生物技术通报

巴西橡胶树响应乙烯利刺激的生理及其分子调控机制研究进展

位明明,李维国,高新生,黄肖

2016, 32(3): 1-11. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.002

摘要 ( 319 )

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生产中施用乙烯利刺激已成为提高橡胶树产量的重要手段, 并在天然橡胶生产中大面积推广应用。然而, 关于橡胶树响应乙烯利刺激的调控机制尚不清晰, 成为橡胶树新型刺激剂研制, 以及耐乙烯利刺激新品种选育中亟待解决的问题之一。综述了近年来橡胶树乙烯信号转导通路相关基因的研究现状, 橡胶树响应乙烯利刺激的生物学调控机制研究进展, 以及乙烯利刺激对橡胶树的副作用, 以期为深入研究橡胶树响应乙烯利刺激的分子机制提供参考。

细菌小RNA抗营养应激调控功能的研究进展

付竹青,喻云梅,温小军,袁伟曦,赵祖国

2016, 32(3): 12-17. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.003

摘要 ( 297 )

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细菌生存的环境复杂多变, 经常处于营养元素过剩或缺乏的状态。因此, 细菌必须及时准确地调节其基因表达以适应不断变化的营养环境, 才能得以生存。小RNA(small RNA, sRNA)是近年来在细菌中发现的一类RNA调控子, 在细菌应对营养应激的基因表达调控中发挥重要作用。就细菌sRNA的特点及其抗营养应激的作用进行综述。

植物颗粒结合淀粉合成酶(GBSS)基因的表达调控机制研究进展

苗红霞,孙佩光,张凯星,金志强,徐碧玉

2016, 32(3): 18-23. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.004

摘要 ( 416 )

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颗粒结合淀粉合成酶(granule-bound starch synthase, GBSS)是决定直链淀粉合成的关键酶, 单子叶植物GBSS包含两种同工酶, 分别是GBSSI和GBSSII, 双子叶植物只有GBSSII一种同工酶。GBSSI基因的表达主要控制种子、胚、胚乳等贮藏器官中直链淀粉的合成, 而GBSSII主要控制根、茎、叶等营养器官中直链淀粉的合成。综述了模式植物及农作物中GBSS基因表达调控机制的最新研究进展, 以期为其他植物GBSS基因的研究提供借鉴。

抗菌肽高效表达及生产优化研究进展

杨平,袁奕豪,杨晓莉,钟玥,廖于鑫,高荣

2016, 32(3): 24-30. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.005

摘要 ( 270 )

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抗菌肽是基因编码、经外界诱导产生的一类多肽。在抗生素引发“耐药性”难题的时代, 抗菌肽以广谱杀菌、不易产生耐药性、抗肿瘤、抗病毒等特点而拥有超越抗生素、造福人类的巨大潜能。然而, 天然抗菌肽还需进行增强抗菌性和稳定性、降低细胞毒性等改造, 并通过工业化改良实现大规模生产。因此现从抗菌肽改造设计、生产应用等最新研究做较为详细的综述。

CRISPR/Cas9系统的脱靶效应

尹珅,贺桂芳,赖方秾,谢凤云,马俊宇

2016, 32(3): 31-37. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.006

摘要 ( 471 )

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在细菌中发现的免疫系统CRISPR/Cas9, 已经成为最有效的基因工程编辑工具, 甚至大有希望可以治疗人类遗传性疾病。但是CRISPR/Cas9系统在使用时会产生严重的脱靶问题, 导致假表型和错误的解释。提高与靶点结合的高效率, 同时减少脱靶效应, 将是今后CRISPR/Cas9技术的挑战。综述关注与CRISPR/Cas9脱靶效应相关的内容, 总结了影响其靶点专一性的因素, 减少CRISPR/Cas9脱靶效应的可行性方法和设计工具等, 供大家学习讨论。

电镜技术在植物病害研究中的应用

马丹丹,邓雨青,周彦,周常勇,李中安

2016, 32(3): 38-43. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.007

摘要 ( 307 )

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电子显微镜(electron microscopy, EM)是20世纪最重要的发明之一, 其特有的高分辨率, 在植物病害检测、超微结构及形态观察中发挥了重要作用。对目前常用的透射电子显微镜, 扫描电子显微镜、环境扫描电子显微镜、扫描隧道显微镜及原子力显微镜等新型电镜的原理及其在植物病害研究中的应用作一介绍, 旨在为更好的运用电镜技术提供参考。

酶法合成RNA的相关技术研究进展

王静,潘孝明,刘宇,梁兴国

2016, 32(3): 44-51. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.008

摘要 ( 329 )

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近些年来RNA相关研究发展迅速, 从质和量两方面对RNA合成技术提出了更高的要求。RNA合成方法包括化学合成和酶法合成两种。目前已商业化的RNA化学合成法能够实现长度小于90个碱基的RNA合成, 但合成费用相对较高, 使许多研究难以展开。相对于化学合成, 酶法合成具有效率高、条件温和的特性, 能够合成长序列, 是一种高效、低耗的RNA合成方案。酶法合成的技术流程包括转录和加工两步, 其中转录的模型主要分为线性转录和滚环转录两种, 不同的模型产生的初始转录产物特性不同, 需要采用相应的加工方式对其进行处理才能获得准确的目的RNA产物。近年来研究者们不断地研究探索RNA的酶法合成, 发现并构建了多种转录模型和初始转录物的加工方案, 将从酶法合成RNA的转录模型和加工技术的原理、特点和问题等方面进行概述, 以期为后续酶法合成RNA的进一步研究和选择性应用提供参考。

利用分子标记技术改良粳稻不育系的柱头外露率

蔡之军,李金军,周德银,富昊伟

2016, 32(3): 52-57. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.009

摘要 ( 278 )

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提高粳稻不育系的柱头外露率是提高杂交粳稻制种产量最有效途径。通过杂交、回交等常规手段将籼稻中控制柱头外露率的QTLs(qPES3、qPES9及qPES12)导入粳稻, 通过系谱选育和分子检测技术试图选育高柱头外露率粳稻不育系, 旨在探索利用分子标记技术改良粳稻不育系柱头外露率的可行性。研究结果表明, 试验中获得的2个粳稻不育系为携带qPES3+qPES12的双聚体, 其柱头外露率及异交结实率表型值显示：调控籼稻高柱头外露率QTLs能够在粳稻背景中表达, 但存在基因型差异；分子标记辅助选择技术是改良粳稻不育系柱头外露率的有效手段。

一种简易的甘蔗叶组织PCR模板制备方法

崔学强,张树珍,冯翠莲

2016, 32(3): 58-62. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.012

摘要 ( 259 )

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以转基因甘蔗叶片为材料, 少量嫩叶经碱并短暂高温处理, 再中和, 形成裂解混合物。直接以此为模板, 转基因甘蔗外源基因bar、KP4、Cry1Ac-2A-gna融合基因及内源基因Shactin基因为靶基因, PCR扩增结果稳定、准确、重复性强, 完全可以达到常规CTAB法提取的DNA扩增效果。用此方法制备的模板室温下2周之内, 4℃、-20℃下一个月之内结果不变。经多种外源基因PCR反应的反复验证, 证实了这种方法在转基因甘蔗检测中的广泛适用性。该方法快速制备PCR模板, 无需DNA提取过程, 具有使用样品量少, 成本低、简便、快捷等优点。

铁皮石斛茎段快繁技术的研究

欧阳凡,董文宾,付瑜,樊成,李雨虹

2016, 32(3): 63-67. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.010

摘要 ( 276 )

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通过组织培养建立铁皮石斛快繁体系, 为更好利用开发铁皮石斛提供原料。以铁皮石斛茎段为外植体, 研究不同种类和浓度配比的激素和天然添加物对组培过程中不定芽的诱导和丛生芽的增殖的影响, 筛选出各阶段最适培养基。结果表明, 不定芽诱导最适激素配比为NAA 1.0 mg/L + BA 2.0 mg/L, 丛生芽增殖最适培养基为NAA 0.5 mg/L + BA 1.0 mg/L +香蕉100 g/L +活性炭100 g/L。以茎段为途径建立铁皮石斛快繁体系高效稳定的获得组培苗是可行的。

不同生物修复技术处理油污土壤的效果研究

孙先锋,杨波波,朱欣洁

2016, 32(3): 68-72. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.011

摘要 ( 238 )

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为了探究生物修复技术对油污土壤的处理效果, 研究采用生物刺激和生物强化修复技术研究在修复过程中石油烃组分含量、表面张力、微生物数量、酶活性指标的变化。结果表明：生物刺激在降解饱和烃、降低土壤中溶液表面张力、增加微生物数量、提高土壤酶活性方面优于生物强化, 而生物强化则对于石油烃中难降解的芳香烃有很好的降解效果, 两者各有优势。

抗除草剂bar基因与EPSPS基因在转基因甘蔗中的应用研究

王文治,杨本鹏,蔡文伟,熊国如,冯翠莲,王俊刚,武媛丽,沈林波,张树珍

2016, 32(3): 73-78. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.012

摘要 ( 200 )

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通过农杆菌介导法, 分别将bar基因和EPSPS基因导入到甘蔗中, 分别获得了抗草铵膦和草甘膦两种除草剂的转基因甘蔗。通过直接喷洒田间施用浓度的草铵膦和草甘膦除草剂, 证明了转基因甘蔗T₀、T₁代、宿根1代和宿根2代外源基因遗传稳定, 且均具有稳定的耐除草剂的功能。因此转耐除草剂基因的甘蔗, 可以与转耐除草剂基因的玉米、大豆、油菜和棉花一样, 有广阔的应用前景。

甘蔗己糖转运蛋白基因ShHXT6的亚细胞定位及表达

马晓雯,赵婷婷,王俊刚,张树珍,杨本鹏

2016, 32(3): 79-86. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.013

摘要 ( 231 )

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通过NCBI公布的同源物种设计特异性引物克隆出甘蔗己糖转运蛋白基因ShHXT6。该基因cDNA长1 929 bp, 其开放阅读框编码490个氨基酸。蛋白分子量为53.87 kD, 理论等电点为9.44。该基因编码的氨基酸与玉米、狗尾草和水稻的己糖转运蛋白的一致性分别为80.85%、76.89%和72.86%等。系统进化树分析表明, ShHXT6氨基酸与玉米HXT6蛋白一致性非常相近。ShHXT6在未成熟组织中表达较高, 尤其是未成熟叶, 在根中几乎不表达。构建该基因的瞬时表达载体, 通过农杆菌注射洋葱表皮的方法对ShHXT6编码的蛋白进行亚细胞定位, 结果表明, 该基因编码的蛋白定位于细胞膜。

辣椒乙烯转录因子CaERF18的分离与诱导表达

郑井元,刘峰,朱春晖

2016, 32(3): 87-92. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.014

摘要 ( 242 )

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旨在明确辣椒(Capsicum annuum L. HDA149)与南方根结线虫(Meloidogyne incognita)不亲和互作过程中相关特异性ERF类型转录因子的候选基因及其表达模式。应用RT-PCR方法, 从南方根结线虫诱导的辣椒中分离到一个694 bp cDNA序列的乙烯(ERF)转录因子基因核心序列, 命名为CaERF18, 编码231个氨基酸, 含有一个保守的由59个氨基酸构成的ERF结构域, 与NtERF118、SlERF4 和 SlERF19 AP2结构域的相似性分别为44.3%、42.6% 和39.3%。表达分析表明, 南方根结线虫侵染可显著诱导CaERF18的表达, 接种线虫后12 h相对表达量开始升高, 12 h升高3.8倍, 72 h升高7.2倍。结果表明, CaERF18是一受病原物诱导表达的基因, 推测CaERF18在介导辣椒对根结线虫的抗性作用中可能具有重要的调控功能。

香菇多糖增强黄瓜幼苗对炭疽病菌抗性机理

张文华

2016, 32(3): 93-97. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.015

摘要 ( 253 )

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旨在考察香菇多糖诱导黄瓜(Cucumis sativus L. cv. Jinfeng)幼苗叶片细胞产生防御响应的效果。经0.75 g/L香菇多糖处理后, 叶片胞内H₂O₂和水杨酸浓度迅速增加, 分别在10 min和4 h达到峰值, 随后均逐渐下降至诱导前水平。经香菇多糖诱导后, 胞内抗性相关蛋白β-1, 3-葡聚糖酶、几丁质酶和苯丙氨酸氨解酶比活性均显著增加, 96 h后酶活力仍然保持较高水平。进一步研究发现, 经香菇多糖诱导后, 黄瓜对炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)抗性明显增强。经2.00 g/L香菇多糖处理后, 叶片菌斑面积和数量分别显著下降至对照水平的53.1%和51.3%, 结果表明香菇多糖具有诱导黄瓜细胞产生防御响应的作用。

山羊MSH4和MSH5基因的cDNA克隆、序列分析及组织表达

郑杰,刘霜,罗斌,胡亮,杨珂伟,字向东

2016, 32(3): 98-104. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.016

摘要 ( 271 )

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PDF (2150KB) ( 430 )

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以低繁藏山羊和高繁金堂黑山羊为研究对象, 分别提取处于发情期的5只藏山羊和5只金堂黑山羊的卵巢、子宫、输卵管、垂体的总RNA, 并通过RT-PCR技术对MSH4、MSH5基因cDNA进行克隆、序列分析, 以Real-time PCR技术对其进行组织表达研究。结果表明, 藏山羊和金堂黑山羊MSH4基因编码区均长2 499 bp, 编码832个氨基酸, 两品种基因编码区有5处碱基不同, 并导致3处氨基酸的差异；MSH5基因编码区均长2 496 bp, 编码831个氨基酸, 两品种基因编码区有9处碱基不同, 并导致5处氨基酸的差异。藏山羊MSH4基因编码区核苷酸序列与金堂黑山羊、山羊、绵羊、牛、马、小鼠、褐家鼠、人的同源性分别为：99.8%、99.8%、99.4%、98.1%、94.4%、85.1%、84.7%和93.5%；藏山羊MSH5基因编码区核苷酸序列与金堂黑山羊、山羊、牛、家犬、小鼠、褐家鼠、人的同源性分别为：99.6%、99.6%、97.3%、88.0%、85.8%、85.3%和90.2%。MSH4和MSH5基因mRNA在两个山羊品种的卵巢、子宫、输卵管、垂体中均有表达, 但两品种间无显著性差异(P>0.05)。说明MSH4和MSH5基因在动物进化中比较保守, 与山羊多羔性状的相关性有待进一步研究。

microRNA-483和microRNA-486在克隆和转fat-1基因牛组织中的表达

吕洋,王煜,孙佳佳,弓春玲,李光鹏

2016, 32(3): 105-108. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.017

摘要 ( 216 )

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利用荧光定量PCR比较正常受精牛、克隆牛和转基因牛的心、肝、脾、肺、肾、胎盘、子叶、子宫内膜中miR-483和miR-486的表达水平。结果显示, miR-483和miR-486在正常受精牛、克隆牛和转fat-1基因牛的组织中均有表达, 其中在心脏中表达量显著高于其他组织。而转fat-1基因牛心脏中miR-483和miR-486表达量均低于正常牛。miR-483和miR-486在不同组织中表达量存在一定差异, 在心脏中呈现高表达, 提示miR-483和miR-486表达降低可能与心肌肥大、心肌梗死等病理生理过程有关。

TGF-β1诱导马鹿茸MSCs软骨分化及c-myc基因的表达

韩春梅,王姗姗,高庆华,郑永富,马梦婷,张勤

2016, 32(3): 109-114. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.018

摘要 ( 255 )

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鹿茸间充质干细胞(MSCs)是维持茸再生与骨化的重要组织, 旨在研究鹿茸MSCs的软骨分化及原癌基因c-myc对该过程的调控作用。利用成年塔里木马鹿生长60 d的鹿茸第2代间充质干细胞(MSCs, P2), 通过TGF-β1(10 ng/mL浓度)刺激, 诱导塔里木马鹿茸间充质干细胞向软骨分化, 采用免疫组化和阿利新蓝染色鉴定诱导结果, 并通过qPCR方法检测软骨分化过程中c-myc基因的表达变化。结果显示, MSCs在诱导后的第9天开始出现细胞形态变化, 由梭形向多角形转变, 原来菊花状的分布逐渐向铺路石状变化, 至14 d可观察到软骨陷窝, 21 d软骨细胞基质明显, 并开始出现细胞凋亡。非诱导组28 d细胞出现凋亡, 细胞内发现空泡。35 d两组细胞凋亡明显, 细胞折光性变差, 间隙变大。阿利新蓝染色鉴定, 诱导至第14天细胞基质中开始出现大量阳性染色。免疫组化实验检测, 诱导至21 d的细胞基质中出现棕色Col II阳性反应物, 随培养时间增加颜色加深, 并集中分布在细胞及其周围基质中。在软骨分化进程中, 第7、14、21和28天, 诱导组c-myc基因表达与非诱导组相比显著下调(P<0.05), 但诱导至35 d, 诱导组c-myc表达与非诱导组相比无显著差异(P>0.05)。在TGF-β1刺激下, 塔里木马鹿茸MSCs可以分化成软骨, 原癌基因c-myc下调表达诱导鹿茸MSCs进入凋亡状态并分化为软骨细胞。

家蝇伴侣蛋白CCTδ基因克隆、序列分析及表达模式的研究

陶如玉,赵学军,杨尉锦,吴建伟,国果

2016, 32(3): 115-121. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.019

摘要 ( 231 )

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旨在对家蝇伴侣蛋白CCTδ基因进行cDNA克隆、序列分析, 并对其时空表达模式进行初步探索。采用EST测序技术从已构建的家蝇幼虫cDNA质粒文库中筛选到家蝇CCTδ基因, 以该基因的cDNA文库质粒为模板, 通过PCR的方法进行扩增。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行结构与功能分析, 构建系统进化树。取家蝇不同生活史时期虫体(卵、各龄幼虫、蛹、雄雌成虫), 3龄幼虫不同组织部位(体壁、气管、唾液腺、脂肪体、马氏管及中肠), 采用实时荧光定量PCR分析CCTδ基因在家蝇不同发育阶段和组织部位的表达情况。结果显示, 经PCR扩增后, 得到了1 600 bp左右的特异性家蝇CCTδ基因片段；CCTδ基因ORF全长1 602 bp, 编码533个氨基酸, 理论分子量57.16 kD, 等电点为7.50；二级结构主要以α-螺旋和不规则卷曲为主；进化树分析显示其具有较好的保守性, 与中华按蚊的遗传距离较近。时空表达谱显示：该基因在家蝇不同发育时期均有表达, 以蛹期表达量最高；在3龄幼虫不同组织中, 以气管表达量最高。成功克隆了家蝇CCTδ基因并初步探索了其时空表达模式。

马尾松毛虫质型多角体病毒非结构蛋白p44在Bac-to-Bac系统中的表达和亚细胞定位

彭晗,王洪秀,王金昌,关丽梅,靳亮,万翠香

2016, 32(3): 122-128. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.020

摘要 ( 274 )

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为探寻马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV 1)p44蛋白的功能, 构建了DpCPV 1基因组S8片段的原核表达体系, 表达纯化蛋白后免疫家兔制备了多克隆抗体。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统, 构建了3种重组的杆状病毒质粒(Bacmid-p44、Bacmid-p44-eGFP和Bacmid-eGFP)。转染昆虫细胞Sf9进行表达, 通过Western blot检测和蛋白的亚细胞定位观察。Western blot检测结果显示, Bacmid-S8在昆虫细胞Sf9中表达实际蛋白的大小为35 kD, 比在原核系统中表达的蛋白(44 kD)略小；利用激光共聚焦显微镜观察p44-eGFP的融合蛋白的亚细胞定位发现, 融合p44的绿色荧光蛋白(eGFP)主要聚集在细胞质中, 而未融合的 eGFP则分布于整个细胞, 说明 DpCPV 1的p44蛋白定位于细胞质中。

七鳃鳗水通道蛋白3的克隆与生物学特性分析

赵春晖,史金杰,王浩,刘欣,李庆伟

2016, 32(3): 129-136. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.021

摘要 ( 243 )

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水通道蛋白3(aquaporin 3, AQP3)属于水甘油通道蛋白家族, 参与水、尿素和甘油的转运和促进细胞增殖及迁移。从七鳃鳗中克隆得到了Aqp3(LjAqp3)cDNA(GenBank 序列号KR054618), 其开放阅读框为900 bp, 编码299个氨基酸, 含6个跨膜螺旋结构域, 有信号肽。序列分析结果表明, 七鳃鳗AQP3有2个高度保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(NPA)模体和1个芳香族/精氨酸(ar/R)结构。进行同源序列比对发现与其它物种具有较高的同源性。实时荧光定量PCR分析表明, LjAqp3在七鳃鳗中分布广泛, 在多种组织器官中表达。

地高辛标记的黄鳝F64基因cRNA探针的制备及其应用

蒋骄云,田文斐,冯龙,曲宪成

2016, 32(3): 137-141. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.022

摘要 ( 222 )

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以黄鳝F64基因序列为模板设计引物, 扩增用于cRNA探针合成的模板, 构建F64/pGM-T重组质粒并线性化, 利用RNA聚合酶体外转录合成正、反义cRNA探针, 并对其进行地高辛标记, 利用原位杂交方法检测F64基因在黄鳝性腺发育过程中的表达变化情况。结果显示, 正义探针未检测到阳性信号, 反义探针检测到该基因在黄鳝性腺发育早期不表达, 于V期性腺开始表达。研究结果表明, 体外转录法可以有效合成cRNA探针, 制备的cRNA探针可以准确检测F64基因的时空表达。

一株凡纳滨对虾源鳗弧菌群体感应信号分子的检测

潘玉荣,张彩丽,朱素芹,孙秀娇,曾名湧

2016, 32(3): 142-147. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.023

摘要 ( 245 )

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旨在检测从凡纳滨对虾体内选取的一株鳗弧菌的群体感应信号分子。利用报告菌株结合薄层层析法鉴定鳗弧菌(Vibrio anguillarum, VA)分泌的高丝氨酸内酯类(AHLs)信号分子, 利用哈维氏弧菌V. harveyi JMH597 和 V. harveyi JAF375作为报告菌株分别检测了VA分泌的AI-2和CAI-1信号分子活性与细菌密度的关系。结果表明, VA能分泌3种类型的信号分子：AHLs信号分子、AI-2信号分子和CAI-1信号分子, 其中分泌的AHLs有N-3-羟基-己酰基-高丝氨酸内酯(3-OH-C₆-HSL)、N-3-辛酰基-高丝氨酸内酯(C₈-HSL)和N-3-氧代-辛酰基-高丝氨酸内酯(3-oxo-C₈-HSL)。VA分泌的AHLs、AI-2和CAI-1均具有密度依赖性。

携带人卵泡刺激素受体的慢病毒载体疫苗的构建及其免疫效应检测

马晓玲,刘红春,李江伟

2016, 32(3): 148-154. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.024

摘要 ( 224 )

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制备携带卵泡刺激素受体的慢病毒载体疫苗, 并研究其对小鼠的免疫效应。将卵泡刺激素受体胞外区(fshr366)基因克隆到慢病毒载体上, 采用脂质体转染法将重组质粒转染至293T细胞中, 包装并产生含有目的基因的病毒颗粒；分别利用RT-PCR和Western blot检测感染病毒颗粒的293T细胞中fshr366 在mRNA水平及蛋白水平的表达情况；用携带fshr366的病毒颗粒单次腹腔免疫BALB/c小鼠, 分别在免疫0、14、21和28 d对小鼠眼眶采血, ELISA法检测免疫小鼠血清的特异性并测定抗体滴度。酶切和测序结果表明fshr366基因片段成功构建到慢病毒载体上。将包装产生的携带fshr366的慢病毒颗粒感染293T细胞后, RT-PCR和Western blot检测结果表明细胞在转录水平和蛋白水平均表达fshr基因。ELISA结果显示携带fshr366的慢病毒颗粒单次腹腔免疫小鼠后, 免疫14 d就激起了机体的体液免疫反应, 抗体滴度达到1:1 600。成功制备了携带卵泡刺激素受体的慢病毒载体疫苗, 其可以在小鼠体内激发FSHR抗原特异的早期持续性免疫反应。

基于细菌同源蛋白预测细菌最适生长温度的研究

丛华剑,武栓虎,田健,初晓宇,伍宁丰

2016, 32(3): 155-165. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.025

摘要 ( 262 )

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不同细菌有不同的最适生长温度, 而基因序列与其最适生长温度密切相关。为探究其相关性, 选取92个具有不同最适生长温度的细菌的全基因组序列为研究材料, 通过寻找92个细菌共有的同源蛋白, 并计算共有同源蛋白中氨基酸的频率, 发现共有同源蛋白的氨基酸频率特征与其最适生长温度存在着显著的相关关系, 其中蛋白质序列中的螺旋结构与其最适生长温度关系最大。该研究为揭示细菌对温度的适应机制, 以及对蛋白质稳定性相关的分子设计具有重要的意义。

人C反应蛋白在不同原核表达载体及菌株中的表达及免疫反应性分析

李江峰,矫丽媛,赵晓妮,王继华,才蕾

2016, 32(3): 166-170. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.026

摘要 ( 319 )

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构建人C反应蛋白(CRP)原核表达载体, 并分别将其转化进入E.coli BL21(DE3)和Rosetta gami 2(DE3)pLysS中, 诱导CRP重组蛋白的表达；主要运用了基因工程, 亲和层析及透析复性等方法。成功构建了CRP原核表达载体及菌株。经IPTG诱导后, 得到了不同的重组CRP蛋白。结果表明, 相同表达载体在不同的表达菌株中的表达情况有一定差别, 分别在大肠杆菌及Rosetta gami2(DE3)pLysS中表达并得到了重组CRP的包涵体, 对复性后的CRP重组蛋白进行Westen blotting及ELISA检测, 结果表明原核表达的重组CRP蛋白的免疫反应性很低, CRP蛋白发挥免疫活性需要以五聚体形式存在。

玉米秸秆酶水解过程中的酶复配条件优化

王奇,王林风,闫德冉,张斐洋,刘天天,吴静波

2016, 32(3): 171-177. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.027

摘要 ( 247 )

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降低酶解成本是纤维素乙醇生产的关键。利用酶复配技术优化蒸汽爆破处理后玉米秸秆的酶水解工艺条件, 以提高纤维素的转化率。通过单因素实验和正交实验, 研究了纤维素酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶对酶解效率的影响规律。结果表明, 汽爆玉米秸秆, 纤维素含量达42.21%, 半纤维素仅为3.65%。纤维素酶对酶解过程起决定性作用, 添加40 FPU/g时, 酶解率为75.45%；木聚糖酶可促使更多的纤维素暴露出来, 添加1 500 IU/g时, 酶解率最高为78.03%；β-葡萄糖苷酶有助于消除纤维二糖积累造成的反馈抑制, 用量40 IU/g时, 纤维二糖浓度为0.330 4 g/100 mL, 酶解率达76.45%。正交实验确定最佳工艺为：纤维素酶用量30 FPU/g, 木聚糖酶用量800 IU/g, β-葡萄糖苷酶用量40 IU/g；该条件下, 进行底物质量浓度25％的验证实验, 葡萄糖达9.3 g/100 mL, 若用单一天冠纤维素酶, 葡萄糖仅5.9 g/100 mL, 提高了57.63%。三种酶的影响顺序为：纤维素酶>木聚糖酶>β-葡萄糖苷酶。

漆酶N端融合His-tag或S-tag标签促进其在大肠杆菌中可溶性表达

岳青霞,张丽洁,田健,伍宁丰,姚冬生

2016, 32(3): 178-183. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.028

摘要 ( 301 )

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来源于地衣芽孢杆菌的漆酶具有催效率高, 底物范围广等优点在工农业等领域具有重要的应用前景, 但该酶在外源基因表达系统中的表达量低, 影响了其在工农业等领域的应用。His-tag和S-tag两种标签由于具有分子量小, 且一般不影响外源蛋白性质等特点, 在外源蛋白的纯化和检测中具有重要的应用。本研究发现将来源于地衣芽孢杆菌的漆酶CotA的N端融合His-tag或S-tag构建于pET-22b载体, 并转化大肠杆菌BL21(DE3)后可以显著提高其在大肠杆菌中的可溶性表达量, 其表达量较N端无融合标签的构建, His-tag可提高漆酶表达量约为37倍, S-tag约可提高20倍, His-tag与S-tag共作用约可提高28倍。

重组羧肽酶G2的原核表达、纯化及活性分析

李树刚,王勇,张伟,辛渝,但国平,柴新娟,龚会英,于廷和

2016, 32(3): 184-189. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.029

摘要 ( 355 )

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在原核表达系统中实现羧肽酶G2(Carboxypeptidase G2, CPG2)的表达, 并对CPG2进行了纯化和活性测定。通过PCR扩增得到编码CPG2的基因片段, 利用基因重组技术构建原核表达质粒pET-30a-CPG2, 在Escherichia coli中进行诱导表达, 菌体经超声破碎后利用金属螯合亲和柱和阴离子交换层析柱对目标蛋白进行纯化。目的蛋白能够以可溶形式表达, SDS-PAGE和Western blotting检测有特异的蛋白表达条带。纯化的CPG2有降解氨甲喋吟(MTX)活性, 酶活力达到400 U/mg。

毕赤酵母表达重组牛胰脏羧肽酶A的响应面法优化

王晓云,徐诗涵,梁志宏,黄昆仑

2016, 32(3): 190-197. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.030

摘要 ( 246 )

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采用Central Composite Design(CCD)实验设计及响应面分析相结合的方法, 对毕赤酵母表达牛胰脏羧肽酶A的表达条件进行优化, 旨在获得牛胰脏羧肽酶A的最佳表达条件。单因素实验结果显示, 诱导时间为96 h时, 最佳甲醇含量为0.5%、最佳pH值为4、诱导时最佳菌体OD₆₀₀值为7。在此基础上, 利用CCD实验设计及响应面分析法进行回归分析, 获得最优表达参数为：甲醇含量0.5%、诱导pH为5.90、接种前种子培养基OD₆₀₀为6.54。在优化后的条件下进行验证实验, 得到牛胰脏羧肽酶A的表达量为0.325 mg/mL, 与理论值(0.326 mg/mL)相比, 相对误差较小, 为0.38%。同时, 对表达产物进行了Western Blot鉴定。研究表明, 采用响应面法分析优化牛胰脏羧肽酶A的表达条件准确可靠, 有助于找出最佳条件, 为指导其在发酵罐中进行高密度发酵生产牛胰脏羧肽酶A奠定基础。

食醋中污染菌的分离与鉴定

翟磊,苏姣姣,刘洋,曹艳花,姚粟,程池

2016, 32(3): 198-202. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.031

摘要 ( 288 )

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首次关于耐酸乳杆菌是引起食醋变质的报道, 旨在为食醋生产企业进行微生物污染控制提供理论依据。采用PCR-DGGE技术以及纯培养技术, 对正常醋样和污染醋样的微生物群落结构和种类进行了研究, 通过对比分析以及回接实验发现了引起食醋变质的污染菌为耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)。

上调基因-11(URG11)生物信息学与功能分析

姚杨,苏杰,刘凯歌,徐锐

2016, 32(3): 203-208. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.032

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应用基因芯片技术获取以稳定转染HBx基因的肝癌细胞HepG₂(HepG2-X)Y, 以及非转染的肝癌细胞HepG₂的差异表达基因, 利用生物信息学方法对其进行初步分析表明, 该蛋白基因编码673个氨基酸, 预测分子量为17.06 kD, 理论等电点为4.83, 定位于细胞核, 具有转录调控、生长因子、信号传导的功能, 同源性分析结果表明, 其碱基序列与已经报道的其他12个物种的相似率为76%-97%, 且符合种属之间的进化关系。

Us11的表达及其多克隆抗体的制备

童海燕,李国毅,汤颖

2016, 32(3): 209-214. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.033

摘要 ( 280 )

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已有研究发现单纯疱疹病毒1(HSV-1)感染后, 病毒的Us11 蛋白在拮抗宿主先天性免疫反应中发挥重要作用。通过合成HSV-1的Us11基因, 克隆表达制备针对Us11的多克隆抗体, 为研究Us11的功能以及与宿主蛋白的相互作用提供的实验基础。通过人工合成Us11基因并以其为模板扩增, 回收Us11基因片段, 克隆至原核和真核表达载体；诱导表达Us11蛋白并纯化, 制备Us11兔源多克隆抗体；转染质粒至293T细胞, 对细胞表达的蛋白进行间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹(WB)检测。成功构建pCold-Us11和pFLAG-Us11质粒, 实现可溶性Us11蛋白表达, 纯化的Us11蛋白免疫动物获得针对Us11的多克隆抗体。IFA和Western blot结果显示, 制备的抗血清能特异性检测到pFLAG-Us11转染293T细胞表达的Us11蛋白。

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2016, 32(3): 300.

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