生物技术通报

宏基因组技术在氮循环功能微生物分子检测研究中的应用

王朱珺, 王尚, 刘洋荧, 冯凯, 邓晔

2018, 34(1): 1-14. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0024

摘要 ( 701 )

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氮循环是最重要的生物地球化学循环之一,而微生物是驱动自然环境中氮循环最重要的动力。应用宏基因组技术来研究自然环境中直接参与氮循环的功能微生物类群的总量和多样性是近年来环境微生物的研究热点之一。本文总结最新氮循环功能微生物类群的研究发现,聚焦各转化过程中（包括固氮、硝化、反硝化、厌氧氨氧化、氮同化/异化还原、氨化和同化作用等）分子标记基因的选择,重点介绍通过这些标记基因的分子检测方法在自然环境中检测到的微生物功能类群的分布状况,最后指出分子检测技术的革新和完善的数据分析平台的建立对未来氮循环功能微生物研究的重要意义。

内质网胁迫在植物中的研究进展

陈倩, 谢旗

2018, 34(1): 15-25. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0996

摘要 ( 412 )

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内质网是膜蛋白和分泌蛋白合成新肽链以及新肽链初步折叠修饰的重要场所,只有经过二硫键形成、羟基化以及糖基化等修饰的肽链正确折叠后才能达到其正确蛋白质构象,或进入高尔基体进行进一步的修饰和折叠。然而,折叠和修饰的过程是复杂且易错的,如果生命体遭受某些内源或外源的压力,出错概率会成倍增加。错误折叠的蛋白质由内质网中的质量检测系统识别并滞留在内质网内,一旦错误蛋白积累量超过内质网的承受能力,就会引起细胞一系列的响应以实现新的内质网稳态,这个过程称为内质网应激反应,也称内质网胁迫应答。重新实现内质网稳态的方法主要有非折叠蛋白反应、内质网相关的蛋白质降解过程、自噬过程以及细胞凋亡。这些过程在酵母和动物领域的研究已经非常系统,主要总结了这些过程在高等生物中的保守作用机制以及在植物领域的研究进展,希望能够为致力于植物生长发育或胁迫响应过程的研究人员提供参考。

植物F-box基因家族的研究进展

许克恒, 张云彤, 张莹, 王彬, 王法微, 李海燕

2018, 34(1): 26-32. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0636

摘要 ( 729 )

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F-box基因家族是植物中最大的基因家族之一,由于其数量巨多,根据其蛋白C末端结构域的不同被分为不同的亚家族。F-box基因编码的蛋白能够调节多种多样的生命活动,如延缓植物衰老、调控植物开花以及响应生物胁迫、干旱和盐等逆境胁迫。近年来,随着全基因组测序的不断完善,越来越多物种的F-box基因被分析鉴定出来。已经鉴定出功能的F-box基因编码的蛋白大多能够和结合蛋白Skp1、骨架蛋白Cullin 1及Rbx1形成SCF复合体,进而参与泛素-蛋白酶途径（UPP）而发挥作用;少部分F-box蛋白以非SCF复合体形式发挥作用。泛素-蛋白酶途径（UPP）是机体重要的调节机制之一,大多数细胞内蛋白都是经过这一途径降解。主要对其蛋白结构,作用途径以及生物学功能进行概述,探讨F-box基因参与的生命活动,旨为F-box的深入研究奠定基础。

植物防御素基因家族结构、功能及调控研究进展

官丽莉, 崔琪, 李声钊, 董程, 李海龙, 彭建豪, 李校堃

2018, 34(1): 33-39. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0457

摘要 ( 427 )

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防御素（Defensins,DF）是抗菌肽家族中最古老的一员。植物防御素是一类包含45-54个氨基酸残基,含有半胱氨酸（Cys）稳定的αβ模序,与哺乳动物及昆虫抗菌肽的亲缘关系非常密切,大部分植物防御素在体内被合成为具有信号肽序列的前体,并被分泌到胞外空间。植物防御素在宿主防御系统中起重要作用,不仅可抑制一系列的植物、动物及人类体内的细菌、真菌,还可杀伤一些肿瘤细胞及病原虫。植物防御素广泛存在于植物的花、茎、叶、果实、根和种子中,具有抗菌、抗肿瘤、抑制酶活、作为离子阻断剂和增加耐受性的功能,可作为新型的杀菌剂或新型的抗生素类药物。随着抗生素导致的耐药菌株的出现,对植物防御素的研究就显得尤为重要,特别是因其有效的抗真菌活性,植物防御素在作物抗病基因工程方面具有巨大的潜力。主要介绍了其发现、结构、类型、逆境调控功能、作用机制以及外源表达植物防御素基因等方面的最新研究进展,有助于将来对植物防御素基因家族进行更深入和全面的研究。

WRKY转录因子的研究进展

张凡, 尹俊龙, 郭瑛琪, 岳艳玲

2018, 34(1): 40-48. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0703

摘要 ( 420 )

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WRKYs是高等植物中最大的转录因子家族（TFs）之一。它具有特殊结构-WRKY结构域,这些结构可使WRKY转录因子拥有不同的转录调控功能。WRKY TFs不仅可以通过调节植物激素信号转导途径来调节它们的应激反应,还可以结合其靶基因启动子中的W-box[TGACC（A / T）],通过激活或抑制下游基因的表达来调节它们的应激反应。此外,WRKY蛋白不仅可以与其他TFs相互作用来调控植物防御反应,而且还可以通过识别和结合本身目标基因中的W-box进行自我调节以调控其对各种压力的防御反应。因此,WRKY TFs不管是在植物响应生物胁迫中,还是非生物胁迫中都具有重要的作用。但是,近年来,关于WRKY TFs在高等植物中的调控作用的研究综述稀少且深度较浅。重点阐述了WRKY TFs的结构特征和分类,在植物生物胁迫和非生物胁迫中发挥的作用,以及通过调节植物激素信号转导途径、MAPK信号级联和自调控来调控各种胁迫,以期为将来WRKY TFs的研究提供理论参考和思路。

合成生物学在改善肠道健康状态中的应用与展望

杜若曦, 郭明璋, 谢子鑫, 贺晓云, 黄昆仑, 许文涛

2018, 34(1): 49-59. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0648

摘要 ( 338 )

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合成生物学是一个新兴的研究领域,它是指新的人工生物路径、有机体或装置的设计和构建,或者对自然生物系统进行重新设计。利用合成生物学改造肠道微生物中的共生细菌,使其实现对肠道菌群或肠道细胞状态的靶向调控,可以有效的改善宿主的肠道健康状态。由于该方法可塑性较强,可调控的靶标范围广泛、调控针对性强,副作用少,因此已逐步应用于肠道疾病的治疗中。综述了合成生物学在杀死肠道致病菌,维持肠道菌群平衡,协助肠道代谢营养物质,改善代谢疾病,诊断肠道疾病,定位肿瘤组织及调节肠道免疫系统等方面的研究进展,分析了现阶段合成生物学用于改善肠道健康状态中的优势和存在的问题,并在此基础上提出了“应用合成生物学建立人体肠道健康调控的新型功能性益生菌系统,实现对肠道健康的个性化医疗”的技术路线和管理体系。

线粒体表观遗传学研究进展

柳莹, 高丽, 冯俊荣

2018, 34(1): 60-66. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0649

摘要 ( 357 )

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作为细胞内的“动力工厂”,线粒体是细胞内进行氧化磷酸化反应和形成ATP的主要场所。传统观点曾认为线粒体缺乏表观遗传机制,但线粒体DNA甲基化酶以及线粒体DNA中5-甲基胞嘧啶与5-羟甲基胞嘧啶的发现推翻了这一论断。在线粒体中,DNA甲基化酶、DNA甲基化模式及DNA羟甲基化模式与核基因组DNA相比均存在较大差异,而外界环境中不同因子的变化也会对线粒体DNA的甲基化状态造成影响。除此之外,线粒体DNA的表观遗传因素还包括线粒体长链非编码RNA、线粒体miRNA和线粒体DNA结合蛋白。随着研究技术手段的不断完善,将线粒体DNA的甲基化状态作为生物标记的应用将日益广泛,其与基因组表观遗传调控的关联也将得到进一步的揭示。

重离子的辐射生物效应及其在生命科学中的应用

贾蓉, 苏锋涛, 胡步荣

2018, 34(1): 67-78. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0735

摘要 ( 538 )

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重离子是指重于元素周期表中2号元素氦并被电离的粒子。高能重离子因在其穿透物质的径迹上产生很强的局部电离,与传统的光子辐射（如X、γ射线）相比,会诱导更严重的辐射损伤生物效应。目前的机理研究显示,重离子辐射造成细胞DNA局部一到两个螺旋内出现多类型、多数量的损伤,即DNA团簇损伤。这种复杂的损伤影响DNA修复酶与DNA片段结合,进而影响修复,导致细胞死亡或产生不正确修复（即突变）。重离子辐射易引起突变的特征在植物与微生物诱变育种方面得到青睐。此外,重离子的细胞杀伤作用大,而且重离子具有倒转的剂量分布优势,将其用于癌症治疗,可使深部区域肿瘤细胞因高剂量辐射而被有效杀灭,而对周围组织因低剂量分布、相对危害较小,能实现精确靶向治疗,这被认为是最有前景的肿瘤放疗技术。对由重离子造成的DNA团簇损伤及其修复机制,以及两个重要修复途径的研究进展,进行了总结与深入分析。此外,我们还对重离子在辐射诱变育种和肿瘤治疗方面的应用进行了概要介绍,以期为从事重离子辐射生物学研究的人员理解DNA团簇损伤与修复机制及未来研究方向提供参考,促进对重离子辐射危害的评估与防护策略的建立、及其在生命科学中的良好应用。

小分子化合物诱导细胞重编程研究进展

顾珊, 赵高平, 李喜和

2018, 34(1): 79-83. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0613

摘要 ( 371 )

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细胞重编程指细胞内的基因表达由一种类型转变为另一种类型,通常包含两层含义：一是分化的细胞重新恢复到多能性或全能性状态;二是从一种分化的细胞转变为另一种分化的细胞。细胞重编程可为临床患者特异性细胞治疗提供无限的细胞资源。细胞重编程的途径有细胞核移植、转染特定转录因子、小分子化合物诱导等方法。核移植技术由于通常需要使用到卵子,而被认为存在伦理问题;转录因子的导入存在引起宿主基因突变的问题,限制了这一技术的临床应用。然而小分子化合物容易合成、细胞渗透性好,并且生物效应具有可塑性,使用小分子化合物诱导细胞重编程,避免了核移植的伦理问题和基因操作潜在的危害。目前,使用小分子化合物从体细胞诱导获得更安全的iPSCs（induced pluripotent stem cells）,ciCMs（chemically induced functional cardiomyocyte cells）和ciNSLCs（chemical-induced neural stem cell-like cells）。对小分子化合物诱导细胞重编程,包括小分子化合物诱导多能干细胞;小分子化合物诱导潜能扩展的多能干细胞,以及小分子化合物诱导细胞转分化等方面的研究做了总结,并对小分子化合物诱导的未来发展做了展望,旨在为今后这方面的研究提供借鉴。

酶联免疫吸附反应对猕猴桃溃疡病菌效应子Hopz5多克隆抗体的特性分析

胡月, 陈航, 杨巽喆, 李庆, 杨辉

2018, 34(1): 84-89. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0668

摘要 ( 271 )

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为了建立一种猕猴桃溃疡病菌（Pseudomonas syringae pv. actinidiae,PSA）的血清学检测方法,我们利用致病性极强的PSA3类群特异效应子Hopz5制备的多克隆抗体（PAb-Hopz5）,通过酶联免疫吸附反应对样品类型、特异性、灵敏度及田间样品进行检测,全面分析了该抗体的特性。结果表明,PAb-Hopz5不仅能够检测发病组织,还能检测人工培养的PSA;即可利用发病组织蛋白,也可利用发病组织浸泡液进行检测。此外,PAb-Hopz5的检测不受PSA侵染时期的影响。PAb-Hopz5与其他供试菌包括P. syringae pv. tomato、P. fluorescens和P. putida等无交叉反应,具有较好的特异性。ELSIA检测菌悬液的最低浓度为3×10⁵ CFU/mL,明显低于PCR检测灵敏度,但对田间发病组织样品的检测效果优于PCR。研究表明,PAb-Hopz5可作为猕猴桃溃疡病菌PSA3类群检测用试剂,进而为猕猴桃溃疡病菌提供新的检测工具。

云南粳稻遗传多样性及群体结构分析

管俊娇, 杨晓洪, 张建华, 王江民, 张鹏, 李彦刚

2018, 34(1): 90-96. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0788

摘要 ( 262 )

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通过分析云南省不同育种单位粳稻选育品种的遗传多样性,阐明云南粳稻品种的遗传结构及其亲缘关系,为粳稻育种提供参考依据。利用30对SSR多态性引物,对7个育种单位的163份粳稻选育品种进行等位基因多样性、遗传结构和聚类分析。共检测等位基因207个,每个位点等位基因变幅为2-17,平均等位基因数为6.6;基因多样性指数变异范围为0.024 4-0.823 9,平均为0.479 8;多态信息含量（PIC）变异范围为0.024 1-0.802 5,平均为0.440 7。基于Nei’s 遗传距离的系统聚类把供试材料分为4大类群,基于模型的群体结构分析,供试材料被分为2个亚群。来自大理州农科院和保山市农科院的品种全部分在第1亚群中,楚雄州农科院和云南省农业科学院的品种主要集中在第2亚群中。丽江市农科院、曲靖市农科院的品种平均分布在两个亚群中。云南省育成的粳稻品种遗传多样性不够丰富,同一单位选育的品种遗传相似度较高,品种间亲缘关系与地域性存在一定的相关性,云南省丰富的粳稻资源还没有被完全挖掘利用。

木薯MeTPP1基因克隆、结构变异及其表达分析

丁泽红, 铁韦韦, 付莉莉, 胡伟

2018, 34(1): 97-103. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0714

摘要 ( 269 )

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旨在研究木薯MeTPP1基因在干旱、低温等非生物胁迫响应中的作用。用同源基因克隆的方法从木薯叶片中克隆MeTPP1基因,用MEGA软件构建Neighbor-joining系统进化树,用DnaSP软件分析基因结构变异,用实时荧光定量PCR技术分析MeTPP1基因在不同胁迫处理下的表达特性。结果表明,MeTPP1基因含有一个1 131 bp的开放阅读框,编码376个氨基酸,含有TPP家族保守结构域。系统进化树分析表明,MeTPP1与杨树和杞柳中同源基因的亲缘关系较近,序列相似性分别为77.8%和74.5%。基因结构变异发现,MeTPP1在木薯野生种和栽培种之间共有9个错义突变,它们可能与MeTPP1的表达有关。实时荧光定量PCR分析表明,MeTPP1表达量受到干旱、低温和ABA处理的响应。上述结果表明,MeTPP1在转录水平参与ABA介导的木薯干旱和低温胁迫,可作为候选基因进一步研究其在木薯抗逆中的功能。

木薯叶片显微结构及叶绿素荧光参数比较

安飞飞, 陈霆, 杨龙, 陈松笔

2018, 34(1): 104-109. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0673

摘要 ( 312 )

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选择野生橡胶木薯（Manihot glaziovii）、野生近缘种W14（M. esculenta ssp. flabellifolia）和栽培种华南205（M. esculenta cv. SC No.205）为材料,对其叶片解剖结构及叶绿素荧光参数进行比较,了解其结构与光合效率上的差异。采用石蜡切片对木薯功能叶片的显微结构进行观察,95%乙醇直接提取法提取叶绿素,采用叶绿素荧光仪PAM-2500测定叶片光系统 II（PS II）叶绿素荧光动力学参数。结果显示,橡胶木薯和SC205叶片拥有“独特”的绿色维管束鞘细胞结构,但没有C4植物典型的“花环结构”;W14叶片海绵组织叶肉细胞围绕维管束鞘细胞排列,但发达程度略低,整体形状略似“花环结构”,但没有典型C4植物的“花环结构”明显。W14叶绿素a及总叶绿素含量均显著低于橡胶木薯和SC205。橡胶木薯、W14和SC205叶片叶绿素荧光参数ΦPS II从大到小依次为SC205、橡胶木薯和W14,但W14叶片Fv/Fm值较橡胶木薯和SC205更高,推测W14有较大的潜在光合能力。橡胶木薯和SC205均属于C3植物,W14是一种介于C3和C4之间的木薯种质。光系统II中光合效率ΦPS II从大到小依次为SC205、橡胶木薯和W14。

小桐子MYB基因家族的鉴定及JcMYB308基因的克隆与低温表达分析

辛胡, 颜岳辉, 丁雪梅, 刘潮, 高永, 代冬琴, 唐利洲, 王海波

2018, 34(1): 110-118. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0621

摘要 ( 322 )

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MYB转录因子家族参与植物生长发育及对环境胁迫的应答等过程。该实验基于小桐子基因组数据库,对MYB基因家族进行鉴定,克隆了小桐子JcMYB308基因,并对其功能结构域、系统进化、基因结构及低温表达特性进行了分析。结果表明,小桐子全基因组共鉴定到213个MYB基因家族成员,聚类为6个亚家族。克隆的JcMYB308基因片段长度为713 bp,基因结构具有较高的保守性,均含有两个外显子,进化树显示其与同属大戟科的蓖麻亲缘关系最近,序列一致性为62.7%。qRT-PCR表达分析表明,小桐子JcMYB308基因的表达存在组织表达特异性,在根中表达量较高,而在叶片中表达量相对较低,在根与茎中低温胁迫24 h时达到最大表达量。

菘蓝ItSnRK2.1基因的克隆及其序列特性分析

张春兰, 满丽莉, 向殿军, 包乌日娜, 刘鹏

2018, 34(1): 119-128. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0692

摘要 ( 218 )

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SnRK2是ABA通路中至关重要的蛋白激酶,可通过调节下游相关蛋白质的活性来调节胁迫响应基因的表达,显著改进植物对高盐和干旱等非生物胁迫的抗性。基于SnRK2成员cDNA的UTR保守区域设计兼并引物,利用RT-PCR方法从菘蓝中克隆得到一个SnRK2全长cDNA序列,命名为ItSnRK2.1。测序显示该基因长度为1 305 bp,包含一个1 071 bp的完整开放阅读框,编码356个氨基酸,在GenBank数据库的登录号为 MF423122。ItSnRK2.1蛋白激酶理论等电点为5.64,理论分子量为40.6 kD,属于亲水性蛋白,存在二个显著跨膜结构域,含有42处磷酸化位点,没有信号肽,最可能定位的位置是在细胞质上。ItSnRK2.1蛋白激酶的二级结构具有151个α-螺旋、109个无规则卷曲、66个延伸链和30个β-转角。ItSnRK2.1蛋白包含一个ATP结合位点和一个丝氨酸/苏氨酸酶活结构域,同AtSnRK2.1、AtSnRK2.5和StSnRK2.6蛋白亲缘关系最近,处在同一进化分枝。实时定量RT-PCR检测结果显示,ItSnRK2.1基因在菘蓝幼苗的根部表达量最高,其次是叶,茎的表达量最低;ItSnRK2.1基因积极参与高盐和干旱胁迫应答反应,但对ABA胁迫不敏感,表明该基因可能与植物抗逆境胁迫有关,且不依赖ABA调控通路。

铁皮石斛转化酶抑制子家族基因的克隆和表达分析

苗小荣, 牛俊奇, 莫昭展, 王爱勤, 何龙飞

2018, 34(1): 129-136. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0746

摘要 ( 287 )

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转化酶抑制子（Invertase Inhibitor,InvInh）能调控转化酶的活性,在植物的蔗糖代谢过程中具有重要作用。本研究旨在从珍稀濒危兰科药用植物铁皮石斛中克隆 InvInh家族基因,并对其进行定量表达以及生物信息学分析。结果显示：从铁皮石斛叶中克隆到3个InvInh基因,分别命名为DoInvInh1、DoInvInh2和DoInvInh3,分别编码176、177和188个氨基酸。生物信息学分析表明,DoInvInh蛋白都具有1个信号肽、2个跨膜结构以及PMEI蛋白的保守结构域。DoInvInh蛋白的氨基酸序列同源性较低,但都具有4个保守的Cys位点和SP位点。荧光定量PCR分析发现,在根、茎、叶和花中都能检测到3个DoInvInh基因表达。DoInvInh2和DoInvInh3基因在根中表达量最低,而在花中表达量最高。DoInvInh1和DoInvInh3基因在铁皮石斛不同生长年限茎中的表达模式相似,都是在 1年生茎中表达量最高,2年生茎中次之,在3年生茎中表达量最低。DoInvInh2基因在2年生茎中基因表达量最高。DoInvInh1和DoInvInh3基因表达量与CIN酶活性都呈显著负相关,推测这2个基因可能在调节茎中CIN酶活性中起作用。

桂花OfLCYB和OfLCYE启动子的克隆和活性分析

沈子又, 张超, 董彬, 付建新, 胡绍庆, 赵宏波

2018, 34(1): 137-143. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0706

摘要 ( 282 )

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番茄红素环化是类胡萝卜素合成过程中的重要分支点,植物中存在两种番茄红素环化酶LCYB和LCYE。前期研究发现,OfLCYB1、OfLCYE1等基因的差异表达决定了桂花不同品种中类胡萝卜素代谢分支下游产物的含量不同。以‘堰虹桂’基因组DNA为模板,通过染色体步移的方法（Genome walking）克隆出OfLCYB和OfLCYE启动子分别为1 028 bp和904 bp。通过生物信息学分析发现两个启动子序列包含TATA-box、CAAT-box等基本元件,同时都含有水杨酸响应元件TCA-element,以及一些光响应元件如Sp1、ACE、Box4、G-box等;OfLCYB启动子还包括脱落酸响应元件ABRE,赤霉素响应元件P-box,OfLCYE启动子包括赤霉素响应元件GARE-motif及热击响应元件HSE。将克隆到的启动子片段与pBI121载体进行重组,构建植物表达载体并转入农杆菌,采用叶盘法侵染烟草叶片进行瞬时表达。结果表明,OfLCYB和OfLCYE启动子片段均具有驱动下游报告基因表达的功能。

茶树1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因CsDXS1的克隆与表达分析

郭亚飞, 王君雅, 郭飞, 倪德江

2018, 34(1): 144-152. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0652

摘要 ( 371 )

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1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase,DXS）是MEP 萜类合成途径的第一个关键酶,在植物萜类物质的生物合成过程中发挥重要的作用。以福鼎大白茶为实验材料,在课题组前期转录组数据的基础上,运用 RT-PCR 技术克隆了茶树CsDXS1基因的完整开放阅读框（ORF）。该 ORF长度为 2 154 bp,编码717个氨基酸。生物信息学分析结果表明,茶树CsDXS1蛋白与其他植物的同源蛋白相似性高达85%-90%,属于 DXS基因家族的I类基因,该蛋白是不稳定的亲水蛋白,不存在信号肽和跨膜结构域,有15个可信度高的磷酸化位点,具有典型的转酮醇酶亚家族功能域。利用实时荧光定量 PCR 对 CsDXS1基因在茶树不同组织和不同激素处理下的表达谱进行检测,结果显示：不同组织中,CsDXS1基因的表达水平在第三叶中最高,嫩叶中的表达量显著高于茎和老叶,表达水平从高到低依次为第三叶>第四叶>第二叶>第一叶>嫩茎>老茎>老叶。在不同激素处理中,CsDXS1的表达量受到不同程度的诱导,且表达量峰值的出现时间存在差异。CsDXS1在IAA和ABA激素处理下的表达量峰值最高（4 h）,均为对照的1.5倍,在 MeJA 处理下表达量峰值最低（24 h）,仅为对照的1.1倍。

草鱼（Ctenopharyngodon idellus）FGF21基因克隆及其表达分析

黄龙, 吴本丽, 何吉祥, 宋光同, 陈静, 汪翔, 武松

2018, 34(1): 153-159. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0729

摘要 ( 282 )

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采用RT-PCR技术从草鱼肝脏中克隆了成纤维细胞生长21（FGF21）基因序列,并利用实时荧光定量PCR（qPCR）技术对该基因在草鱼幼鱼不同组织中表达进行了研究。结果表明,草鱼FGF21基因（GenBank登录号为MF_094727）cDNA序列全长615 bp,其中5'端非翻译区51 bp,开放阅读框564 bp,编码187个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,草鱼FGF21基因与斑马鱼同源性最高（78.86%）,与犀角金线鲃、鲤、虹鳟、大西洋鲑、罗非鱼和日本青鱂的同源性分别为77.66%、73.94%、53.29%、52.41%、43.71%和35.96%,与人和小鼠同源性较低,分别为31.87%和30.39%。qPCR分析表明：FGF21基因在草鱼幼鱼肝脏、前肠、中肠、后肠、心脏、肌肉、肾脏和全脑中均有表达,在肌肉、前肠和中肠表达量最高,表明该基因可能在草鱼肌肉和肠道等组织发挥重要作用。

日本鳗鲡TLR3基因的克隆及其免疫功能分析

余丽丽, 林鹏, 郭松林, 王艺磊, 张子平, 王婷婷, 冯建军

2018, 34(1): 160-171. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0656

摘要 ( 266 )

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Toll样受体3（TLR3）是用于识别双链RNA的一种重要模式识别受体。利用RT-PCR和RACE技术克隆了日本鳗鲡TLR3（AjTLR3）基因cDNA全长序列,并采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测分析该基因在日本鳗鲡各组织器官以及体外肝脏细胞的表达水平变化,以期对日本鳗鲡TLR3 基因的序列特征及其功能进行研究。结果表明：AjTLR3基因全长3 383 bp,开放阅读框为2 766 bp,编码921个氨基酸。该蛋白具有16个LRR的胞外结构域、跨膜结构域以及TIR结构域,其中在TIR结构域含有一个高度保守的氨基酸残基Tyr⁷⁷⁸。AjTLR3基因在日本鳗鲡各组织器官中均有表达,其中肝脏表达量最高;经poly I∶C刺激后在血、肠、肝脏、脾脏、皮肤、心脏及肌肉组织中均显著提高;而LPS刺激后,仅在肝脏和肠中有显著提高。日本鳗鲡肝脏细胞体外实验结果显示：poly I∶C处理后12 h和24 h表达水平显著增高,CpG-DNA和肽聚糖处理后24 h表达量均有显著增加;而细菌浓度达到10⁷CFU/mL和10⁸ CFU/mL后,AjTLR3基因表达水平分别在24 h、12 h显著增高并达到峰值。以上研究表明,AjTLR3在日本鳗鲡抵御病毒及细菌的免疫应答过程中具有重要作用。

杀菌剂苯并异噻唑啉酮对斑马鱼胚胎的急性毒性和氧化应激效应研究

吕鹏, 徐嘉擎, 王森, 闫艳春

2018, 34(1): 172-182. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0665

摘要 ( 324 )

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苯并异噻唑啉酮（Benzisothiazolin,BIT）是一种广泛使用的工业防腐剂,在水体中分布较广,对水生生物特别是对鱼类存在潜在威胁。本研究以斑马鱼为受试生物,通过96 h急性暴露实验,氧化应激效应检测和相关基因表达量的分析,研究BIT对斑马鱼胚胎的发育毒性和氧化损伤。结果表明BIT对受精后51 h（51 hours post-fertilization,51 hpf）斑马鱼胚胎孵化具有强烈抑制作用,能导致胚胎畸形,96 h半致死浓度（96 h half lethal concentration,96h-LC₅₀）为3.65 mg/L,96 h半数致畸浓度（96 h half teratogenic concentration,96 h-TC₅₀）为1.31 mg/L。氧化应激相关酶（SOD,CAT,GST）的活性都受到了不同程度的影响,抗氧化相关基因（Mn-sod,cat,gstp-2,nqo-1,cox-1和ucp-2）的表达量也受到了干扰,这些结果说明机体受到了严重的氧化损伤。细胞凋亡相关基因（bcl-2和bax）的表达模式也向着促进凋亡的方向发生改变,表明氧化损伤导致了细胞凋亡。BIT对斑马鱼胚胎具有很高的发育毒性,能造成机体氧化损伤,最终导致胚胎死亡。本实验结果可为BIT在环境中的风险管理提供科学依据。

草地贪夜蛾组织蛋白酶B的基因克隆、序列分析、三维结构预测及其分子对接模拟

程杏安, 叶静敏, 蒋旭红, 刘展眉, 胡美英

2018, 34(1): 183-194. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0818

摘要 ( 300 )

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昆虫组织蛋白酶B（Cathepsin B）在昆虫发育和代谢过程中发挥重要作用。本研究首先克隆了草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda（J.E.Smmith）的组织蛋白酶B基因Cathepsin B（SCB）,获得其开放阅读框（ORF）序列（GenBank 登录号：HQ110064）。生物信息学分析表明,该基因的开放阅读框包含1 026 bp 的片段,编码341 个氨基酸,预测N-末端含有长度为20 个氨基酸残基的信号肽序列,去除信号肽序列后,预测成熟蛋白分子量为35.6 kD,等电点为6.59。氨基酸序列与15 种物种Cathepsin B比较有51.2%-96.2%的一致性,与甜菜夜蛾Spodoptera exigua（Hiibner）相似度最高,达96.2%。利用同源建模预测SCB的三维结构,经动力学的优化,SCB折叠成紧密而稳定的球状结构,含6 个对结构有稳定作用的二硫键,亲水性氨基酸主要包被在蛋白表面。同时分子对接模拟结果表明,SCB结合口袋比较浅,形状不规则,袋口较宽。ARG19、VAL23和ASN24为活性位点关键氨基酸残基,抑制剂CA与SCB活性位点3个关键氨基酸残基有较强的相互作用,且均主要表现为静电相互作用能,其中VAL23、ASN24与CA形成氢键。以期为进一步运用生物实验手段研究Cathepsin B的结构和功能,设计和开发昆虫组织蛋白酶类抑制剂类杀虫剂奠定基础。

白背飞虱几丁质合成酶1基因的结构及特性研究

陈静, 张道伟, 钱正敏

2018, 34(1): 195-201. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0569

摘要 ( 296 )

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几丁质合成酶1（CHS1）是昆虫几丁质合成的关键酶,在昆虫几丁质合成的组织中发挥着重要作用。为探索白背飞虱Sogota furcifera几丁质合成酶1（SfCHS1）的基因结构特征及其功能,利用转录组测序结合PCR扩增技术,研究了SfCHS1基因的结构特性,采用定量PCR技术研究SfCHS1基因的时空表达特性,最后利用显微注射RNAi方法研究SfCHS1基因的RNAi效果。通过转录组测序获得的SfCHS1基因开放阅读框为4 719 bp,编码1572个氨基酸,预测蛋白分子量为180.6 kD,预测有6个糖基化位点和16个跨膜螺旋。PCR扩增及测序结果表明SfCHS1基因存在两个可变剪切,产生两个转录本（CHS1a和CHS1b）。通过系统进化树分析,SfCHS1和灰飞虱Laodelphgax striatellus及褐飞虱Nilaparvata lugens的CHS1同源性最高,为97%。时间表达特异性分析结果表明,SfCHS1基因在4龄期第1天,5龄期第1天,成虫第1天即几丁质合成时的表达量最高。组织特异性检测结果表明,SfCHS1基因主要在白背飞虱的表皮中表达,其次为气管,在肠中也有少量表达。显微注射RNAi的结果表明该方法能显著降低SfCHS1基因的转录水平,并导致白背飞虱的死亡。研究结果说明,SfCHS1基因具有两个可变外显子结构,SfCHS1基因在几丁质合成阶段及几丁质含量高的组织表达量较高,沉默SfCHS1基因的表达会对白背飞虱产生致死的表型,出现较高的死亡率。

一株解淀粉芽孢杆菌生防蛋白的鉴定及分析

郭继平, 马光, 王志杰, 齐善厚, 王宝梅, 苏长青

2018, 34(1): 202-207. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0630

摘要 ( 263 )

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旨在鉴定一株拮抗葡萄霜霉病的解淀粉芽孢杆菌在NA液体培养基中的分泌蛋白中与生物防治相关的蛋白组分。采用蛋白质谱的方法对前期筛选到的一株拮抗葡萄霜霉病的解淀粉芽孢杆菌生防菌的在NA液体培养基中的分泌蛋白进行了鉴定。对鉴定到的蛋白采用基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）的方法进行蛋白质组学分析,筛选与生物防治相关的蛋白。结果表明,从分泌蛋白中鉴定到了确定的53种蛋白质,其相对分子量大部分集中到0-100之间（占79.24%）;涉及碳水化合物代谢、能量代谢、脂类代谢、氨基酸代谢和生物防御等过程,以及作为细胞组分参与结构组成。发现了6种参与植物与病原菌互作的蛋白,2种属于氨基肽酶家族,4种参与几丁质的生物降解过程。

一种高效表达碱性蛋白酶的新型启动子的筛选及研究

陈坤, 袁飞燕, 柴昊男, 刘焕, 王兴吉, 张会图, 路福平

2018, 34(1): 208-214. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0748

摘要 ( 325 )

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碱性蛋白酶广泛的应用价值及市场供不应求的现状,旨在构建碱性蛋白酶高效表达系统。通过蛋白电泳和质谱检测的方法,由地衣芽孢杆菌中筛选获得一种新型启动子pChi,以两种已知强组成型启动子pShuttle-09和pyxiE为对照,研究其对克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶与地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的表达活性。成功构建了6种重组表达载体及重组菌,结果表明,pChi的启动强度是pShuttle-09的1.25倍,pyxiE的2倍,从而为介导枯草芽孢杆菌表达系统中异源基因的表达奠定基础。

Lsa蛋白对金黄色葡萄球菌介导的炎性细胞因子表达的影响

卫瑞阳, 白杰, 徐彬, 席燕燕, 王琳燚, 王改利, 付趁, 魏凤仙, 李绍钰

2018, 34(1): 215-222. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0731

摘要 ( 239 )

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试验旨在研究家蝇Lsa（Lectin subunit alpha）蛋白在金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）刺激下的炎性反应。通过慢病毒转染的方法,将构建好的载体pLEX-Lsa及pLEX分别转染到RAW264.7细胞中,通过筛选,获得稳定表达的RAW-pLEX-Lsa及RAW-pLEX细胞系,其中RAW-pLEX细胞作为阴性对照。然后通过S. aureus刺激细胞,收集未刺激和刺激后3 h,6 h,12 h和24 h的细胞,且收集未刺激和刺激6 h细胞上清。提取RNA,通过实时定量PCR（RT-PCR）检测炎性细胞因子TNF-a,IL-1β,NFκB-1 和NFκB-2基因的相对转录水平。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞上清中TNF-a和IL-1β的蛋白水平。RT-PCR结果显示,在S. aureus刺激后,与RAW-pLEX细胞相比,RAW-pLEX-Lsa细胞中TNF-a的两个转录剪接体的相对转录水平,TNF-α-tv-1在6 h显著下调（P<0.05）,TNF-α-tv-2在6 h和12 h显著下调（P<0.05）;RAW-pLEX-Lsa细胞中IL-1β的两个转录剪接体的相对转录水平,IL-1β-T在3 h,6 h和12 h显著下调（P<0.05）,IL-1β在3 h和6 h显著下调（P<0.05）;RAW-pLEX-Lsa细胞中NFκB-1 和NFκB-2基因的相对转录水平无明显下降趋势。ELISA检测结果显示,在S. aureus刺激6 h后,与RAW-pLEX细胞相比,RAW-pLEX-Lsa细胞上清中,TNF-a的蛋白水平显著下调（P<0.05）。结果表明,家蝇Lsa蛋白可以有效地发挥抗炎活性,显著地抑制TNF-α和IL-1β的转录和生产,而TNF-α和IL-1β的转录和生产的下调并不是通过抑制NFκB信号通路的活性引起的。

菌株CICC 6287发酵特性研究及其在辣椒发酵中的应用

谢九艳, 翟磊, 宋振, 杨玉新, 程池, 姚粟

2018, 34(1): 223-229. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0527

摘要 ( 283 )

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旨在对从新疆乳制品中分离菌株CICC 6287的发酵特性进行研究,并通过辣椒发酵试验评价菌株CICC 6287作为发酵菌株的优势。采用多相分类技术确定该菌株的分类学地位,通过测定耐酸耐盐特性、产酸能力、降解亚硝酸盐能力、氨基酸脱羧酶活性和抑菌能力表征其发酵特性。在此基础上,将菌株CICC 6287应用于新疆特色辣椒发酵中,评价其在辣椒发酵过程中的作用。菌株CICC 6287鉴定为产马乳酒乳杆菌,能够降解亚硝酸盐,耐受8% NaCl和pH3,抑制大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和沙门氏菌,产生生物胺的四种氨基酸脱羧酶活性为阴性。接种菌株CICC 6287的发酵辣椒亚硝酸盐的含量1.06 mg/kg,生物胺的含量为5.62 mg/kg,总酸含量达到2.54%。研究结果表明,菌株CICC 6287具有良好的发酵特性,能够应用于辣椒发酵,提高发酵辣椒的安全性。

连作对大豆根际土壤细菌菌群结构的影响

殷继忠, 李亮, 接伟光, 蔡柏岩

2018, 34(1): 230-238. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0728

摘要 ( 335 )

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土壤细菌的菌群结构是土壤生态环境质量的重要组成部分。为探明大豆连作种植后根际土壤细菌群落结构变化,试验选取连作0年大豆根际土样与连作2年大豆根际土壤,利用Illumina高通量测序技术对比研究了其中的细菌群落结构。结果表明,连作0年根际土壤中的细菌丰富度和多样性指数均高于连作2年大豆根际土壤中相应值。大豆根际土壤中的噬纤维菌科（Cytophagaceae）、鞘氨纯单胞菌（Sphingomonas）、慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）及链霉菌属（Streptomyces）等一些有益菌的相对丰度要变化并不显著。大豆连作会降低土壤的细菌多样性,改变细菌菌群结构。但是在短期连作过程中,不同作物根际微生物类群的变化规律各不相同,难以用来推断作物连作所存在普遍现象。以期试验结果同时为缓解短期大豆连作障碍提高大豆产量提供一定的理论依据。

CO₂浓度对雨生红球藻生理生化指标的影响

陈佳妮, 林丽春, 徐年军, 张琳, 孙雪

2018, 34(1): 239-246. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0669

摘要 ( 258 )

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为了探讨雨生红球藻对不同CO₂浓度的响应,利用生理生化测定方法比较了两种CO₂浓度对雨生红球藻生长、色素含量、叶绿素荧光参数和两种碳代谢相关酶的影响。结果显示在雨生红球藻的绿色营养阶段,4倍空气CO₂浓度下培养的藻细胞密度是空气CO₂浓度下的3.08倍（第10 天）,与空气CO₂相比,较高CO₂培养藻的叶绿素和类胡萝卜素含量、胞外碳酸酐酶（CA）活性降低,非光化学淬灭（NPQ）显著升高,最大光能转化效率（Fv/Fm）、实际光化学量子效率（Ф_PSII）多显著升高,而光化学淬灭（qP）、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）活性无显著差异。在雨生红球藻的红色孢子阶段,4倍空气CO₂培养下的藻细胞密度显著降低,但虾青素含量提高了20.23%（第8 天）。以上研究表明可以通过适当提高CO₂浓度来促进雨生红球藻的生长和虾青素的积累。

SGK3基因RNAi慢病毒载体的构建及其对乳腺癌MB-474细胞增殖和凋亡的影响

郭红艳, 高涵, 吴琦, 孙晓杰, 刘秀财, 赵立群

2018, 34(1): 247-252. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0557

摘要 ( 235 )

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旨在构建SGK3基因RNAi慢病毒表达载体,观察其对人乳腺癌细胞MB-474增殖和凋亡的影响。构建靶向SGK3的shRNA序列慢病毒载体,将其转染至人乳腺癌MB-474细胞以沉默SGK3基因,Real-time PCR、Western bloting方法检测MB-474细胞SGK3 mRNA及蛋白表达,MTT法和流式细胞术检测SGK3基因沉默对MB-474细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。测序结果显示,成功构建4组SGK3基因RNAi慢病毒表达载体,经 293T 细胞包装,病毒滴度为（3-8）×10⁸ TU/mL;将慢病毒转染MB-474细胞后,Real-time PCR、Western bloting结果显示,干扰组SGK3的表达水平较对照组均降低,且PGC-LV3-SGK3-1序列对其干扰效果最佳,SGK3基因沉默可抑制MB-474细胞增殖、促进凋亡,但其对细胞周期进程无明显影响。成功构建靶向SGK3基因的RNAi慢病毒载体,SGK3基因沉默可影响乳腺癌细胞增殖和凋亡等生物学行为。

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2018, 34(1): 300.

摘要 ( 127 )

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