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2015年 第31卷 第8期    刊出日期：2015-08-21

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综述与专论

植物表皮蜡质参与干旱胁迫的反应机制

韦百阳, 徐小静

2015, 31(8):  1-8.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.001

摘要 ( 432 )   HTML   PDF (1121KB) ( 1001 )  

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植物表皮是植物与外部环境直接接触的部位,包括具有立体网状结构的角质和填充其间并覆盖其上的蜡质。植物在适应外界环境的过程中,表皮蜡质形成了特殊的结构和复杂的化学组成。植物表皮蜡质最重要的功能是参与阻止植物非气孔性失水,提高植物对水分的利用效率,以实现对干旱环境的适应。干旱环境会导致植物表皮蜡质代谢的变化,这种变化最终通过调控基因表达来实现。目前已经发现了多个蜡质代谢相关基因参与了植物对干旱环境的适应,部分基因已经成功克隆并且用于改良农作物的抗旱性。但这些基因参与干旱响应的分子机制及其与ABA的关系并不很清楚。就植物适应水分胁迫而发生的包括蜡质组成和含量在内的代谢变化,以及该过程中所涉及的主要基因及其分子生物学研究进行综述。探讨表皮蜡质在植物适应干旱中的重要作用及其分子机制,可为农作物的抗旱育种提供新型的分子标记和重要靶基因,最终服务于农业生产实践。

植物油脂合成调控的研究进展

赵国淼, 曾燕如, 徐亚楠, 贾宁, 唐研耀

2015, 31(8):  9-16.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.002

摘要 ( 400 )   HTML   PDF (1100KB) ( 1410 )  

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植物种子是人们日常生活所需油脂的重要来源。近年来研究者对植物种子的研究阐明了油脂合成的机理,并挖掘了一些调控合成途径的关键酶和基因。在前人研究的基础之上,补充了成油途径、成油相关基因、转录调控等方面的进展,并从碳源供应、转运及胚乳的影响等方面概述了它们可能对植物油脂形成的影响。

无脊椎动物DNA甲基化研究进展

柳莹, 唐永政, 高丽

2015, 31(8):  17-23.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.003

摘要 ( 371 )   HTML   PDF (1101KB) ( 1023 )  

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DNA甲基化是一种重要的表观遗传机制,可在不改变DNA序列的基础上改变细胞的转录物组并造成表型上的差异。在不同进化分支中,DNA甲基化状态有很大的不同,无脊椎动物DNA甲基化多发生于转录区域并与基因表达高度相关。研究表明,DNA甲基化对于社会性昆虫的等级分化具有重要影响,并且可以通过启动子识别、外显子遗漏等机制来增加转录变异体的数量,从而提高表型的灵活性,增加生物体应对环境变化的能力。对无脊椎动物DNA甲基化的机制及功能进行综述,旨在为相关研究提供参考,并对未来的研究方向作出展望。

鹿茸再生相关蛋白研究进展

王权威, 董振, 王桂武, 杨福合, 刘慧, 李春义

2015, 31(8):  24-29.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.004

摘要 ( 357 )   HTML   PDF (1083KB) ( 904 )  

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鹿茸是迄今为止发现的唯一能够周期性再生的哺乳动物器官,它的生长速度极快却没有发生癌变。而蛋白质是生命活动的体现者,是生命活动的功能执行者,鹿茸相关蛋白的研究是揭开鹿茸再生秘密的重要途径。综述了鹿茸再生相关蛋白的筛选、血管生成相关蛋白、软骨形成相关蛋白、神经再生相关蛋白以及其他与鹿茸再生相关蛋白的研究进展,旨在为从蛋白质水平上揭示鹿茸再生过程提供基础资料。

植物内生菌研究进展

陈龙, 梁子宁, 朱华

2015, 31(8):  30-34.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.005

摘要 ( 580 )   HTML   PDF (1057KB) ( 2354 )  

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植物内生菌是指生活史中某一阶段生活在植物组织内,对植物没有明显病害症状的一类微生物,研究发现其主要包括内生细菌、内生真菌和内生放线菌。内生菌能够产生与宿主植物相同或相似的活性物质,从而拓宽了药用资源并且具有巨大的应用价值。从植物内生菌的分布规律及其生长特点,与宿主植物的关系,研究领域以及发展现状与存在问题等方面进行了综述,并对植物内生菌在药用资源开发中的前景进行了展望。

嗜麦芽窄食单胞菌在环保和农业生产上的应用

李昱龙, 韩正敏

2015, 31(8):  35-43.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.006

摘要 ( 475 )   HTML   PDF (1251KB) ( 1138 )  

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嗜麦芽窄食单胞菌广泛分布于大自然各种环境中,它的氧化代谢系统能够有效降解烷烃及多环芳香烃污染物并将其降解,同时该菌还具有吸附重金属的能力。嗜麦芽窄食单胞菌是典型的植物促生菌,能够分泌多种酶类、抗菌素和生长素等代谢产物,促进植物生长,防控真菌病害,抑制线虫生长。嗜麦芽窄食单胞菌的这些特性在环境污染治理、农林生产方面都有较大应用价值。通过综述嗜麦芽窄食单胞菌生物除污和植物促生的作用及机理,为嗜麦芽窄食单胞菌的进一步研究和应用提供参考依据。

技术与方法

微生物法生产L-丝氨酸代谢工程研究进展

刘岩, 王慧, 史吉平, 赵志军, 丛丽娜

2015, 31(8):  44-49.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.007

摘要 ( 391 )   HTML   PDF (1279KB) ( 1504 )  

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L-丝氨酸是生物体内一种重要的中间代谢产物,为甘氨酸等多种氨基酸、核苷酸、胆碱、磷脂的合成前体,现已广泛应用于医药、食品、化妆品等领域。L-丝氨酸的生产方法有蛋白质水解提取法、化学合成法、转化法及微生物发酵法,其中微生物发酵法具有原料廉价、环境污染小、产物纯度高等优点。系统综述了微生物发酵法生产L-丝氨酸所涉及的代谢工程策略,包括微生物合成L-丝氨酸的各种代谢调控机制及相应采取的改造措施和效果,并探讨了L-丝氨酸育种技术未来的发展趋势。

RNAi技术及其在真菌基因功能研究中的应用

苏子敬, 李巧玲, 黄程, 谢成建, 杨星勇

2015, 31(8):  50-58.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.008

摘要 ( 385 )   HTML   PDF (1347KB) ( 833 )  

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RNA干扰是指在进化过程中由高度保守的外源或内源双链RNA（dsRNA）引发的转录后水平基因沉默的现象。RNAi技术作为一种高效、特异的基因阻断技术,已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域,成为2l世纪的研究热点之一。简要综述了RNAi的发现过程,作用机制,作用特点及其在真菌基因功能研究中的应用前景,为相关研究奠定理论基础。

磁性纳米材料载体固定纤维素酶技术研究进展

邢朝晖, 苏跃龙, 张琦, 阮馨怡, 林燕, 王欣泽, 孔海南

2015, 31(8):  59-65.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.009

摘要 ( 352 )   HTML   PDF (1112KB) ( 997 )  

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生物质原料转化为还原性糖,从而为生物质燃料乙醇的生产提供基础原料。针对现在游离酶生产工艺中的不足,研究者提出了纤维素酶固定化技术,其中以磁性纳米材料作为纤维素酶的固定化载体,不仅可提高纤维素酶的催化性能,增强酶的稳定性,而且以外加磁场代替传统的机械搅拌方式可充分发挥载体材料的磁响应性,从而使制备的固定化酶从反应体系中易于分离,高效且具有重复性。研究者们提出了很多优秀的纤维素酶固定化方案,综述了近年来磁性纳米材料固定纤维素酶的不同方法,并对其做了较为详细的阐述,在此基础上进一步对其优缺点和发展前景进行了讨论。

贵州地方猪种及三元商品猪氟烷基因的检测

冯文武, 龙威海, 丁玫, 陈祥, 陈村年

2015, 31(8):  66-70.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.010

摘要 ( 489 )   HTML   PDF (1227KB) ( 611 )  

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旨在对贵州地方猪种“抗应激敏感基因专门化品系”的培育提供技术支撑,运用PCR-RFLP技术对白洗猪、黔北黑 猪、宗地花猪、糯谷猪和从江香猪5个地方猪种及三元商品猪共151份样本进行了氟烷基因检测,筛选出猪群中应激敏感基因隐性携带型Hal^Nn、抗应激敏感基因型Hal^NN和应激敏感基因型Halⁿⁿ。结果表明,贵州5个地方猪种全为Hal^NN型;三元商品猪群无Halⁿⁿ型,Hal^Nn型检出率为52.63%,Halⁿ型等位基因频率为26.32%。

新型鸭呼肠孤病毒RT-LAMP检测方法的建立

于可响, 马秀丽, 韩宏宇, 刘存霞, 李玉峰, 黄兵, 宋敏训

2015, 31(8):  71-75.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.011

摘要 ( 374 )   HTML   PDF (1275KB) ( 600 )  

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建立适于基层实验室快速检测新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）的一步反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）方法。基于新型鸭呼肠孤病毒S3基因的6个保守区域设计了4条LAMP引物,利用Bst DNA聚合酶在63℃恒温保持45 min即可完成反转录和扩增反应,由此建立了RT-LAMP检测方法。该方法具有良好的特异性,除NDRV外对其他6种常见鸭病的检测结果均为阴性。该方法对病毒RNA的最低检出量为0.1 pg,是常规RT-PCR方法的100倍。临床应用结果表明,该方法与病毒分离鉴定方法的符合率为98%,而且对仪器的要求低,适于基层实验室和现场检测。

研究报告

水稻miR169o及其靶基因OsNF-YAs对缺水胁迫期表达模式

陈禹彤, 陈华民, 余超, AmyThein, 田芳, 何晨阳

2015, 31(8):  76-81.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.034

摘要 ( 361 )   HTML   PDF (1317KB) ( 650 )  

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MicroRNAs（miRNAs）是一类小的非编码RNA,在植物逆境胁迫应答中发挥重要的调控作用。miR169可受干旱胁迫诱导表达,而过表达miR169则可以增强植物对干旱的耐受性。然而,miR169及其靶基因NF-YAs在水稻干旱胁迫条件下的表达动态至今尚不清楚。对水稻进行不同时间缺水处理,用qRT-PCR法定量测定了水稻根、茎、叶组织中miR169o及其靶基因表达的动态变化。结果表明,随着缺水处理时间的增加,水稻不同组织中miR169o表达量总体上有升高趋势;而靶基因（NF-YA1、NF-YA2 和NF-YA3）表达模式基本与miR169o的表达模式相反,但并不全部对应。推测在水稻干旱胁迫早期反应中,miR169o可能主要调控了部分特定靶基因的表达。此外,miR169o在水稻根、茎、叶组织中的表达和丰度存在着明显的差异,具有组织特异性。

大豆基因GmGW2的克隆与转化

熊鹤雯, 吴志慧, 段思宇, 谢皓, 秦玉涛, 郭蓓

2015, 31(8):  82-87.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.012

摘要 ( 347 )   HTML   PDF (1760KB) ( 626 )  

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GW2 编码一个环型E3 泛素连接酶,位于细胞质中,通过将其底物锚定到蛋白酶体进行降解,从而负调节细胞的分裂。之前有文献报道GW2位点突变可导致水稻籽粒大小的改变。根据水稻中GW2基因序列,在GenBank中找到与之同源的大豆基因序列GmGW2,克隆目的片段并进行了生物信息学分析。构建转化载体pCAMBIA1300∷GmGW2∷EYFP,并对大豆品种中黄10进行转化。利用含有重组载体的农杆菌EHA105侵染萌发24 h的中黄10幼胚。当外植体长出3片复叶后,提取基因组DNA,对报告基因EYFP进行PCR检测。得到的阳性株在激光共聚焦显微镜下观察,EYFP蛋白含量显著增加,实验结果显示目的基因已转化成功。序列分析表明GW2基因与苜蓿,鹰嘴豆中的GW2基因具有较高的同源性。

拟南芥SPX1蛋白原核表达及纯化分析

胡涛, 安艳, 吕群丹, 徐英武

2015, 31(8):  88-93.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.013

摘要 ( 403 )   HTML   PDF (1644KB) ( 720 )  

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包含SPX结构域的蛋白在高等真核生物中广泛存在,这类蛋白的功能多数还不太清晰,但发现有些与磷信号相关,有些与铁信号相关。拟南芥中含有SPX结构域的蛋白可分为4个家族,本研究中的拟南芥SPX1（AtSPX1）属于一个只含有SPX结构域的蛋白组成的家族,其它家族成员还包含额外的基因序列。进化树分析表明,AtSPX1编码的氨基酸序列与双子叶植物具有较高的一致性,与单子叶植物进化距离较远。为了揭示AtSPX1蛋白的结构形态与其生物学功能之间的联系,开展了AtSPX1蛋白质体外可溶性表达实验,构建了原核体外表达载体,在大肠杆菌（E.coli）细胞中获得了该蛋白可溶性高表达。表达的蛋白包含有His标签方便了蛋白纯化,插入的SUMO融合蛋白标签可以通过蛋白酶切除,而目标蛋白通过硫酸铵沉淀实现了纯化。进一步分子筛层析分析表明AtSPX1以单体形式存在。实验结果提供了一套表达纯化AtSPX1蛋白的有效方案。

拟南芥GCR2参与感应N-丁酰基高丝氨酸内酯过程的初步研究

艾秋实, 张哲, 屈凌波, 刘方, 赵芊, 宋水山

2015, 31(8):  94-101.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.014

摘要 ( 357 )   HTML   PDF (1549KB) ( 681 )  

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N-丁酰基高丝氨酸内酯（C4-HSL）是革兰氏阴性菌主要的群体感应信号,其能促进植物生长发育,激活细胞膜表面的Ca²⁺通道,从而参与调控植物的生理代谢。然而,植物感应C4-HSL的分子机制并不清楚。拟南芥GCR2作为ABA的受体,对植物的生理代谢十分重要。旨在探寻GCR2是否参与拟南芥感应C4-HSL的过程。qRT-PCR结果表明,C4-HSL处理后1 h,GCR2基因表达量出现明显上调并在6 h后达到最大值,说明C4-HSL可调节GCR2。ELISA结果显示,GCR2蛋白表达量也在6 h达到最大值。对体外表达的GCR2进行纯化和浓缩,使其达到0.6 mg/mL后进行微量热泳动（MST）检测。MST测得C4-HSL与GCR2的解离常数（K_d）为166 nmol/L,显示出较强的结合能力。用BSA作为阴性对照,表明C4-HSL与GCR2的结合具有一定的特异性。这些结果表明GCR2可能参与了拟南芥感应C4-HSL的过程。

鸡Vezf1基因RCAS干扰载体构建及鉴定

张超, 葛君, 袁明婧, 叶军, 袁立

2015, 31(8):  102-107.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.015

摘要 ( 387 )   HTML   PDF (1506KB) ( 727 )  

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为研究Vezf1基因在鸡胚早期发育过程中的作用,构建了针对鸡Vezf1基因的RCAS病毒RNA干扰载体,分别在鸡胚细胞和胚胎水平对Vezf1基因实施沉默,通过Real-time PCR和原位杂交法检测目的基因mRNA表达水平。结果表明,基于RCAS病毒的干扰载体可以在鸡胚成纤维细胞和活体鸡胚中成功沉默Vezf1基因的表达。此研究为利用鸡胚模型深入了解Vezf1基因在早期发育过程中的作用提供了素材。

大黄鱼Wap65-2基因成熟肽区酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

裘天休, 李长红, 陈炯

2015, 31(8):  108-113.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.016

摘要 ( 330 )   HTML   PDF (1425KB) ( 464 )  

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用大黄鱼Wap65-2基因成熟肽区构建酵母双杂交诱饵质粒,并对诱饵质粒进行自激活活性及毒性检测。从大黄鱼（Larimichthys crocea）肝组织cDNA中扩增Wap65-2基因成熟肽片段（LcWap65-2m）,将其克隆至pGBKT7载体中,获得诱饵载体pGBKT7-LcWap65-2m,经PCR、酶切和测序验证无误后,转化至酵母菌株Y187中,在营养缺陷培养基中观察重组蛋白的毒性作用和自激活活性,同时利用Western blot分析重组蛋白的表达。成功扩增LcWap65-2m,并克隆至pGBKT7载体中;Western blot检测结果表明,pGBKT7-LcWap65-2m在酵母细胞中表达诱饵蛋白LcWap65-2m;表型筛选结果显示,LcWap65-2m无毒性作用和自激活活性。成功构建了LcWap65-2m酵母双杂交诱饵载体,为进一步利用酵母双杂交技术筛选与Wap65-2相互作用的蛋白奠定基础。

樟子松外生菌根中NADP-依赖型异柠檬酸脱氢酶的酶学性质研究

王一超, 姚庆智, 朱和平, 陈丽霞, 郭欣, 杨倩倩, 闫伟

2015, 31(8):  114-118.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.017

摘要 ( 308 )   HTML   PDF (1381KB) ( 532 )  

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对褐环乳牛肝菌-樟子松菌根组织、樟子松根组织及褐环乳牛肝菌纯培养菌丝的异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase,IDH）进行纯化和酶学性质鉴定。通过硫酸铵分级沉淀及葡聚糖凝胶层析纯化后的IDH进行SDS-PAGE电泳检测,并进行3种来源酶的酶学性质鉴定。菌根组织、根组织及真菌纯培养菌丝NADP-IDH对NADP⁺的K_m值分别为10.7 μmol/L、11.4 μmol/L和22.1 μmol/L;对异柠檬酸的K_m值分别为71.7 μmol/L、79.3 μmol/L和87.8 μmol/L。最适pH 分别为8.2、8.0和7.5,略偏碱性。菌根IDH和根IDH的最适反应温度为45℃,真菌IDH的最适反应温度为42℃。3种IDH的活性依赖于不同的二价金属阳离子的存在,Mn²⁺、Mg²⁺存在时酶活性最强,Ca²⁺、Co²⁺、Cu²⁺和Zn²⁺对酶的活性有较强抑制作用。菌根真菌与樟子松形成外生菌根之后异柠檬酸脱氢酶的蛋白含量及酶活力都得到了提高。

疣孢漆斑菌Myrothecium verrucaria GH-01漆酶的纯化和酶学性质研究

王紫娟, 赵敏

2015, 31(8):  119-124.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.018

摘要 ( 376 )   HTML   PDF (1743KB) ( 548 )  

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疣孢漆斑菌具有生长周期短,分泌漆酶酶活高等特点。利用已分离得到的疣孢漆斑菌GH-01（Myrothecium verrucaria GH-01）发酵产生粗酶液。进而通过分级沉淀、透析和层析的方法对漆酶粗酶液进行纯化。SDS-PAGE和Native-PAGE结果表明纯化可获得具有漆酶活性的单体蛋白。酶学性质研究表明,该漆酶催化最适温度为40℃,在底物ABTS存在条件下的最适pH值为4.0,且在低温及碱性条件具有较好的稳定性。此外通过漆酶对4大类染料脱色能力的研究,发现该漆酶对偶氮类的橙黄Ⅰ和蒽醌类的茜素红脱色有较好的脱色效果,反应1 h脱色率达80%以上;对三苯甲烷类的碱性品红脱色能力较弱,脱色率只能达到20%左右;脱色率最差的是杂环类的亚甲基蓝。在含10 U漆酶的体系中,对50 mg/L的染料降解效果相对最佳。

高产武夷菌素wysR基因过表达菌株的筛选及菌株生物特性研究

王家旺, 葛蓓孛, 刘艳, 刘彦彦, 张克诚

2015, 31(8):  125-131.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.019

摘要 ( 315 )   HTML   PDF (1484KB) ( 508 )  

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以武夷菌素生物合成正调控基因wysR过表达菌株为初选材料,通过琼脂块法对2 060个过表达菌株单菌落进行初筛,得到35个优选菌株,再采用摇瓶发酵复筛的方法筛选出9个高产菌株,并通过菌株遗传稳定性分析,最终确定W-273菌株为最优菌株。研究武夷菌素wysR基因过表达菌株W-273的生理生化特征,发现与原始菌株CK-15相比,W-273菌株生长迅速,产孢量增加且产孢时间提前,W-273菌株生长3-4 d即可完成产孢,较菌株CK-15产孢时间提前了3-4 d;电子显微镜观察W-273菌株和CK-15菌株孢子形态不同,W-273菌株孢子呈椭圆形或杆状,CK-15菌株孢子呈圆形;通过摇瓶发酵表明W-273菌株较CK-15菌株代谢旺盛,抗生素产量提高79%-289%,且最佳发酵时间缩短4-8 h。

海洋真菌提取物损伤大肠杆菌DNA活性的筛选及活性菌株研究

鲍海燕, 谷朋娟, 张翼, 穆军, 冯妍, 赵辰燕

2015, 31(8):  132-139.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.020

摘要 ( 321 )   HTML   PDF (1427KB) ( 639 )  

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从海洋微生物中筛选抗菌、抗肿瘤物质是海洋药物研究的热点之一,而筛选模型在研究中起着重要作用。建立了可用于抗菌及潜在抗肿瘤活性物质筛选的大肠杆菌差异性DNA修复试验模型,并运用该模型对海洋共附生真菌的提取物进行了筛选。结果显示,5株海洋真菌的提取物具有较强的选择性抑制DNA损伤修复基因缺陷型大肠杆菌的活性,可能具有DNA损伤作用。对这5种活性真菌进行了分子生物学鉴定,而且薄层色谱（TLC）和高效液相色谱（HPLC）-活性追踪显示这些菌株可产生较多样化的活性物质。

东北地区产油能源微藻的筛选和鉴定

师文静, 廖莎, 孙启梅, 王鹏翔, 李晓姝

2015, 31(8):  140-146.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.035

摘要 ( 371 )   HTML   PDF (1906KB) ( 454 )  

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微藻作为21世纪生物柴油的理想燃料已被人们广泛的关注,但是目前微藻种类很多,如何从诸多的微藻中筛选油脂含量高的微藻已成为人们函待解决的问题。从东北地区水样中分离纯化出93种藻种,采用尼罗红染色法对其中30株藻种进行了筛选获得了8种具有产油潜力的藻种,并利用自制的柱式反应器微藻评价装置对这8株藻株进行了产油能力的评价,获得了一株总脂产率达到133.9 mg/（L·d）的产油能源微藻。在此基础上,对该藻株进行了18S rRNA 的鉴定,确定为Chlorella sp.。

苏云金芽胞杆菌chiA73基因的克隆、表达和酶活性分析

张圆, 周国旺, 李海涛, 刘荣梅, 赵一夔, 高继国

2015, 31(8):  147-152.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.021

摘要 ( 325 )   HTML   PDF (1454KB) ( 506 )  

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旨在对苏云金芽胞杆菌几丁质酶基因进行分子鉴定和酶活测定,从产几丁质酶活力高的Bt DLD171菌株中提取基因组DNA,通过PCR法克隆得到几丁质酶chiA73 基因（GenBank登录号为KJ508093）。结果显示,对chiA73 基因进行表达,获得大小约74 kD的表达产物。用荧光底物对表达产物进行酶活测定,发现表达产物只能水解荧光底物4-甲基伞形酮几丁三糖[4- MU-（GlcNAc）₃],而不能水解4-甲基伞形酮几丁单糖（4-MU-GlcNAc）。结果表明,ChiA73为一种内切几丁质酶,在pH值为8、温度为40℃时酶活性最高。

苏云金芽胞杆菌LTS290菌株抑制镰孢菌的作用

周国旺, 李玉红, 张圆, 李海涛, 刘荣梅, 高继国

2015, 31(8):  153-158.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.022

摘要 ( 322 )   HTML   PDF (1497KB) ( 505 )  

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旨在扩大苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）的生防范围,通过对BtLTS290菌株的对峙培养和菌株无菌发酵液对镰孢菌的抑制作用进行研究。结果表明,BtLTS290菌株可抑制6种马铃薯致病镰孢菌的生长,并且BtLTS290无菌发酵液的抑菌效果显著。抑菌物质对温度不敏感,经过121℃处理 20 min后仍然具有抑菌活性。在pH3-11范围内存放12 h 后,抑菌活性变幅不大,并且用蛋白酶K处理后其抑菌活性依然存在。实验证明苏云金芽胞杆菌BtLTS290是一株可以高效抑制马铃薯致病镰孢菌的生防菌株。

黄芩醇提物对副溶血性弧菌抑制机制的研究

谢丽玲, 彭齐, 蔡链纯, 周亮, 朱炎坤, 韩光耀

2015, 31(8):  159-165.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.023

摘要 ( 537 )   HTML   PDF (1610KB) ( 954 )  

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从4种常见中药中筛选出对副溶血性弧菌有较好抑制作用的中药,并对其抑制机制进行研究。采用牛津杯法及液体倍比稀释法研究了中药醇提取物对副溶血性弧菌的敏感性;通过生长曲线和杀菌曲线、电镜观察以及SDS-PAGE等方法探讨黄芩醇提物的抑菌作用及机理。结果显示,4种中药醇提物对副溶血性弧菌表现出不同的抑菌活性,其中黄芩醇提物对副溶血性弧菌的抑制作用最强,抑菌圈为22.00±1.00 mm,MIC和MBC均为3.91 mg/mL。经MIC浓度处理后,细菌经过较长一段时间的延迟期,也能进入正常的对数期和稳定期;菌体表面变粗糙,出现裂解,菌液的蛋白含量明显升高,但是菌体的可溶性蛋白变化较小。结果表明,黄芩醇提物对副溶血性弧菌有很强的抑制效果,其作用是破坏细胞膜的完整性导致菌体裂解死亡。

绿针假单胞菌HT66中luxR_19对吩嗪-1-甲酰胺合成的影响

陈亚汶, 彭华松, 王威, 张雪洪

2015, 31(8):  166-173.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.024

摘要 ( 311 )   HTML   PDF (1405KB) ( 625 )  

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旨在研究调控基因luxR_19对绿针假单胞菌HT66中的抑菌物质吩嗪-1-甲酰胺（phenazine-1-carboxamide,PCN）合成及菌体生长的影响,通过分子操作构建了luxR_19基因敲除株、回补菌株、过表达菌株以及luxR_19（G85A）点突变菌株,检测了目标菌株生长曲线、PCN发酵结果、细菌泳动性与从动性等。结果显示,将luxR_19敲除后PCN产量明显降低,对luxR_19基因进行过表达,发现能够将PCN产量提高2倍;luxR_19对于吩嗪合成的多个调控基因以及合成基因表达均产生影响;luxR_19的敲除对HT66的生长及泳动性不产生影响,而对细菌的从动性有一定的促进作用;luxR_19（G85A）点突变菌株吩嗪产量较野生型相差很小。结果表明,luxR_19对PCN的合成为正调控基因,一定程度上影响HT66的从动性,第254位碱基突变对PCN合成产量不产生影响。

高产二羟基丙酮重组菌株的构建

许晓菁, 赵琼, 王祥河

2015, 31(8):  174-179.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.025

摘要 ( 316 )   HTML   PDF (1630KB) ( 500 )  

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旨在构建一株过量表达编码膜系甘油脱氢酶的sldAB基因的重组菌株,以提高二羟基丙酮产量。以氧化葡萄糖酸杆菌ATCC621H的基因组DNA为模板,运用PCR方法扩增得到基因sldAB,并连接到pBBR1MCS-2质粒上,构建表达载体pBBR1MCS-2-sldAB。通过电转化将载体pBBR1MCS-2-sldAB转化进入氧化葡萄糖酸杆菌ATCC621H内,得到重组菌株GOX205。结果显示,重组菌株构建成功,其甘油脱氢酶的酶活力较之于出发菌株提高了26%。在甘油初始浓度100 g/L的甘油发酵培养基中,较之于出发菌株,GOX205的生长状况良好,发酵52 h时DHA浓度达到94.1 g/L,较之于出发菌株提高了19.7%,甘油残量降低了15.1 g/L。

重组精氨酸脱亚胺酶制备L-瓜氨酸的工艺条件优化

马越, 宿玲恰, 吴丹, 吴敬

2015, 31(8):  180-185.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.026

摘要 ( 352 )   HTML   PDF (1523KB) ( 824 )  

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将来源于Pseudomonas putida ACCC 10185的ADI编码基因克隆到表达载体pET-24a（+）中,转化Escherichia coli BL21（DE3）,通过超声波破碎得到粗酶液,酶活检测ADI酶活为26 U/mL发酵液。对酶转化L-精氨酸盐酸盐生成L-瓜氨酸的反应条件进行了优化,结果表明,当底物L-精氨酸盐酸盐浓度650 g/L,反应初始pH6.0,温度37℃,加酶量24 U/g底物,转速100-200 r/min,转化时间7 h,L-瓜氨酸转化率达到100%,是目前国内外报道的酶法制备L-瓜氨酸的最高水平。

瘤背石磺多糖提取工艺优化及其体外抗氧化活性评价

程知庆, 沈和定, 姚理想, 刁亚, 刘宸

2015, 31(8):  186-192.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.027

摘要 ( 216 )   HTML   PDF (1621KB) ( 623 )  

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采用传统的热水浸提法提取瘤背石磺多糖,运用响应面法优化多糖的提取工艺,并以粗多糖对其体外抗氧化活性作初步研究。通过单因素实验,探讨浸提温度、浸提时间、料液比对瘤背石磺多糖提取率的影响并选取实验水平,采用 Box-Behnken设计实验方案,利用Design-Expert 8.05软件分析数据。通过清除羟基自由基和 DPPH自由基的能力来检测多糖抗氧化性能。结果显示,最佳水提条件为浸提温度92℃、浸提时间30 h、料液比1∶29（g/mL）,在最优工艺条件下瘤背石磺多糖的提取率为 9.206%,瘤背石磺多糖对羟基自由基和DPPH自由基都具有一定的清除率。采用该方法优化提取多糖,合理可靠,为以后的工业化生产提供理论依据,且多糖具有明显的体外抗氧化活性。

猪胰脏羧肽酶转酯功能和耐酸抗蛋白酶特性研究

冯士元, 孙同韦, 牟慧艳, 张会图, 路福平

2015, 31(8):  193-199.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.028

摘要 ( 323 )   HTML   PDF (1761KB) ( 627 )  

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羧肽酶（carboxypeptidase）是一类可水解肽链C末端氨基酸残基的蛋白酶,可用作饲料添加剂,促进畜禽生长。猪胰脏中含有一种羧肽酶A1（CPA1）,该酶除能水解蛋白质外,还能分解油脂。CPA1在以酪蛋白和橄榄油为底物时,比活力分别为53.14 U/mg和22.4 U/mg;经过pH2.0酸性环境和胰蛋白酶处理后,其酶活残留率分别为95.65%和78.14%。结果表明,CPA1具有转酯功能和耐酸抗蛋白酶特性。

抗CD47胞外区骆驼多克隆抗体的制备及鉴定

贾二坷, 冯亚宁, 李江伟

2015, 31(8):  200-205.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.029

摘要 ( 447 )   HTML   PDF (1502KB) ( 758 )  

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验证人CD47蛋白能否在新疆双峰驼中产生高滴度抗体;为制备高亲和力的抗CD47纳米抗体提供实验依据。 构建CD47胞外区原核表达载体,诱导表达及纯化CD47蛋白,免疫新疆双峰驼。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和Western blot分别检测骆驼多克隆抗体的效价及与CD47蛋白特异性结合活性。结果显示,成功构建CD47胞外区原核表达载体,获得纯度大于90%的CD47蛋白,表达纯化的CD47重组蛋白可与抗CD47单抗B6H12.2特异结合;ELISA测定CD47重组蛋白免疫骆驼7次后,抗CD47多克隆抗血清的效价至少达到1∶200 000,免疫印迹检测表明抗CD47骆驼抗血清与CD47重组蛋白、Jurkat和Raji细胞表面表达的CD47均能特异结合。 重组人CD47蛋白可以在骆驼体内激发高滴度抗体反应。

薯蓣褪绿坏死花叶病毒CP基因的原核表达及抗血清的制备

张鹏远, 任龙辉, 王建光, 陈壮壮, 钟宇, 陈穗云

2015, 31(8):  206-212.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.030

摘要 ( 229 )   HTML   PDF (1642KB) ( 388 )  

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薯蓣褪绿坏死花叶病毒（yam chlorotic necrotic mosaic virus,YCNMV）是马铃薯Y病毒科柘橙病毒属暂定成员。采用RT-PCR方法,以Sprimer/M4简并引物对扩增获得的YCNMV分离物3'端基因组序列为参考序列,根据该序列设计CP基因特异引物获得YCNMV CP基因并插入pET-30a表达载体中,在BL21（DE3）菌株中诱导表达。获得的融合蛋白经Ni⁺-NTA柱纯化后免疫新西兰大白兔,制备抗血清。结果表明,连接在表达载体中的CP基因序列及表达的蛋白氨基酸序列与预期的CP基因核苷酸和氨基酸序列同源性均为99.65%。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,获得的融合蛋白大小约为44 kD,与预期蛋白大小相符。制备的抗血清经Western blotting和ID-ELISA检测表明,获得的多克隆抗体效价较高,能可靠、灵敏、特异地与YCNMV病毒颗粒结合,可应用到该病毒的检测中。

重组绿脓杆菌外膜蛋白OprF的表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定

陈春琳, 刘祥, 俱雄

2015, 31(8):  213-218.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.031

摘要 ( 349 )   HTML   PDF (1823KB) ( 737 )  

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绿脓杆菌外膜蛋白OprF可有效激活机体的免疫机制对抗细菌的感染,在疫苗上有很好的应用前景。采用分子克隆方法获得绿脓杆菌外膜蛋白OprF表达菌株;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素梯度复性获得OprF蛋白,免疫小鼠制备OprF蛋白多克隆抗体。ELISA法表明,OprF抗血清滴度达1∶12 800倍,Western blotting证实抗血清具有很好的特异性。通过DNAMAN软件对OprF序列同源性分析发现其C端在不同细菌间存在较高同源性;采用MEGA软件对OprF的系统发生分析发现假单胞菌属细菌的亲缘关系高于其它属细菌。

建立CRISPR/Cas9慢病毒系统高效敲除人源AIP1基因

苏甲林, 阙彪, 张继勤, 李锦辉, 王敏, 纪卫东

2015, 31(8):  219-224.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.032

摘要 ( 655 )   HTML   PDF (1653KB) ( 1893 )  

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旨在构建AIP1基因CRISPR/Cas9敲除体系,获得高效、稳定、永久性AIP1敲除的人胚肾细胞株（293T）。针对AIP1的外显子设计3个20 bp的sgRNA（sp1、sp2和sp3）。与PX458载体连接,构建PX458-sgRNA敲除表达载体。T7E1实验评估敲除效率。将敲除效率最高的sgRNA与lentiCRISPRv2慢病毒载体连接,构建lentiCRISPRv2-sgRNA敲除表达载体,将阳性重组质粒导入病毒包装细胞293T中,收集病毒上清液转染293T细胞。对敲除成功的293T细胞通过有限稀释法构建敲除AIP1基因的稳定细胞株。Western blot测定转染后293T细胞中AIP1蛋白的表达量。结果显示,测序证实AIP1的3个靶序列分别正确插入PX458表达载体中,T7E1实验证实AIP1sgRNAsp2靶向敲除效率最高;成功构建lentiCRISPRv2-sgRNAsp2 AIP1敲除表达载体,并包装病毒,感染293T细胞;Western blot证实获得稳定的AIP1基因表达缺失的293T细胞株。建立了能稳定敲除AIP1基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统,成功获得AIP1敲除的293T稳定细胞株。

毒死蜱的环境生物学效应分析

余凯敏, 冯为民, 李国超, 张家禹, 刘丽丽, 闫艳春

2015, 31(8):  225-230.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.033

摘要 ( 319 )   HTML   PDF (1322KB) ( 556 )  

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高毒有机磷农药禁用以后,毒死蜱作为其替代品逐渐开始大规模应用。毒死蜱在水中降解缓慢,因此在水中的残留会对水生生物及其他生物造成潜在危害。为探究低浓度毒死蜱的内分泌干扰效应,使用流式细胞仪分析了其对人子宫内膜癌细胞HEC-1B生长周期的影响。为探究高浓度毒死蜱的生物毒性,将斑马鱼胚胎暴露在不同浓度的毒死蜱（0、1.0、2.0、3.0和4.0 ppm）中60 h,发现毒死蜱能导致斑马鱼胚胎的死亡和严重畸形,并且胚胎存活率与处理浓度呈负相关,畸形率与处理浓度呈正相关。最后,检测了毒死蜱处理后斑马鱼胚胎中5种神经系统发育相关基因的表达情况。结果表明,低浓度毒死蜱具有内分泌干扰效应,高浓度毒死蜱会影响斑马鱼神经系统的正常发育。