生物技术通报

药用植物黄花蒿内生菌的研究进展

宋春竹, 陈昕雯, 陈东红

2016, 32(1): 1-7. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.002

摘要 ( 484 )

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黄花蒿作为治疗疟疾最有效的中草药植物, 同时还具有其他多种药用和农业生产价值。与其密切相关的内生菌资源已是目前研究的一大热点。总结整理了黄花蒿内生菌的研究现状, 其应用主要集中在抗肿瘤抗氧化活性、抑菌活性、促进青蒿素的合成等方面。

植物天冬氨酸蛋白酶的研究进展

葛伟娜, 李超, 张家琦, 张岚, 王振怡

2016, 32(1): 8-14. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.003

摘要 ( 557 )

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天冬氨酸蛋白酶是四大类蛋白水解酶之一, 广泛存在于多种生物中, 参与了很多重要的生理过程。相对于其他生物而言, 对植物天冬氨酸蛋白酶的研究相对滞后。自20世纪末以来, 这一领域的工作取得了重大进展。经典的植物天冬氨酸蛋白酶除了具有保守的蛋白酶结构域外还有一段植物特有的插入片段;在动植物分离之后, 植物天冬氨酸蛋白酶基因家族进行了大规模的扩增;该类蛋白酶在植物的整个生长发育过程中发挥重要的功能, 尤其是胁迫反应、有性生殖、衰老和程序性死亡以及蛋白质的加工和降解。对近些年植物天冬氨酸蛋白酶的研究进展进行综述, 并对其未来的发展进行展望。

食物功能性成分对动物基因组DNA甲基化影响的研究进展

赵静, 李楠, 吴茹, 杨占威, 胡文兵, 王文君

2016, 32(1): 15-19. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.004

摘要 ( 319 )

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DNA甲基化是表观遗传学的一部分。功能性成分如多酚、黄酮、维生素、n-3不饱和脂肪酸等对DNA甲基化有重要影响。功能性成分主要通过影响甲基转移酶活性和活性甲基基团数量实现对DNA甲基化的影响, 结合研究成果阐述多种功能成分：多酚、黄酮、维生素(叶酸、VB12、VB6)、n-3多不饱和脂肪酸等对DNA甲基化的影响和作用机制进行综述, 以期为从分子角度探究功能性成分的作用机理提供新思路。

长链非编码RNA MALAT1的研究进展

宋铁峰, 袁颖, 王会琴, 庄春雨, 王楠, 张同存

2016, 32(1): 20-28. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.005

摘要 ( 462 )

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长链非编码RNA(Long noncoding RNAs, lncRNAs)是一类转录本长度超过 200 nt 的RNA分子, 它们并不编码蛋白质, 而是以RNA的形式在转录水平、转录后水平、表观遗传学修饰等多种层面上调控基因的表达。肺癌转移相关转录本1(Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1)首先在非小细胞肺癌被发现, 并引起学者关注。MALAT1定位于染色体11q13.1, 具有高度保守性。近年来, 研究发现, MALAT1能特异性招募SR蛋白家族成员, 并参与表观遗传调控以及细胞周期调控等;MALAT1高表达于多种肿瘤中, 促进肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭。此外, 最近发现MALAT1在血管生成过程中发挥重要作用。主要对MALAT1的特性、作用机制, 以及在肿瘤和血管系统的作用作一系统综述。

表皮干细胞的生物学特性及其潜在应用

刘雪婷, 白春雨, 关伟军, 马月辉

2016, 32(1): 29-32. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.006

摘要 ( 385 )

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表皮是维持生命及保障各个组织器官发挥功能的重要屏障, 而表皮干细胞能够分化为皮肤各层组织, 从而使表皮始终处于持续不断的增殖、分化、凋亡的状态, 在维持表皮平衡, 表皮损伤后修复的过程中发挥重要的作用。随着细胞生物学的飞速的发展, 人们越发认识到表皮干细胞的重要性, 使其成为人们目前的研究热点之一。针对表皮干细胞研究进展, 着重叙述了表皮干细胞的分类、定位、特征、功能以及应用前景, 旨为相关研究者对表皮干细胞生物学特性及应用有更全面的认识。

小分子非编码RNA与雄性不育

廖珂, 柴志欣, 钟金城

2016, 32(1): 33-40. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.007

摘要 ( 383 )

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小分子非编码RNA(Small non-coding RNA, sncRNA)是一类20-30个左右核苷酸长度的RNAs, 不具有编码蛋白质的功能, 但在调控机制方面具有广泛的生物学功能。在动物精子形成过程中有两类sncRNAs, 即miRNAs和piRNAs起着重要调控作用, 它们在动物睾丸组织中表达异常会导致精子生成障碍从而表现出雄性不育性状。综合分析了sncRNA的结构、功能以及对雄性动物生育能力的影响, 以期为进一步研究sncRNA的调控机制提供参考。

园林废弃物堆肥化技术中微生物菌剂的功能与作用

赵恺凝, 赵国柱, 国辉, 王晓旭, 朱胜男, 徐锐

2016, 32(1): 41-48. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.008

摘要 ( 598 )

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园林废弃物的日益增加给环境带来了巨大压力。微生物菌剂接种于园林废弃物中堆肥, 可以加速堆肥的腐熟度, 增强肥效, 改善并促进资源利用效率, 在园林废弃物再利用方面已显示较好的应用前景。从园林废弃物目前的处理方法和菌剂在堆肥化技术方面的应用着手, 介绍了微生物在园林废弃物堆腐中和发酵成微生物菌肥后的功能与作用, 阐述了目前监测堆肥腐熟程度的重要参数以及检测发酵过程中菌群变化的技术手段, 最后对微生物菌剂接种于园林废弃物堆肥化技术的前景进行了展望, 旨为相关领域的研究与开发提供参考和借鉴。

纳米生物技术在医学中的应用

杨慧, 丁良, 岳志莲

2016, 32(1): 49-57. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.009

摘要 ( 598 )

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近年来纳米材料和纳米生物技术在临床治疗及临床诊断方面的应用越来越广泛, 纳米药物、纳米医用材料、纳米芯片技术、体外诊断试剂逐渐开发并取得了重要进展。主要从纳米医疗和纳米诊断这两方面对纳米材料和纳米生物技术的现状及其发展前景进行了阐述。

利用发酵法生产四甲基吡嗪研究进展

侯孝元, 顾如林, 梁文龙, 肖梓军

2016, 32(1): 58-64. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.010

摘要 ( 456 )

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2, 3, 5, 6-四甲基吡嗪(2, 3, 5, 6-Tetramethylpyrazine, TTMP)是一种重要的食品香料添加剂, 同时具有治疗心脑血管疾病、呼吸系统疾病和肾小球疾病等的药用价值。回顾了微生物发酵法生产TTMP的研究进展, 并分析了TTMP的产生机制, 总结了提高生产TTMP的有效途径, 包括筛选内源性高产菌株、发酵过程优化、外源添加铵盐和分阶段的发酵控制等策略。提出合成TTMP的过程是一个生化反应过程, 是生物酶催化代谢产生乙偶姻和乙偶姻与铵离子自发生成TTMP两个阶段综合作用的结果, 利用分阶段温度控制的发酵策略可有效提高TTMP产量。对产物的提取和纯化进行了介绍, 并根据目前的进展、面对的挑战和发展趋势对发酵法生产TTMP研究前景进行了展望。

螺旋藻藻蓝蛋白提取纯化方法研究进展

付丽丽, 那日, 郭久峰, 金晶

2016, 32(1): 65-68. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.011

摘要 ( 474 )

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藻蓝蛋白具有抗氧化、增强机体免疫力、抗癌、抗炎及保肝护肝等诸多生理活性, 被广泛应用于食品、化妆品及医药等邻域, 其提取纯化技术备受关注。列举了近些年藻蓝蛋白的提取纯化技术, 比较了一些主要的提取纯化方法的优缺点。

实时荧光PCR法同时检测食物中大豆和芹菜致敏原成分

汪永信, 程潇, 安虹, 聂磊, 张波, 刘娟娟

2016, 32(1): 69-73. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.012

摘要 ( 328 )

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大豆、芹菜等食品原料是一些特殊人群的致敏原。根据大豆atp A基因和芹菜mtd基因设计特异性引物, 利用不同荧光素标记的TaqMan探针, 建立了一种实时荧光PCR检测方法, 可同时检测食物中大豆和芹菜致敏原成分。分别以大豆、芹菜、大米、小麦、大麦、花生、芝麻、玉米、马铃薯、蕃茄、核桃、开心果、腰果、葵花籽、杏仁、苹果、梨、草莓、猪肉、牛肉、羊肉及鱼肉等材料的基因组DNA作为模板, 进行PCR扩增实验, 结果发现该方法仅能特异性扩增大豆和芹菜致敏原成分。灵敏度测试结果表明大豆和芹菜成分的检出限均达0.01%。因此, 本方法可以作为同时检测食品中大豆和芹菜致敏原成分的特异性方法。

枝干树皮宏基因组DNA的提取

赵玲云, 范东颖, 李燕芳, 颜霞, 黄丽丽

2016, 32(1): 74-79. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.018

摘要 ( 449 )

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旨在得到一种适用于提取多种枝干树皮的高质量DNA的方法。参考前人提取植物DNA的经验, 综合了研磨时加PVP、缓冲液洗涤、SDS与CTAB结合使用、高浓度KAc低温冻融、高浓度NaCl条件下异丙醇沉淀、DNA完全溶解后加微量RNase A处理等操作, 所得5种基因组DNA浓度介于190-970 ng/μL, 纯度都很高, 皆能被限制性内切酶切割, 都可用作模板扩增到细菌16S rRNA基因片段, 以苹果树皮DNA为模板扩增到苹果BIP和PDI基因且苹果树皮基因组DNA经测序公司检测, 质量满足高通量测序法研究微生物多样性对环境宏基因组的要求。

基于cpDNA片段探讨中-日间断分布双花木属植物的系统发育学

李丽卡, 李象钦, 谢国文, 李海生, 郑毅胜, 藤婕华, 高锦伟

2016, 32(1): 80-87. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.013

摘要 ( 387 )

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双花木属(Disanthus)植物为东亚特有濒危物种和典型的中-日间断分布成分, 基于叶绿体DNA(cpDNA)的3个片段(psbA-trnH、rps16F-R2、psaA-ycf3)联合对双花木属16个居群的164个个体进行系统发育学研究, 系统发育的结果支持日本的D. Cercidifolius和中国的D. cercidifolius subsp. Longipes为单系类群, 两个群体间无共享单倍型, 且结果进一步支持日本群体分为两个地理组, 一个来自日本本州岛的中部(居群QF, CY), 一个是来自日本本州岛的西南部(居群gz、gd和JH)。PERMUT分析结果表明, 双花木属居群间总的遗传多样性Ht(0.725)高于居群内平均遗传多样性场Hs(0.148), 居群遗传差异Nst(0.905)大于Gst(0.796), 存在极显著的谱系地理学结构。AMOVA进一步表明, 双花木属的变异主要来自群体间, 即中国和日本的两个群体分化明显, 变异占53.08%, 组内种群间的变异占24.11%, 来自个体间的变异为22.80%。

6-BA、IAA、GA₃与ABA对木枣果实成熟衰老的调控作用

杨卫民, 杜京旗, 赵君

2016, 32(1): 88-91. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.014

摘要 ( 349 )

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在木枣白熟期, 用不同的植物激素处理果实, 通过检测其生理生化变化, 研究6-BA、IAA、GA₃与ABA对枣果实成熟衰老的调控作用。结果显示, 6-BA、IAA、GA₃和ABA处理后枣果中DNA含量差异较为明显, 其中, ABA和6-BA处理效果显著;GA₃和IAA处理后枣组织中的丙二醛(MDA)含量明显低于对照组, 6-BA和ABA处理则相反;除ABA处理外, 枣组织中脯氨酸(Pro)含量明显低于对照组, 维生素C(Vc)含量变化则相反;过氧化氢酶(CAT)活性表现差异很大, ABA和6-BA处理CAT活性显著高于对照组, IAA和GA₃处理则相反。6-BA、IAA、GA₃与ABA的生理作用在多方面表现为相互促进与互为拮抗的关系, 有调控木枣果实成熟衰老的作用。

韭菜胚根高效植株再生体系的建立

王婷婷, 高行英, 李梅兰, 宋红霞, 侯雷平

2016, 32(1): 92-96. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.015

摘要 ( 337 )

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为了建立韭菜高频植株再生体系, 以韭菜胚根的不同部位为外植体, 研究了不同部位愈伤组织和芽的诱导。结果表明, 胚根尖为诱导愈伤组织的最佳外植体, 愈伤诱导率达到81.4%, 出芽率达到73.3%;比较在不同激素配方上的愈伤组织诱导和芽的分化, 在MS+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT培养基中再生率最高, 诱愈率达到80%以上, 不定芽分化率达78.8%, 繁殖系数为24.7;在MS+1 mg/L GA+0.5 mg/L KT不定芽伸长培养基中, 30 d不定芽伸长为独立植株, 比例为85.5%;独立的韭菜苗在1/2 MS+0.3 mg/L IAA中生根率及根系状况最佳。通过该方法130 d左右即可从胚根脱分化再生出植株。

六个海岛棉品系体细胞胚胎发生及再生体系的研究

丁喜莲, 曲延英, 李琼, 郭家雁, 陈全家

2016, 32(1): 97-102. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.016

摘要 ( 326 )

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以海岛棉DJ-1(373)、天长2号(376)、5917(380)、阿长-599(381)、塔07-152(383)、S0717(408)6个品系的下胚轴为外植体, 通过双因素随机区组设计的方法筛选出的两组最佳激素组合, 诱导出愈伤组织, 并成功获得再生植株。研究结果表明, 0.1 mg/L 2, 4-D+0.1 mg/L KT 为海岛棉380、383和381愈伤组织最佳诱导条件, 0.3 mg/L NAA+0.1 mg/L KT 为海岛棉373、376和408愈伤组织最佳诱导条件;诱导出的愈伤组织接种于KNO₃加倍的培养基可产生胚性愈伤组织;将其接种于含有0.1 mg/L KT和0.05 mg/L IBA的培养基中可促进体细胞胚胎的发生和成熟, 利用畸形苗的培育可缩短再生体系的周期, 6个品种在6-8个月内均能获得再生植株。

甘蔗一次多基因遗传转化及多重PCR检测

王文治, 杨本鹏, 蔡文伟, 熊国如, 王俊刚, 冯翠莲, 张树珍

2016, 32(1): 103-108. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.017

摘要 ( 351 )

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通过多基因遗传转化策略, 水稻、玉米等农作物实现了一次多个性状的遗传改良, 为探索甘蔗一次多基因遗传转化的可行性, 用一个多基因植物表达载体, 对甘蔗进行遗传转化。通过多重PCR法对4个外源基因在各个转基因株系内的整合与缺失进行检测。结果证明, 甘蔗一次多基因遗传转化是可行的, 但因插入的DNA片段较大, 会发生基因丢失现象。因此, 一次多基因遗传转化需要在转化的过程中获得相对较多的转化株系, 才能从中筛选到有应用价值的株系。

山葡萄CBF基因表达载体构建及对拟南芥根生长的影响

王法微, 董金晔, 李晓薇, 刘洋, 吴学彦, 王南, 董园园, 陈欢, 李海燕

2016, 32(1): 109-114. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.019

摘要 ( 332 )

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为了研究山葡萄CBF基因调节植物对盐胁迫的应答机理, 分别构建了山葡萄VaCBF1、VaCBF2和VaCBF3的植物过表达载体。经酶切及琼脂糖电泳检测证实3个基因均插入到pBASTA中, 表明表达载体构建成功。然后, 分别将3个植物过表达载体转入农杆菌EHA105中, 并通过浸花法浸染拟南芥。利用除草剂筛选获得3个基因的拟南芥过表达株系。最后, 对野生型拟南芥与转基因拟南芥进行盐胁迫处理, 发现OE-CBF2转基因植株的主根伸长长度显著长于其它植株, 3个转基因株系的侧根长度也明显长于野生型植株。上述结果表明山葡萄CBF基因可能在植物盐胁迫中对根部生长发育起到非常重要的调控作用。

日本结缕草‘胶东青’DREB2.2基因克隆及表达模式研究

可祥, 农钧琇, 石大林, 马礼鹏, 李京, 韦善君

2016, 32(1): 115-123. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.020

摘要 ( 346 )

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DREB(dehydration responsive element binding protein)是植物中普遍存在的一类重要转录因子, 参与植物逆境响应和生长发育过程。以日本结缕草‘胶东青’为材料, 克隆获得了DREB2.2基因的编码区序列, 分析了该基因的生物信息学特征, 通过半定量PCR技术检测其逆境表达模式。测序结果表明, ‘胶东青’DREB2.2 基因存在长、短两个转录本。长转录本DREB2.2-L编码区长1 067 bp, 多含一个长50 bp的序列, 阅读框提前终止, 仅推测编码65个氨基酸。短转录本DREB2.2-S编码区长1 017 bp, 推测编码338个氨基酸, 蛋白质分子量37.3 KD, 等电点 pI为4.86, 含有一个保守的AP2结构域和核定位序列, 属于DREB亚家族A-2组成员。半定量PCR结果显示, DREB2.2-S和DREB2.2-L在正常生长条件下有表达, 低温胁迫时表达量上调, 胁迫2 h时最高, 干旱胁迫2 h和24 h时轻度上调表达, 高盐胁迫下表达量无显著变化。在相同条件下, DREB2.2-L的表达量均略高于DREB2.2-S。

马铃薯突变体赤霉素代谢关键酶基因差异表达分析

石建斌, 杨永智, 王舰

2016, 32(1): 124-130. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.021

摘要 ( 350 )

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为揭示马铃薯株高突变与赤霉素代谢途径关键酶基因的关系, 以马铃薯株高突变株系4P2-9为材料, 利用实时荧光定量PCR方法中的相对定量RT-PCR建立双标准曲线, 以Actin基因为内参基因, 对高原4号及其株高突变材料4P2-9中的赤霉素代谢相关基因的表达情况进行了检测。结果显示, 4P2-9的株高及节间数显著低于对照材料(P<0.05), 节间长度显著高于对照(P<0.05), 赤霉素代谢的关键酶基因KS、KO和GID1表达量显著下调, 分别为对照材料的0.725倍、0.657倍和0.890倍;GA20ox1和GA2ox1基因的表达量表现为上调, 分别为对照材料的1.557倍和1.425倍。结果表明, 赤霉素代谢过程中关键酶基因表达量的改变是造成4P2-9材料株高变化的原因之一, 而GA20ox1和GA2ox1基因的表达量的上调是促使株高降低的主要因素。

新疆野生及栽培荒漠肉苁蓉提取物免疫活性研究

杨秀梅, 杨雨, 王丹阳, 吴道澄, 张爱莲

2016, 32(1): 131-137. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.022

摘要 ( 356 )

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旨在比较新疆野生与栽培荒漠肉苁蓉提取物主要活性成分差异, 并检测其诱导小鼠体内树突状细胞(Dendritic cells, DC)成熟能力, 评价其免疫活性。采用超声法制备提取物, 紫外法测定多糖及苯乙醇苷类化合物含量;脚掌免疫小鼠, 流式细胞术检测其对小鼠体内CD11c⁺DCs表面CD86(Cell differentiation antigens 86, CD86)和MHCII(Major histocompatibility complex II, MHCII)表达情况。结果表明, 野生及栽培荒漠肉苁蓉水提物中多糖含量分别为59.58%和76.82%, 醇提物中苯乙醇苷类化合物含量分别为17.12%和8.47%;小鼠免疫实验结果表明, 野生和栽培荒漠肉苁蓉提取物可显著增强小鼠体内CD11c⁺DCs表面CD86和MHCII上调表达(P<0.01), 且效果与阳性对照组LPS相当, 相同剂量野生与栽培醇提物除对CD86的作用差异显著外(P<0.05), 其它提取物之间对CD86和MHCII的作用均无显著差异(P>0.05)。新疆野生和栽培荒漠肉苁蓉主要成分之间存在一定差异, 且在适宜浓度下均可显著促进小鼠体内DCs成熟, 且差异不大。

美洲大蠊i型溶菌酶的原核表达及多克隆抗体制备

王赟, 翟素珍, 张春林, 王吉平

2016, 32(1): 138-143. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.023

摘要 ( 331 )

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旨在获得美洲大蠊i型溶菌酶PaI的原核表达蛋白, 并制备鼠抗PaI多克隆抗体。PCR扩增PaI成熟肽编码序列, 构建原核表达载体pET28a-PaI, 诱导表达、纯化PaI-His融合蛋白, 免疫Balb/c小鼠, 间接ELISA法检测抗血清效价, Western blotting检测多克隆抗体的特异性。结果显示, PaI成熟肽部分的编码序列长414 bp, 由137个氨基酸组成。构建的原核表达载体pET28a-PaI在大肠杆菌Rosetta(DE3)中成功表达, SDS-PAGE检测显示纯化的PaI-His融合蛋白的大小约为18 kD, 间接ELISA和Western blotting分析表明免疫小鼠产生的抗血清具有较高的效价和较强的特异性。美洲大蠊溶菌酶PaI成功实现原核表达, 并获得了高效价特异性多克隆抗体。

猪γ干扰素在家蚕中的表达和抗病毒活性检测

刘兴健, 李皓洋, 胡小元, 张志芳, 易咏竹, 李轶女

2016, 32(1): 144-148. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.024

摘要 ( 315 )

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干扰素在畜牧养殖业中可以用于病毒性传染病的治疗和疫苗免疫效力的提高, 用杆状病毒表达系统在家蚕中表达了猪γ干扰素。根据已发表的序列对猪γ干扰素基因的密码子进行优化并合成, 将其克隆到杆状病毒转移载体pVL1393上, 与BmBacmid病毒基因组DNA共转染BmN细胞系, 获得重组病毒, 猪γ干扰素基因位于重组BmNPV病毒的多角体基因启动子下游。用该重组病毒感染家蚕获得含有猪γ干扰素的表达产物。Western blotting检测到表达产物中的猪γ干扰素, 用微量细胞病变法利用干扰素抑制VSV-GFP感染VERO细胞的方法来测定干扰素活性, 结果显示干扰素效价可以达到6×10⁵ IU/mL以上。在家蚕幼虫体内成功表达并获得了有活性的猪γ干扰素。

牦牛CAPN3基因的克隆及组织表达特异性

王英杰, 阎萍, 潘和平, 吴晓云, 李明霞

2016, 32(1): 149-155. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.025

摘要 ( 485 )

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以牦牛背最长肌为材料, 采用RT-PCR法克隆了CAPN3基因的CDs区, 并对其进行生物信息学分析。结果表明, 牦牛CAPN3基因的CDs区长2 469 bp, 编码822个氨基酸残基;生物信息学分析显示, 其编码的蛋白属于非分泌表面蛋白, 含有35个磷酸化位点, 主要在细胞质和细胞核中发挥生物学作用。二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲、伸展链和β-转角组成, 具有CysPc、calpain-Ⅲ和EFh家族蛋白结构域, 无信号肽。牦牛CAPN3基因与黄牛、绵羊和猪在系统发育树上的距离最近。运用实时荧光定量分析CAPN3在不同组织中的表达量, CAPN3基因在牦牛的7种组织中均有表达, 但在背最长肌、胰脏中的表达量较高。

三角帆蚌微卫星多重PCR体系的建立及其应用

殷浩, 白志毅, 韩学凯, 李家乐

2016, 32(1): 156-162. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.026

摘要 ( 323 )

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为了提高三角帆蚌微卫星分析效率, 从已开发的微卫星标记中构建了三组四重PCR, 并将稳定的多重PCR体系用于56个三角帆蚌紫色选育系的遗传多样性研究。结果表明该群体的平均等位基因数18.75, 平均有效等位基因数为9.010, 平均多态信息含量为0.857, 平均观测杂合度和期望杂合度分别为0.809和0.876, 香农多样性指数为2.422。运用Cervus v3.0 软件对3个三角帆蚌全同胞家系共114个个体进行亲子鉴定, 结果显示, 使用该3组微卫星多重PCR体系进行亲子鉴定准确率为100%。该三角帆蚌微卫星多重PCR应用于三角帆蚌群体遗传多样性分析、亲子鉴定和家系管理等, 可提高工作效率, 降低实验成本。

斑马鱼SFPQ蛋白的原核表达及纯化

杨川, 胡敏

2016, 32(1): 163-168. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.027

摘要 ( 424 )

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Splicing Factor Proline and Glutamine Rich简称为SFPQ, 是广泛表达在脊椎动物中的一类蛋白。它作为抑癌基因, 对生物体内肿瘤发生具有重要的调控作用。目前对于SFPQ的研究主要集中在人和小鼠上, 对于斑马鱼SFPQ的研究还比较少。为了获得原核表达的SFPQ蛋白进行下一步研究, 构建了斑马鱼SFPQ-pET28a重组质粒, 然后转化到BL21化学感受态细胞中, 探索用IPTG进行低温诱导蛋白的最适条件, 然后用Ni-NTA琼脂糖镍柱纯化SFPQ蛋白。实验结果表明, 当IPTG浓度为0.75 mmol/L, 诱导时间为10 h时, 蛋白表达量最大, Western blot结果表明纯化得到的斑马鱼SFPQ蛋白可以和抗体特异性结合, 说明纯化得到的斑马鱼SFPQ蛋白可以用于下一步实验。

诺氟沙星对斑马鱼胚胎发育的毒性作用及对TGF-β1的影响

王冬梅, 谷从友, 刘铜, 张琼宇, 李培, 胡晓军

2016, 32(1): 169-173. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.028

摘要 ( 397 )

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旨在通过观察不同浓度诺氟沙星对斑马鱼胚胎不同发育时期的毒性作用, 以及对TGF-β1基因表达的影响。配制诺氟沙星浓度为0、10、20、40 μmol/L, 将斑马鱼胚胎暴露在上述浓度的诺氟沙星中。观察在胚胎不同发育时期, 诺氟沙星对斑马鱼脊柱弯曲、心包囊肿、卵黄囊肿和死亡率的影响, 以及使用实时定量聚合酶链式反应(qPCR)检测其对TGF-β1基因表达的影响。结果显示, 诺氟沙星对斑马鱼的胚胎发育有明显影响, 主要表现在脊柱弯曲、心包囊肿和卵黄囊肿, 随着诺氟沙星暴露浓度的增大, 胚胎的发育延迟, 孵化时间延长, 胚胎死亡率增加;当诺氟沙星暴露浓度为40 μmol/L时, 96 hpf的胚胎死亡率达到76.45%;与正常状态相比, 暴露于不同浓度诺氟沙星的斑马鱼胚胎中TGF-β1基因的mRNA表达随发育时间延长而增加趋势减缓。说明诺氟沙星对斑马鱼胚胎发育的致畸作用与致死作用有显著的影响。提示水体中残留的诺氟沙星对鱼类的生殖与发育具有潜在的危害。

ARTP技术选育吩嗪-1-甲酰胺高产菌株及发酵优化

谭剑, 熊欣, 梁万利, 彭华松, 张雪洪

2016, 32(1): 174-179. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.029

摘要 ( 350 )

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从一株高产吩嗪-1-甲酰胺(PCN)的绿针假单胞菌P3株出发, 利用常压室温等离子体诱变技术进行诱变育种, 从初筛的20株突变株中获得了一株PCN产量达到2 093 mg/L的突变株P3-9, 为出发菌株的125%。随后通过单因素实验考察了各种营养因子对该高产菌株合成PCN的影响, 结果表明发酵培养基的最佳碳源、氮源分别为甘油和蛋白胨, 外源添加Fe³⁺或Fe²⁺对于积累PCN有显著促进作用, 而添加苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸对PCN产量无明显影响。优化后, 该突变株的PCN产量高达2 810 mg/L, 是目前国际上通过诱变育种获得的较高PCN产量。

毕赤酵母Kar2p过表达对假黑盘菌素表达量的影响

王楠, 李刚强, 郭文芳, 刘德虎

2016, 32(1): 180-186. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.001

摘要 ( 336 )

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Kar2p是一种分子伴侣蛋白, 为研究其对外源蛋白在毕赤酵母中表达的影响, 从毕赤酵母菌株GS115中克隆出编码该蛋白的基因, 利用其对毕赤酵母转化子P-Ple进行二次转化, 获得了能够同时过表达假黑盘菌素和Kar2p的二次转化子P-PleKar;采用荧光定量PCR方法, 对P-Ple和P-PleKar两个转化子中的Kar2p转录水平进行了测定发现, 在P-PleKar中Kar2p的转录水平比P-Ple上调了约18倍。对P-Ple和P-PleKar两个转化子的生长曲线进行比较, 发现Kar2p过表达对宿主细胞的生长无明显影响, 但对外源蛋白假黑盘菌素的表达确实产生了一定的抑制作用, 受Kar2p的影响, 在诱导培养48 h时, 假黑盘菌素的最高抑菌活性明显降低。这种抑制表达不单针对假黑盘菌素, 对毕赤酵母的蛋白酶表达和分泌也同样起到了一定的抑制作用, 具体表现在分泌到培养液中的假黑盘菌素在发酵后期仍然能保持较高抑菌活性, 没有被发酵液中的累积的蛋白酶快速降解。与P-Ple相比, P-PleKar假黑盘菌素的表达量虽略有降低, 但可以维持更长时间的稳定表达。

一株高产纳豆激酶菌株的鉴定与分析

王雪妍, 孙玉飞, 冯菲, 陈晓飞, 李锋, 周伏忠

2016, 32(1): 187-194. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.030

摘要 ( 335 )

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鉴定高产纳豆激酶菌株Td, 分析纳豆激酶的分子特征。利用菌体形态、生理生化特征、以及分子生物学方法对菌株Td进行鉴定;并采用MALDI-TOF质谱测定与分析、SDS-PAGE和纤溶活性测定等方法检测纳豆激酶特性, 利用PCR方法扩增纳豆激酶的基因全长。结合菌体形态、生理生化特征和16S rDNA、gyrA基因序列、DNA-DNA杂交率等实验结果, 鉴定菌株Td为枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp. subtilis);菌株Td发酵产生的纳豆激酶产量可达300 mg/L以上, 占发酵液总蛋白的40%以上;纤溶活性达230 U/mL以上;氨基酸序列与subtilisin E的序列相似性最高;基因全长序列为1 143 bp。枯草芽孢杆菌枯草亚种Td是一株高产、高活性纳豆激酶的产生菌, 具有优良的工业化开发价值。

一株深海真菌FS86的分离鉴定及其生物活性研究

吴后吕, 李浩华, 谭国慧, 陈玉婵, 刘运美, 章卫民

2016, 32(1): 195-200. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.031

摘要 ( 356 )

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采用平板涂布法从南海深海沉积物中分离出一株真菌FS86, 根据培养特征、形态学特征和ITS序列分析, 该菌株被鉴定为球孢枝孢(Cladosporium sphaerospermum)。生物活性测试结果表明, 其发酵提取物对8种病原真菌和4种肿瘤细胞株都具有明显的抑制作用, 其MIC值和IC₅₀值分别为0.1-4 mg/mL和0.86-2.13 μg/mL。

基于酵母表面展示技术的胸苷磷酸化酶全细胞催化剂的构建

王洁, 余磊, 杨东, 李婕, 王洪钟

2016, 32(1): 201-206. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.032

摘要 ( 362 )

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胸苷磷酸化酶(TP)在核苷类代谢通路中发挥重要作用, 可催化生成多种核苷类似物。构建了TP的酵母表面展示系统作为全细胞催化剂。从大肠杆菌K12菌株中克隆编码TP的deoA基因, 利用酵母表达质粒pKFS构建重组质粒, 电击转化毕赤酵母GS115菌株。高拷贝阳性转化子经甲醇诱导96 h后, 免疫荧光结果显示TP在酵母细胞表面成功展示。利用β-胸苷为底物, 重组酵母细胞作为全细胞催化剂, 经HPLC检测, 结果表明展示在酵母表面的TP有催化活性, 可以催化β-胸苷生成产物胸腺嘧啶。

复合红景天苷支架材料对大鼠骨髓间充质干细胞的影响

王九娜, 向大伟, 唐俊杰, 李根, 赵玲, 秦文, 赵红斌

2016, 32(1): 207-212. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.033

摘要 ( 285 )

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探讨复合红景天苷微球的胶原蛋白材料支架对大鼠骨髓间充质干细胞的影响及作用。将红景天苷制作成微球复合到胶原蛋白中, 扫描电镜观察材料支架的表征, 接种大鼠骨髓间充质干细胞后扫描电镜观察细胞与材料的黏附性, CCK-8法测细胞在材料上的增殖情况, HE染色检测细胞在材料上的增殖及形态, S100免疫荧光化学法检测干细胞向神经细胞的分化情况。结果显示, 细胞接种到材料上, 在材料上黏附并生长。同种材料, 随着时间的延长, 材料上的细胞显著增殖(P <0.05)。神经细胞标志性蛋白S100表达为阳性。复合红景天苷微球的胶原蛋白具有良好的生物相容性, 红景天苷微球不影响细胞在材料上的增殖, 且可有效诱导大鼠间充质干细胞向神经细胞分化。

5-Aza-CdR对低氧NG108-15细胞的影响机制研究

张柱霞, 孙明英, 杨洁, 姜树原, 闫少春, 邵国

2016, 32(1): 213-219. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.034

摘要 ( 306 )

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通过使用DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)抑制剂5-氮-2'脱氧胞苷(5-aza-2'deoxycytidine, 5-Aza-CdR)和低氧干预神经细胞系NG108-15, 旨为揭示5-Aza-CdR、低氧、低氧预适应对NG108-15细胞增殖和细胞周期影响的相关机制。利用5-Aza-CdR(10.0 μmol/L)孵育NG108-15细胞后进行低氧与低氧预适应处理;使用倒置显微镜观察细胞形态的变化;通过RTCA分析细胞增殖指数;收集细胞后使用流式细胞仪检测各组细胞周期和细胞凋亡的变化情况;利用Real-time PCR检测甲基转移酶DNMTs和细胞周期相关基因在mRNA水平的表达变化情况。结果表明, 5-Aza-CdR和低氧抑制NG108-15细胞增殖, 促进细胞早期和晚期凋亡, 低氧预适应促进细胞的增殖。然而, 5-Aza-CdR处理后再低氧与低氧预适应, DNMTs和细胞相关周期基因的mRNA转录增加(P<0.05)。10.0 μmol/L的5-Aza-CdR联合低氧处理抑制细胞的增殖, 低氧预适应对细胞的增殖有促进作用。

TALENs新型模块组装法及活性鉴定方法

高敬, 魏迪, 池振奋, 张癸荣, 张万明, 聂凌云

2016, 32(1): 220-228. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.035

摘要 ( 317 )

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旨在提供一种新型的转录激活样效应子核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases, TALENs)模块组装法(Unit assembly, UA)及活性鉴定方法。利用TALE-NT 2.0在线工具在线粒体DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)设计TALENs识别位点和剪切位点, 借助pEGFP-N1质粒将该段靶序列随机整合于HEK293F核基因组中, 构建HEK293F-T1细胞系, 用于TALENs活性鉴定。依据转录激活样效应子(Transcription activator-like effectors, TALEs)自然单元模块序列, 设计出一种新型的人工TALEs偏单元;根据TALENs识别位点, 选取相应一单元模块, 利用UA法组装;并设计出含有相应双酶切位点的TALEs串联模块序列和TALENs载体序列, 定向连接后瞬时转染HEK293F-T1细胞系。结果显示, 新型模块组装法定向组装TALEs模块, 克隆效率高且瞬时转染后可看到清晰的套峰。结果表明, 新型模块组装方法提高了TALENs构建过程中的克隆效率, 并且不受末位0.5模块的RVD(repeat-variable diresidue)限制, 增加了靶序列设计的灵活性。

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2016, 32(1): 300.

摘要 ( 231 )

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