生物技术通报

钙抑制植物病害作用及机制的研究进展

王芳, 李振轮, 陈艳丽, 杨水英, 徐义

2017, 33(2): 1-7. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.001

摘要 ( 226 )

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钙不仅是植物生长必需的营养元素,在植物的生长发育中发挥着重要作用。研究发现,钙可减少和降低植物病害的发生。总结了钙抑制植物病害发生的作用机制：参与组织结构的形成,增强植物细胞稳定性和抗病能力;诱导植物产生防卫反应,增强植物抗病能力;调节植物的抗氧化系统,提高植物的抗病性;抑制病原菌的生长;与生防菌协同控制植物病害的发生等。最后,还探讨了矿质元素防治植物病害可能存在的问题以及应用前景,以期为进一步的研究提供参考。

植物根际促生细菌定殖研究进展

孙真, 郑亮, 邱浩斌

2017, 33(2): 8-15. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.002

摘要 ( 331 )

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植物促生菌（plant grwth-promoting bacterium,PGPB）因可有效抑制根际病原菌,促进植物生长,增加作物产量等作用,在农业生产领域展现出巨大前景。以了解植物根际促生细菌的种类,理解定殖相关的促生机制为目的,展示了根际细菌的定殖过程及影响细菌在根部定殖的因素,通过抗生素标记、免疫学方法、外源基因标记等方法进行定殖微生物的检测,以高通量测序技术在根际定殖中的广泛应用为结果,得出结论应从遗传水平上对菌株进行解读,获得植物根际土壤微生物群落多样性,功能基因等研究,这项工作对预测根际促生细菌与植物的交互作用,生物菌剂的田间应用有重要意义,应是植物根际促生细菌今后的研究方向。

优化大肠杆菌表达外源蛋白的研究进展

苏鹏, 龚国利

2017, 33(2): 16-23. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.003

摘要 ( 291 )

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大肠杆菌表达系统是目前表达外源蛋白的首选,利用该表达系统表达重组蛋白有许多优越性,但表达的外源蛋白容易被宿主蛋白酶攻击或未能正确折叠形成包涵体,其表达受到了限制。综述了国内外利用大肠杆菌表达外源蛋白过程中采用的一些优化策略,主要包括表达稀有密码子、应用融合标签,改变表达菌株、降低包涵体形成、单一蛋白技术、自诱导、流加培养以及高密度细胞培养等,以期探索外源蛋白表达的最优策略。

转运蛋白NupC与NupG微生物胞内核苷分泌的作用研究进展

王梦娇, 方海田, 刘慧燕, 贺晓光, 吴庆, 赵贝贝

2017, 33(2): 24-29. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.004

摘要 ( 201 )

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核苷用途广泛,微生物发酵法是其主要的生产方法之一。微生物细胞内核苷的分泌对于高产核苷有重要的作用,其细胞膜上存在多种起运输作用的转运蛋白参与代谢产物的分泌。主要阐述核苷转运蛋白NupC和NupG在微生物细胞内核苷分泌过程中的作用。此外,介绍了转运蛋白的修饰改造对于核苷生物合成的影响,旨在为构建高产菌株的育种策略提供依据。

GLP-1R结构和功能及小分子药物筛选研究进展

胡中平, 程念, 杨帆, 苏正定

2017, 33(2): 30-40. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.005

摘要 ( 384 )

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胰高血糖素样肽-1受体（glucagon-like peptide-1 receptor,GLP-1R）作为2-型糖尿病（T2DM）药物研发和治疗的靶点有着十分重要的临床意义。尽管通过结构生物学,蛋白质工程等方法和手段对于GLP-1R结构的研究有了较大突破。但是关于其全长结构解析,多肽结合受体的分子机理及受体激活的内在机制还不曾得到解决。近些年有关GLP-1R相关研究发展较快,简述了该受体的结构与功能以及已有的小分子药物先导化合物,并讨论GLP-1受体分子结构作用机制的发展方向及应用前景,旨为进一步探寻2型糖尿病的治疗方案提供有利的帮助。

基于核糖开关的新型基因表达调控系统的应用

熊莹喆, 曹苑青, 肖玲慧, 李招发

2017, 33(2): 41-46. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.006

摘要 ( 279 )

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核糖开关是能对细胞环境的改变做出反应的顺式作用元件,通过改变自身的构象实现对基因表达的调控。基于核糖开关调控方式简洁,无需蛋白质参与,响应迅速,且自身片段小,结构简单,易于设计和改造等特性使其在生物医学领域体现出诸多应用优势。对核糖开关的结构,调节机理以及这种新型基因表达调控系统在基因治疗、抗生素新靶点的开发、病毒疫苗的安全控制、新型核糖选择器和生物体内传感器的应用进行了综述,旨为启示我国核糖开关的新型应用。

人工miRNA技术及其在植物抗病育种中的应用

林艺华, 郑涛, 高三基, 陈振东

2017, 33(2): 47-52. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.007

摘要 ( 233 )

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内源miRNAs被认为是真核生物调控基因表达的重要调节因子,人工miRNA（amiRNA）是一种基于天然miRNA的结构用以沉默内源基因的有效策略。利用人工miRNA替换植物内源miRNA前体中miRNA/miRNA*序列,使产生的人工miRNA与靶基因配对,并特异性地抑制靶基因的表达。从天然miRNA的合成过程和作用机制,人工miRNA的设计基本原理及构建方法,人工miRNA技术在植物抗病育种上的应用等方面进行综述。

CRISPR/Cas系统最新研究进展

刘妮, 陆沁, 刘娟, 陈航

2017, 33(2): 53-58. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.008

摘要 ( 300 )

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CRISPR/Cas系统为细菌与古细菌中抵御外源病毒和质粒DNA入侵的获得性免疫机制系统。作为一种新型的基因组编辑技术,具有设计简单、特异性强、效率高等优点,为基因组定向改造调控和应用带来了突破性的革命。就CRISPR/Cas系统的研究背景、存在类型以及TypeⅡ和TypeⅢ CRISPR系统的基本作用原理和新的研究突破做了较为详尽的介绍,以便为读者和相关领域的研究者提供参考。

烟草碱法提取基因组DNA的改进

徐宗昌, 王萌, 孔英珍

2017, 33(2): 59-65. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.009

摘要 ( 214 )

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为能够快速高效的对大量转基因烟草样品进行DNA提取,对碱法提取烟草组织DNA的方法进行了改进。采用0.01 mol/L的NaOH溶液为提取液,破碎转基因烟草叶片组织后无需经过加热煮沸中和等步骤,上清液可直接用作PCR反应的模板。结果表明,0.01-0.1 mol/L之间的NaOH溶液制备的DNA模板均能成功扩增,该方法制备的DNA模板不依赖特殊的反应条件,多种品牌的PCR Mix均能成功进行扩增反应。与传统SDS提取法和试剂盒提取法获得的DNA相比,PCR结果没有明显差异。此提取方法在小麦、高粱、水稻、玉米等作物上也取得了很好的实验效果。通过本方法制备的DNA模板,其PCR扩增的产物可直接用来测序分析。该方法使用仪器少,样品消耗少,快速、简便、成本低,没有交叉污染,能够在短时间内处理大量样品,因此能够对大量的转基因烟草样品进行DNA的快速提取和鉴定。

重金属污染土壤的植物仿生和植物修复比较研究

郝大程, 周建强, 王闯, 韩君

2017, 33(2): 66-71. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.010

摘要 ( 237 )

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土壤是人类赖以生存和发展的重要物质基础,但是随着工业化、城市化的快速推进,我国面临的土壤环境安全问题日益严峻。探讨新型植物仿生修复技术修复重金属污染土壤的可行性,采用基于植物仿生的重金属污染土壤原位自持修复技术,研究该方法对重金属污染土壤的修复能力。研究不同填充材料（海泡石、高岭土、活性炭、硅藻土）的仿生修复装置修复同一种金属离子（铅、铬、镉或锌）的效果和同一填充材料的仿生修复装置对不同金属离子的修复效果,并首次将植物仿生修复与植物修复效果进行对比。结果显示,植物仿生修复装置对不同的重金属离子具有不同的降低效率,海泡石组Cr含量降低最多,4种填料均显著降低褐土Zn和Cd含量,含硅藻土的装置Pb去除率最高。这与重金属本身性质有一定关系,也与吸附填料类型相关,同时与重金属含量及饱和吸附位点密切相关。与单纯植物修复比较,仿生修复与植物修复联用,显著降低红土Cd和Pb含量,且对植物富集Cd和Pb无消极影响,同时海泡石+硅藻土+高岭土+活性炭组填料中Pb和Cd含量高于其它填料组合。该技术可以与植物修复技术、微生物修复技术、物理-化学修复技术等联用,构建污染土壤的复合修复技术。植物仿生修复作为一种新型修复技术可以有效降低土壤重金属含量。在同一条件下,植物仿生修复与植物修复相比,效率较高,吸附重金属的量较大。

油葵种子特异启动子Ha ds10 G1的克隆及功能鉴定

孙黎, 周茜萍, 齐梓云, 王梦瑶, 陈福龙

2017, 33(2): 72-79. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.011

摘要 ( 204 )

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从油葵中克隆得到LEA蛋白基因家族Ha ds10 G1基因的启动子序列,并对其进行功能分析。利用PCR 技术从油葵品种“矮大头“基因组DNA中分离Ha ds10 G1基因上游的调控序列,将其与GUS 基因融合,构建种子特异性表达载体pBI121-PHa ds10,通过根癌农杆菌介导法转化烟草（Nicotiana tabacum）NC89,对再生植株进行PCR、RT-PCR和GUS组织化学分析,以检测GUS基因在转基因烟草中的表达情况。结果表明,油葵Ha ds10 G1基因启动子长度为 1 417 bp,与已报道的向日葵Ha ds10 G1基因启动子序列同源性为89.42%。作用元件分析发现该区域除了具有启动子核心调控序列外,还含有多个与组织特异性、激素、逆境等表达相关的顺式作用元件,如RY重复元件、ABRE元件、TC-rich元件等。转基因植株的PCR结果显示,成功地获得了转基因阳性植株;GUS活性检测表明,该启动子序列仅能够驱动GUS基因在烟草种子表达,而在根、茎、叶等组织中均未检测到GUS基因表达。因此,油葵LEA蛋白基因家族Ha ds10 G1基因上游1 417 bp片段具有种子特异性启动子功能。研究结果为油葵等油料作物的油脂遗传改良提供组织特异性启动子。

结缕草转录因子基因ZjDREB4.1克隆和逆境表达模式

李京, 吴奇, 张琳婕, 李旭婷, 周敏琪, 韦善君

2017, 33(2): 80-88. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.012

摘要 ( 212 )

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以日本结缕草（Zoysia japonica）‘Meyer’品种为材料,克隆获得了1个DREB（dehydration responsive element binding）类转录因子基因,命名为ZjDREB4.1。该基因编码区长651 bp,编码216个氨基酸,推测的蛋白质ZjDREB4.1分子量为22.9 kD,等电点pI为5.74,第50-110位氨基酸组成一个典型的AP2 保守结构域。在基因的系统发生树中,ZjDREB4.1蛋白与拟南芥AtTINY蛋白和玉米ZmDBF2蛋白聚为一支,属于DREB亚家族A-4组。在叶组织中ZjDREB4.1为组成型表达,受低温诱导上调表达,在干旱和高盐胁迫下表达先下调后恢复至正常水平。

牦牛TMEM-18基因多态性及其与生产性能关联分析

张欢, 张全伟, 王琪, 马友记, 张勇, 赵兴绪

2017, 33(2): 89-96. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.013

摘要 ( 174 )

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跨膜蛋白18基因（TMEM-18）是一个末端为低聚嘧啶的基因,与动物生长发育密切相关。为了研究牦牛TMEM-18 基因多态性与生产性能的关系。以192头天祝雌性牦牛血样NDA构建混合池,扩增TMEM-18基因内含子1和外显子5的序列。运用BLAST和Chromas软件分析突变位点,运用高分辨率熔解曲线分析技术（HRM）统计基因型分型,采用SHEsis 软件进行基因型频率和等位基因频率计算,同时对多态位点进行配对连锁不平衡和单倍型分析,运用SPSS21.0分析基因多态位点与生产性能关联。结果表明,牦牛TMEM-18基因内含子1处存在2个多态位点,分别是861（A/G）和1267（C/T）,外显子5处存在1个多态位点为4 447（C/T）。关联分析表明,牦牛TMEM-18基因861（A/G）位点的不同基因型与牦牛的体高、体重、胴体重和屠宰率差异性显著（P<0.05）;1267（C/T）位点的不同基因型与牦牛的体高、体重和屠宰率差异性显著（P<0.05）,而牦牛TMEM-18基因4447（C/T）位点的不同基因型与牦牛的体斜长、管围、胸围、体重、胴体重、净肉重、净肉率和屠宰率均存在显著性差异（P<0.05）。通过单倍型分析发现群体中存在3种单倍型组合,即ACC单倍型、GTC单倍型和GTT单倍型,其中ACC单倍型组合个体数目明显多于其他单倍型组合,为优势单倍型。本实验揭示TMEM-18基因可作为牦牛生产性能开发的候选分子标记,为牦牛遗传资源的利用、开发与新品种的选育提供依据。

齐口裂腹鱼白介素-1β基因的克隆及表达谱

段荟芹, 王利

2017, 33(2): 97-101. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.014

摘要 ( 200 )

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探讨齐口裂腹鱼白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）基因的基本特点。用RT-PCR方法以齐口裂腹鱼脾脏cDNA作为模板扩增IL-1β基因,用生物信息学软件分析其序列,用RT-PCR方法检测IL-1β基因在齐口裂腹鱼6种组织的表达情况。克隆获得的IL-1β序列长1 252 bp,共编码276个氨基酸。GenBank 序列号为KU886235。IL-1β蛋白相对分子量为31.25 kD,等电点5.45,预测为亲水性蛋白。二级结构主要结构元件为随机卷曲和延伸链,有4个N-糖基化位点和16个磷酸化位点。NJ法系统进化树显示,齐口裂腹鱼与鲤鱼、鲫鱼的亲缘关系最近。组织表达分析显示,IL-1β基因主要在脾脏和肾脏中表达。这为深入研究鱼IL-1β的生物学功能提供理论依据。

家蝇几丁质酶基因MDCII重组表达质粒的构建及表达模式研究

杨尉锦, 国果, 吴沁怡, 李妍, 付萍, 张勇

2017, 33(2): 102-108. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.015

摘要 ( 198 )

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从家蝇EST测序数据库中筛选获得家蝇几丁质酶基因 MDCII,对该基因进行克隆及分子特性分析,探讨其在家蝇不同组织、不同发育时期及经不同微生物诱导后的时空表达模式。利用EST测序技术从已构建的家蝇幼虫cDNA质粒文库筛选出MDCII基因,运用生物信息学方法分析该基因序列及其编码蛋白的理化特性,采用邻接法构建系统进化树;PCR技术扩增目的基因,构建pEASY-E1-MDCII重组质粒,转化到Trans1-T1克隆感受态细胞中;采用实时荧光定量PCR（Real Time PCR）技术,检测MDCII基因在不同发育时期和不同组织部位的表达差异;采用注射法将不同微生物导入到家蝇3龄幼虫体内,Real Time PCR检测诱导后不同时间点MDCII基因表达水平的变化。结果显示,MDCII基因的ORF框全长1 374 bp,编码457个氨基酸,理论分子量51.6 kD,进化树分析比对与果蝇成虫盘生长因子的遗传距离较近。构建了具有正确基因序列的pEASY-E1-MDCII重组质粒。MDCII基因在家蝇不同发育阶段中均有不同程度的表达,在3龄幼虫中,以唾液腺和脂肪体中的表达水平较高;在白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌诱导后3 h,MDCII基因均出现明显的表达上调。MDCII基因属于几丁质酶中成虫盘生长因子,参与了家蝇的生长发育,在免疫防御过程中也发挥了一定作用。

珠子参β-香树素合成酶基因的克隆和生物信息学分析

吴亚运, 赵小龙, 陈平, 张绍鹏

2017, 33(2): 109-117. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.016

摘要 ( 212 )

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β-香树素合成酶（beta-amyrin synthase βAS）是定向分流齐墩果烷型皂苷和达玛烷型皂苷的限速酶,对药用植物三萜皂苷的生物合成具有重要的调控作用。基于珠子参转录组数据中βAS转录本序列设计引物,利用RT-PCR方法从珠子参根状茎中克隆得到βAS基因全长cDNA序列,命名为pjβAS。经测序鉴定该基因长度为2 655 bp,包含一个2 286 bp的完整开放阅读框,编码761个氨基酸,在GenBank数据库的登录号为KX254566。生物信息学分析显示,其编码蛋白分子量为87.90 kD,理论等电点（pI）5.84,不含跨膜区,为非分泌蛋白,含有38处磷酸化位点,主要于叶绿体和内质网中发挥生理作用;二级结构预测发现其α-螺旋占39.82%、延伸链16.56%、β-转角10.38%、无规则卷曲33.24%,具有DCTAE、QW（QXXXXXW）和MWCRCY3个氧化鲨烯环化酶（OCS）基因家族特征保守基序;pjβAS蛋白与竹节参（AKN23431.1）序列的一致性为100%,系统进化分析中与竹节参（AKN23431.1）、西洋参（AGG09939.1）、柴胡（ABY90140.2）划为同一分支。通过实时荧光定量PCR分析pjβAS在珠子参不同组织中的相对表达量,发现pjβAS基因在花、叶、茎、根状茎中均有表达,在叶中表达量最高,根状茎中表达量最低。

香蕉海藻糖合成酶基因（MaTPS5）生物学及表达特性分析

邢文婷, 李科明, 贾彩红, 舒海燕, 王安邦, 孙佩光, 许桂莺

2017, 33(2): 118-124. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.017

摘要 ( 173 )

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通过研究香蕉MaTPS5基因的生物学功能,探讨海藻糖合成酶基因在香蕉植株抗逆反应中的作用。利用随机克隆测序法从香蕉根系转录组中获得海藻糖合成酶基因,命名为MaTPS5。生物信息学分析表明,MaTPS5全长cDNA序列3 081 bp,完整开放阅读框2 559 bp,编码852个氨基酸;MaTPS5蛋白属于不稳定、疏水性蛋白,等电点pI6.52,有两个结构域GT1-TPS和TPP,定位于细胞质中,含2个跨膜区域,不存在信号肽;与已知植物TPS氨基酸序列同源性达到77.31%;进化分析表明,香蕉MaTPS5氨基酸序列与野蕉TPS氨基酸序列聚为一类,说明二者亲缘关系较近,具有共同的祖先。组织特异性表达研究表明MaTPS5在球茎、叶、花中表达量较高,在根中表达量最低。qRT-PCR分析表明,MaTPS5响应激素ACC和盐的处理,表达量在24 h均达到极显著水平。在Foc TR4病原菌处理后,表达量升高,并在3个时段保持一致。结果表明,MaTPS5可能依赖乙烯信号传导途径诱导自身表达,合成海藻糖,参与香蕉抗逆反应。

一种具有琼胶酶活性的海洋细菌淀粉酶的表达和分析

林伯坤, 宋燕, 陆国永, 赵敏, 钟名其, 胡忠

2017, 33(2): 125-130. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.018

摘要 ( 177 )

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旨在验证海洋新种细菌ZC1中可能存在的具有琼胶酶活性的淀粉酶。对菌株ZC1中的淀粉酶编码基因amy440进行基因克隆和重组原核表达,并用活性电泳法验证重组蛋白的淀粉酶和琼胶酶活性。结果显示,基因amy440的重组蛋白在淀粉酶和琼胶酶活性电泳上均出现活性显色条带。菌株ZC1中基因amy440的编码蛋白是一种具有琼胶酶活性的淀粉酶。

新疆特色植物恰玛古块根内生真菌的分离与鉴定

梁寒峭, 迪丽达尔·库德热提, 白飞荣, 苗蕾, 李南南, 刘素辉, 陈建国, 刘洋, 孙玉萍

2017, 33(2): 131-136. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.019

摘要 ( 262 )

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植物体的内生真菌与其自身生长及生物防御均有密切关系,因此对健康恰玛古块根组织进行内生真菌分离与纯化,利用形态学结合分子鉴定方法对内生真菌群落多样性进行了初步研究。从恰玛古块根中共分离到可培养内生真菌29株,鉴定结果分属于8个属的11个种,其中支顶孢属（Acremonium sp.）和青霉属（Penicillium sp.）为优势属,分别占总菌株数的34.48%和27.59%。为国内外首次对新疆特色药用植物恰玛古内生真菌进行分离研究,并对其分类地位进行了确定。

豨莶草内生抗感染细菌的分离鉴定及生长特性

陈少红, 赵朋超, 陈明钊, 李洛宜, 李悦, 贾靖靖

2017, 33(2): 137-142. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.020

摘要 ( 174 )

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豨莶草有多种药用价值,旨在从豨莶草果实中分离和筛选出高拮抗活性的内生细菌。采用了形态学观察、生理生化试验、16S rRNA 序列比对、系统发育树分析以及OD₆₀₀值、药敏试验和超滤等方法对该抗感染细菌C-5-1进行了相关生物学特性评价。结果显示,C-5-1为侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）,对多种病原细菌均敏感,尤其是对铜绿假单胞菌;低pH和高NaCl盐度环境中耐受性有限,在pH≤5.0或盐度≥15%时其生长受到了完全的抑制甚至是死亡,但在pH范围7.0-11.0和盐度范围0-5%下均能生长良好,说明该菌株为耐碱,但不耐酸和盐;筛选出了对菌株C-5-1高度敏感而对5种指示病原菌耐药的抗生素,即氨苄西林;C-5-1发酵上清液中存在着两种抗菌物质,且它们的相对分子质量均小于2 000。因此豨莶草有着优良微生物资源,可以成为开发抗感染细菌药物的重要资源。

一株枯草芽孢杆菌噬菌体的生物学特性分析及抗性菌株的诱变筛选

刘秀侠, 徐海燕, 辛国芹, 穆熙军, 孙学森, 谷巍

2017, 33(2): 143-148. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.021

摘要 ( 371 )

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枯草芽孢杆菌工业生产发酵过程中经常出现噬菌体污染的问题,分离筛选以枯草芽孢杆菌为宿主菌的噬菌体,分析其生物学特性并采用自发突变方法筛选噬菌体抗性菌株。以枯草芽孢杆菌KC-260为宿主菌,从车间异常发酵液中分离纯化得到一株噬菌体,将其命名为P260,富集培养后测定效价,对其热稳定性、最佳感染复数、宿主范围、抑制剂和消毒剂耐受性等生物学特性进行了研究。为防治噬菌体P260的污染,利用自发突变的方法筛选对噬菌体P260有抗性的枯草芽孢杆菌突变菌。结果显示,分离纯化得到一株效价为3.45×10¹⁰ PFU/mL的噬菌体P260,该噬菌体具有一定的宿主专一性,对凝结芽孢杆菌和短小芽孢杆菌不敏感。噬菌体P260在高温条件下很容易失活,不耐热,70℃处理15 min存活率下降极为明显;25 mg/L的ClO₂对P260有极强的杀灭作用;0.5%的草酸铵和柠檬酸铵对该噬菌体有一定的抑制作用。P260感染宿主菌的最佳感染复数为0.01,增殖的潜伏期为15 min,45 min进入裂解期。通过自发突变的方法获得了抗噬菌体菌株ZF-260,发酵过程中添加噬菌体后ZF-260的生长不受影响,说明ZF-260是一株可以抗噬菌体P260的优良菌株。研究了噬菌体P260的生物学特性,获得了遗传稳定且活菌数高的抗性菌株ZF-260。

基于四环素调控系统的叶绿体启动子在大肠杆菌中活性检测

于晓俊, 曹绍玉, 董玉梅, 毕保良, 张应华, 许俊强

2017, 33(2): 149-154. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.022

摘要 ( 214 )

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旨在研究四环素调控系统在叶绿体基因工程中调控启动子活性。以四环素基因及四环素特异性识别序列的核心操控区为基础,首先合成带有四环素核心操控区的prrnO1O2启动子,通过酶切连接的方法连接到表达载体Bio3-GFP,并在大肠杆菌中验证该启动子的活性。结果表明,在该启动子的驱动下GFP基因表达使菌落呈明亮绿色;构建四环素诱导下GFP基因的表达载体Bio3-TetR-prrnO1O2-GFP,筛选出适应大肠杆菌生长的最高四环素使用浓度为5 μg/mL;然后构建四环素调控系统下的GFP表达载体,在未加入四环素时,prrnO1O2启动子的功能被抑制,加入四环素后,GFP基因表达出绿色荧光蛋白。说明利用四环素调控系统可以在大肠杆菌中控制叶绿体启动子prrnO1O2的活性,从而避免了核基因组对质体基因组的调控干扰,为进一步利用质体基因工程育种提供有效的方法和途径。

耐辐射异常球菌dlp基因缺失突变株构建及其生物学功能研究

刘小利, 江世杰, 薛冬, 刘盈盈, 吴小丽, 冯帅, 韩佳慧, 汪雨舟, 平淑珍, 王劲

2017, 33(2): 155-163. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.023

摘要 ( 194 )

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耐辐射异常球菌（Deinococcus radiodurans,DR）因其具有对非生物胁迫超强的抵抗能力而备受关注。旨在了解该菌亲水蛋白Dlp在细胞耐受非生物胁迫中的作用,采用融合PCR和基因同源重组技术,获得了dlp基因缺失突变株Δdlp,对野生型DR及突变株Δdlp进行非生物胁迫。结果表明,dlp的缺失导致DR细胞对高盐和氧化胁迫敏感。体外检测氧化胁迫条件下Dlp蛋白对苹果酸脱氢酶（MDH）和乳酸脱氢酶（LDH）活性的保护,结果显示,Dlp蛋白的加入能缓解氧化胁迫条件下MDH、LDH酶活性的损失。由此表明,亲水蛋白Dlp增强了耐辐射异常球菌对非生物胁迫的抗性,并能以类似分子伴侣的形式保护胁迫条件下酶的活性。

铁蛋白DrfE对耐辐射异常球菌抗氧化酶活性的影响

吴小丽, 刘盈盈, 江世杰, 陈云, 刘小利, 汪雨舟, 平淑珍, 王劲

2017, 33(2): 164-171. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.024

摘要 ( 197 )

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为研究耐辐射异常球菌（Deinococcus radiodurans）中drfE编码的铁蛋白DrfE的功能,通过基因回补试验构建drfE基因的回补菌株（pdrfE∷Δ）,对野生型WT、突变株ΔdrfE及回补菌株pdrfE∷Δ进行不同浓度H₂O₂和NaCl胁迫,分别测定野生型WT、突变株ΔdrfE和回补菌株pdrfE∷Δ体内Fe²⁺含量及抗氧化酶类活性。结果显示,drfE基因缺失导致菌株对氧化和盐胁迫敏感,该基因的回补能够恢复菌株对氧化和盐胁迫的抗性。drfE基因缺失导致耐辐射异常球菌体内Fe²⁺浓度由232 μmol/L增加至293 μmol/L;80 mmol/L H₂O₂处理30 min后,突变株ΔdrfE的CAT活性下降32.74%,SOD下降41.3%。以上结果表明DrfE蛋白可能参与耐辐射异常球菌铁代谢途径,并且在细胞抗氧化体系中发挥重要作用。

非生物胁迫条件下施氏假单胞菌生物膜形成规律的研究

闫宁, 杨智敏, 尚立国, 戴淑玲, 战嵛华, 陆伟, 林敏, 燕永亮

2017, 33(2): 172-178. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.025

摘要 ( 204 )

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旨在系统研究非生物胁迫因素对固氮施氏假单胞菌A1501生物膜形成能力的影响,测定了不同NaCl浓度、pH值、温度等培养条件下A1501生长及其生物膜形成能力的变化规律。结果显示,上述3种环境因素均对A1501菌的生长及生物膜形成具有影响,且呈现出一定的规律性。NaCl浓度2 mmol/L、pH值6.8、温度30℃是A1501的最适生长条件,而在0.6 mol/L的NaCl、pH值6.0及温度40℃等胁迫条件下,A1501菌的生物膜形成量均达到最高,分别为最佳生长条件下的7.8、7.0和2.0倍。在测试的诸因素中,NaCl浓度对A1501生物膜形成影响最大。以上结果表明,生物膜的形成与菌体生长负相关,即高盐、弱酸、高温等条件不利于A1501的生长,但刺激了其生物膜的形成。

铁蛋白基因Fth1的克隆及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

刘伟, 朱修良, 李清海

2017, 33(2): 179-184. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.026

摘要 ( 221 )

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旨在构建编码大鼠铁蛋白重链多肽1（ferritin heavy chain 1,Fth1）的慢病毒,并检测其在大鼠骨髓间充质干细胞（RMSC）中的表达。PCR扩增大鼠Fth1基因,克隆至pLenti-GFP-C慢病毒表达载体,包装慢病毒,感染RMSC细胞。荧光显微镜观察细胞内GFP荧光情况,Western blot检测Fth1的表达情况,WST-1试剂检测Fth1慢病毒感染组（RMSC-Fth1）和空载体组（RMSC-GFP）的细胞增殖活性。DNA测序结果表明,pLenti-GFP-C-Fth1慢病毒载体构建成功。包装慢病毒感染RMSC细胞后,荧光显微镜下可见明显绿色荧光,表明感染成功。Western blot结果显示,实验组细胞裂解液中可检测到特异的Fth1表达条带。细胞增殖实验显示,与空载体组相比,过表达Fth1并不影响RMSC细胞生长。成功构建并包装携带大鼠Fth1基因的慢病毒,其能够成功感染RMSC细胞并表达Fth1蛋白,且对细胞增殖无明显影响。

增加规则重复序列对光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP914热滞活性的影响

王军, 杜荣俸, 刘忠渊, 毛新芳

2017, 33(2): 185-191. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.027

摘要 ( 186 )

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旨在探究光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP914结构与热滞活性（Thermal hysteresis activity,THA）的关系。采用基因合成的方法,在光滑鳖甲抗冻蛋白基因ApAFP914中增加单个规则重复序列并进行蛋白原核表达及热滞活性测定。结果显示,增加单个重复序列的ApAFP-C914为312 bp,融合蛋白TrxA-ApAFP-C914经SDS-PAGE及Western bolt分析表明,分子量为34 kD。差示扫描量热法（Differential scanning calorimetry,DSC）测定表明,在50 μg/mL的浓度下,增加单个重复序列显著提高了ApAFP的THA活性。光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP914增加一个重复序列可显著提高其热滞活性。

α-芋螺毒素GIC与Ac-AChBP共结晶条件的筛选与优化

林波, 刘坤, 朱明月, 李伟, 董栩, 李孟森

2017, 33(2): 192-198. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.028

摘要 ( 180 )

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旨在筛选及优化α-芋螺毒素与乙酰胆碱结合蛋白（AChBPs）共结晶的条件,得到高分辨率的共结晶晶体。在昆虫表达系统中分泌表达海兔乙酰胆碱结合蛋白（Ac-AChBP）,并用凝胶色谱进行纯化,把纯化的乙酰胆碱结合蛋白与α-芋螺毒素GIC共结晶,利用结晶机器人及HAMPTON RESEARCH 结晶试剂盒进行结晶及结晶条件的筛选与优化。结果显示,在0.6 mol/L Ammonium citrate dibasic,0.1 mol/L Sodium acetate trihydrate pH4.8的条件下生长的晶体较好,其分辨率可以达到2.1 Å。筛选与优化结晶条件（Ammonium citrate dibasic的摩尔浓度及0.1 mol/L Sodium acetate trihydrate的pH值）可以得到高分辨率的α-芋螺毒素GIC与Ac-AChBP共结晶晶体。

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2017, 33(2): 300.

摘要 ( 106 )

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