴定

庞志伟, 路旭, 胡江春 , 陈晓琦, 王楠, 宋艳玲

2015, 31(7):  174-179.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.026

摘要 ( 250 )   HTML   PDF (1664KB) ( 544 )  

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激发植物本身的天然免疫系统可作为防控植物病害的新途径。以50株分离自繁茂膜海绵的真菌为受试菌株筛选具有诱导植物抗性活性的菌株及其代谢产物。采用基于H₂DCF-DA的荧光酶标法考察这些真菌的粗代谢物诱导烟草悬浮细胞产生氧爆发的活性，最终筛选到一株真菌HMP-F66能够显著诱导烟草悬浮细胞产生活性氧。根据其形态学特征、培养特征、特征性生理生化反应以及基于rDNA ITS的分子生物学分析，推测该菌株为米曲霉(Aspergillus oryzae)。

沙雷氏菌(Serratia marcescens)Yj1的分离鉴定及菌体有机磷降解酶的分离纯化

于亭, 王春红, 张婷婷, 汲添, 武志海, 杨美英

2015, 31(7):  180-187.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.027

摘要 ( 257 )   HTML   PDF (1993KB) ( 1167 )  

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从大豆土壤中分离纯化得到一株具有卵磷脂和乐果降解能力的菌株Yj1，对该菌株进行鉴定、生长条件优化、酶活性鉴定以及有机磷降解酶的分离纯化。结果表明，Yj1与Serratia marcescens WW4(CP003959.1)的16S rDNA相似度为99%。正交试验对所需培养基进行优化，得到该菌株的最佳生长条件为甘露糖、蛋白胨和pH 8的组合。Yj1菌株在两种磷源条件下，菌株生长量均很低，但72 h内以大豆卵磷脂为磷源时的菌体生长情况优于乐果。以大豆卵磷脂为磷源时酸性磷酸酶、碱性磷酸酶与有机磷降解酶活性明显高于以乐果为磷源时的酶活，且72 h内碱性磷酸酶活性一直都高于酸性磷酸酶和有机磷降解酶。硫酸铵沉淀法结合阳离子交换层析成功从Yj1菌体中分离纯化了有机磷降解酶，SDS-PAGE结果显示纯化的蛋白为单一条带。且阳离子交换层析的提纯倍数是硫酸氨沉淀的5.303倍，硫酸氨沉淀为粗酶的1.416倍。

酸性α-淀粉酶菌株的筛选及其发酵条件研究

屈建航, 尹伊, 焦国宝, 丁长河, 张倩, 屈凌波, 刘仲敏

2015, 31(7):  188-192.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.028

摘要 ( 308 )   HTML   PDF (1755KB) ( 599 )  

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自淀粉厂周边土壤分离筛选到一株高效耐酸α-淀粉酶菌株SH3，初步鉴定为酵母菌，发酵粗酶pH范围3.8-8.0，最适作用pH5.0，该酶在80℃下仍有酶活，最适作用温度50℃。经单因素发酵条件的研究与优化，最适温度37℃，培养基初始pH5.0，可溶性淀粉作碳源，蛋白胨为氮源，200 mL装液量。正交试验确定最佳产酶条件为可溶性淀粉15 g/L、蛋白胨30 g/L、37℃、pH4.5，该条件下酶活力为96.8 U/mg。

粉红黏帚霉糖化酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

张亮, 花尔并, 王华明

2015, 31(7):  193-200.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.029

摘要 ( 208 )   HTML   PDF (2787KB) ( 487 )  

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用黑曲霉(Aspergillusniger)G1为宿主菌表达粉红黏帚霉(Gliocladiumroseum)糖化酶。运用PCR技术从粉红粘帚霉中扩增得到一个疑似糖化酶基因序列(约1.8 kb)，并将其连接到载体pGm上组建成重组质粒pGm-3440。将重组质粒转化到黑曲霉G1菌株中，经amdS筛选及PCR验证获得表达糖化酶的黑曲霉重组工程菌。重组菌的发酵结果显示，糖化酶基因在黑曲霉中得到了分泌表达，用国标法(QB/T 1803-1993)测得重组糖化酶活性达292 U/mL。进一步对其酶学性质进行分析发现，该重组酶最适温度和pH分别为50℃和5.0，该酶的耐热性较差，pH稳定性较好。

响应面优化丙酮粉法提取金银花多酚氧化酶

屈政, 罗磊, 杨彬, 康新艳

2015, 31(7):  201-206.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.031

摘要 ( 250 )   HTML   PDF (1957KB) ( 460 )  

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对丙酮粉法提取金银花多酚氧化酶的工艺进行研究，结果表明，缓冲液pH、料液比、提取时间对PPO比活力影响显著。缓冲液pH与料液比交互作用极其显著，回归模型拟合性良好(R²=99.31%)；影响显著顺序为：静置时间>缓冲液pH值>料液比；最优化工艺参数为：缓冲液pH7.5，料液比为1∶120，提取时间为14.5 min。在此条件下，酶比活力为137.389 U/mg。

铜绿假单胞菌外膜蛋白I的原核表达、纯化及免疫保护作用研究

陈春琳, 刘祥, 王成祥, 张晓娟, 俱雄, 张涛, 吴三桥

2015, 31(7):  207-213.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.032

摘要 ( 224 )   HTML   PDF (2075KB) ( 481 )  

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铜绿假单胞菌外膜蛋白OprI具有较强的免疫原性，在疫苗上具有开发前景。利用分子方法获得OprI蛋白的表达菌株。Western blotting 验证表明抗体能与OprI蛋白特异性结合。SDS-PAGE电泳切胶纯化获得OprI蛋白。将OprI蛋白免疫小鼠并攻毒铜绿假单胞菌，发现OprI蛋白激活的特异性免疫对小鼠铜绿假单胞菌感染的保护率达到57.14%，与对照组相比较达到显著性。采用正交试验设计，获得OprI菌株最佳诱导表达条件为：加IPTG菌夜OD₆₀₀值0.8，加IPTG终浓度 0.3 mmol/L，诱导时间 8 h，诱导温度 28℃；菌株最佳培养条件为转速230 r/min，葡萄糖浓度0％，装液量50 mL。

LSPA1早期基因gp22细菌双杂交诱饵载体与筛选文库的建立

冯梦蝶, 毛普加, 洪愉, 许泽仰, 赵继华, 杨洪文 宋武战, 黄芬, 井申荣, 曾韦锟

2015, 31(7):  214-219.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.033

摘要 ( 313 )   HTML   PDF (2494KB) ( 668 )  

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构建细菌双杂交系统中的诱饵载体pKT25-gp22和甲型副伤寒沙门氏菌基因文库以便后续的筛选实验。PCR扩增获得gp22基因，插入pKT25构成诱饵质粒pKT25-gp22。提取甲型副伤寒沙门氏菌基因组DNA，经Sau3AⅠ部分酶切后连接到pUT18C质粒的BamHⅠ位点，获得基因组DNA表达文库。用化转的方法将诱饵质粒与pUT18C共转入BTH101，检测诱饵质粒自激活作用，并检测诱饵蛋白对宿主菌的毒性。将文库质粒电转至JM109感受态，PCR鉴定文库的多样性。诱饵载体pKT25-gp22无自激活报告基因的能力且对细菌的生长无毒性。所构建的副甲基因组文库覆盖基因组达8倍，满足文库筛选需要。成功构建细菌双杂交系统中诱饵载体pKT25-gp22，筛选文库质量良好，可应用于细菌双杂交实验。

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的克隆表达及纯化

闫锦锦, 闫东明, 邹雪, 刘丹, 彭超, 苏亚南

2015, 31(7):  220-225.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.034

摘要 ( 249 )   HTML   PDF (2386KB) ( 495 )  

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为获得高纯度具有生物活性的尿素酶B亚单位(UreB)蛋白，利用PCR方法扩增出ureB目的基因，将其插入到pET28a载体中，构建表达质粒pET28a-ureB。将鉴定正确的质粒转入大肠杆菌中培养，通过IPTG诱导表达获得UreB蛋白。采用Q Sepharose High Performance阴离子交换层析纯化，G-25凝胶过滤层析脱盐，并通过SDS-PAGE和免疫双扩散法对UreB蛋白进行鉴定。结果表明，该蛋白相对分子质量约为64 kD，与预期结果相符，脱盐后获得的UreB蛋白纯度为98.5%；免疫双扩散法证明该蛋白具有良好的生物活性和反应特异性。最终确定的纯化工艺，达到了一步纯化即得到高纯度、具有生物活性蛋白的目的，该纯化工艺简单、有效。

肺炎链球菌SPD1587蛋白的表达纯化及晶体生长研究

黄健, 黄美容, 骆诗露, 朱杰华, 闵迅

2015, 31(7):  226-230.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.035

摘要 ( 249 )   HTML   PDF (2058KB) ( 425 )  

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SPD1587蛋白是肺炎链球菌D39菌株中的一种转录因子，其在鼻咽部定植和肺部感染过程中发挥着重要作用。生物信息学分析提示其具有与A群链球菌的转录因子Mga蛋白相似的结构，目前其三维结构尚未被解析。成功构建了SPD1587蛋白的全长表达载体PET28a-spd1587，利用大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行原核表达，获得了以可溶形式表达的目的蛋白。经Ni-NTA柱亲和层析及DEAE阴离子交换层析纯化后，获得了高纯度的目的蛋白。采用悬滴气相扩散法获得了SPD1587蛋白晶体。