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2022年 第38卷 第11期    刊出日期：2022-11-26

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综述与专论

草甘膦在我国生物育种产业化应用中的机遇与挑战

张雅涵, 朱丽霞, 胡静, 朱亚静, 张雪婧, 曹叶中

2022, 38(11):  1-9.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0924

摘要 ( 472 )   HTML ( 42)   PDF (3383KB) ( 509 )  

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草甘膦作为一种广谱除草剂广泛用于各种环境杂草治理，由于其出色的除草效果、安全性和可以在耐草甘膦转基因作物上使用的优点，成为了全球范围内用量最大的除草剂。我国是草甘膦的最大生产国，主要用于出口。国内的草甘膦主要是在非转基因作物种前与收后使用，然而随着有序推进生物育种产业应用的中央决策部署明确后，草甘膦在我国市场上将会迎来一个爆发期。同时由于“草甘膦安全之争”对草甘膦的广泛应用产生了消极影响，所以草甘膦在我国生物育种应用中存在巨大机遇的同时伴随着巨大的挑战。本文从草甘膦的问世、应用现状、作用机理、与耐草甘膦作物之间的关系以及我国生物育种现状等多个维度全面梳理草甘膦的发展历史与应用现状，建立公众对草甘膦的客观认识，促进我国生物育种产业化应用有序推进。

大豆疫霉菌效应子研究进展

郑向, 段左平, 张杰, 潘素君, 戴良英, 刘世名, 李魏

2022, 38(11):  10-20.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0097

摘要 ( 404 )   HTML ( 23)   PDF (1297KB) ( 276 )  

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大豆疫霉菌引起的根腐病是危害最严重的大豆病害之一。大豆疫霉菌在侵染过程中会分泌大量效应子到寄主细胞，抑制或激发寄主免疫系统。深入了解大豆疫霉菌效应子特性及其与寄主之间的作用机制，可为疫霉菌引起的大豆根腐病防治提供重要参考。本文对大豆疫霉菌效应子的类型、分泌和转运到寄主细胞的过程、效应子抑制寄主免疫反应及触发寄主免疫反应的作用机制、效应子对应的大豆抗病基因鉴定情况等方面研究进展进行了综述，同时讨论了当前大豆疫霉菌效应子研究中存在的问题，并对未来的研究方向进行了展望，以期为大豆疫霉菌引起的根腐病防治提供参考依据。

甘蔗根际微生态及其与黑穗病防治之间的关系

张靖, 尤垂淮, 曹月, 崔天真, 杨靖涛, 罗俊

2022, 38(11):  21-31.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0303

摘要 ( 318 )   HTML ( 16)   PDF (1981KB) ( 240 )  

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黑穗病严重危害甘蔗生产，造成蔗茎产量降低和蔗糖分损失。该病害通过气传和土传等方式传播，其病原菌的孢子能在高温干燥环境下存活半年以上。根际微生态是根系与土壤紧密联系的微型生态体系。该体系的环境因素如土壤微生物、根系分泌物、土壤理化性质等对作物生长发育有着极为重要的影响。同样地，根际微生态与植物病害的发展和防控也有着极其密切关系。甘蔗根际微生态系统的特征及其与黑穗病之间内在联系的阐述，有助于甘蔗黑穗病的早期预防及生防资源的开拓挖掘。本文从甘蔗黑穗病的发生与危害、植物根际微生态与病害的关系、甘蔗根际微生态及黑穗病防治这几方面，对前人研究进展进行综述，旨在为甘蔗根际微生态的研究和优异生防资源的挖掘及甘蔗黑穗病的高效防治提供参考和借鉴。

真菌Hog1 MAPK信号通路研究进展

许机分, 陈泓妃, 王娜, 刘晶

2022, 38(11):  32-40.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0335

摘要 ( 416 )   HTML ( 20)   PDF (1705KB) ( 316 )  

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丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路广泛存在于真核细胞并且高度保守，是生物体内非常重要的信号转导系统之一。胞外刺激信号通过细胞膜上的特异性受体传递给胞内MAPK信号通路，该信号通路通过磷酸化下游转录因子、调节各种酶类来调控转录水平及生化反应等，进而使细胞适应外界环境变化。Hog1 MAPK信号通路能够被胞外高渗透压胁迫等刺激激活，对细胞在高渗环境下的存活至关重要。近年来，越来越多的研究发现虽然该信号通路在真核生物中高度保守，但不同物种中的组成仍有差异，且该信号通路的功能也相对多元化。本文综述了Hog1 MAPK信号通路的组成、功能及其与其他信号通路之间的cross-talk，旨在为今后深入研究该信号通路的作用机制及其与其他信号通路间的cross-talk提供参考。

单细胞转录组测序技术及在哺乳动物上的应用

寇佳怡, 王玉玲, 曾睿琳, 兰道亮

2022, 38(11):  41-48.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0094

摘要 ( 390 )   HTML ( 26)   PDF (1255KB) ( 257 )  

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哺乳动物的器官是由多种细胞类型组成，它们通过细胞间的相互作用来发出信号，以维持体内平衡和确保机体发育。传统转录组测序是以大量细胞或组织为研究样本，反映的是细胞总体上转录组特征，不能分析单个细胞的基因表达情况，而单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技术的发展为揭示单个细胞转录组特征提供了有效方法。本文通过对scRNA-seq平台、scRNA-seq主要技术类型及scRNA-seq在哺乳动物上的应用展开综述。

技术与方法

Analog-sensitive蛋白激酶研究系统在植物病原真菌中的建立

孙忠娟, 刘倩倩, 郭雨纤, 王光辉, 王晨芳

2022, 38(11):  49-57.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1602

摘要 ( 197 )   HTML ( 5)   PDF (5841KB) ( 194 )  

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常用的基因敲除技术无法应用于某些特殊激酶的研究，旨为在植物病原真菌中建立基于蛋白激酶人工改造的analog-sensitive蛋白激酶研究系统，为蛋白激酶的研究提供新的思路和方法。采用网站预测蛋白激酶的“守门员”残基，用载体回补法对其进行突变获得相应的类似物敏感型（analog-sensitive，as）突变体gpmk1-as与pmk1-as，并检测类似物敏感型蛋白激酶的功能及其对ATP类似物抑制剂1-NM-PP1的敏感性。结果显示，Gpmk1与Pmk1的守门员残基分别为Q103和Q104，此位点在多个代表性真菌中均十分保守；类似物敏感型突变体gpmk1-as的菌落生长速度与野生型PH-1一致，均快于Gpmk1敲除突变体，Pmk1-as能够产生与野生型Guy11一样成熟的黑化附着孢，而Pmk1敲除突变体无法产生；在5 μmol/L的1-NM-PP1条件下，gpmk1-as的菌落生长速度下降，但PH-1正常生长，在10 μmol/L的1-NM-PP条件下，pmk1-as无法形成附着孢，但Guy11可以形成成熟的黑化附着孢。结果表明，Gpmk1和Pmk1的类似物敏感型蛋白激酶均能行使正常的蛋白功能，却对ATP类似物抑制剂1-NM-PP1十分敏感。

转录组与代谢组联合分析菠萝网纱覆盖防寒机制

刘传和, 贺涵, 何秀古, 赖秋勤, 刘开, 邵雪花, 赖多, 匡石滋, 肖维强

2022, 38(11):  58-69.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0203

摘要 ( 257 )   HTML ( 13)   PDF (5402KB) ( 258 )  

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本研究以不覆盖为对照（CK），通过转录组、代谢组进行基因表达和代谢物差异分析，探究冬季菠萝黑色网纱覆盖防寒（FH）的生理及分子机制。转录组分析表明，与CK相比，FH中筛选到1 125个差异表达基因，其中表达上调和下调基因分别为417个和708个。差异基因主要富集在淀粉和蔗糖代谢、内质网蛋白加工、苯丙素生物合成和氨基酸生物合成等通路；筛选出19个与防寒相关的候选关键差异基因，包括WRKY、MYB、bHLH等转录因子基因及ERD6-like、β-葡萄糖苷酶等酶基因。代谢组分析表明，与CK相比，FH中筛选到151个差异代谢物，包括含量上调57个和含量下调94个。差异代谢物主要富集在嘌呤和嘧啶代谢、氨基酸类代谢、脂类代谢和黄酮类代谢等通路；筛选出26个与防寒相关的关键差异代谢物，主要包括类黄酮、氨基酸、多胺、脂和糖类等。本研究结果表明，黑色网纱覆盖通过影响菠萝相关基因差异表达和代谢物变化来调控菠萝生长发育，安全越冬，为今后指导菠萝冬季防寒，挖掘菠萝耐寒功能基因奠定基础。

改良高通量测序技术揭示除藻剂对藻类群落的影响

陈宇捷, 郑华宝, 周昕彦

2022, 38(11):  70-79.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0193

摘要 ( 284 )   HTML ( 6)   PDF (4626KB) ( 214 )  

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研究藻华水体中浮游植物群落对除藻剂的响应，可为在实际应用中选择合适的除藻剂提供理论依据。近年来，高通量测序技术已逐步用于表征藻类群落结构，然而它无法区分群落中的“死亡”和“存活”个体。本研究利用经叠氮溴化丙锭（PMA）前处理和未经PMA前处理的高通量测序技术，探究Ca(ClO)₂、CuSO₄和一种市售生物除藻剂对某一存在藻华的景观水体中藻类群落组成、多样性和标志物种的影响。结果显示，3种除藻剂均能有效降低水样的藻密度；初始水样中绿藻门的单针藻属（Monoraphidium）相对丰度最大（74.34%），是造成藻华的优势藻；与非PMA处理组相比，经PMA处理后的测序结果更能体现不同除藻剂处理后活藻群落组成和多样性差异：在除藻剂作用下，绿藻门相对丰度下降至1.50%-24.61%，蓝藻门优势种Leptolyngbya boryana相对丰度上升至27.85%-41.52%；50 mg/L生物除藻剂能显著提升群落的Chao1指数、observed species指数、Pielou's evenness指数和Shannon指数，增加了群落的多样性、均匀性和稳定性；主坐标分析表明投加量增大不会显著改变Ca(ClO)₂和生物除藻剂处理组的活藻群落结构；物种差异分析显示，Chroococcidiopsis sp.这一典型的逆境环境优势藻种可在1.0 mg/LCuSO₄和50 mg/L生物除藻剂处理组中富集。基于PMA前处理的高通量测序技术，为研究不同类型除藻剂处理后藻华水体中活藻群落结构的变化提供了一种有效的技术手段。

一种同时测定十种类胡萝卜素的液相色谱方法的建立

孔谦, 黄文洁, 吴绍文, 李坤, 张名位, 晏石娟

2022, 38(11):  80-89.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0122

摘要 ( 314 )   HTML ( 15)   PDF (4331KB) ( 324 )  

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建立了一种同时定量分析叶黄素、玉米黄素、α-隐黄素、β-隐黄素、ε-胡萝卜素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、（6R）-δ-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、番茄红素10种类胡萝卜素的方法。该方法的色谱条件为：YMC Carotenoid C₃₀（250 mm×4.5 mm，5 μm）色谱柱，柱温（25±1）℃，紫外检测波长450 nm，流速1 mL/min，进样体积10 μL，流动相分别由A1和B1按照不同比例混合制得A相和B相，A相中A1∶B1体积比为9∶1，B相中A1∶B1体积比为1∶9。其中，A1相为97%甲醇-水，含有0.05 mol/L乙酸铵和0.1%（W/V）2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）；B1相为100%甲基叔丁基醚（MTBE），含有0.1%（W/V）BHT，梯度洗脱。在0.5-20 μg/mL范围内，10种类胡萝卜素的质量浓度与峰面积呈良好的线性关系，相关系数（R²）均大于0.995，检出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10）分别为0.01-1.6 μg/mL、0.2-4.0 μg/mL，且平均回收率在96.29%-104.47%之间，相对标准偏差（RSD）范围为0.03%-1.24%，整个过程可以在40 min内完成。应用此方法对香蕉和玉米样品中的类胡萝卜素含量进行测定，验证此方法在真实农业生物样品中的稳定性、准确性和可靠性。

应用CRISPR/Cas9技术敲除Mda5基因对新城疫及传染性法氏囊病毒复制的影响

钟菁, 孙玲玲, 张姝, 蒙园, 支怡飞, 涂黎晴, 徐天鹏, 濮黎萍, 陆阳清

2022, 38(11):  90-96.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0087

摘要 ( 261 )   HTML ( 11)   PDF (5435KB) ( 180 )  

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采用CRISPR/Cas9技术敲除DF-1的黑色素瘤分化相关基因5（melanoma-differentiation-associated gene 5，Mda5），探索Mda5基因对新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）和传染性法氏囊病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）复制的影响。通过CRISPR/Cas9技术构建Mda5敲除的DF-1细胞系；实时荧光定量PCR和免疫荧光法检测病毒感染Mda5敲除细胞后病毒RNA水平、细胞病变情况及抗病毒相关基因mRNA水平等。获得Mda5基因敲除的DF-1细胞；与对照组细胞相比，细胞形态、贴壁能力和增殖能力均无显著性差异；与对照组细胞相比，Mda5基因敲除的DF-1细胞感染IBDV后，IFN-β和PKR表达显著性下调，CH25H的表达和病毒复制水平均无显著性差异；感染NDV后，IFN-β表达和病毒复制水平显著性下调，CH25H表达量显著性上调，PKR表达无显著性差异。CRISPR/Cas9技术建立Mda5敲除的DF-1中，IFN-β虽然显著应答IBDV和NDV感染，但不能显著抑制病毒的复制，说明Mda5并非抗病毒复制的关键模式识别受体。

Galectin-1的4T1乳腺癌过表达细胞的构建及其对增殖和转移的影响

王树萱, 向钢, 马小京, 于晶

2022, 38(11):  97-103.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0114

摘要 ( 242 )   HTML ( 10)   PDF (7156KB) ( 107 )  

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探查galectin-1促癌作用的广泛性，并为进一步研究该基因在三阴性乳腺癌中促癌转移的分子作用机制提供必要的实验工具和依据。采用生物信息学方法去分析多种癌症病人样本中该基因的表达情况，及其与乳腺癌病人总体生存率的关系；通过慢病毒转染去构建galectin-1过表达的4T1细胞株，并检测该基因对细胞增殖（CCK8检测法）、迁移和侵袭（Transwell检测法）的影响。研究结果显示，galectin-1在乳腺癌和淋巴癌等多种癌症中呈现高表达状态，且与乳腺癌病人的总体生存率呈负相关。同时，galectin-1过表达三阴性乳腺癌4T1细胞株被成功构建。Galectin-1的过表达能够显著促进4T1肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。这些都显示了galectin-1是一个对乳腺癌等多种癌症具有促癌作用，并能促进三阴性乳腺癌细胞体外增殖和转移的因子。

研究报告

‘凤丹’牡丹PoFD基因克隆及表达分析

张琳, 魏祯祯, 宋程威, 郭丽丽, 郭琪, 侯小改, 王华芳

2022, 38(11):  104-111.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0004

摘要 ( 447 )   HTML ( 15)   PDF (4884KB) ( 227 )  

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Flowering Locus D（FD）基因属于bZIP转录因子家族，与FT基因相互作用，在促进植物开花等方面发挥重要作用。本研究以‘凤丹’牡丹为材料，基于‘凤丹’三代全长转录组测序结果，采用RT-qPCR技术克隆PoFD基因，并进行生物信息学和表达模式分析。结果表明，克隆到的PoFD基因含有一个2 712 bp完整的ORF框，编码903个氨基酸。PoFD蛋白分子式为C₈₂₆₁H₁₃₇₂₂N₂₇₁₂O₃₄₆₈S₅₅₂，理论等电点（pI）为4.88，为亲水蛋白，无跨膜结构，二级结构中无规则卷曲和α-螺旋所占比例较高，β-转角仅占少部分。荧光定量分析发现，PoFD基因在叶片中表达量最高，推测PoFD基因可能主要作用于叶片调控牡丹花期。牡丹不同花发育时期，PoFD基因在半开期的表达量较高，推测PoFD基因在‘凤丹’开花的中期发挥功能。不同浓度油菜素内酯（brassinosteroids，BR）激素喷施处理下，‘凤丹’牡丹花期具有不同程度的延迟，并且PoFD基因的表达均有所下降，表明PoFD基因可能响应BR调控牡丹花期。本研究为进一步研究PoFD基因在牡丹花期调控中的作用提供理论参考。

桑树MnERF2的表达分析

董亚茹, 赵东晓, 耿兵, 李云芝, 王照红

2022, 38(11):  112-121.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0016

摘要 ( 248 )   HTML ( 6)   PDF (4956KB) ( 253 )  

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乙烯响应因子（ethylene responsive factors，ERFs）是植物特异性转录因子，参与多种生物过程，特别是非生物胁迫耐受。研究干旱胁迫下MnERF2的表达情况，为研究桑树AP2/ERF转录因子的抗逆分子机制提供基础理论数据。从桑树中鉴定了一个ERF转录因子亚家族成员，命名为MnERF2，对其进行生物信息学分析，并通过瞬时转化分别获得过表达MnERF2和RNA干扰（RNAi）沉默MnERF2桑树植株，利用功能增益和功能损失方法分析其抗旱功能。结果显示，MnERF2开放阅读框为1 050 bp，编码349个氨基酸，编码蛋白质分子量为39.48 kD，理论等电点为5.6，具有一个典型的AP2/ERF保守结构域。过表达MnERF2显著提高桑树对干旱胁迫的耐受性，相比之下，MnERF2的沉默显著降低了对干旱胁迫的耐受性。进一步试验表明，MnERF2增强SOD、POD、CAT、GST活性，促进ASA、GSH、脯氨酸含量的升高，降低O₂^·-、H₂O₂、·OH、MDA的含量和电解质渗透率。MnERF2通过提高脯氨酸的生物合成来调节渗透势，通过提高抗氧化酶活性和抗氧化物质含量来提高活性氧的清除能力，从而提高桑树干旱胁迫的耐受性。

三角梅黄烷酮3-羟化酶基因的克隆及表达分析

孙蓉, 刘姗, 高静雷

2022, 38(11):  122-128.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0048

摘要 ( 244 )   HTML ( 8)   PDF (7393KB) ( 106 )  

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为探究三角梅产生飞燕草素的可能性，根据前期获得的三角梅转录组数据，克隆花青素合成途径关键酶黄烷酮3-羟化酶基因（flavanone 3-hydroxylase，F3H），并通过荧光定量PCR技术检测其在不同颜色三角梅叶片及苞片中的表达量差异。结果显示成功克隆获得了一条cDNA全长1 089 bp，编码363个氨基酸的基因序列，将其命名为BsF3H，登陆GeneBank（OL957093）。BsF3H相对分子质量为41.14 kD，理论等电点为5.48，含有2OG-FeⅡ_Oxy加氧酶结构域，不具有信号肽及跨膜结构，细胞定位于细胞质中，最多的二级结构为α螺旋，三级结构预测显示为单体蛋白。RT-qPCR结果显示该基因在不同颜色三角梅中表达量均不高，相对而言在紫色安格斯（Elizabeth Angus）苞片中表达量最高。研究结果表明三角梅具有产生各类花青素的潜力，可利用基因工程手段对其颜色进行改造。

刺葡萄查尔酮合成酶基因CHS对不同光质的响应及转录因子调控分析

赖恭梯, 阙秋霞, 潘若, 刘雨轩, 王琦, 赖谱富, 高慧颖, 赖呈纯

2022, 38(11):  129-139.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0077

摘要 ( 269 )   HTML ( 6)   PDF (5387KB) ( 197 )  

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查尔酮合成酶（chalcone synthase，CHS）是花青素合成途径的第一个关键酶，为探明CHS在不同光质下的表达模式及转录因子调控特征，以刺葡萄愈伤组织为材料，克隆了2个CHS基因（VdCHS2和VdCHS3），进行生物信息学分析和8种不同光质培养处理下的表达分析，并对CHS启动子顺式作用元件和转录因子结合位点进行预测。结果显示，VdCHS2和VdCHS3基因长度分别为1 382 bp和1 398 bp，均由2个外显子和1个内含子组成，编码蛋白均为无信号肽、定位于细胞质的亲水性蛋白。光照促进VdCHS的表达，VdCHS在短波光诱导下，先呈上调表达，当表达量达到一定水平后则呈现下调作用，而长波光抑制VdCHS的表达。靶向CHS的转录因子预测得到13个MYB成员，2个CHS启动子上存在23个MYB转录因子识别和结合元件。研究结果表明，不同光质的波长对VdCHS表达影响显著，13个MYB转录因子可能在刺葡萄花青素合成中参与CHS的转录调控。

卷丹新种质JD-h-15的形态特征与遗传变异分析

符勇耀, 易德燕, 杨先茂, 蔡莉, 梁渝华, 雷美艳, 杨利平

2022, 38(11):  140-150.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0091

摘要 ( 208 )   HTML ( 4)   PDF (6642KB) ( 196 )  

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为培育优质的卷丹新种质，以秋水仙素诱变材料JD-h-15于田间种植3年分析鉴定染色体倍性。对JD-h-15和卷丹植株形态、柱头与花粉育性、叶表皮与淀粉粒特征以及鳞茎有效成分等进行比较，结合ISSR标记分析JD-h-15的遗传变异。结果表明，诱变株系JD-h-15已由非整倍的嵌合体恢复为3倍体植株。JD-h-15的株高、叶间距和叶面积与卷丹相比明显增加，茎粗和单株叶片数减少，单株花期提前约14 d。JD-h-15鳞茎独头率为93.75%，显著高于卷丹独头率70.00%。不同时期柱头可授性试验表明，JD-h-15在花苞生长至50-60 mm时表现出高于对照的活性。JD-h-15的花粉有13.71%可正常萌发，而卷丹花粉不萌发，与JD-h-15自交授粉后子房膨大相符。微形态分析表明，JD-h-15的花粉粒大于卷丹对照，气孔大小和密度与对照无差异，而珠芽和鳞茎淀粉粒小于对照。JD-h-15鳞茎中可溶性糖、总黄酮和总皂苷含量比对照分别增加42.37%、67.54%和45.65%，而抗坏血酸、总酚和总生物碱分别减少22.86%、33.02%和50.41%。ISSR标记分析发现3年生JD-h-15和卷丹植株遗传稳定，JD-h-15相比卷丹发生遗传变异，变异率为21.30%。研究结果为卷丹遗传性状改良和秋水仙素诱变百合新种质提供重要参考。

山杏油体蛋白基因PsOLE4克隆及其调控油脂累积功能分析

党瑗, 李维, 苗向, 修宇, 林善枝

2022, 38(11):  151-161.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0251

摘要 ( 295 )   HTML ( 9)   PDF (8042KB) ( 94 )  

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油体蛋白OLE在植物油脂合成累积中具有重要调控作用。依据山杏（Prunus sibirica）不同发育阶段种子的mRNA转录组测序数据，注释获得5个具有完整开放阅读框和典型保守结构域oleosin的油体蛋白OLE家族基因，通过差异转录谱分析及RT-qPCR检测，确定与山杏种子发育及油脂累积密切相关的高表达PsOLE4基因为研究对象，克隆该基因并进行生物信息学分析、组织特异表达检测、亚细胞定位分析、遗传转化拟南芥及其种子油脂含量和脂肪酸组分测定等研究。结果显示，PsOLE4基因全长序列为378 bp，可编码含125个氨基酸且分子量为13 kD的蛋白。该蛋白为疏水性无信号肽的非分泌蛋白，含有18个磷酸化位点、2个跨膜结构域和1个高度保守的脯氨酸结（PX₅SP₃P）结构域，定位于细胞膜上。PsOLE4基因在山杏种子中的表达量显著高于茎、叶及果实，而且PsOLE4基因表达可有效促进转基因拟南芥种子的脂肪酸含量提高与油脂累积，表明山杏PsOLE4基因具有种子表达特异性，对油脂累积具有重要调控作用。研究结果为后续开展山杏种子PsOLE4功能鉴定及应用奠定基础。

建兰ABC基因家族鉴定及其在花发育过程中的表达模式分析

曹映辉, 胡美娟, 童妍, 张燕萍, 赵凯, 彭东辉, 周育真

2022, 38(11):  162-174.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0321

摘要 ( 359 )   HTML ( 12)   PDF (14645KB) ( 107 )  

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ABC基因家族编码一类定位于生物膜的转运蛋白，参与多种物质的转运，在植物生长发育和适应胁迫等生命活动中发挥重要作用。通过生物信息学方法对建兰ABC基因家族成员进行全基因鉴定，并基于转录组数据和实时荧光定量PCR技术（RT-qPCR）分析其在建兰花发育过程中的表达模式。结果表明，建兰基因组中共存在121个可分为8个亚族的ABC基因。所有的建兰ABC基因均具有至少1个保守的核苷酸结合结构域。建兰ABC基因家族成员不均匀分布于19条染色体上，2号和8号染色体上成员数目最多。串联重复事件是导致建兰ABC基因家族扩张的主要原因。建兰ABC基因启动子序列上存在多种环境和激素响应元件。CeABCB6、CeABCB30、CeABCG3、CeABCG54和CeABCI7基因的表达水平与建兰主要花香物质的释放量呈正相关。本研究为后续了解建兰ABC基因的功能奠定基础，并为建兰花香研究提供基因资源。

遮荫对云曼红豆杉活性成分10-DAB及矿质营养累积的影响

王刚, 罗建勋, 蒲尚饶, 李亚平, 王刚, 孙志鹏

2022, 38(11):  175-184.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0353

摘要 ( 190 )   HTML ( 2)   PDF (4168KB) ( 177 )  

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光照是植物生长的必要环境因子，揭示不同遮荫处理对云曼红豆杉苗木活性成分10-DAB、矿质营养累积和光合作用的影响，为云曼红豆杉林下综合利用和林-草复合生态系统的构建提供科学依据。以2年生云曼红豆杉实生苗为材料，设置5种光强条件，阐明云曼红豆杉对不同光照环境的响应策略。结果表明，遮荫对云曼红豆杉苗木各生长时期10-DAB累积具有显著影响（P < 0.05），10-DAB产量在4-10月呈上升趋势，10月达到最大值；随着遮荫的增强，各部位矿质元素的累积量均呈先增加再降低的趋势，其中，N和P在75%遮荫处理下最高，含量大小依次为叶>根>茎，K在50%遮荫处理下最高，含量大小依次为叶>茎>根；遮荫可以显著提高云曼红豆杉光合色素含量（P < 0.05），随遮荫的增强呈“先升后降”的变化规律，75%遮荫下最大，净光合速率（P_n）、气孔导度（G_s）和蒸腾速率（T_r）的变化规律同光合色素相一致，胞间CO₂浓度（C_i）则是先降低后增加，在95%遮荫下的各指标（除C_i）均最低。重度遮荫抑制了云曼红豆杉光合作用，遮荫强度可以有效提高云曼红豆杉苗木（枝叶）10-DAB产量及矿质营养累积，云曼红豆杉苗木培育宜选50%-75%遮荫。

慈竹纤维素合酶BeCesA4的克隆及功能分析

王博雅, 姜勇, 黄艳, 曹颖, 胡尚连

2022, 38(11):  185-193.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0237

摘要 ( 236 )   HTML ( 12)   PDF (4256KB) ( 150 )  

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非木造浆是解决国内纸浆短缺的重要手段。慈竹（Bambusa emeiensis）是我国非木造浆的主要原材料之一，提高慈竹中纤维素的含量能够有效提高竹类造浆的效率。通过前期对慈竹进行的转录组测序分析，挖掘出慈竹中一个与植物中纤维素合酶亚基A（cellulose synthase A，CesA）同源的基因，命名为BeCesA4。结果显示，克隆出的BeCesA4基因编码一个含有982个氨基酸的蛋白质，具备CesA家族的保守结构域；BeCesA4在慈竹快速生长的笋与茎中显著表达；过量表达该基因会使转基因植物出现生物量提升、纤维素含量升高和次生细胞壁加厚等现象。结果表明，BeCesA4的表达量与慈竹茎内纤维素的积累呈正相关。本研究结果为进一步揭示慈竹纤维素合成机制奠定了基础。

羽衣甘蓝类黄酮糖基转移酶基因的筛选及分析

罗雅方, 朱春花, 肖钰婷, 李方全, 张江, 王玉书

2022, 38(11):  194-201.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0434

摘要 ( 259 )   HTML ( 13)   PDF (4146KB) ( 221 )  

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筛选羽衣甘蓝类黄酮糖基转移酶（UDP glycosyltransferase，UGT）基因，研究其在不同材料中的表达模式，为后续的功能研究提供依据。以不同叶色羽衣甘蓝转录组数据为材料，筛选UGT基因并对其进行分析，通过RT-qPCR验证候选UGT基因的表达与花青苷和类黄酮含量的相关性。结果共筛选获得32个UGT基因，32个BoUGT蛋白的C端均含有Motif 1和Motif 2，29个BoUGT蛋白的N端含有Motif 3。其氨基酸数目为222-501个，分子量为24.69-56.53 kD，等电点为4.85-7.19。亚细胞定位预测结果显示，BoUGT以叶绿体定位居多。蛋白聚类分析发现，有21个BoUGT基因编码的蛋白可能参与激素的糖基化修饰过程，11个可能参与类黄酮的糖基化修饰过程。花青素含量与Bol018968、Bol011466和Bol028297表达呈正相关；类黄酮含量与Bol021317、Bol027055和Bol026392表达呈正相关，而与Bol018968负相关。为后续羽衣甘蓝类黄酮物质生物合成途径研究提供了候选基因。

氮添加对樟子松人工林土壤细菌磷酸酶编码基因丰度的影响

武林辉, 耿必苗, 王艳杰, 周国伟, 孙庆业, 赵琼

2022, 38(11):  202-209.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1604

摘要 ( 233 )   HTML ( 2)   PDF (3228KB) ( 330 )  

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为研究氮添加影响森林土壤有机磷矿化的微生物调控机制，分析了10年的野外氮添加（100 kg N ha^-2year^-1）对沙地樟子松人工林土壤微生物中编码酸性磷酸单酯酶、碱性磷酸单酯酶和植酸酶的功能基因（phoC、phoD和appA）丰度及相关酶活性和土壤理化性质的影响。结果表明，氮添加使樟子松人工林土壤中酸性和碱性磷酸单酯酶活性分别下降了18.09%和55.29%，植酸酶活性下降了41.88%。氮添加使土壤微生物中各基因拷贝数分别下降40.97%（16S-rRNA）、78.38%（phoD）、67.92%（phoC）、74.37%（appA）。各基因拷贝数占总细菌基因拷贝数的比例显著下降了61%（phoD）、44%（phoC）、55%（appA）。土壤微生物量碳、微生物量磷含量与酸性磷酸单脂酶、碱性磷酸单脂酶、植酸酶活性及16S rRNA、phoD、phoC、appA基因丰度显著正相关。土壤铵态氮含量与酸性磷酸单脂酶、碱性磷酸单脂酶活性及16S rRNA、phoC、appA基因丰度显著负相关。酸性磷酸单酯酶活性与其基因丰度显著正相关，其他两种酶活性与其基因丰度无显著相关性。以上结果表明，氮添加不仅降低了土壤解磷微生物丰度，还降低了解磷细菌在总细菌中的比例，从而大大降低了磷酸酶活性，抑制了有机磷的矿化。

CLCrV介导的VIGE体系承载力的研究

赵燚, 雷建峰, 刘敏, 胡子曜, 代培红, 刘超, 李月, 刘晓东

2022, 38(11):  210-219.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0173

摘要 ( 497 )   HTML ( 8)   PDF (4144KB) ( 226 )  

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探索CLCrV介导的VIGE体系的承载力。通过CLCrV介导的sgRNA投送系统将基因编辑载体注射过表达Cas9的棉花，提取棉花基因组DNA，利用PCR/RE的方法筛选有效的sgRNA。然后利用同样的方法来检测CLCrV介导的VIGE体系的承载力。基于棉花GhBsr-k1基因成功构建了6个基因编辑载体，其中2个基因编辑载体实现了对棉花GhBsr-k1基因的靶向编辑；将完整的基因编辑载体元件构建到CLCrV病毒载体上并没有检测到棉花细胞中发生基因编辑。针对棉花GhBsr-k1基因，筛选到两个有效的sgRNA。但承载整个CRISPR/Cas9系统的CLCrV载体难以在棉花叶片中实现有效的基因编辑。

5株生防真菌对孢囊线虫的杀线活性测定

武玉环, 彭焕, 葛逢勇, 彭德良, 刘大群, 李亚宁

2022, 38(11):  220-226.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0691

摘要 ( 217 )   HTML ( 4)   PDF (3022KB) ( 131 )  

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为了丰富防治线虫的真菌资源，测定了实验室分离保存的5株生防真菌粉红粘帚霉JGZ、淡紫紫孢菌Y2和BL2、哈茨木霉菌L4和球孢白僵菌BJ对甜菜孢囊线虫、大豆孢囊线虫和禾谷孢囊线虫的杀线虫活性。结果表明，淡紫紫孢菌Y2和哈茨木霉菌L4的孢囊寄生率为100%，随着作用时间增长，孢囊壁消解破裂。5株真菌发酵液随着稀释倍数的增加，线虫的校正死亡率降低。哈茨木霉菌L4的5倍发酵稀释液对甜菜孢囊线虫、大豆孢囊线虫和禾谷孢囊线虫的校正死亡率分别为96.75%、95.95%和96.35%；淡紫紫孢菌Y2的5倍发酵稀释液对甜菜孢囊线虫、大豆孢囊线虫和禾谷孢囊线虫的校正死亡率分别为97.37%、95.74%和97.77%，两者差异不显著。盆栽试验结果表明，哈茨木霉菌L4和淡紫紫孢菌Y2发酵液作用大豆孢囊线虫30 d，孢囊减退率分别为43.67%和41.87%，根长和茎粗显著高于其他处理，哈茨木霉菌L4处理地上鲜重和地下鲜重显著高于其他处理。结合孢囊寄生率、发酵液杀线活性、孢囊减退率和促生作用综合评价，哈茨木霉菌L4生防效果最好。

代谢工程改造黑曲霉生产葡萄糖二酸

郭宇飞, 闫荣媚, 张小茹, 曹威, 刘浩

2022, 38(11):  227-237.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0280

摘要 ( 293 )   HTML ( 9)   PDF (4033KB) ( 287 )  

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葡萄糖二酸是葡萄糖的一种二元羧酸衍生物，是重要的平台化合物，被应用于医药、化工等领域。本研究以黑曲霉为底盘细胞，通过表达来自恶臭假单胞菌Pseudomonas putida KT2440的糖醛酸脱氢酶基因ppudh，成功在黑曲霉中实现了葡萄糖二酸的合成，产量为18.74 mg/L；在此基础上通过共过表达黑曲霉自身来源的肌醇加氧酶（anmioxA）和肌醇-1-磷酸合酶（aninoA）、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288C来源的羧酸转运蛋白（scJEN1），强化了合成通路和外泌途径，将产量提高至102.10 mg/L；通过表达来自乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363的NADH氧化酶（llnox），建立NAD⁺辅因子循环系统，使产量进一步提高至115.65 mg/L；利用RNA干扰技术对竞争支路中的关键酶磷酸果糖激酶（pfkA）和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（zwf）进行弱化表达，葡萄糖二酸最终的产量达到313.65 mg/L。本研究为微生物高效生产葡萄糖二酸和下游相关产品生产奠定基础。

基于信号肽和分子伴侣策略促进大肠杆菌高效转化尿苷

赵宝顶, 吕佳, 申玉玉, 桂玲, 陈钟秀, 陈杰, 路福平, 黎明

2022, 38(11):  238-249.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0167

摘要 ( 281 )   HTML ( 6)   PDF (6583KB) ( 352 )  

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以大肠杆菌作为嘧啶核糖核苷水解酶（pyrimidine-specific ribonucleoside hydrolase RihA，RihA）表达宿主，利用生物转化的方法将尿苷高效转化为尿嘧啶。首先构建pET22b-RihA质粒，在大肠杆菌BL21（DE3）中重组表达，研究尿苷的转化情况。采用优化pET22b-RihA质粒信号肽和与分子伴侣质粒共表达两种策略进一步提高大肠杆菌转化尿苷的效率。来源于碱性磷酸酶的PhoA信号肽和分子伴侣GroES-GroEL共表达的菌株F在投底物发酵时转化效果最好，当底物浓度为65 g/L转化15 h时，菌株F几乎将尿苷完全转化，尿苷转化率达到98.9%，而原始菌株A的尿苷转化率仅为80.2%。进一步对菌株F转化尿苷的浓度进行优化，投入一倍体积的尿苷底物后继续培养约53 h尿苷转化完全，得到尿嘧啶产量为73.45 g/L，尿嘧啶产率为98.16%。发酵液上清中RihA酶活最高的为PelB信号肽和分子伴侣GroES-GroEL共表达的菌株C，其RihA酶活是原始菌株A的10.0倍。其中总可溶性RihA酶活最高的为PhoA信号肽和分子伴侣DnaK-DnaJ-GrpE共表达的菌株G，其RihA酶活是原始菌株A的4.45倍。通过优化信号肽和分子伴侣，提高了尿苷的转化效率，并建立了一种高效的利用大肠杆菌全细胞催化生产药物中间体尿嘧啶的方法。与化学合成方法生产相比，避免了繁琐的生产工艺步骤，对环境友好绿色。

噬菌体DCEAV-31和DCEIV-9对溶藻菌溶藻特性的影响

张俊锋, 李孟珂, 吴志浩, 崔晓龙, 肖炜, 张仕颖

2022, 38(11):  250-257.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0009

摘要 ( 199 )   HTML ( 1)   PDF (2652KB) ( 141 )  

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水华是全球关注的环境问题，而微囊藻是造成水华的主要藻类。微囊藻消长与水体理化因子和生物因子密切相关，但对感染溶藻菌的噬菌体对微囊藻的调控作用缺乏认识。本研究的目的在于理解微囊藻，溶藻菌及其噬菌体三者间的相互关系。本研究对分离自滇池的微小杆菌噬菌体DCEAV-31进行生物学特征研究，采用微囊藻-微小杆菌-噬菌体共培养体系研究三者间的相互关系。DCEAV-31属长尾噬菌体科，爆发量为28 PFU/cell，宿主域较窄，对温度、pH较敏感，对氯仿、乙醇、蛋白酶 K 和SDS 非常敏感，对Triton X-100 不敏感。微囊藻-微小杆菌-噬菌体共培养实验表明噬菌体降低了溶藻菌对微囊藻的溶藻作用，噬菌体也直接抑制了微囊藻的增殖。这些结果表明噬菌体通过裂解溶藻菌或藻际菌调控微囊藻的增殖，为我们理解微囊藻的消长提供了新的视角。

Paraglaciecola hydrolytica中新型β-琼胶酶Aga2的异源表达及酶学性质分析

王小桃, 邹杭, 吴怡, 向省维, 吕华, 刘超兰, 林家富, 王欣荣, 褚以文, 宋涛

2022, 38(11):  258-268.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1617

摘要 ( 192 )   HTML ( 5)   PDF (8397KB) ( 177 )  

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琼胶寡糖具有抗氧化、抗肿瘤和调节肠道菌群等多种生物活性，而微生物来源的琼胶酶是酶法制备琼胶寡糖的重要工具酶。目前报道的琼胶酶数量较少，而具有优良酶学特性的琼胶酶数量更少，极大阻碍了酶法制备琼胶寡糖的工艺开发进程。因此有必要发掘更多微生物来源的新颖琼胶酶。从副居冰菌属Paraglaciecola hydrolytica细菌基因组中挖掘到一个新颖琼胶酶基因aga2，构建至表达载体 pET28a（+），并在大肠杆菌 BL21（DE3）中进行表达；通过镍金属亲和层析纯化蛋白并探究温度、pH、金属离子、NaCl浓度对Aga2活性的影响；采用¹³C核磁共振、薄层色谱和基质辅助激光解吸飞行时间质谱分析酶解产物。Aga2与已知琼胶酶的最高相似度为53.7%。同时Aga2在IPTG（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside）浓度为90 μmol/L，20℃下诱导9 h时，可溶性表达量最高。纯化的Aga2最适反应温度为50℃，且40℃孵育3 h后仍保持72.9%的相对酶活力，具有较好的温度稳定性。Aga2的最适pH为6.0，在不同pH（4-9）下放置5 h后，仍保持62.6%以上的相对酶活力，具有较好的pH稳定性。Aga2在NaCl浓度为2.5 mol/L时仍保持78%的相对酶活力，具有较强的盐耐受性。同时Aga2对Ni²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、K⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、EDTA、DTT、Urea、SDS、TritionX-100有耐受性。薄层色谱结果表明，该酶属于内切型β琼胶酶，产物为新琼四糖和新琼六糖。Aga2具有温度和pH稳定性、盐耐受性和重金属离子耐受性，具有良好的工业应用前景。

高活性和高热稳定性乙烯合成酶的筛选和鉴定

张晨, 张佟佟, 刘海萍

2022, 38(11):  269-276.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0329

摘要 ( 230 )   HTML ( 4)   PDF (7631KB) ( 126 )  

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乙烯合成酶（ethylene-forming enzyme，EFE）是潜在的乙烯生物合成关键酶，酶的高活性和高热稳定性是工业化应用的必要基础。根据进化树选取了6种乙烯合成酶候选基因，成功地进行了表达纯化并测定其活性和热稳定性。最终筛选到来源于Streptomyces bottropensis和 Streptomyces turgidiscabies的乙烯合成酶SbEFE和StEFE具有较高活性和热稳定性，酶比活分别是已报道的乙烯合成酶PsEFE的3.23和4.23倍。35℃水浴30 min后，酶活性仍可保留95.73%和88.22%，而PsEFE在相同条件下完全失活。酶动力学分析表明，SbEFE和StEFE催化反应的副产物也明显低于PsEFE。因此，SbEFE和StEFE是目前已发现的具有最高活性和热稳定性的乙烯合成酶，为深入研究乙烯合成酶的催化机制和应用工艺提供了新的基础。

一株增强中华绒螯蟹抗病力的固氮红细菌SY5的分离鉴定与表征

曹海鹏, 张书萌, 刁菁, 许拉, 盖春蕾

2022, 38(11):  277-285.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0043

摘要 ( 284 )   HTML ( 9)   PDF (2824KB) ( 223 )  

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为丰富在中华绒螯蟹病害防控中具有潜在应用价值的微生物资源，以类胡萝卜素产生能力作为评价指标，从养殖池底泥中分离获得一株优良的好氧光合细菌SY5，在形态与生理生化鉴定以及分子鉴定的基础上对其进行药敏特性分析，并进一步评价了其对中华绒螯蟹抗弗氏柠檬酸杆菌感染的保护效果。结果表明，菌株SY5为固氮红细菌（Rhodobacter azotoformans），革兰氏染色阴性，在营养琼脂平板上的菌落特征为深红色、圆形、边缘整齐、光滑、湿润，与固氮红细菌YLK20的亲缘关系最近，对阿莫西林、新霉素、庆大霉素、四环素、多黏菌素B、恩诺沙星、环丙沙星、卡那霉素、氨苄西林、罗红霉素、磷霉素、链霉素高度敏感，对多西环素中度敏感；在饲料中添加终浓度为（6.0×10⁵）-（6.0×10⁹）CFU/g时对中华绒螯蟹抗弗氏柠檬酸杆菌感染的有效保护率为60.0%-100%。这些研究结果为固氮红细菌SY5作为中华绒螯蟹养殖用饲料添加剂的后期开发奠定了基础。

牦牛FGG组织表达与雌性生殖器官中定位分析

蒋旭东, 刘宇, 邬建飞, 胡双阁, 卢建远, 字向东

2022, 38(11):  286-294.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0216

摘要 ( 263 )   HTML ( 7)   PDF (6675KB) ( 223 )  

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旨在克隆获得牦牛纤维蛋白原γ链（FGG）基因，明确其在组织中的表达特性，探讨FGG对母牦牛繁殖的影响。采集母牦牛的心、肝、脾、肺、卵巢、输卵管和子宫等组织样以及颗粒细胞，利用RT-PCR克隆FGG基因并利用RT-qPCR和免疫组化检测其组织表达。获得到牦牛FGG基因cDNA序列，编码区全长1 332 bp，编码443个氨基酸，FGG蛋白属于酸性亲水稳定蛋白。FGG基因核苷酸序列进化树显示牦牛先与黄牛聚为一类。RT-qPCR显示FGG基因在检测的7个组织均有表达，肝脏表达量最高，显著高于其他组织（P<0.05）；在卵泡不同发育阶段的颗粒细胞中均有表达，且大卵泡颗粒细胞表达量最高，显著高于其他发育阶段（P<0.05）；妊娠期卵巢和子宫中表达量显著高于空怀期（P<0.05）。IHC显示FGG蛋白主要在卵巢颗粒细胞、卵泡腔、输卵管黏膜和子宫内膜中表达。牦牛FGG基因在物种间具有较高的保守性，组织表达广泛，可能在牦牛繁殖调控中发挥着重要作用。

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2022, 38(11):  295-295. 

摘要 ( 88 )   PDF (380KB) ( 102 )  

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版权

2022, 38(11):  296-296. 

摘要 ( 65 )   PDF (154KB) ( 44 )  

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2022, 38(11):  297-297. 

摘要 ( 65 )   PDF (98472KB) ( 43 )  

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