生物技术通报

诱导多能干细胞研究进展

宋卫华, 刘坤, 赵同标

2014, 30(5): 1-7.

摘要 ( 447 )

PDF (6551KB) ( 671 )

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成熟的体细胞过表达转录激活因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc能够转化为具有多能性的干细胞，称为诱导多能干细胞。类似于胚胎干细胞，诱导多能性干细胞具有自我更新和多向分化潜能性两个主要特征。同胚胎干细胞相比，诱导多能干细胞不仅能够为以细胞替代治疗为核心的再生医学提供无限的细胞来源，而且有望解决胚胎干细胞临床开发面临的伦理道德及免疫排斥问题。从诱导多能干细胞技术的建立、重编程的机理及其在临床中的应用几方面作简要综述。

ABA相关基因抗旱基因工程研究进展

田孝威, 彭守华, 尉继强, 姜勇, 王志强, 王化琪

2014, 30(5): 8-14.

摘要 ( 396 )

PDF (5575KB) ( 793 )

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干旱是影响植物生长发育的重要因素之一。ABA在植物生长发育及应对胁迫反应方面发挥着重要的作用。随着分子生物学等相关学科的快速发展，人们对ABA合成及信号通路相关基因的研究取得了长足进展，并进行了转基因抗旱基因工程研究。对ABA相关基因抗旱基因工程研究进展进行了综述。

哺乳动物正呼肠孤病毒反向遗传学研究进展

柯飞, 王赟, 侯丽芳, 胡兴安, 李佩佩

2014, 30(5): 15-19.

摘要 ( 395 )

PDF (4486KB) ( 501 )

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呼肠孤病毒科是分布最广的病毒类群之一，其中哺乳动物正呼肠孤病毒(Mammalian Orthoreovirus，MRV)属于正呼肠孤病毒属，主要感染哺乳动物的呼吸道和肠道。近年来，MRV的反向遗传学操作技术取得了长足进步，运用该技术，在MRV基因组组装、基因功能及致病机制等方面都获得了较大突破。综述了MRV反向遗传学操作技术的建立过程及运用该技术取得的最新成果，并展望了该技术在呼肠孤病毒科其他病毒中的应用。

鲤春病毒血症病毒G蛋白的研究进展

张家林, 李洋, 李强

2014, 30(5): 20-24.

摘要 ( 341 )

PDF (4749KB) ( 510 )

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鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus，SVCV)是引起鱼类传染性病毒病鲤春病毒血症(Spring viremia of carp，SVC)的病原，对鲤科鱼类养殖业造成巨大的经济损失。囊膜糖蛋白G可介导病毒内吞，还是最主要的抗原决定簇蛋白，已成为国内外研究的热点。综述G蛋白在表达技术、病毒检测、疫苗研制等方面的研究状况，旨在为G蛋白的深入研究及鲤春病毒血症的防治提供参考。

大肠杆菌外源蛋白表达载体稳定性的研究进展

江伟华, 刘益丽, 江明锋

2014, 30(5): 25-31.

摘要 ( 353 )

PDF (5804KB) ( 1526 )

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构建高产、稳定、可靠的质粒载体成为基因重组表达技术的研究重点之一。宿主细胞代谢反应和质粒不稳定性相关信息的缺乏，仍然阻碍着质粒载体的优化，成为限制外源蛋白在大肠杆菌中高效表达的瓶颈之一。主要论述了大肠杆菌外源蛋白表达载体的稳定性，分别从质粒和外源基因的本身特性、重组质粒转化对宿主细胞造成的影响及其他因素等方面阐述了对质粒载体稳定性的影响，同时介绍了相关的解决办法，从而为大肠杆菌表达系统高效表达外源蛋白提供参考。

细菌线性质粒的复制研究

朱云霞, 赵昕, 张绮思, 张海方

2014, 30(5): 32-36.

摘要 ( 405 )

PDF (4258KB) ( 629 )

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细菌的线性质粒是近年来基础微生物学研究的一个新热点。线性质粒的复制与环状质粒相比，其最突出的特点就是它的5'末端填补机制——填补因为5'末端引物被切除所留下的缺口。根据线性质粒末端结构的不同将其分为两大类：一类具有共价闭合的发夹末端，另一类具有共价结合的末端蛋白。就细菌线性质粒复制的研究现状作一综述，重点介绍了具有两种不同末端结构的线性质粒5'末端填补机制。

细菌异源表达抗菌肽的研究进展

吕晓萌, 胡彤, 俞婷, 崔艳华

2014, 30(5): 37-44.

摘要 ( 335 )

PDF (7278KB) ( 686 )

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抗菌肽是一类从动植物、微生物体内分离得到的阳离子小分子量肽，具有天然的抗菌活性。它作用迅速，广谱，不易产生耐药性，具有重要的应用价值，近年来成为研究热点。普遍认为异源表达是生产大量抗菌肽的最有效方法。大肠杆菌作为经典的表达宿主，具有生长速度快、遗传背景清晰、有大量可利用的商业表达载体、易操作等优势，现已成为抗菌肽表达的首选宿主。乳酸菌作为世界公认安全的食品级微生物，近年来广泛用于抗菌肽的异源表达。着重阐述了抗菌肽在大肠杆菌、乳酸菌中重组表达的研究进展。

提高放线菌次级代谢产物产量方法的研究进展

雷秀清, 李力, 黄建忠

2014, 30(5): 45-51.

摘要 ( 412 )

PDF (6751KB) ( 768 )

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放线菌的次级代谢产物一直是抗生素等药物开发的重要来源。通过基因技术来提高放线菌次级代谢产物产量的方法已被广泛接受。结合近年的研究成果，概述了利用基因技术过表达或者敲除代谢途经关键基因及加倍基因簇，诱变核糖体相关蛋白的基因，以及异源表达外源基因簇等提高次级代谢产物产量的方法。旨在为寻找新药及改造高产菌株提供相应的技术参考。

Cell-SELEX技术研究进展

赵仲麟, 李燕, 袁超

2014, 30(5): 52-56.

摘要 ( 564 )

PDF (4651KB) ( 602 )

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适配子是通过SELEX技术，即指数富集配体系统进化技术，经反复放大筛选得到的、与目标分子有高度亲和性的分子。SELEX技术常使用纯化的靶分子，目前活细胞也可用于筛选目标，这种技术称为细胞指数富集配体系统进化技术(Cell-SELEX)，其优点是产生的适配子可以与活细胞中的靶分子的天然构象发生作用。细胞表面的跨膜蛋白也可作为适配子的目标。此外，在不知道任何细胞表面分子的情况下也可以得到细胞特异性适配子。对Cell-SELEX技术的应用及研究进展进行综述。

利用SSR技术分析我国16种甜玉米的遗传特性

黄华如, 梁凯光, 蚁珩鑫, 梁雪莲

2014, 30(5): 57-61.

摘要 ( 312 )

PDF (5008KB) ( 500 )

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利用SSR分子标记研究16个甜玉米品种的遗传变异。从200对SSR引物中筛选出10对具有稳定多态性的引物，它们在供试材料中共检测出254个位点，每对引物检测位点5-38个，平均为25.4个，得出的平均多态性信息量为0.920 8；据此进行了聚类分析，将16个品种分为3大类。研究表明，SSR分子标记技术可以用于品种间的遗传分析，方便杂交育种品种的选择。

转Bt cry1Ah基因抗虫玉米的分子检测及农艺性状分析

戴军, 李秀影, 朱莉, 汪海, 张杰, 何康来, 郎志宏, 黄大昉

2014, 30(5): 62-68.

摘要 ( 295 )

PDF (5917KB) ( 892 )

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利用农杆菌介导法将具有自主知识产权的Bt cry1Ah基因转入玉米自交系综31中，在获得的1 764株转基因植株中筛选获得1株对玉米螟有显著抗性的转基因植株。对该抗性植株进行了室内和田间抗虫性分析及外源基因表达分析，并研究了其杂交后代的农艺性状。结果表明，该转基因植株对亚洲玉米螟田间抗虫性达到高抗水平；外源基因能够正常高效表达，在玉米抽穗期的叶片中Cry1Ah蛋白表达量最高，达到1 μg/g鲜重；株高、穗位高、穗长、穗粗等与非转基因对照植株相比差异不大，秃尖长明显短于对照，千粒重及单株产量明显高于对照，这种差异在人工模拟虫害爆发情况下达到极显著水平。

玉米ZmCI-1B启动子及其7个5'端缺失体在转基因拟南芥中的活性分析

李业, 柳小庆, 李素贞, 周晓今, 杨文竹, 陈茹梅

2014, 30(5): 69-75.

摘要 ( 7153 )

PDF (5083KB) ( 580 )

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将ZmCI-1B全长启动子及其7个5'端缺失的启动子片段的表达载体分别转化农杆菌GV3101，经PCR鉴定正确之后，以拟南芥为遗传转化受体，利用花序侵染法将各个表达载体转化拟南芥。用PCR法检测转化后的拟南芥植株，取阳性植株的幼苗或花、角果进行GUS组织化学染色。结果表明，ZmCI-1B启动子在拟南芥中的调控特性与玉米中的不同；ZmCI-1B启动子及其7个5'端缺失启动子转基因拟南芥植株中GUS的染色部位各异，说明了不同长度的启动子功能特性不同，推测其可能与启动子上的顺式作用元件有关。

盐穗木转录因子HcSCL13转录激活的体外鉴定及植物表达载体的构建

周莲洁, 张富春, 王艳

2014, 30(5): 76-82.

摘要 ( 304 )

PDF (6909KB) ( 441 )

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通过同源重组的方法将盐穗木盐响应GRAS家族转录因子HcSCL13基因(GenBank登录号：KC68640)构建至酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7上，转化酵母菌Y2HGold，通过自激活性和毒性检测确定该转录因子的体外激活能力。试验表明，重组菌株pGBKT7-HcSCL13/Y2HGold对宿主菌无毒性，且该菌株表达的融合蛋白能够激活报告基因的表达，说明HcSCL13具有转录激活域，是一类转录因子。成功构建了HcSCL13基因的植物表达载体和亚细胞定位表达载体，为进一步在体内研究该基因的耐盐功能奠定了基础。

毛白杨PtoeIF5A4的原核表达、纯化及鉴定

张杰伟, 管阳, 朱丹, 陈亚娟, 丁莉萍, 王宏芝, 魏建华

2014, 30(5): 83-87.

摘要 ( 247 )

PDF (5701KB) ( 560 )

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为获取大量高纯度的毛白杨PtoeIF5A4蛋白以便研究其特性和生物学功能，以pGEM-T Easy-PtoeIF5A4质粒为模板，PCR扩增毛白杨PtoeIF5A4基因的cDNA编码区，测序正确后，经酶切将其插入到原核表达载体pET28a上，然后将表达载体转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，经不同浓度IPTG诱导培养后发现，0.1 mmol/L IPTG，28℃诱导4 h时目的蛋白最多，且该重组蛋白主要以可溶性的形式存在。采用亲和纯化从可溶性蛋白中纯化到大小为18 kD的蛋白条带。Western blotting分析发现亲和纯化所得蛋白可以与His单克隆抗体发生免疫交叉反应，表明纯化所得蛋白是PtoeIF5A4重组蛋白。

棕色棉DFR基因的克隆与生物信息学分析

肖向文, 朱奇朗, 刘海峰, 王俊铎, 罗城, 曾闻, 梁亚军, 龚兆龙, 李晓波

2014, 30(5): 88-95.

摘要 ( 296 )

PDF (7651KB) ( 370 )

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花色素苷是影响花色的主要色素，二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因是花色素苷生物合成途径的关键酶基因。通过同源克隆策略，以新彩棉6号(XC-6)纤维的RNA以及DNA为模板克隆得到GhDFR基因的CDS全长编码序列及带有内含子的基因组序列，并进行了生物信息学分析。序列分析结果显示，该基因含有6个外显子，5个内含子结构，其cDNA包含一个1 020 bp的开放阅读框，编码355个氨基酸，其氨基酸序列包含具有高度保守性的NADP(H)的结合位点以及底物特异性结合位点。推定的GhDFR蛋白质分子量为39.65 kD，等电点为5.67。该蛋白氨基酸序列同毛果杨、葡萄、天竺葵等物种DFR蛋白显示出较高同源性，而系统进化分析结果表明其与天竺葵、芍药DFR亲缘关系较近。氨基酸序列分析预测表明，GhDFR基因所编码的蛋白不具备信号肽区段，无明显跨膜区域，不属于分泌蛋白，可能为亲水性蛋白，定位于细胞质的可能性最高，其主要二级结构元件为α-螺旋和无规则卷曲。GhDFR属于NADB-Rossmann superfamily。

早胜牛类群A-FABP基因SNPs及其与胴体品质和肉质性状的相关性分析

唐红杰, 赵生国, 雷赵民, 王欣荣, 王建福, 蔡原, 吴建平

2014, 30(5): 96-101.

摘要 ( 248 )

PDF (5702KB) ( 393 )

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研究早胜牛类群A-FABP基因多态性及其与胴体品质和肉质性状的相关性。采用PCR-SSCP方法对5个早胜牛类群(庆阳类群、平凉类群、南德温与庆阳类群杂种、西门塔尔与平凉类群杂种、秦川牛与平凉类群杂种)的A-FABP基因进行多态性分析，分析基因型与胴体品质和肉质性状的相关性。结果显示，A-FABP基因第三外显子区存在c.408G>C的突变，并检测到3种基因型GG、GC和CC。胴体性状相关分析表明，GG基因型的胴体重显著低于CC基因型(P<0.05)；GG基因型屠宰率极显著低于GC基因型(P<0.01)，显著低于CC基因型(P<0.05)；GG基因型净肉率显著低于GC基因型(P<0.05)；GG基因型的眼肌面积显著低于GC和CC基因型(P<0.05)。肉质性状相关分析表明，GG基因型失水率显著高于CC基因型个体(P<0.05)；GG基因型剪切力极显著高于GC和CC基因型(P<0.01)；GG基因型蒸煮损失和pH均显著高于GC基因型(P<0.05)，极显著高于CC基因型(P<0.01)。A-FABP基因突变位点可作为胴体性状和肉质性状遗传标记。

天祝白牦牛IGF-2基因的cDNA克隆

李亚兰, 张全伟, 王雪莹, 马友记, 张勇, 赵兴绪

2014, 30(5): 102-106.

摘要 ( 302 )

PDF (4485KB) ( 405 )

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旨在克隆天祝白牦牛胰岛素样生长因子2(IGF-2)基因编码区全长cDNA序列，为研究该基因的生理功能奠定基础。运用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得天祝白牦牛IGF-2基因全长cDNA序列。扩增获得天祝白牦牛IGF-2基因全长cDNA序列为1 060 bp(GenBank登录号：KF682139)，ORF长540 bp，编码179个氨基酸。其编码的氨基酸与已报道哺乳动物IGF-2氨基酸序列同源性在80%-92%之间。天祝白牦牛IGF-2基因的成功克隆为进一步研究该基因的功能奠定了基础。

甘肃不同地区绵羊TLR9基因多态性分析

吕伟丽, 张小丽, 马小军, 张国华

2014, 30(5): 107-111.

摘要 ( 223 )

PDF (5057KB) ( 381 )

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针对由于急、慢性呼吸道引起的生产性能降低甚至死亡，选择与该病相关的基因TLR9为研究对象，分析群体中该基因的遗传多态性及变异特征，为进一步揭示舍饲绵羊的遗传特性和生产利用提供基础数据。采用PCR-SSCP检测427只表型正常和58只患呼吸道疾病的舍饲绵羊TLR9基因的多态性，测序群体内变异的各等位基因数列，并构建系统发育树以明确舍饲绵羊TLR9基因等位基因之间的遗传关系。结果显示，甘肃地区绵羊在TLR9基因中发现了4个等位基因，共7个核苷酸多态位点，这些位点多是由点突变形成，其中转换4个(占57.14%)，颠换3个(占42.86%)。甘肃地区绵羊TLR9基因具有较丰富的多态性；TLR9基因多态性与绵羊呼吸道疾病有一定的相关性。

MT-III基因在不同海拔地区藏羊及其脑组织不同部位的差异表达研究

王佳丽, 王欣荣, 赵生国, 王建福, 吴建平

2014, 30(5): 112-116.

摘要 ( 215 )

PDF (4724KB) ( 325 )

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为了了解金属硫蛋白-3(Metallothionein-3，MT-III)基因在不同海拔地区饲养的藏羊脑组织及脑组织不同部位间的表达差异，随机选取高海拔地区(青海河南县)饲养的成年雄性藏羊6只和低海拔地区(甘肃临洮县)饲养的成年雄性藏羊3只，屠宰后分别在脑组织的颞叶、顶叶、延髓、小脑及松果体各部位取样，利用实时荧光定量PCR法研究MT-III基因在藏羊脑组织及其不同部位的相对表达量。结果显示，MT-III基因在藏羊脑组织各部均有表达，但不同部位相对表达量有差异；藏羊松果体中MT-III基因的相对表达量极显著高于其它部位(P<0.01)；饲养在高海拔地区藏羊的脑组织的颞叶、顶叶和延髓中，MT-III基因的相对表达量均极显著高于低海拔地区饲养的藏羊(P<0.01)。MT-III是在藏羊脑组织不同部位普遍表达的一种蛋白，其在颞叶、顶叶和延髓较高的表达量可能与该区域脑细胞对低氧及高辐射的耐受性有关。

鸡胚胎干细胞多能性相关基因cNanog和cPouV干扰载体的构建及筛选

彭特, 王丙云, 李东升, 陈志胜, 陈胜锋, 计慧琴, 陈金顶

2014, 30(5): 117-121.

摘要 ( 237 )

PDF (3855KB) ( 411 )

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旨在构建靶向鸡胚胎干细胞多能性相关基因cNanog和cPouV的siRNA表达载体，并在体外检测其对cNanog和cPouV表达的抑制作用。分别选择cNanog和cPouV中3个区域合成寡聚核苷酸构建siRNA表达载体，同时构建cNanog和cPouV全基因表达载体来检测基因表达下调的效果。经Western blotting检测显示，所构建的siRNA表达载体可在293T细胞内表达siRNA或shRNA，诱发RNA干扰效应，从而抑制目的基因cNanog和cPouV的表达。不同位点的寡核苷酸序列抑制效率不同，其中pS3-cNanog和pS3-cPouV重组质粒的干扰效果和抑制效率最好。研究结果为后续得到稳定干扰cNanog 和cPouV基因的重组载体和进一步研究cNanog 和cPouV基因功能奠定了基础。

利用Tol2转座子构建转基因草金鱼初探

董颖, 胡红霞, 王巍, 田照辉

2014, 30(5): 122-128.

摘要 ( 501 )

PDF (5060KB) ( 607 )

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青鳉Tol2转座子是脊椎动物中发现的第一例天然具有活性的转座子，目前已经被成功应用于多种模式动物的转基因研究中。采用PCR的方法以质粒pCAgcGH为模板亚克隆出一段含有草鱼生长激素(GH)5个外显子、鲤鱼β-actin启动子及多个酶切位点的序列，并将这段序列与经双酶切处理的质粒pTol2-MCS-EGFP进行重组连接，得到重组质粒pTol2-GH-EGFP。采用显微注射的方法将重组质粒pTol2-GH-EGFP与体外合成的Tol2转座酶mRNA一起注入草金鱼受精卵中。通过观察绿色荧光和PCR检验绿色荧光蛋白和GH基因的表达，筛选出成功转入外源基因的草金鱼。阳性表达检出率为17.3%。利用Tol2转座子构建转基因草金鱼，不仅丰富了Tol2转座子的应用范围，而且为进一步利用Tol2转座元件进行观赏鱼转基因及基因表达研究奠定了基础。

DNA条形码揭示日本纺织娘(Mecopoda niponensis)个体内和个体间的序列变异

周志军, 尚娜, 常岩林, 石福明

2014, 30(5): 129-136.

摘要 ( 328 )

PDF (5807KB) ( 747 )

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采用DNA条形码通用引物对分布于我国的两种纺织娘14个个体进行了扩增与测定。结果显示，6个纺织娘Mecopoda elongata个体均可由PCR产物直接测序法获得良好测序结果，序列长度均为658 bp，且不存在碱基插入/缺失。而8个日本纺织娘M. niponensis个体PCR法直接测序结果峰图杂乱，软件无法识别，后经克隆法测定的85条克隆序列长度为580-662 bp，其中，20条为明显的线粒体假基因(Nuclear sequences of mitochondrial origin，numts)，包括4条存在终止密码子，15条存在碱基插入/缺失，1条存在读码框摆动；38条为疑似numts(含≥2个非同义替换位点)。利用Kimura 2-parameter(K2P)模型计算遗传距离发现，两种纺织娘之间的遗传距离为0.077，纺织娘及日本纺织娘个体间的遗传距离分别为0-0.008及0.030-0.051，而日本纺织娘个体内克隆间的遗传距离则分别为0-0.143(含numts)及0-0.083(不含numts)。邻接法系统发育树聚类结果显示，纺织娘形成一个单系分支，自举值为99，而日本纺织娘的COI和numts序列则聚类形成多个分支，提示这些numts序列可能是线粒体COI多次向核内转移的结果。

紫苏DGAT1基因克隆及四尾栅藻表达载体构建

王莹莹, 刘玉, 姬妍茹, 张正海, 周广麒, 刘宇峰

2014, 30(5): 137-141.

摘要 ( 268 )

PDF (4935KB) ( 541 )

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利用RNAiso Plus试剂盒提取紫苏总RNA，以其为模板采用RT-PCR方法扩增出紫苏DGAT1基因的cDNA编码区序列并构建克隆载体pMD-DGAT1，再将克隆载体pMD-DGAT1和pBI121空载体进行Xba I和BamH I双酶切，连接目的片段构建表达载体pBI121-DGAT1。结果显示，克隆得到目的片段长度为1 657 bp，与GenBank中紫苏DGAT1基因序列的最大同源性为97%，所构建表达载体pBI121-DGAT1双酶切得到的两条片段长度与连接前一致。结果表明，成功转化四尾栅藻并得到表达，转化后四尾栅藻的油脂含量较转化前提高近1倍。

真姬菇在高温胁迫下的差异表达蛋白分析

刘琳, 贾培培, 卢伟东, 郭奇林, 郭立忠

2014, 30(5): 142-147.

摘要 ( 296 )

PDF (4672KB) ( 534 )

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采用双向电泳分析Tris-饱和酚法获得的真姬菇菌丝体全蛋白，利用PDQuest8.0软件分析双向电泳图谱，比较最适温度(25℃)和高温胁迫条件下(42℃)真姬菇菌丝体蛋白的表达差异，筛选出与高温胁迫相关的蛋白，并对获得的差异蛋白进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定。结果显示，共鉴定7个蛋白点中，Spa2同源结构域的表达量下调，DEHA2G15532p、肽酶M76家族、HSP70、SNF2家族的DNA修复蛋白、细胞色素p450及AM域家族和锌指蛋白的混合物的表达量上调。这些蛋白参与了信号转导、蛋白处理、DNA修复等多种抗逆反应生理过程。

产角质酶酵母菌的发现与鉴定及产酶条件的优化

冉琴琴, 张效宁, 张文坤, 张学俊, 张萌萌

2014, 30(5): 148-154.

摘要 ( 250 )

PDF (7050KB) ( 549 )

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为得到有效水解杜仲角质层的角质酶，通过生物酶法提取杜仲中的活性成分。从病变的杜仲叶中分离出一株能高产角质酶的菌种，鉴定分析证实该菌株是胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)，这是首次从植物病原真菌以外发现产角质酶的酵母菌，并对该菌株发酵产角质酶的条件进行优化。这一发现意义重大，因为酵母菌比植物病原菌安全许多，更利于大规模生产。

杀真菌素链霉菌AL-04的筛选与鉴定

李增波, 孙红艳, 赵静娴, 周剑武, 梁栋, 高晔

2014, 30(5): 155-161.

摘要 ( 290 )

PDF (8310KB) ( 407 )

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对13株来源于青藏高原土壤的放线菌进行活化，再分别采用琼脂扩散法、生长速率法、孢子萌发抑制法和离体叶片法筛选出一株抗菌活性高且抗性稳定的菌株AL-04。抗菌活性结果表明，该菌株对4种常见的土传病害病原真菌：辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. niveum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)都有较强的抑制效果，抑菌率均在70.0%以上，其中对辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)抑菌率高达93.0%。通过形态特征、生理生化特征分析和16S rDNA序列分析，将该菌株鉴定为杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)。

一株筛选自高寒草地木聚糖酶产生真菌的鉴定及酶学特性研究

芦光新, 陈秀蓉, 王军邦, 吴楚

2014, 30(5): 162-178.

摘要 ( 232 )

PDF (7165KB) ( 643 )

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为研究一株分离、筛选自高寒草地土壤中的真菌，采用ITS-rDNA基因序列分析法、液体摇瓶发酵法和传统微生物培养法，对供试菌株的分类学地位进行了确定，并对该菌株产木聚糖酶的酶学性质及其主要生物学特性进行了测定。结果表明，经ITS-rDNA基因序列分析法鉴定，供试菌株初步确定为Saccharicola bicolor。供试菌株S. bicolor可分泌木聚糖酶，且在pH为3.0-9.5时，酶活力相对稳定，表明S. bicolor所分泌的木聚糖酶具有一定的耐受碱性条件的能力。供试菌株S. bicolor在温度为35℃时生长较快，对5种碳源利用情况的先后顺序为：麦芽糖＞淀粉＞蔗糖＞糊精＞葡萄糖，对5种氮源利用情况的先后顺序为：蛋白质＞磷酸铵＞硫酸铵＞硝酸钠＞尿素。

培养基种类对花生毛状根株系生物量和白藜芦醇含量的影响

姚庆收, 姜吉刚, 武玉永, 梁乘榜

2014, 30(5): 174-178.

摘要 ( 244 )

PDF (3754KB) ( 397 )

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旨在研究不同培养基对花生毛状根株系生物量和白藜芦醇含量的影响。利用发根农杆菌R1601侵染花生的叶片，诱导毛状根，利用PCR技术检测毛状根。使用5种培养基(1/2MS、MS、MS+500 mg/L羧苄西林钠、B5和N6)分别培养同一个株系的花生毛状根，4周后利用高效液相色谱法(HPLC)测量毛状根生物量和白藜芦醇含量。结果显示，不同培养基对花生毛状根株系生物量的积累有显著差异，1/2MS培养基和MS培养基有利于花生毛状根株系生物量的积累。不同培养基对花生毛状根株系中白藜芦醇的含量有显著差异，B5培养基和N6培养基有利于花生毛状根株系中白藜芦醇的积累。

假单胞杆菌BS1转座突变及高产生物表面活性剂突变株初步筛选

侯巨梅, 韩巍, 国莉玲, 刘铜, 王彦杰

2014, 30(5): 179-183.

摘要 ( 209 )

PDF (3511KB) ( 350 )

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利用含转座子Tn917的温敏性质粒pTV1-OK转化假单胞杆菌BS1原生质体，成功获得3个稳定的转化子；通过Tn917诱导转座突变，产生大量突变体，构建了转座突变体库，采用特异引物对随机挑取的5株突变体进行PCR扩增，获得与预期大小一致片段，表明突变体基因组中有Tn917插入；通过对随机挑取24株突变体乳化(E24)性能测定，发现有一株突变体E24值达到67%，明显高于野生菌株。结果表明转座突变是假单胞杆菌BS1获得高产生物表面活性剂菌株的一种有效手段。

一株淡色生赤壳菌的生防作用分析及系统发育树构建

陈秀玲, 李景富, 张丽莉, 张俊峰, 王傲雪

2014, 30(5): 184-189.

摘要 ( 258 )

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保护地栽培面积的增加使果蔬病害的防治难度加大，生物防治手段越来越受到青睐。采用平板对峙法、扫描电镜法、5.8S rDNA-ITS序列分析及系统发育树构建对一株从草炭土中分离的菌株进行研究。该菌对番茄灰霉病、番茄叶霉病、番茄绵疫病、番茄黄萎病、番茄枯萎病、杨树烂皮病、杨树枯萎病和黑穗醋栗叶斑病均有抑制作用。扫描电镜显示，该生防菌对番茄灰霉病具有明显抑制作用。5.8S rDNA-ITS序列分析及系统发育树构建表明该菌为淡色生赤壳菌，为果蔬病害的生物防治提供了新的选择。

鲎素I对普通变形杆菌的作用研究

金元宝, 王英, 刘莉萍, 王倩, 金刚, 张丽君, 代建国,

2014, 30(5): 190-196.

摘要 ( 266 )

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旨在研究鲎素Ⅰ对普通变形杆菌的抑杀作用机制。利用鲎素Ⅰ对普通变形杆菌的抑杀浓度、壁膜通透性和电荷性、分泌蛋白酶活力的影响及其在培养基中的稳定性进行研究。结果显示，鲎素Ⅰ对普通变形杆菌的MIC和MBC值分别为40-80和80 μg/mL，它也能增加普通变形杆菌的壁膜通透性及其所带的正电荷。在鲎素Ⅰ浓度≤40 μg/mL时，普通变形杆菌分泌的蛋白酶活力有所增加，而≥60 μg/mL时，则呈下降趋势。在普通变形杆菌培养环境中的鲎素Ⅰ含量会降低。结果证明，鲎素Ⅰ能对普通变形杆菌产生抑杀作用，其抑菌机制与破坏细菌壁膜的通透性有关。

小鼠DEAF1多克隆抗体的制备及应用

朱小慧, 盛德乔, 康乐, 伍仙凤, 邵文, 刘晓艳

2014, 30(5): 197-201.

摘要 ( 262 )

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为研究DEAF1在小鼠胰淋巴结中的内源性表达及调控外周组织抗原基因表达的机制，将DEAF1的原核表达质粒转化至E. coli BL21中，诱导获得重组DEAF1蛋白；经尿素梯度裂解包涵体纯化获得的重组DEAF1蛋白分期免疫Balb/C小鼠，获取鼠抗DEAF1的多克隆抗血清；采用ELISA、Western blot、免疫荧光、免疫沉淀分别鉴定其效价﹑特异性﹑敏感性和亲和力。结果表明，抗血清可与抗原发生特异性的免疫反应，可用于检测DEAF1的表达及荧光定位，抗血清与抗原有较高的亲和力。结果证明所制备的多克隆抗血清具有较高的特异性﹑敏感性和亲和力。

UL27、UL29基因shRNA表达载体的构建及对HSV-2的干扰效应研究

吕延成, 潘晓瑜, 黄畅, 丁娟

2014, 30(5): 202-209.

摘要 ( 267 )

PDF (5293KB) ( 474 )

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探讨Ⅱ型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type 2，HSV-2)UL27、UL29基因联合靶向siRNA对HSV-2复制的影响。构建UL27、UL29基因的siRNA的重组表达载体并转染293细胞，通过实时荧光定量PCR技术和蛋白质印迹方法检测UL27、UL29基因的表达，终点滴定法检测细胞上清液中的各组病毒滴度，MTT法检测细胞的存活率。结果显示：(1)成功构建短发夹RNA(shRNA)重组表达载体。(2)转染后48 h，与空白组(空载体)相比，UL27 shRNA75组对UL27基因mRNA的抑制率为75.17%(P<0.05)，UL29 shRNA1461组对UL29基因mRNA抑制率为66.08%，具有显著性差异(P<0.05)。UL27 shRNA75联合UL29 shRNA1461联合干扰组对UL27基因抑制率约为91.28%，UL29基因表达抑制率约为80.40%，与空白组比较具有显著性差异(P<0.05)。(3)终点滴定法结果显示单干扰组和联合干扰组可不同程度降低上清液中的病毒感染滴度，与空白组比较差异性显著(P<0.01)。(4)Western blot检测目的基因蛋白，单干扰组与联合干扰组可不同程度降低目的基因蛋白的表达，其中UL27 shRNA75+UL29 shRNA1461联合干扰组能显著抑制相应的蛋白表达水平，蛋白表达量明显减少，与单干扰组相比具有显著差异(P<0.05)。(5)经MTT法检测，UL27 shRNA75、UL29 shRNA1461、UL27 shRNA75+UL29 shRNA1461联合干扰组的细胞存活率明显提高，差异有显著意义(P<0.05)。构建的pGPU6/GFP/Neo-UL27、pGPU6/GFP/Neo-UL29重组表达载体，能在体外细胞水平上不同程度的干扰HSV-2 UL27、UL29基因表达，UL27、UL29联合干扰效率更高，抑制HSV-2在HEK293细胞中复制。

针对ALK4基因的TALEN质粒构建与活性鉴定

曾凡才, 顾洪, 王轲, 周红

2014, 30(5): 210-216.

摘要 ( 285 )

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旨在利用类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)技术构建具有活性的敲除类激活素激酶受体4(Activin receptor-like kinase 4，ALK4)的TALEN质粒。利用TALEN在线设计工具，根据TALEN设计原则和ALK4剪接异构体的共同序列确定基因敲除的靶位点、TALEN识别序列和用于活性验证的限制性酶切位点。利用质粒文库试剂盒快速构建TALEN质粒，并通过酶切、测序和BLAST比对加以验证。应用脂质体转染法将构建质粒导入HEK293T细胞，通过共转染的pEGFP-N1质粒判断转染效率。利用嘌呤霉素进行阳性筛选后提取基因组DNA，PCR扩增靶序列，HhaⅠ酶切纯化后的PCR产物。结果显示，来自转染TALEN质粒细胞基因组的PCR产物的酶切效率明显下降，提示部分细胞的ALK4基因发生了突变。首次成功构建了在HEK293T细胞中有活性的TALEN质粒。

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