生物技术通报

欧盟新型植物育种技术的研究及监管现状

杨艳萍, 董瑜, 邢颖, 袁建霞

2016, 32(2): 1-6. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.032

摘要 ( 364 )

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近年来多种具有较大应用前景的新型植物育种技术，如寡核苷酸定点诱变、锌指核酸酶技术、同源转基因技术、RNA介导的DNA甲基化、反向育种、转基因砧木嫁接和农杆菌浸润等在欧洲发展迅速。这些新技术比常规育种技术更具特异性和针对性，可为育种家提供准确和有效的方法。文献计量学研究表明，农杆菌浸润和RNA介导的DNA甲基化等技术在欧盟研究中使用率较高；德国、英国是欧盟新型植物育种技术研究的重要国家。目前，欧盟正在讨论由这些新技术产生的植物是否属于其监管体系，尤其是2001/18/EC指令中定义的转基因生物。相关机构也纷纷发布一系列报告，对新技术产生的植物及产品的分类监管问题进行了广泛讨论。欧洲食品安全局分别对同源转基因(cisgenesis/Intragenesis)和锌指核酸酶(ZFN-3)等技术产生的植物进行风险评估，并认为Cisgenesis与常规育种技术植物的风险程度相当，Intragenesis和常规转基因技术获得的植物均可能造成新风险；ZFN-3技术比常规转基因技术具有更小的风险。

植物热激蛋白研究进展

栗振义, 龙瑞才, 张铁军, 杨青川, 康俊梅

2016, 32(2): 7-13. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.003

摘要 ( 450 )

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热激蛋白(heat shock protein，HSP)是一种普遍具有抗逆作用的保护蛋白，主要通过分子伴侣形式与其他蛋白结合来保护蛋白稳态及修复变性蛋白从而维持植物内环境的稳定，在植物生长发育及逆境调控过程中发挥重要作用。植物热激蛋白分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSP 五大家族，每一家族含有多个热激蛋白。随着对HSP的不断研究，已有大量文献报道了不同物种中的热激蛋白，在此基础上通过阐述植物热激蛋白的结构、功能以及调控作用，旨在为进一步认识热激蛋白及其作用机理提供有价值的参考。

土壤酸杆菌门细菌生态学研究进展

王光华, 刘俊杰, 于镇华, 王新珍, 金剑, 刘晓冰

2016, 32(2): 14-20. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.002

摘要 ( 711 )

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酸杆菌是土壤中一类重要的细菌类群。基于16S rRNA基因序列分析发现，酸杆菌一般占细菌总量的20%左右，甚至高达50%以上，表明酸杆菌在土壤生态过程中起到重要的作用。从植被、海拔高度、氮肥管理及二氧化碳升高对土壤酸杆菌分布的影响，以及酸杆菌根际效应等几方面论述了土壤酸杆菌门细菌生态学研究进展；综合分析揭示出不同分类单元酸杆菌细菌分布与环境因子间的关系；阐述了部分酸杆菌细菌的潜在生态功能。最后指出在土壤酸杆菌研究中应强化分离培养、细化分子生态、采用宏基因组学和单细胞测序新技术的重要性。

不同紫细菌光合基因表达调控机制异同

邓春浩, 孙良昱, 陈坤明

2016, 32(2): 21-29. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.005

摘要 ( 338 )

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紫细菌是一类可以进行不放氧光合作用的原核微生物，可以利用光能产生ATP并为其生长代谢提供能量。其光系统由一系列色素及蛋白组成的复合体组成，并由一系列光合基因如puc、puf、bch和crt等编码。紫细菌光合相关基因的表达主要受到外界氧化还原信号及光照的影响，然而不同紫细菌光合基因表达调控机制具有明显的多样性。以球形红细菌与沼泽红假单胞菌为重点，介绍了近年来几种光合基因表达调控系统如PpsR/CrtJ型调控蛋白、双组分磷酸化调控系统、CRP-FNR型调控蛋白等在紫细菌中的研究进展。通过系统深入分析这些调控通路在不同紫细菌中的特征及功能，发现不同菌株中类似调控通路通常具有相似功能，但又各具特点。旨为对进一步了解紫细菌光合基因表达调控机制并为其应用研究提供参考。

PGF_2α诱导的早期反应基因参与黄体退化的研究进展

茆达干, 郭南南, 邝美倩

2016, 32(2): 30-37. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.001

摘要 ( 287 )

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哺乳动物卵巢黄体的存留对母畜生殖活动具有重要的作用。前列腺素F_2α(PGF_2α)是哺乳动物的主要溶黄体因子，通过与其受体结合，激活一系列早期反应基因，进而诱导黄体的功能性(孕酮水平下降)和结构性退化(细胞程序性死亡)。虽然PGF_2α已被广泛应用于动物的同期发情、分娩控制和繁殖障碍治疗等方面，但其溶解黄体的分子机制尚未完全明确。综述了PGF_2α受体及其诱导的早期反应基因参与卵巢黄体退化的研究进展，旨在为进一步研究PGF_2α诱导黄体退化的分子机制提供理论依据。

生物乙烯研究进展

孙梦婷, 范晓蕾, 郭荣波, 邱艳玲, 赵晓娴

2016, 32(2): 38-45. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.004

摘要 ( 432 )

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乙烯是世界需求量最大的化工原料，被广泛用于制造塑料制品、纺织品及其他化工产品。目前，最常用的生产乙烯的方式是通过石油裂解制备乙烯，但其存在生产成本高、环境不友好等弊端，这为生物乙烯的发展带来契机。生物乙烯合成以CO₂或生物质等可再生能源为原料，具资源节约、环境友好的优势。描述了生物乙烯合成的两种途径──间接和直接合成途径，着重论述微生物通过乙烯合成酶(EFE)直接合成乙烯的原理，描述了EFE的结构、序列及催化机制，列举了数个工程菌异源合成乙烯的成功案例，提出提高产量的策略，并对微生物制乙烯的发展前景进行展望。

多胺在癌症治疗中的作用及机制

马容, 陈咨余, 姜冬梅, 康波

2016, 32(2): 46-50. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.006

摘要 ( 369 )

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多胺是真核细胞生长及发育的必需物质，多胺代谢功能的紊乱与癌症发生密切相关。研究表明，抑制多胺生物合成途径的限速酶鸟氨酸脱羧酶和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶能有效缓解癌症的发展。此外，利用多胺跨膜转运系统的特异性，可将多胺类似物和缀合物转运至细胞内，通过降低细胞内多胺水平，调节组蛋白乙酰化和甲基化水平，促进肿瘤细胞凋亡等途径发挥其抗癌治疗的作用。综述了通过抑制多胺合成酶以及利用多胺类似物和缀合物治疗癌症的研究进展，以期为今后利用多胺代谢途径靶向治疗癌症的研究提供参考。

土壤汞污染生物修复技术研究进展

王立辉, 严超宇, 王浩, 张翔宇

2016, 32(2): 51-58. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.007

摘要 ( 308 )

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汞作为常温下唯一的一种液态金属，在环境中分布十分广泛，极易造成土壤污染。生物修复是一种用于土壤汞污染治理的重要修复技术，该技术因具有修复成本低、绿色环保等优点而受到重视。对现有的土壤汞污染生物修复技术进行了评述，主要涉及植物修复技术、微生物修复技术和动物修复技术的研究和应用情况：植物修复技术主要研究汞在植物体内代谢机理和规律，微生物修复技术研究侧重于利用外源微生物降解土壤中汞，动物修复技术研究较少，目前仅见有关蚯蚓富集汞的报道。现代生物修复技术已经发展成为一门包括土壤化学、植物生物学、生态学、土壤微生物学、分析化学及分子生物学等多学科融合性技术，借助这些学科力量可以对植物提取汞根际微界面过程和植物体内微界面过程、微生物和动物汞富集机制有更深刻的认识。综述最后对目前土壤汞污染生物修复技术主要研究方向进行总结和归纳，明确了汞污染生物修复领域存在的几大问题以及研究方向。

miRNA qPCR检测方法研究进展及其应用

冯世鹏

2016, 32(2): 59-69. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.008

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miRNA是目前国际研究的热点领域之一，而miRNA表达检测是miRNA研究的基础内容。针对miRNA序列短小的特点，开发出了多种检测方法，其中miRNA qPCR定量检测是应用最广泛的方法。就miRNA抽提，miRNA qPCR定量检测原理及miRNA qPCR定量检测流程包括引物设计、反应体系设置、内参基因筛选等方面进行了深入探讨，并对miRNA定量检测研究方法的发展趋势进行了展望，以期为研究者进行miRNA qPCR定量检测提供参考。

黄瓜细菌性角斑病PMA-qPCR检测方法的建立和应用

孔维文, 李云龙, 王敬琦, 刘婷婷, 陈南, 金一, 何晓青

2016, 32(2): 70-75. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.009

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黄瓜细菌性角斑病为黄瓜常见的一种细菌病害，其致病菌为丁香假单胞菌黄瓜致病型。目前该病在全球范围内已经造成严重的经济损失。针对于PMA染料能够区分细胞死活的特性将其与荧光定量PCR技术结合。(1)通过比对分析GenBank中该菌种不同株的gap1基因序列，找出gap1基因的保守区并根据保守区基因序列设计了一对特异性引物Dxf1和Dxr1，以其他5种非丁香假单胞菌基因组为模板进行实时定量PCR扩增，只有丁香假单胞菌有扩增曲线，证明引物非常特异。(2)以gap1基因为目的基因构建其克隆载体，将克隆载体导入到大肠杆菌感受态细胞中进行培养，使其大量复制。再将质粒提取，以提取的质粒作为标准品，根据其浓度将其稀释为5×10¹-5×10⁷7个梯度绘制标准曲线，获得的扩增效率为96.6%，并做组内重复和组间重复，变异系数均在2%内，证明标准曲线重复性良好。(3)将构建好的方法用于实际样品的检测，得到的Ct值为27.99，根据标准曲线所得的起始模板与Ct值之间的线性关系公式，检测到100 mg患病叶片中含有的菌体为7.69×10²拷贝。研究表明，该方法可以快速鉴定并检测实际样品中的活的致病菌的数量，为黄瓜细菌性角斑病的防控提供技术支持。

三种检测内源性基因修饰方法比较

李炜杰, 杨娇, 何高明, 王立民, 皮文辉, 周平

2016, 32(2): 76-83. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.010

摘要 ( 372 )

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为获得准确的突变信息，除直接测序外，实验初步确定了3种人工核酸酶生物学活性检测方法。利用Surveyor nuclease、T7E1(T7 Endonuclease 1)和HRM(High resolution melt)，均以变性退火突变型和野生型DNA序列形成扭曲的双螺旋DNA(distorted duplex DNA)为基础的3种人工核酸酶生物学活性检测方法，确定目标位点是否发生突变。实验成功检测出作用于绵羊MNST基因第一外显子的CRISPR/Cas9和第三外显子的TALEN目标位点发生突变，并对3种检测方法的结果和特点进行了分析比较，得出3种检测方法的优缺点，为实验室分析确定细胞利用非同源末端连接修复DNA双链断裂结果提供参考。

人IL-24基因原核表达载体的构建及蛋白的表达纯化

喻放, 杨忠华, 范汉东, 左振宇

2016, 32(2): 84-89. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.011

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构建人白细胞介素24(IL-24)原核表达载体并利用ELP-Intein系统表达纯化可溶性的IL-24蛋白。通过PCR扩增不含信号肽的人IL-24基因，将IL-24基因插入pET-ELP-Intein质粒构建重组表达载体pET-ELP-Intein-IL-24。将重组质粒转化至E.coli BLR(DE3)，20℃下经IPTG诱导表达。利用ELP蛋白在不同温度下发生相变的特点和Intein蛋白的自切割反应纯化可溶性IL-24蛋白，将纯化得到的IL-24蛋白进行Western blot鉴定。用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测IL-24蛋白的生物学活性。成功构建了重组表达载体pET-ELP-Intein-IL-24，第一次通过原核表达方法表达并纯化出了可溶性的IL-24蛋白。Western blot检测显示目的蛋白能与IL-24抗体特异性结合，表明纯化出的蛋白确实为IL-24蛋白。细胞凋亡检测实验证明IL-24蛋白能显著地诱导hepG2细胞发生凋亡。

陆地棉GhPYR1基因的克隆和功能分析

刘妍, 孟志刚, 孙国清, 王远, 周焘, 郭三堆, 张锐

2016, 32(2): 90-99. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.012

摘要 ( 288 )

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植物激素脱落酸(Abscisic acid，ABA)在植物应对干旱、盐碱等逆境胁迫以及植物种子萌发、根伸长、芽休眠等阶段发挥重要作用。PYR/PYL/RCAR蛋白家族是ABA受体，与ABA结合后能够启动ABA信号传导通路，诱导ABA应答基因的表达。利用电子克隆和RT-PCR技术从陆地棉中克隆了GhPYR1基因，其编码的GhPYR1蛋白与拟南芥中AtPYR1蛋白相似度为73%。将GhPYR1蛋白序列与拟南芥14个PYR/PYL/RCAR家族成员蛋白序列进行比对并构建进化树，发现它与拟南芥PYR/PYL/RCAR蛋白亚家族III亲缘关系最近。过表达GhPYR1基因的T₃代拟南芥在外源ABA处理下，其种子萌发和初期根生长均滞后于野生型，表现出对ABA更加敏感；高盐和干旱胁迫对转基因种子的萌发抑制更强烈，但苗期胁迫处理下转基因拟南芥的长势却明显优于野生型；同时在外源ABA诱导条件下ABA应答基因RD29A、RAB18的表达量较野生型有明显提高。以上结果说明GhPYR1基因编码的蛋白是ABA的受体，过表达该基因能够提高植物对ABA的敏感性和增强应对逆境胁迫的能力。

牦牛GDF9和BMP15基因的克隆、表达分析及miRNA研究

李明霞, 潘和平, 阎萍, 吴晓云, 王英杰

2016, 32(2): 100-108. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.013

摘要 ( 315 )

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以牦牛GDF9和BMP15基因为研究对象，采用PCR方法分别克隆出GDF9和BMP15的两个外显子片段，RT-PCR方法分析了GDF9和BMP15及靶定miRNA在各组织中的表达情况。实验结果显示，克隆扩增获得外显子区进行生物信息学分析。牦牛GDF9基因外显子片段长分别411 bp和1 082 bp，编码453个氨基酸；BMP15基因外显子片段长分别为323 bp和802 bp，编码372个氨基酸。GDF9编码蛋白是亲水蛋白，含有一个信号肽和15个潜在磷酸化位点；BMP15编码蛋白是亲水蛋白，不含信号肽，有6个潜在磷酸化位点。通过实时荧光定量PCR方法分析牦牛GDF9和BMP15基因在不同组织中的表达量，结果表明GDF9在卵巢和子宫中表达相对较高，且卵巢表达显著高于其他组织，心、肾、胰和脾中无表达。BMP15仅在卵巢中表达。TargetScan预测靶定牦牛GDF9和BMP15基因的靶定miRNA，分析GDF9靶基因bta-miR-193a-3p和bta-miR-193b在心、脾、肺、肾和子宫中的表达量，结果显示bta-miR-193a-3p脾中表达量显著高于其他组织，但在心、肺和子宫中均不表达。bta-miR-193b在心和肾中没检测到表达，在肺中的表达量显著低于脾和子宫中。

香鱼精氨酸酶II基因的cDNA克隆及其表达与鳗弧菌感染的相关性

丁斐斐, 李长红, 陈炯, 张琪

2016, 32(2): 109-115. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.014

摘要 ( 293 )

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精氨酸酶II(arginase II，Arg-II)是精氨酸酶的一种，不仅可以参与机体尿素循环，还与机体病理过程密切相关。通过香鱼(Plecoglossus altivelis)单核/巨噬细胞转录组测序获得香鱼Arg-II基因全长cDNA序列，结果表明，Arg-II基因由4 707个核苷酸组成，包含一个大的开放阅读框，编码348个氨基酸，预测分子量为38.09 kD，等电点为6.15。氨基酸序列多重比对结果显示，香鱼Arg-Ⅱ具有典型的Arg-Ⅱ结构特征，与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)Arg-Ⅱ同源性最高，为85.3%；系统进化树分析表明，鱼类Arg-Ⅱ形成一个大簇，香鱼Arg-Ⅱ与虹鳟Arg-Ⅱ进行相关性最高。实时荧光定量PCR(quantitive real-time PCR，qRT-PCR)结果显示，香鱼Arg-Ⅱ基因mRNA主要在健康香鱼肝、脑、头肾和单核/巨噬细胞中表达；鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后，香鱼肝、脑、头肾和单核/巨噬细胞Arg-Ⅱ基因mRNA的表达量显著上调。综上，香鱼Arg-Ⅱ基因的表达与鳗弧菌感染紧密相关，揭示其可能在鱼类抗感染免疫应答中发挥重要作用。

黑曲霉C112纤维二糖酶基因的克隆与生物信息学分析

朱永瑞, 曾柏全, 曾磊, 刘辉

2016, 32(2): 116-122. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.015

摘要 ( 305 )

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以紫外诱变获得的高产纤维素酶黑曲霉C112菌株为模板，采用RT-PCR技术克隆黑曲霉C112的纤维二糖酶基因bgl(GenBank登录号：KP307454)；该基因全长2 934 bp，含有非编码序列，编码860个氨基酸，等电点为4.70，核酸序列与数据库的Aspergillus niger(GenBank登录号JX982101.1)同源性达到了99%；生物信息学分析表明，纤维二糖酶为具有一定亲水性的稳定酸性分泌蛋白；二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲为结构元件；该基因经IPTG 诱导重组蛋白表达，SDS-PAGE 检测结果表明，重组表达产物的相对分子量约为93.3 kD，与预期相符；纤维二糖酶在大肠杆菌BL21中胞内融合表达，重组蛋白pNPG酶活为5.847 U/mL，最适反应温度为50℃，最适pH值为5.0。

法夫酵母中产类胡萝卜素特性与其合成相关基因表达关系的研究

郑晨华, 杜希萍, 李利君, 李天丽, 曹樱, 倪辉

2016, 32(2): 123-130. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.016

摘要 ( 269 )

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为研究法夫酵母中类胡萝卜素合成代谢调控机理，通过高效液相色谱法和实时定量PCR技术分别对JMU-VDL668和JMU-N3法夫酵母菌株中类胡萝卜素和类胡萝卜素合成相关基因的表达差异进行分析，并研究了在JMU-VDL668菌株培养过程中添加β-胡萝卜素对其产虾青素的影响。结果显示，法夫酵母类胡萝卜素代谢途径的关键酶crtE, crtYB, crtI和crtS基因在JMU-VDL668菌株中的表达水平整体低于JMU-N3菌株，而JMU-N3菌株中没有检测到crtR基因的表达。在JMU-VDL668菌株培养过程中添加β-胡萝卜素发现，在72 h和96 h添加时能促进虾青素的合成，其中96 h添加时所得虾青素比对照组提高了83%。结果表明，这两株菌的产类胡萝卜素特性与类胡萝卜素合成相关基因的表达量存在一定的正相关关系，且JMU-VDL668菌株中总类胡萝卜素细胞产率在一定范围内，可能存在反馈调节机制。

嗜酸氧化亚铁硫杆菌硫酸盐同化相关基因的鉴定与分析

郑春丽, 王丹, 张礼, 陈敏洁, 马宏伟, 姜志艳

2016, 32(2): 131-139. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.017

摘要 ( 210 )

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旨在鉴定和分析嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)ATCC 23270硫酸盐同化相关的基因。首先利用生物信息学的方法分析A.ferrooxidans ATCC 23270基因组中可能参与硫酸盐同化的基因，通过反转录、凝胶电泳等技术手段对可能参与编码半胱氨酸(Cys)操纵子的几个候选基因cys JI、cys H、cys D-2、cys N、cys D-1和cys NC进行共转录鉴定，并对其关键的基因进行体外克隆、表达、纯化重组，同时进行功能验证和酶活测定。结果分析表明，半胱氨酸(Cys)操纵子的候选基因cys D-1和cys NC共转录，Cys JI、cys H、cys D-2、cys N共转录。初步确定了A.ferrooxidans ATCC 23270硫酸盐同化可能的基本代谢路径，探索了半胱氨酸(Cys)操纵子的调控机制。

一株耐高温菌CICC 10853的分离和鉴定

都海渤, 张欣, 李赞, 刘毅, 刘波, 李金霞, 姚粟, 程池

2016, 32(2): 140-145. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.018

摘要 ( 232 )

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从斜面培养基中分离到一株耐高温菌CICC 10853，对该菌株的分类地位进行了研究。通过形态学、生理生化特征、16S rRNA和recN基因序列分析的多相鉴定技术，将其鉴定为噬热地芽胞杆菌(Geobacillus thermoleovorans)，为后续对该菌的生物学功能研究奠定基础。

一株新的染料甲基红降解菌株 Paracoccus sp.L-4的分离、鉴定及其脱色特性研究

陈亮, 王莉

2016, 32(2): 146-151. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.019

摘要 ( 253 )

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从副球菌属首次分离到一株有较强甲基红降解能力的菌株Paracoccus sp.L-4，在LB培养基中，16 h内使100 mg/L培养液甲基红降解掉91.74%，2 d 内可使甲基红降解率近达100%。该菌株降解甲基红适宜的温度和pH值范围分别为25-30℃、pH6.0-7.0，Zn²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Ag⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Fe²⁺ 对甲基红的降解有明显抑制作用。菌株L-4在好氧和缺氧条件均能较好降解甲基红，装液量≤100 mL时脱色率随装液量增加而减少，装液量≥125 mL时，12 h时降解率仍大于40%。菌株L-4在染料废水的生物处理方面有一定的应用价值。

草酸青霉菌生产纤维素酶的反应条件优化

李洋高晓蓉张健

2016, 32(2): 152-157. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.020

摘要 ( 250 )

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纤维素酶在生物能源、纺织、饲料和造纸工业等具有重要作用，筛选高效微生物生产菌株，优化最佳产酶工艺，是获得该产品的有效途径。从含有落叶腐木和腐烂秸秆的土壤中筛选出一株高效纤维素降解菌，采用形态学观察及核糖体保守序列分析确定该菌株分类地位，对菌株最适发酵初始pH、最适碳源、氮源及不同表面活性剂选择添加进行最佳产酶条件优化。形态学结合ITS(Internal Transcribesd Spacer)基因序列系统发育学分析确定分离的菌株其为草酸青霉菌，命名为Penicillium oxalicum JG。该菌株以初始pH2.0-3.0，CMC-Na为碳源，豆粉为氮源时，产纤维素酶能力达到最大。不同表面活性剂对菌株产酶影响的结果发现，来源广泛、价格相对较低廉的卵磷脂对草酸青霉菌具有明显的产酶促进作用，发酵液中滤纸酶(FPA)、β-1，4-内切葡聚糖酶(CMCase)和β-葡萄糖苷酶(BGL)活力分别提高72.9%、20.8%和33.6%。草酸青霉菌JG可在酸性初始条件下发酵生产复合纤维素酶，卵磷脂可明显提高其产酶活性。

蚕蛹超声辅助常温脱脂工艺条件优化

左振宇, 喻放, 黄艳鸿, 王家怡, 李凌凌

2016, 32(2): 158-164. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.021

摘要 ( 191 )

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脱脂是蚕蛹精制过程中的重要环节，脱脂过程中保持蚕蛹蛋白的活性十分必要。旨在对蚕蛹超声辅助常温脱脂工艺进行研究，采用响应面分析法对工艺条件进行优化，并建立相应的预测模型。单因素实验和响应面法优化得到蚕蛹超声辅助常温最佳脱脂工艺为：石油醚-丙酮(3:7)为溶剂，液料比11 mL/g，超声功率125 W、超声时间27 min，温度40℃左右；在该脱脂条件下，蚕蛹脱脂率为(96.8±0.8)％。各因素对蚕蛹脱脂率的影响程度由强至弱依次为：液固比>超声时间>超声功率。溶剂类型和液固比是影响蚕蛹脱脂效率的决定性因素，超声辅助脱脂具有脱脂温度低，脱脂时间短，物质活性不易破坏，脱脂率高的优点。

γ-谷氨酰转肽酶补料法合成L-茶氨酸工艺研究

傅嘉懿, 陈晟, 吴敬

2016, 32(2): 165-171. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.022

摘要 ( 209 )

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对γ-谷氨酰转肽酶酶法制备L-茶氨酸的工艺进行优化。通过恒速补料的策略，以200 mmol/L L-谷氨酰胺和2 mol/L乙胺盐酸盐作为初始底物，37℃、pH10.0条件下反应，每2 h补加100 mmol L-谷氨酰胺，反应14 h，最终L-谷氨酰胺底物总浓度为900 mmol/L，L-茶氨酸的生成量达到573.2 mmol/L，转化率达到63.7%，生产强度为40.9 mmol/(h·L)。采用变速流加的工艺，以同样的初始条件进行反应，每2 h补加L-谷氨酰胺至初始浓度200 mmol/L，反应15 h，最终L-谷氨酰胺总浓度为600 mmol/L，L-茶氨酸的生成量达到445.8 mmol/L，转化率为74.3%，生产强度为29.7 mmol/(h·L)。

一氧化氮对干旱胁迫下白菜幼苗微管蛋白的影响

马晓丽, 冀瑞萍

2016, 32(2): 172-177. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.023

摘要 ( 190 )

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旨在探讨一氧化氮对干旱胁迫后白菜叶片微管蛋白的影响，以津育11白菜种子为实验材料，分别采用15、18、21、24和27 g/mL 5种不同浓度的PEG6000溶液对7日龄白菜幼苗进行模拟干旱处理，通过紫外分光光度计和SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳研究不同处理组白菜幼苗叶片微管蛋白含量的差异，确定PEG6000最佳处理浓度为27 g/mL。50、100和150 μmol/L 3个不同浓度的一氧化氮对PEG6000处理组进行熏蒸，观察不同处理组白菜幼苗叶片微管蛋白含量的变化差异。结果显示，与对照组相比不同浓度PEG6000对白菜幼苗叶片微管蛋白含量都呈增加的趋势，经一氧化氮处理后降低；且在干旱胁迫的过程中白菜体内编码一氧化氮的基因表达量和一氧化氮含量都有大幅上调。因此，生理浓度的一氧化氮对干旱引起的微管蛋白的解聚有一定的缓解作用，减少胁迫对植株造成的损害。

中间锦鸡儿转录组EST-SSR标记系统性识别与引物筛选

王光霞, 杨杞, 王瑞刚, 李国婧

2016, 32(2): 178-184. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.025

摘要 ( 179 )

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旨在对中间锦鸡儿转录组数据库EST信息进行SSR系统性识别和初步验证，为进一步SSR分子标记开发提供依据。对HiSeq²⁰⁰⁰测序技术获得的中间锦鸡儿转录组Unigenes进行SSR位点搜索，共获得45 706个SSR位点，出现频率为10.38%，平均4.30 kb出现一个SSR位点。SSR重复类型以单核苷酸重复序列基元为主，所占比例为56.47%；二核苷酸、三核苷酸重复序列基元的数量所占比例分别是20.56%和21.04%；其他数量的基元所占比例仅为1.9%。多核苷酸重复类型中最多的为2核苷酸重复AG/CT；其次为3 核苷酸重复AAG/CTT。针对EST-SSR位点随机挑选了150 对引物，通过琼脂糖凝胶电泳进行PCR验证，其中有79对能获得扩增条带，21对引物扩增出单一条带，比例为14.0%。

PiggyBac转座系统在转mCherry基因斑马鱼上的应用

曹守莹, 白长存

2016, 32(2): 185-191. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.027

摘要 ( 266 )

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改造了PiggyBac转座子供体质粒5'-PTK-3'，将红色荧光蛋白基因(mCherry)定向插入其中，构建得到了基因捕获载体质粒：PTK-mCherry。通过显微注射，将PiggyBac 转座子供体质粒与PiggyBac转座酶mRNA共注射于斑马鱼受精卵中，筛选得到了mCherry的表达在时间及空间上均不同的转基因斑马鱼，统计表明mCherry在F0代中有8.2%的表达率，PiggyBac转座子能够在斑马鱼中进行有效转座且捕获到不同基因，有效实现突变体的筛选。

幼体发育速度不同的罗氏沼虾遗传结构分析

戴习林, 高翔, 王海洋, 明磊, 江宗冰, 丁福江

2016, 32(2): 192-197. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.026

摘要 ( 219 )

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旨在从分子生物学角度探讨造成罗氏沼虾幼体期发育速度不同步和生长差异的原因，利用8对微卫星引物对5组幼体发育速度不同的罗氏沼虾群体进行遗传多样性和遗传变异分析。结果显示，8对微卫星引物在5组罗氏沼虾群体中共检测到57个等位基因，各微卫星座位的等位基因数(Na)分别在5-10个之间，5组罗氏沼虾群体的遗传多样性无明显差异，同时两两群体间的遗传分化系数和遗传距离亦非常接近，均说明5组幼体发育速度不同的罗氏沼虾群体的遗传分化主要来自于个体间遗传差异。结合前期研究表明导致罗氏沼虾幼体发育速度的不同步和生长差异的原因并非遗传变异和环境差异。

脯氨酸和可溶性糖在南极冰藻低温适应机制中的作用

王以斌, 缪锦来, 姜英辉, 刘芳明, 郑洲, 李光友

2016, 32(2): 198-202. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.024

摘要 ( 203 )

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对低温胁迫下两种南极冰藻胞内的脯氨酸和可溶性糖含量的变化进行分析研究，探讨两种冰藻对低温的适应性机制。测定不同培养温度和培养时间下两种南极绿藻细胞中的脯氨酸和可溶性糖含量，获得其在低温下随温度和胁迫时间变化的趋势，分析其产生变化的原因。结果显示，温度越低，塔胞藻Pyramidomonas sp.L-1胞内的脯氨酸和可溶性糖含量增加越明显。-5℃，培养48 h后，脯氨酸含量是初始值的6.5倍，可溶性糖含量增加60%。衣藻Chlamydomonas sp.L-4胞内脯氨酸的含量同样为温度越低，胞内脯氨酸的含量越高；但随时间变化趋势与塔胞藻Pyramidomonas sp.L-1相反，含量随温度作用时间的增加出现减少的趋势。-5℃，48 h后脯氨酸含量基本维持不变，可溶性糖含量增幅达90%。结果表明, 脯氨酸和可溶性糖在南极冰藻的低温适应性机制中具有重要的作用，但在不同藻种中的作用机制不同。

阿尔巴斯绒山羊骨髓间充质干细胞体外分离培养及鉴定

马苏日古嘎, 彭航, 刘佳佳, 张亦婷, 桂花, 刘鹏霞

2016, 32(2): 203-210. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.028

摘要 ( 210 )

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探讨阿尔巴斯绒山羊骨髓间充质干细胞(Arbas cashmere goat bone marrow-derived mesenchymal stem cells，gBM-MSCs)体外分离培养，并对其生物学特性进行系统的鉴定，进一步深入分析体外诱导时多向分化相关基因动态表达情况。结果显示，原代培养的gBM-MSCs呈梭形或纺锤形、放射状排列的细胞集落，能够连续稳定传代至15代以上；免疫荧光及流式细胞术检测显示，gBM-MSCs表达间质系特异性表面标志物，如：CD13、CD29、CD44、CD106、CD90及CD166，不表达造血干细胞表面标志物CD45及CD34；体外诱导实验证实该细胞具有多向分化潜能，能够向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化；荧光定量PCR实验结果显示，gBM-MSCs多向分化相关基因的表达水平随着诱导天数的增加呈上升趋势。实验结果证实阿尔巴斯绒山羊骨髓中分离培养的细胞具备gBM-MSCs的生物学特性。

Leptin介导AMPK信号通路对猪皮下前脂肪细胞脂类代谢调控的研究

黄英, 杨明华, 孔令富, 郝美林, 高士争, 李永能, 赵素梅

2016, 32(2): 211-218. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.029

摘要 ( 166 )

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以体外培养的猪原代皮下脂肪细胞为研究材料，检测Leptin介导AMPK信号通路中基因表达水平，旨在阐明Leptin介导AMPK信号通路对脂肪代谢调控的分子机制。用0和100 ng/mL Leptin分别处理脂肪细胞48 h，油红O染色鉴定脂肪细胞，试剂盒测定细胞中甘油三酯和游离脂肪酸含量，Real-time PCR方法检测皮下前脂肪细胞中AMPK信号通路中基因表达水平。研究结果表明，皮下前脂肪细胞中，Leptin组甘油三酯含量均显著低于对照组(P<0.05)，表明Leptin可以降低细胞中甘油三酯和游离脂肪酸含量。Leptin组中AMPK信号通路中的基因lepR、AMPK、CPT-1基因的表达量均显著高于对照组(P<0.05)，ACC基因表达量显著低于对照组(P<0.05)，表明Leptin通过调控AMPK信号通路中基因表达，启动AMPK信号通路的信号传递。皮下前脂肪细胞中，lepR、AMPK和CPT-1基因表达量均与甘油三酯和游离脂肪酸含量呈显著负相关(P<0.05)；ACC基因表达量与甘油三酯和游离脂肪酸含量呈显著正相关(P<0.05)。结果表明，Leptin通过激活AMPK信号通路，降低ACC基因的表达量，提高CPT-1基因表达水平，促进甘油三酯分解及脂肪酸的氧化，降低细胞中甘油三酯和游离脂肪酸的含量。

GST-SUMO-MT融合蛋白在大肠杆菌中的自诱导表达

彭冬, 杨威, 王昭, 王席, 柳忠玉

2016, 32(2): 219-224. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.030

摘要 ( 275 )

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旨在考察在大肠杆菌中自诱导表达GST-SUMO-MT融合蛋白的可行性，并对自诱导培养条件及培养基成分进行优化，以提高蛋白产量。采用摇瓶培养，利用单因素和正交实验对工程菌自诱导的培养条件(诱导时间、诱导温度)和培养基组分(蛋白胨、酵母粉、甘油、葡萄糖、乳糖)进行优化，检测菌体浓度、可溶性目的蛋白的表达量。结果表明，自诱导培养基碳氮源的最优配比为：2% 蛋白胨、2% 酵母粉、0.3% 甘油、0.05% 葡萄糖和0.3% 乳糖。重组菌自诱导表达最优发酵条件为：采用两阶段温度控制，37℃培养3 h，25℃继续培养 13 h。此时可溶性目的蛋白的表达量和菌体浓度分别为 LB 培养基(IPTG 诱导)的 2.2倍和 2.3倍。

TALEN介导的CXCR4敲除肝癌细胞株的建立

张文美, 丁妍, 郭兴荣, 李东升, 赵万红, 王小莉

2016, 32(2): 225-228. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.031

摘要 ( 192 )

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通过TALEN打靶建立CXCR4的细胞株，旨在研究CXCR4对肝癌的影响。选用肝癌细胞株HepG2，采用转录激活样效应物核酸酶(TALEN)干扰细胞中CXCR4的表达。构建的CXCR4 TALEN质粒转入HepG2细胞，通过T7E1酶切确定打靶效率为40%，并通过测序筛选出了CXCR4敲除的单克隆细胞，免疫荧光和Western blot进一步证实CXCR4基因表达显著下调。

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2016, 32(2): 300.

摘要 ( 95 )

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