生物技术通报

生物分析测试：探索生命科学奥秘的工具

李亮

2020, 36(5): 1-1. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0599

摘要 ( 268 )

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转基因产品检测标准物质量值一致性研究进展

王颢潜, 李夏莹, 张丽, 赵新, 陈锐, 陈笑芸, 高芳瑞, 兰青阔, 王永, 张秀杰

2020, 36(5): 2-8. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0013

摘要 ( 359 )

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转基因产品检测标准物质是转基因生物安全管理的物质基础,是检测结果可比性、有效性和溯源性的保障。当前国际上转基因产品检测标准物质研发机构主要有欧盟联合研究中心、美国油脂化学家学会等。我国近年也研发了一系列转基因成分检测标准物质。对各机构研发的标准物质种类、数量、量值表述方式以及量值转换进行汇总、统计、分析,挖掘异同点,并在国内外交流合作、新型标准物质研发以及标准物质应用方面提出合理化建议,以期为我国转基因产品检测标准物质研发和应用提供支撑。

脂肪酸标准物质的研究进展

韩璐, 盛灵慧, 高运华, 吴枭, 王志栋, 李保山

2020, 36(5): 9-15. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0995

摘要 ( 384 )

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脂肪酸是一类具有重要功能的生物分子,广泛存在于动植物体内,是人体的重要组成成分,与人体很多疾病的发生都息息相关。脂肪酸标准物质是脂肪酸检测结果准确与否的依据,世界各国都在积极研制,目前我国脂肪酸标准物质研制单位主要有国家粮食局科学研究院和中国计量科学研究院等。综述了国内外脂肪酸标准物质的现状,对比分析了国内外脂肪酸标准物质的种类、特性量值组成和定值方法等。国外脂肪酸标准物质一般含有多种特性组分,特性量值较多,国内脂肪酸标准物质一般仅针对脂肪酸测量研制,基体比较单一,特性组分较少,量值较少。

生鲜牛乳体细胞检测与计量校准必要性研究

杨佳怡, 牛春艳, 刘瑛颖, 傅博强, 王晶

2020, 36(5): 16-21. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-1121

摘要 ( 383 )

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体细胞数是反映生鲜牛乳质量及奶牛健康状况的重要指标。2018年我国食品安全国家标准首次计划加入体细胞数限量值分级标准,体细胞数准确检测直接影响生乳产品正确分级。本综述基于体细胞对乳制品质量的重要性,对国内外生鲜牛乳体细胞限量标准进行了总结和比较;对现有的体细胞检测方法和原理进行了概括分析,阐明了不同原理仪器的方法性能的关键检测参数指标,指出了计量校准对于保证体细胞检测仪器结果准确可比的重要性。

等温扩增技术及其结合CRISPR在微生物快速检测中的研究进展

高威芳, 章礼平, 朱鹏

2020, 36(5): 22-31. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0820

摘要 ( 730 )

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等温扩增技术因其对仪器依赖性低、核酸扩增高效等优势,非常适合于快速检测,已在微生物快速检测领域得到了广泛应用。本文从核酸提取、等温扩增（以环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）和重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase polymerase amplification,RPA）为例）和产物检测角度,就近年来核酸等温扩增技术的发展及其在病原微生物核酸快速检测领域的应用进行综述,并概述了核酸等温扩增技术与CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）基因编辑技术相结合的最新研究成果,为这些新兴技术的研究和未来的发展提供新思路。

四引物扩增受阻突变体系PCR技术及其在动植物遗传育种研究中的应用

余钧剑, 迟美丽, 贾永义, 刘士力, 竺俊全, 顾志敏

2020, 36(5): 32-38. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0575

摘要 ( 1306 )

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四引物扩增受阻突变体系PCR（Tetra-primer amplification refractory mutation system PCR,Tetra-primer ARMS PCR）技术是一种在普通PCR基础上发展起来的单核苷酸多态性（SNP）分型技术。该项技术综合了扩增受阻突变体系（Amplification refractory mutation system,ARMS）和四引物PCR（tetra-primer PCR）技术的优点,是对等位基因特异性PCR法的改良。它具有操作简便、分型快速、费用低廉等特点,在国内外生命科学领域尤其是遗传育种领域的应用越来越广泛。本文介绍了四引物扩增受阻突变体系PCR的技术原理及优势、结果检测手段和反应体系改进方法,并在此基础上对该技术在遗传育种研究中的应用进行综述。

玉米转基因成分筛查策略

温洪涛, 李夏莹, 杨洋, 陈子言, 丁一佳, 张秀杰, 张瑞英

2020, 36(5): 39-47. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-1090

摘要 ( 439 )

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本研究通过查阅相关数据库中转基因玉米品系中的常用遗传转化载体中含有的调控元件和标记基因,并结合目前国内外现有转基因检测标准方法,建立了基于P-CaMV 35S、T-NOS、Bar基因、Pat基因、Cp4-epsps基因、NPTⅡ基因、cry1A基因、P-Rice actin、phy结构特异性片段等9种元件/基因实时荧光PCR方法的玉米转基因筛查策略,并对32种转基因玉米进行筛查实验测试,结果表明本筛查策略可覆盖30种独立性状转化体。同时还构建了包含玉米内标基因及9种目标元件/基因序列的质粒分子,经过验证该质粒分子具有良好的可替代性,可作为阳性对照与本检测方法配套使用。

转基因玉米双抗12-5转化体特异性PCR方法验证结果分析

王颢潜, 肖芳, 杨蕾, 缪青梅, 张旭冬, 张秀杰

2020, 36(5): 48-55. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0299

摘要 ( 557 )

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抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种,该品种于2020年1月21日获得农业转基因生物安全证书,具有广阔的应用前景。转化体特异性PCR方法是进行转基因生物安全监管的最有效的技术手段之一,可以对转基因产品进行身份鉴定。本研究组织8家实验室对研发单位提供的的双抗12-5转化体特异性定性、定量PCR方法进行了验证,验证结果显示定性与定量PCR检测方法均具有稳定性好、特异性强和灵敏度高的特点,定量PCR方法能精确地定量检测质量分数为5%和0.5%的双抗12-5样品,并且具有良好的重复性和再现性,符合相关标准的要求。本研究有助于后续标准方法的建立和完善,为我国转基因生物安全监管提供技术支撑和决策依据。

基于RNAi技术的转基因玉米逆转录数字PCR检测方法

杨镇州, 刘刚, 许丽

2020, 36(5): 56-63. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0897

摘要 ( 358 )

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针对基于RNAi技术的转基因玉米品系,研究并建立了一套逆转录芯片式数字PCR（dPCR）定量检测该品系玉米双链RNA的方法。研究内容主要包括RNA提取方法、引物探针设计、逆转录方法、dPCR反应条件及体系等方面的探索和优化。该方法的绝对定量限为2.5 copies/μL,RSD为12.4%;检测低浓度实际样品达21.7 copies/μL时,相对偏差为2.7%,RSD为14.6%,满足国际上转基因定量结果RSD≤25%的要求。将该方法用于基于RNAi技术转基因作物的定量检测,将为我国相关转基因作物的安全评价提供了精确可靠的技术手段。

抗虫耐除草剂玉米GH5112E-117C定性PCR检测方法

李葱葱, 谢苹, 董立明, 夏蔚, 兰青阔, 闫伟, 龙丽坤, 李飞武

2020, 36(5): 64-67. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0701

摘要 ( 382 )

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转基因抗虫耐除草剂玉米GH5112E-117C是由北京奥瑞金公司研发的转mG2-aroA基因和mcry1Ah基因抗虫耐除草剂玉米新品系,对玉米螟、粘虫等鳞翅目害虫具有抗性、耐草甘膦除草剂的转基因玉米,在我国具有重要产业化应用前景。本文研发了GH5112E-117C转基因玉米的定性PCR检测方法,该方法能特异性地检测转基因抗虫耐除草剂玉米GH5112E-117C,在每个反应引物浓度为0.2 μmol/L、Taq DNA 聚合酶0.625 U、DNA模板50 ng,退火温度为58℃的条件下,检测灵敏度可稳定达到0.1%。该方法为转基因抗虫耐除草剂玉米GH5112E-117C的精准检测提供了一种新的技术手段,为农业转基因监管提供技术支撑。

转基因大豆MON89788芯片式数字PCR定量方法的建立

杨镇州, 刘刚, 梁文

2020, 36(5): 68-73. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-1002

摘要 ( 332 )

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针对抗虫耐除草剂大豆转基因品系MON89788,从转基因植物基因组DNA的提取、核酸模板的质量和浓度控制、引物探针的筛选、PCR反应过程的建立等方面建立了一套完整的转基因大豆芯片式dPCR定量检测方法。本实验也对该方法的重复性和定量检测限进行考察。10组5%转基因品系大豆MON89788样品定量重复性RSD在1.17%-9.97%之间,均满足国际上转基因定量结果RSD小于25%的要求。用该方法对转基因含量为5%、1%、0.1%的大豆MON89788进行定量检测,其定量结果为5.20%、0.94%和0.11%,RSD分别为6.2%、3.6%和15.2%。该检测方法的定量限达到0.1%,能满足欧盟对转基因定量标识0.9%的要求。将本实验建立的方法用于转基因大豆的定量检测,能为规范我国转基因监管工作的实施提供强有力的技术支撑。

猪瘟病毒抗体纳米荧光检测试纸条方法建立及性能评价

吴昊星, 刘百红, 刘雪微, 周景云, 马永缨, 杨欣艳, 李宝春, 陈西钊

2020, 36(5): 74-79. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0986

摘要 ( 330 )

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基于镧系元素Eu微球标记技术建立了一种猪瘟病毒抗体检测的免疫层析方法。通过对反应体系中包被浓度、复溶浓度以及反应时间等因素进行优化,确定最适的反应条件,建立检测方法,然后通过从敏感性、特异性、重复性、临床评价等方面对其进行性能评价。对反应体系进行优化,最终确定包被浓度为0.1 mg/mL,复溶浓度为6倍稀释,检测时间为15 min。通过对试纸条的性能评价可以得出,猪瘟病毒抗体荧光检测试纸条的敏感性为猪瘟阳性血清国家参考品倍比稀释至1∶128倍仍可以检测到;对常见的猪繁殖与呼吸综合征、猪I型疱疹病毒、猪口蹄疫、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻、牛病毒性腹泻病毒、羊边界病毒等抗体阳性血清无交叉反应;批内和批内变异系数均小于10%;经临床评价,与商品化的猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒相比阳性符合率为90%,阴性符合率为100%,总符合率为97.7%;与荧光抗体中和试验（FVNT）的阴性符合率为100%,阳性符合率为93%,总符合率为98.5%。综合评定认为本研究建立的猪瘟病毒抗体纳米荧光检测方法,符合各项性能参数,可以快速、经济、方便地对猪个体及群体进行猪瘟病毒抗体检测评估,可广泛应用于猪场管理中。

PRRSV NADC30-like SYBR Green I qPCR检测方法的建立与应用

项明源, 廖倡宇, 江地科, 张鹏飞, 王印, 罗燕, 杨泽晓, 姚学萍

2020, 36(5): 80-85. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0885

摘要 ( 376 )

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为建立高效快速的PRRSV NADC30-Like毒株荧光定量PCR（SYBR Green real- time PCR）检测方法,根据NADC30毒株Nsp2基因保守序列设计特异性引物,通过优化确定最佳反应条件,并进行灵敏度、特异性、重复性实验以及临床样品的检测。结果显示,标准品在10⁷ copies/μL到10² copies/μL浓度范围内具有良好的线性关系,最低检测浓度为2.25×10¹ copies/μL;该方法与HP-PRRSV、PCV、PEDV、TGEV、PRV、CSFV、PoRV无交叉反应,批内和批间的变异系数（CV）小于1.9%,在临床样品的检测中较普通PCR有更高的检出率。建立了PRRSV NADC30-Like毒株荧光定量PCR检测方法,具有敏感性高、特异性强、稳定性好、准确度高和检测快速等优点,可用于PRRSV NADC30-Like感染的早期诊断、样品的快速检测与定量分析。

基于数字PCR的不同品种鸭组织中线粒体与核DNA拷贝数差异研究

纪艺, 徐晓丽, 姜媛媛, 汪小福, 徐俊锋, 李玥莹, 陈笑芸

2020, 36(5): 86-91. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0934

摘要 ( 571 )

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肉和肉制品是人类生活的重要营养来源,但近年来肉制品中发生的掺假使假事件屡见不鲜,使得肉品的质量安全问题已经成为全世界关注的热点话题。以核酸为目标的动物源鉴定是当前普遍使用的方法。在核酸检测中,常用线粒体基因或核基因作为靶标,缺乏统一标准。以绍兴鸭和北京鸭等不同品种及生鲜组织（鸭血、鸭胸肉、鸭肝、鸭皮、鸭心和鸭腿肉）为实验材料,提取DNA后利用微滴式数字PCR开展线粒体和核DNA拷贝数的比较研究,以两者拷贝数及其比值的变异系数为判定依据。结果显示,核DNA的拷贝数在不同品种鸭组织间相对稳定,且变异系数小于线粒体DNA,表明核DNA是开展鸭肉制品掺假定量检测的最适DNA来源。鸭腿肉中线粒体/核DNA拷贝数比值的变异系数最小,表明线粒体DNA作为靶基因的鸭肉掺假比例定量检测时,鸭腿肉来源的肉制品是最佳选择。

基于比浊法的杆菌肽定量测定方法优化

王志新, 刘洋, 周景波, 宏丹, 鲁雷震, 宁亚维, 贾英民

2020, 36(5): 92-97. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0994

摘要 ( 393 )

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杆菌肽在研究应用过程中,定量测定方法不统一,结果缺乏参考性。为规范其测定方法,拟通过建立杆菌肽浓度对数值与OD₆₀₀之间的线性关系,以重复性和精密度为指标,优化指示菌初始浓度、杆菌肽溶液与菌悬液的比例、培养时间等因素,确定比浊法测定杆菌肽抑菌活性的方法。结果显示,比浊法的最适测定条件为：指示菌初始浓度10⁷ CFU/mL,杆菌肽溶液与菌悬液比例1∶9,培养时间4 h,在此条件下,线性关系良好,R²达到0.99以上,且具有良好的重复性。进一步选用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌验证方法的可行性,方法重复性好,精密度高。研究结果将为比浊法的进一步应用以及杆菌肽在试验和生产过程中的定量测定提供参考和依据。

玉米根际高效溶磷菌的筛选、鉴定及促生效应研究

万水霞, 王静, 李帆, 蒋光月, 徐文静, 刘祚军

2020, 36(5): 98-103. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0678

摘要 ( 466 )

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为获得玉米根际高效溶磷促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR）并明确其促生特性,采用选择培养方法从玉米根际土壤筛选出优良PGPR 菌株,测定其溶磷及分泌吲哚乙酸（IAA）的能力,并对优良菌株进行鉴定;采用盆栽试验研究菌株的促生作用。结果分离到2 株优良PGPR 菌株CH07和FD11,其溶磷量分别为368.5 mg/L和321.5 mg/L,产IAA量分别为30.93 mg/L和15.93 mg/L。形态学特征、生理生化特征和16S rDNA 序列分析结果表明,CH07为芽孢杆菌属（Bacillus aryabhattai）,FD11为链霉菌属（Streptomyces maritimus）。最后通过盆栽试验对这2株细菌分离物的促生效果进行比较,结果发现,CH07、FD11,尤其是CH07与FD11的复合物,对苋菜的株高及地上部鲜重有积极作用,可作为研制生物肥料的优良菌株资源。

辣椒根际促生菌的分离筛选及抗病促生特性研究

杨茉, 高婷, 李滟璟, 魏崇瑶, 高淼, 马莲菊

2020, 36(5): 104-109. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0840

摘要 ( 481 )

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获得辣椒根际促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria,PGPR）并探究其抗病促生特性。采用固氮、无机磷和有机磷培养基从江苏省徐州市采集的辣椒根际土壤中分离筛选根际促生菌株（PGPR）,通过形态特征及16S rDNA序列分析进行菌株鉴定,对菌株的固氮、解磷、分泌3-吲哚乙酸（IAA）能力及对4种辣椒病害病原菌抗病能力进行探究。得到13株辣椒PGPR菌株,经鉴定分别属于Bacillus、Pseudomonas、Lelliottia、Siccibacter、Achromobacter、Microbacterium和Paenibacillus;13株PGPR菌株均有固氮功能;其中7株可解有机磷,分别属于Lelliottia、Bacillus、Siccibacter、Microbacterium、Paenibacillus;5株可解无机磷,分别属于Lelliottia、Bacillus、Siccibacter、Pseudomonas;3株具有分泌IAA能力,分别属于Lelliottia、Siccibacter、Bacillus;5株具有抗病能力,分别属于Bacillus、Lelliottia、Siccibacter。辣椒根际土壤含有在农业生产上具有潜在的应用价值的多功能根际促生菌。

丢糟和磷矿粉高温堆肥中耐高温解磷菌的筛选及性能分析

张芮瑞, 邱树毅, 周少奇, 王雪郦

2020, 36(5): 110-119. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-1150

摘要 ( 315 )

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为了解决高温极端环境下的磷素溶出问题,从高温堆肥中分离出具有耐高温能力的解磷微生物。该研究利用无机磷选择培养基,从添加磷矿粉和丢糟的高温堆肥样品中,分离筛选出5株耐高温解磷菌（细菌为GDB1-2;真菌为GDF1-3）,并对这5株菌株进行形态学和分子生物学鉴定及解磷能力分析。研究结果表明,筛选获得的解磷菌株分别为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、多枝横梗霉（Lichtheimia ramosa）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）及构巢曲霉（Aspergillus nidulans）。该5株菌具有较好的耐高温和耐pH性能,各菌株耐高温范围为40-60℃,在50℃条件下其解磷能力均达到最大值,当初始pH 在5-9范围时各菌株均能保持一定的解磷能力。此外,通过解磷曲线发现各菌株的最高解磷量范围在136.85-174.33 μg/mL。该研究结果为后续开发高温环境微生物资源提供了素材,具有良好的应用推广前景。

巴西橡胶树HbAIH基因的克隆及表达分析

杨洪, 岳镒繁, 胡燕玲, 邓治, 代龙军, 李德军

2020, 36(5): 120-129. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0940

摘要 ( 362 )

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鲱精胺亚胺水解酶（Agmatine iminohydrolase，AIH）是植物通过精氨酸途径合成多胺过程中的重要酶之一。本研究首次从巴西橡胶树中克隆了AIH基因HbAIH。序列分析结果表明HbAIH全长1 462 bp，开放阅读框长为1 137 bp，编码378个氨基酸。预测 HbAIH 蛋白的分子量是42.28 kD，等电点为5.09，是一个亲水性蛋白。氨基酸相似性比对结果表明HbAIH与大戟科木薯MeAIH、蓖麻RcAIH和麻风树JcAIH等具有很高相似性，且含有植物AIH中高度保守的与酶活性位点形成和参与底物结合的11个氨基酸位点。qRT-PCR 分析表明，HbAIH表达无组织特异性，在雌花中表达量最高，树皮、茎尖、胶乳、叶片和雄花中表达量依次降低。HbAIH在不同发育时期叶片中的表达存在变化，稳定期表达量最低，淡绿期最高，说明HbAIH可能参与橡胶树叶片发育过程。此外，低温、干旱、高盐、过氧化氢、乙烯利、茉莉酸甲酯处理以及橡胶树死皮的发生均能引起HbAIH表达变化。这些结果说明HbAIH可能参与了橡胶树生长发育、产排胶调控及逆境应答过程。

苦参种子深加工过程油脂类副产物发酵产灵菌红素的研究

倪亮, 张森, 郭盛, 曾飞, 徐明明, 段金廒

2020, 36(5): 130-138. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-1161

摘要 ( 328 )

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为提升苦参资源的利用效率,本研究以苦参种子提取生物碱过程中产生的副产物油脂类物质为研究对象,筛选可利用苦参种子废弃油脂生产灵菌红素的菌株并优化其发酵工艺。利用UPLC-Q-TOF-MS /MS对纯化后的发酵产物进行分析,并通过单因素考察和响应面优化获得菌株利用苦参种子油发酵产灵菌红素的最佳工艺参数。筛选到的菌株经形态和16S rDNA测序鉴定为粘质沙雷氏菌,并命名为粘质沙雷氏菌L9。优化的最佳发酵工艺条件为：苦参种子油、牛肉膏和氯化钙的最佳浓度分别为13 g/L、9.5 g/L及0.3 g/L,温度30℃;在最佳发酵工艺条件下,灵菌红素最高产量约为317.21 mg/L,产率提高约3.2倍。本研究以苦参种子深加工过程产生的副产物为研究对象,对其油脂类成分进行资源化利用研究,在有效处置苦参种子固废物的同时产生灵菌红素高附加值产品,为以种子类药材深加工过程固废物的资源化利用提供了借鉴。

稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白的Vero细胞系的建立

王彩霞, 杜方原, 林祥梅, GrzegorzWozniakowski, 王勤, 冯春燕, 吴绍强

2020, 36(5): 139-144. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-1099

摘要 ( 433 )

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旨为建立稳定表达非洲猪瘟病毒（ASFV）P54蛋白的Vero细胞系,将ASFV-P54基因与绿色荧光基因Azami Green的融合基因片段,将其克隆至慢病毒载体pLV-puro中构建重组慢病毒质粒pLV-ASFV-P54-AG,将该质粒与慢病毒包装质粒pH1和pH2共转染HEK-293V细胞,包装表达ASFV-P54蛋白的慢病毒。将重组慢病毒在聚凝胺（Polybrene）的介导下感染Vero细胞,筛选出一株稳定表达ASFV-P54蛋白的Vero细胞系,命名为Vero-AG-ASFV-P54。间接免疫荧光试验表明,该细胞系能够与P54多克隆抗体反应;经波兰国家兽医研究所进一步验证,结果显示,该细胞系与ASFV抗体阳性血清也能发生反应,并且与阴性血清无反应。结果表明,Vero-AG-ASFV-P54细胞系能够稳定高效的表达具有生物活性的ASFV-P54蛋白。

苏姜猪OLR1基因多态性及其与肉质性状的关联分析

任善茂, 王温慧, 陶勇

2020, 36(5): 145-149. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0827

摘要 ( 343 )

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探讨OLR1基因在苏姜猪群内的遗传多态性,以及该基因多态对苏姜猪猪肉质性状的影响。采用PCR-RFLP技术检测OLR1基因在苏姜猪试验群体中的PstⅠ酶切遗传多态性,运用单因素方差分析方法分析了该多态位点对苏姜猪肉质性状的影响。结果发现,苏姜猪试验群体OLR1基因内含子5区域内发现一个PstⅠ酶切多态性,检测到CC、CD和DD三种基因型,多态信息含量呈现中度多态性。CC型与DD型个体的肌肉失水率、大理石纹间的差异达到显著水平（P<0.05）,CD型个体用色差仪测得的b值显著高于DD型（P<0.05）。因此,检测到的OLR1基因PCR-RFLP-PstⅠ多态性与大理石纹等肉质性状存在着显著的相关关系,可以作为肉质性状候选基因在苏姜猪的持续选育中加以应用。

重组毕赤酵母产青蛤Mytimacin抗菌肽的表达研究

赵震, 王莎莎, 吕星星, 陶妍, 谢晶, 钱韻芳

2020, 36(5): 150-158. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0700

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Mytimacin是主要在无脊椎动物中表达的Macin抗菌肽家族中的一员,具有较强的抗病原微生物活性,是利用重组DNA技术开发天然抗菌剂的良好候选者。通过RT-PCR从青蛤（Cyclina sinensis）闭壳肌中克隆编码Mytimacin成熟肽的基因,经3次PCR在该基因的5'端添加Xho I限制性酶切位点和信号肽酶识别位点、3'端添加Xba I限制性酶切位点和6×His,获得目的基因“CsMm”以pPICZαA为表达载体、毕赤酵母（Pichia pastoris）X-33为工程菌,构建重组毕赤酵母X-33/pPICZαA-CsMm。通过高浓度博来霉素筛选高拷贝酵母转化子,在28℃、250 r/min条件下,使用1.5%的甲醇诱导表达72 h;使用固化金属离子亲和层析（IMAC）对表达产物进行纯化,并通过MALDI-TOF-TOF质谱分析对纯化产物进行鉴定。另外,通过涂布法和浊度法考察重组CsMm的抑菌活性。结果表明：基于X-33/pPICZαA-CsMm重组毕赤酵母的外源表达获得了表达量为25.6 mg/L的重组蛋白,经MALDI-TOF-TOF质谱鉴定其为分子量约7.8 kD的预期重组CsMm。抑菌试验证明重组CsMm对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）和副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）具有明显的抑菌活性。构建的重组毕赤酵母X-33/pPICZαA-CsMm能有效合成具有生物学活性的重组青蛤Mytimacin,旨为贝类来源天然小分子抗菌剂的开发提供可资参考的技术途径。

共表达HAC1和分子伴侣基因对甘露聚糖酶在毕赤酵母中表达的影响

闵琪, 高子涵, 姚银, 张华山, 熊海容, 张莉

2020, 36(5): 159-168. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0718

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为了提高甘露聚糖酶ManA在毕赤酵母中分泌表达的酶活,选择毕赤酵母内质网未折叠蛋白反应（Unfolded protein response,UPR）激活调控因子HAC1与5种毕赤酵母蛋白折叠相关的分子伴侣ERO1、PDI、PDI1、CPR5、BiP,通过构建pPICZA-HAC1等6种胞内表达重组质粒,分别电转化至分泌表达ManA的毕赤酵母重组菌中胞内共表达,并分析其重组菌摇瓶发酵时ManA表达的影响。结果发现在摇瓶发酵水平,胞内共表达HAC1、ERO1、PDI的重组菌发酵上清液中的ManA酶活力分别提高了26%、15%、20%,其重组菌发酵上清液的酶活力分别达到1 014 U/mL、925 U/mL、965 U/mL。通过对各重组菌上清液酶活力、胞内滞留酶活力、上清液蛋白浓度数据进行分析,进一步选择将HAC1、ERO1、PDI进行两基因或三基因组合,并分别在分泌表达ManA的重组菌胞内共表达,但各共表达重组菌发酵上清液的酶活力都没有进一步的提升。单独共表达HAC1或者分子伴侣ERO1、PDI可以辅助ManA的正确折叠,提高其蛋白表达。

杜氏盐藻促生菌株的分离与鉴定

段露露, 杭伟, 程宇娇, 崔红利, 王计平, 李润植

2020, 36(5): 169-175. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-1264

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拟通过探究藻际微生物对微藻生长及代谢产物积累的影响,筛选出促进微藻生长的促生菌株。以杜氏盐藻（Dunaliella salina）Ds-SXYC-2为试材,分离鉴定盐藻藻际环境中的共生菌株,进一步构建藻菌（1∶1）共培养体系、测试盐藻生长及代谢产物积累等表型。结果显示,从杜氏盐藻藻际环境分离获得5株共生菌株,经16S rDNA分子鉴定,属于3个菌属。菌株B1与B2为涅斯捷连科氏菌（Nesterenkonia）,菌株B3与B4为盐单胞菌（Halomonas）,菌株B5为海杆菌（Marinobacter）。5株共生菌株对杜氏盐藻的生长均有促进作用,菌株B3能显著促进杜氏盐藻生长及代谢产物的积累。共培养15 d后,杜氏盐藻生物量达到2.3 g/L,比对照组增加了28.9%,叶绿素a的含量达到4.61 mg/L,比对照组增加了36.3%,β-胡萝卜素比对照组提高了56.4%。盐藻多糖、蛋白质、总脂含量分别比对照组增加了34.8%、71.2%和37.6%。菌株B3盐单胞菌可以作为促进杜氏盐藻生长及代谢产物累积的优势菌株,进一步构建共培养体系可应用于杜氏盐藻的商业生产。

鲜切香菇贮藏过程中质构变化与自溶自噬分析

赵爽, 苏哲, 谷彤彤, 高琪, 荣成博, 宋爽, 刘宇

2020, 36(5): 176-182. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0781

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旨在明确鲜切香菇经过机械损伤后发生的应激生理以及自溶进程中细胞质构的变化。以香菇0912子实体新鲜切片为材料,研究低温和室温贮藏条件下香菇切片生理生化指标的变化趋势,利用显微技术研究老化组织中细胞结构的变化。结果显示低温贮藏条件有利于减缓鲜切香菇褐变、软化、蒸腾失重及抗氧化活性的下降。微观结构研究显示鲜切香菇经过机械损伤后激发了自溶自噬机制,细胞内出现胞壁断裂、胞膜消融、自噬体吞噬细胞器、大量DNA断裂、细胞核消失及细胞解体等现象。鲜切香菇切片在损伤后发生自溶自噬现象,微观组织结构的破坏,是菇体劣变的重要原因之一,在外界贮藏环境的共同作用下加速腐败的进程。

多基因模型在肝细胞癌预后中的应用

魏之菡, 法博涛, 俞章盛

2020, 36(5): 183-192. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-1254

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利用较少分子信息预测肝细胞癌类型对患者的个性化治疗十分关键。探索已知的与肝细胞癌预后相关的信号通路,共发现41个关键基因。随后,运用机器学习的方法对其构建风险预测模型,并在4个肝细胞癌数据集上进行验证。结果显示,该模型能将肝细胞癌患者分成两个预后差异显著的类型：癌症基因图谱（The cancer genome atlas,TCGA）数据集交叉验证的平均log rank P值为0.03;其他测试数据集的log rank P 值分别为0.000 38、0.002 1和0.01。生物信息学分析显示肝细胞癌的预后与细胞周期等信号通路显著相关,并筛选出12个潜在的肝细胞癌分子标志物。研究结果表明,基于41个基因构建的肝细胞癌预后模型具有较好的稳健性和准确的风险预测能力。

漆酶介导生物体内酚类氧化偶联的基本原理及其在绿色合成中的应用

陈慧玲, 张青云, 孙凯

2020, 36(5): 193-204. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-1007

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漆酶（Laccase,p-diphenol dioxygen oxidoreductases,EC 1.10.3.2）是一类包含三核铜簇位点的多酚氧化还原酶,广泛存在于细菌、真菌、高等植物和昆虫体内。该类酶不仅能够促进生态系统中高分子木质素和腐殖质聚合物的生物分解,还可以催化有机体内单酚和多酚类化合物参与黑色素、木质素、黄酮类和角质层等功能酚聚合物的生物合成。漆酶介导有机物的分解代谢和合成代谢机制有益于生态环境中碳循环和生物形态发生变化。在生物体内,漆酶催化天然酚类单电子氧化形成苯氧活性自由基或醌类中间体,随后这些活性中间体发生自我偶联或交叉偶联反应,生成多种结构复杂的大分子C-C、C-O-C或C-N-C功能聚合产物。因此,通过人工模拟漆酶催化生物体内的绿色合成代谢机理和路径,合理设计和定向改造漆酶在生物体外催化酚类底物偶联形成大分子功能聚合产物的结构和特性,有望为拓展和研发漆酶在绿色合成化学中的多功能应用提供丰富的参考价值和新颖的见解思路。

一个RNAi载体上反向重复片段的测序策略

杨文文, 倪嘉瑶, 胡蕊洁, 王华忠

2020, 36(5): 205-210. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0977

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相邻的反向重复DNA片段有形成单链内二级结构的倾向,属于一种测序困难的DNA模板。解决RNAi载体插入的反向重复片段的测序问题,为该类载体正确性的测序验证奠定基础。采用常规分子克隆方法构建表达小麦TaATG2串联反向重复片段的RNAi载体,设计2种策略对经菌落PCR初步鉴定的载体进行测序验证：一种是以完整的载体质粒为模板进行测序;另一种是先对载体进行酶切处理,切除反向重复片段中的一个后对保留另一个片段的线性载体进行测序。结果表明,第一种测序策略受到串联反向重复片段形成的单链内部二级结构的影响,测序信号在反向重复片段处出现衰减或乱峰,无法读取序列。第二种测序策略排除了2个反向重复片段之间的干扰,保留在载体上的片段测序信号清晰,序列准确。采用酶切切除一个片段后进行测序的方法,经过2次酶切和2次测序可以有效地对载体上的2个反向重复片段分别进行序列测定,进而确认构建载体的正确性。

2020, 36(5): 211-211.

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