当期目录

2018年 第34卷 第3期    刊出日期：2018-03-20

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综述与专论

植物萜类合成关键基因DXS研究进展

张浩宇, 樊俊苗, 王婷, 韩渊怀, 杜方

2018, 34(3):  1-8.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0779

摘要 ( 617 )   HTML   PDF (1689KB) ( 630 )  

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萜类物质是自然界中广泛存在的一类天然化合物，对植物、动物和人类都有重要价值。1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶（DXS）对萜类物质合成调控起关键作用，是2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸（MEP）途径的第一个酶，也是该途径的一个限速酶，亚细胞定位于类囊体中，具有质体转运肽序列和3个功能结构域：TPP结合结构域、转酮醇酶结构域和嘧啶结合结构域，可用高效液相色谱法测定其活性。目前已从178种植物中克隆分离到DXS基因，按蛋白同源性可分为3类：DXS1、DXS2和DXS3。DXS基因表达具有组织特异性、昼夜节律性，与花朵、果实发育程度和品种有关。转外源或内源DXS基因的植株过表达或抑制表达都会引起植物光合色素（如叶绿素和类胡萝卜素）、内源激素（如脱落酸和赤霉素）和单萜等萜类物质含量的改变。重点综述了DXS蛋白的特性、基因的类型、基因表达、调控和遗传转化方面的研究进展，以期为植物育种和代谢调节提供理论和实践参考。

植物类甜蛋白基因家族研究进展

刘潮, 韩利红, 王海波, 高永, 唐利洲

2018, 34(3):  9-17.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0774

摘要 ( 532 )   HTML   PDF (2290KB) ( 1197 )  

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类甜蛋白（Thaumatin-like proteins，TLPs）在植物对抗胁迫过程中发挥重要作用。该家族属多基因家族，蛋白分子量较小，具有典型的thaumatin结构域，且高度保守；典型的TLP蛋白由16个半胱氨酸残基对形成8个二硫键，三维解析结构具有功能域I、II和III 3个保守功能域，表面具有“V”形酸性裂缝，保证了蛋白的催化功能；多数物种TLP蛋白归为10个聚类组，各组发生了不均衡扩增；TLP蛋白具有抗真菌、葡聚糖酶、过敏原等活性，能被激素、逆境胁迫等多种信号诱导表达，能被生物或非生物因子诱导表达，广泛参与了植物生长发育、抵御胁迫等多项生命进程，在植物先天免疫中发挥作用。通过基因工程手段，越来越多具有抗真菌潜力的TLP家族基因被用于提高植物抗病性。从类甜蛋白结构、进化、生物学功能及其应用等方面对近期研究成果进行了综述，以期为后续研究提供参考。

高等植物赤霉素3-β-双氧化酶基因研究进展

杨意宏, 徐浩, 陈段芬, 高志民

2018, 34(3):  18-22.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0751

摘要 ( 570 )   HTML   PDF (1104KB) ( 418 )  

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赤霉素3-β-双氧化酶（GA3ox）是赤霉素（GA）生物合成过程中的关键酶之一，直接作用于活性GA的生成，在植物的生长发育过程中发挥着重要作用。GA3ox已在拟南芥、烟草、高粱和杨树等多种植物中得到克隆，在植物个体的不同生长阶段、不同组织中GA3ox的表达量均存在着差异，这主要是由物种内在的遗传因素所决定的，同时环境因子和外源激素处理对GA3ox表达也有着显著的影响。通过对基因突变体的研究，揭示出GA3ox突变导致GA的生物合成受阻而间接影响植物的生长，导致植物茎秆、花、种子、果、根等部位性状的改变，包括植株矮化、结籽困难等。过量表达GA3ox基因促进GA的生成，诱导细胞的分裂与分化，促进根尖的径向伸长、种子萌发等。主要从GA3ox的基因克隆与表达模式及其功能效应两方面综述了其在高等植物中研究进展，通过对GA3ox在不同植物中的相关功能研究，探讨其在植物生长发育过程中的具体作用，以期为了解GA3ox对植物生长发育的调控机制提供参考，也有助于在生产实践中更好地利用GA3ox开展基因工程研究，定向培育植物新品种。

木质纤维素水解副产物对乙醇发酵的影响及应对措施

林贝, 李健秀, 刘雪凌

2018, 34(3):  23-30.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0657

摘要 ( 301 )   HTML   PDF (1130KB) ( 341 )  

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利用木质纤维素原料生产燃料乙醇，预处理是必需的环节，在预处理过程中会产生一些对微生物生长和发酵有抑制作用的化合物，这些抑制剂可分为3类：呋喃醛类化合物、酚类化合物和弱酸。近些年来，关于抑制剂的研究取得了一些重要的研究进展。介绍了各种抑制剂的产生、作用机理及近几年的相关研究成果；阐述了应对抑制剂影响的多种措施，包括采用新型的预处理方式在源头上控制抑制剂的产生、发酵前利用有效的脱毒方法减少抑制剂的浓度、耐受抑制剂的菌株的选育、通过发酵过程的控制有效减少抑制物的毒害作用等。目前，大量研究集中在抑制剂耐受性菌株的开发上，总结了通过诱变、驯化、代谢工程改造等方法以及这些方法的联用选育耐受性菌株的研究成果及进展，指出对微生物进行代谢工程改造是克服抑制剂对乙醇发酵影响的最有前途的方法，并对将来的研究方向进行了展望，以期为该领域研究人员提供方法的参考。

转基因产品成分检测技术研究进展

王颢潜, 陈锐, 李夏莹, 王梦雨, 刘鹏程

2018, 34(3):  31-38.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0814

摘要 ( 376 )   HTML   PDF (1114KB) ( 538 )  

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近年来随着转基因作物的大规模商业化种植以及转基因研发技术的不断发展，抗病、抗虫、耐除草剂、抗逆境和高产优质等转基因产品越来越多，应用也越来越广泛。转基因产品给人们带来便利和经济利益的同时，也带来了安全性问题的争议。为加强对转基因产品的管理，发展转基因产品成分检测技术尤为重要。目前，转基因产品的检测技术主要分为两类：一是基于外源核酸的检测技术，主要包括定性PCR技术、定量PCR技术、等温扩增技术和基因芯片技术等；二是基于外源蛋白的检测技术，主要包括酶联免疫吸附技术、Western blot检测技术和试纸条技术等。每种检测技术都有其优缺点和适用范围，在实际检测过程中，应根据检测的需要并结合转基因产品的类型和特点，选择最有效的检测技术或组合来满足检测的目的。就两类方法中主要检测技术的原理、优缺点和研究进展进行了简要概述，并就转基因检测技术的发展方向进行了总结和展望，旨在促进我国转基因检测技术更好地适应当前转基因领域的发展。

组学技术在高氨基酸茶树中的应用研究进展

马林龙, 曹丹, 刘艳丽, 金孝芳

2018, 34(3):  39-42.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0901

摘要 ( 222 )   HTML   PDF (1057KB) ( 325 )  

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高氨基酸茶树因其所制绿茶滋味鲜爽、香气馥郁且集观赏、健康于一体，在市场上取得了良好的社会和经济效益，对其研究已然成为当前茶学领域的热点之一。随着对生命科学的研究进入多组学时代，以转录组学、蛋白质组学和代谢组学为基础的组学技术得到了迅猛发展，被广泛应用在茶学领域的各项研究中，并成为研究高氨基酸茶树不可或缺的重要手段。综述了近年来转录组、蛋白质组、代谢组等组学技术在高氨基酸茶树中的相关应用研究进展，分析了组学技术在高氨基酸茶树研究中的应用仍存在着很多的不足和亟待突破的难题，并对组学技术在高氨基酸茶树上的深入研究与应用进行了展望，以期为今后高氨基酸茶树的进一步研究提供参考和方向，同时也为高氨基酸茶树品种选育与高效栽培技术提供理论依据。

宏基因组学在传染病防控中的应用进展

李沛翰, 李鹏, 宋宏彬

2018, 34(3):  43-52.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0787

摘要 ( 440 )   HTML   PDF (1103KB) ( 868 )  

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新发突发传染病暴发给全球公共卫生防控带来严峻挑战。快速识别致病病原体是应对新发突发传染病的首要问题，传统病原检测方法难以应对已知变异较大病原或未知病原，基于高通量测序的宏基因组学研究给病原识别鉴定带来了新的方法和思路。核酸提取、高通量测序和数据分析等关键技术方法不断发展，使宏基因组学成为新突发传染病防控的重要研究方向。宏基因组学可对传染病防控中的多种类型样本进行直接测序，获得高通量的测序数据，并结合病原核酸数据库，通过序列比对、变异进化分析等生物信息学方法，通过监测可疑样本对疫情暴发进行预测预警；识别传染病患者感染致病病原，为临床诊治提供指导；构建病原系统发育关系，追溯疫情潜在感染来源，最终实现新突发传染病病原的快速识别、分型、耐药及溯源分析。宏基因组学作为一项新兴技术，在传染病防控领域具有巨大潜力和发展空间。通过对宏基因组学在传染病病原监测、检测及溯源等方面的应用进展进行综述，以期为传染病防控提供新的视角。

数字PCR在转基因水稻拷贝数鉴定中的应用

王永, 兰青阔, 赵新, 陈锐, 沈晓玲, 李文, 张耀中, 李亮, 王勤英

2018, 34(3):  53-58.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0756

摘要 ( 339 )   HTML   PDF (3391KB) ( 411 )  

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转基因作物中插入外源基因拷贝数等分子特征是转基因生物安全评价的重要内容，但是以往的拷贝数鉴定方法存在操作性差等不足，因此亟需操作简单且准确的鉴定方法。应用微流滴数字PCR方法鉴定转基因水稻中插入目的基因的拷贝数，测试方法的可行性。实验结果表明，4个重复样品的目的/内标准基因的比值分别为674/662、516/541、737/759、528/571，均值为0.97，因此验证的目的基因拷贝数为1，与Southern 杂交结果一致。微流滴数字PCR作为插入外源基因拷贝数鉴定的新方法，具有操作简单、准确度高、设计灵活等优点。

基于sRNA的氧化葡萄糖酸杆菌基因调控的研究

李真真, 赵佳晨, 马昱澍

2018, 34(3):  59-66.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0837

摘要 ( 252 )   HTML   PDF (1994KB) ( 193 )  

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在氧化葡萄糖酸杆菌中建立一种调控基因表达的工具。通过顺式/反式作用的非编码小RNA与核糖体结合位点（RBS）的相互作用，在翻译水平上对氧化葡萄糖酸杆菌中目标基因的表达进行调控。以绿色荧光蛋白作为报告基因，在所构建的顺式调控系统中，插入RBS上游的顺式阻遏序列，能够在转录后与RBS形成茎环结构，从而抑制报告基因的表达。这一茎环结构能够被与顺式阻遏序列具有更高亲和力的抗阻遏序列打开，从而重启报告基因的翻译；在所构建的反式调控系统中，由独立启动子控制转录的非编码小RNA与RBS互补形成双链，通过阻碍核糖体与mRNA的结合抑制报告基因的表达。在此基础上，设计并导入了一系列反式作用的小RNA，实现了对氧化葡萄糖酸杆菌中内源基因pstI表达的抑制。本研究提供了一种在氧化葡萄糖酸杆菌中不同于传统基因敲除的调控基因表达的方法。

铜绿假单胞菌检测方法的比较与优化

张帆, 李树垚, 张子豪, 蔡雪凤, 任岩, 刘凯, 侯翠艳, 易欣欣, 高秀芝

2018, 34(3):  67-74.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0742

摘要 ( 426 )   HTML   PDF (1475KB) ( 1871 )  

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通过铜绿假单胞菌检测方法比较和优化以期获得一种准确度高、操作简单且对实验条件要求不高的检验方法。实验以VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定系统鉴定结果为参考，采用GB 8538.57-2016和GB/T7918.4-1987中铜绿假单胞菌的检测方法，对27株试验菌株进行鉴定试验。结果表明，GB 8538.57-2016方法检测结果准确度最低，假阳性检出率为29.6%，GB/T7918.4-1987假阳性检出率为7.4%。以GB 8538.57-2016铜绿假单胞菌的检测方法为例，优化后的检测方法增加了血琼脂平板培养、革兰氏染色及镜检和对血平板所有可疑菌落进行绿脓菌素试验。用改进后的GB 8538-2016铜绿假单胞菌检测方法对27株试验菌株进行验证试验，检验结果与VITEK 2 Compact一致。

微囊藻毒素-LR的定量荧光纳米微球免疫层析检测

张艺, 丁新良, 张珏, 周彬, 郭明明, 黄飚

2018, 34(3):  75-79.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0873

摘要 ( 359 )   HTML   PDF (2155KB) ( 250 )  

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研制了一种快速、定量荧光免疫层析试纸条，用于检测水体中MC-LR含量。基于竞争法原理，采用荧光免疫层析技术，建立MC-LR免疫层析法，并对该试剂考察其灵敏度、准确度、特异性、稳定性等指标。经过对免疫层析试纸条制备参数的优化，即检测线抗原浓度、微球标记量和结合垫微球浓度的选择，加样15 min后，获得了MC-LR荧光免疫层析法的工作直线，方法灵敏度0.195 μg/L，回收率99.4%，变异系数小于10%，与MC-LF交叉反应率低，与市售试剂盒检测结果一致，试剂在37℃稳定保存6 d。本研究研制的荧光免疫层析试剂灵敏、稳定、准确，可快速、定量检测水样中MC-LR含量，操作便捷。

研究报告

甜菜碱改善水稻高GC含量DNA序列的PCR扩增

王同同, 张利平, 尹康权,

2018, 34(3):  80-86.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-1105

摘要 ( 592 )   HTML   PDF (2845KB) ( 717 )  

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聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）作为一项基本的分子生物学技术，是DNA序列扩增的强有力工具。水稻作为人类最重要的粮食作物之一被广泛研究，然而由于水稻基因组序列的GC含量相对较高，而高GC含量DNA序列的PCR扩增一般比较困难，使得水稻高GC含量序列的功能研究受阻。通过使用不同的添加剂，发现相比于二甲基亚砜和甘油等，甜菜碱对于水稻高GC含量片段的PCR扩增的增强效果最明显。通过对多个高GC含量的水稻DNA片段进行PCR扩增，发现1-2 mol/L甜菜碱对于增强PCR扩增效果显著。此外，甜菜碱对于多种DNA聚合酶作用下的PCR扩增均有增强效果。

外源茉莉酸甲酯对小麦幼苗低温耐受性的影响

李杨洋, 焦浈

2018, 34(3):  87-92.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0780

摘要 ( 304 )   HTML   PDF (2121KB) ( 222 )  

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以矮抗58小麦为材料，探究在冷驯化条件下，外源茉莉酸甲酯对小麦幼苗生理生化特性及抗冻应答因子表达的影响。实验设置两组小麦幼苗，分别用双蒸水和100 μmol/L茉莉酸甲酯溶液喷施4℃低温处理组，低温处理一周。生理生化结果表明，100 μmol/L浓度外源茉莉酸甲酯喷施处理的小麦幼苗存活率达91%，较低温处理组显著升高，细胞内SOD、CAT和POD活性分别较双蒸水喷施对照组活性升高34%、50%和14%，胞内可溶性蛋白含量增加30%，游离脯氨酸含量提高14%，MDA含量相对下降5%，实验组与对照组间具显著性差异；实时荧光定量PCR结果表明，100 μmol/L外源茉莉酸甲酯处理可显著升高冷驯化条件下小麦幼苗中抗寒应答转录因子TaCBFⅣd-B4、TaCBFⅢd-B19、TaCBFⅢc-D3和TaCBFⅢd-D19表达量，其中TaCBFⅣd-B4抗冻应答转录因子表达量最高。结果表明，100 μmol/L外源茉莉酸甲酯的喷施能够增强小麦对低温胁迫的耐受能力。

遮光模拟短日照对春夏播燕麦穗发育的影响

杨晓虹, 安江红, 韩冰, 周海涛, 杨才

2018, 34(3):  93-97.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0741

摘要 ( 273 )   HTML   PDF (2387KB) ( 413 )  

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为研究短日照对北方春夏播燕麦穗发育的影响，以5个光周期敏感品种和1个光周期不敏感品系分析日照长度对燕麦穗分化发育的影响，并比较燕麦光周期敏感品种和不敏感品系在海南自然短日照条件下的生长发育情况。结果表明，遮光条件下，当日照长度由正常光照15 h减少至11 h时，光周期敏感品种的燕麦幼穗分化进程不能正常进行，形态上穗部发育退化严重，不能完成生长发育；而光周期不敏感品系能正常进行穗分化，完成整个生长发育。在海南自然短日照条件的试验表明，北方春夏播燕麦在自然短日照条件下，光周期不敏感品系能抽穗结实，完成整个生长发育过程，光周期敏感品种在生育期内不能抽穗，只有营养生长没有生殖生长。裸燕麦不同品种之间及皮裸燕麦之间在正常穗分化情况下，扫描电镜形态无明显差异。对光周期敏感的燕麦品种在每日11 h的短日照条件下，不能完成穗发育分化进程，只进行营养生长，即使是短生育期的燕麦也不能完成抽穗开花结实，导致绝产。燕麦品种生育期与光周期敏感性不存在相关性。

甜高粱蔗糖积累关键时期叶片转录组测序分析

陈思孛, 赵质涵, 马爱军, 张敖, 王志和, 阮燕晔

2018, 34(3):  98-104.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0876

摘要 ( 345 )   HTML   PDF (3622KB) ( 492 )  

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通过转录组测序技术，在甜高粱糖分累积的关键时期寻找甜高粱和普通高粱组织间差异表达的相关基因，通过相关基因的功能注释及相关联的Pathway代谢通路分析，进一步筛选与糖分积累与代谢相关的基因，以利于为充分挖掘甜高粱的生物学潜能，改良高粱品种提高其茎杆的糖含量打下坚实基础。以甜高粱辽甜1号和粒用高粱新苏2号为材料，对甜高粱与粒用高粱在成熟期进行叶片转录组数据测序分析并比较，测序结果如下，共得到71.98 M条reads，总碱基数14.54 Gb。使用Cufflinks软件对reads进行组装，共发掘出1 562个新基因。通过差异表达筛选出3 115个差异基因，其中1 499个上调，1 616个下调。对差异基因进行GO、COG分类和KEGG代谢途径富集性分析，将这些差异表达基因归类于包括淀粉与蔗糖代谢途径在内的94个代谢途径，从淀粉与蔗糖代谢通路（Pathway ID：Ko00500）中取β-呋喃果糖苷酶、蔗糖合成酶、果糖激酶的5个差异基因分别为Sb06g031910、Sb06g023760、Sb01g035890、Sb01g033060和Sb10g0082805进行实时荧光定量分析，发现这些基因在不同生育时期的表达与其对应酶类的活性有紧密的联系，推测这些基因在甜高粱叶片的蔗糖合成及积累过程中发挥着至关重要的作用。

P5CR基因的进化及其在木薯中的表达分析

丁泽红, 付莉莉, 颜彦, 铁韦韦, 胡伟

2018, 34(3):  105-112.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0796

摘要 ( 304 )   HTML   PDF (2417KB) ( 476 )  

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吡咯啉-5-羧酸还原酶（P5CR）催化脯氨酸合成途径的最后一步反应，在植物逆境胁迫响应中起重要作用。采用生物信息学方法从木薯（Manihot esculenta Crantz）等45个已完成基因组测序的植物中共鉴定出54条P5CR序列，分析其在不同物种的分布和序列特征；用MEGA软件构建Neighbor-joining系统进化树；采用实时荧光定量PCR技术分析MeP5CR在不同组织和胁迫处理下的表达特性。P5CR在内含子长度上差别较大，而在氨基酸长度、外显子数目、等电点和分子量等方面差别不大。在大多数植物（如木薯）中，P5CR有且仅有1个拷贝，表明P5CR在进化上比较保守，且是单基因起源。然而，在某些植物（如大豆、苹果等）中存在2-3个拷贝，说明在物种进化的过程中P5CR发生了多次重复事件，并将它们归纳为3种进化模式。表达分析表明，MeP5CR在叶片、须根和储藏根中表达量最高，而在叶柄和茎中的表达量最低。MeP5CR表达量受低温胁迫诱导、但被干旱胁迫抑制。MeP5CR在转录水平参与木薯干旱和低温胁迫响应。

青杄PwNAC42基因的克隆及表达模式分析

袁义杭, 张鹤华, 游韩莉, 张凌云

2018, 34(3):  113-120.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0924

摘要 ( 280 )   HTML   PDF (3858KB) ( 494 )  

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NAC转录因子是植物中最大的转录因子家族之一，广泛参与了植物的生长发育过程，并在植物响应盐害、干旱、冷害和脱落酸等多种非生物胁迫的过程中发挥重要作用。通过青杄转录组数据获得PwNAC42基因的cDNA序列，对其蛋白序列进行生物信息学预测，通过实时荧光定量PCR检测PwNAC42基因在青杄各个组织及非生物逆境胁迫下的表达水平。生物信息学分析结果显示：PwNAC42基因cDNA全长共1 749 bp，其中编码区1 140 bp，共编码379个氨基酸；蛋白理论分子质量为42.92 kD，理论等电点为6.53，有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点，不存在信号肽结构域，为非跨膜的亲水蛋白。组织特异性表达结果显示，PwNAC42在青杄球果中表达量最高。逆境胁迫实验表明PwNAC42的表达量在NaCl、干旱、4℃以及脱落酸处理下产生显著的变化。因此推测PwNAC42在青杄球果发育及青杄对逆境胁迫的响应过程中发挥作用。

黄秋葵果实转录组测序及分析

李和平, 姚运法, 练冬梅, 赖正锋, 洪建基

2018, 34(3):  121-127.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0765

摘要 ( 304 )   HTML   PDF (2055KB) ( 369 )  

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为了研究黄秋葵果实转录组中功能基因的表达情况，采用RNA-Seq技术对3份黄秋葵果实进行测序分析。结果显示，3份测序材料组装后共获得了77 476个Unigene序列，有61 891个Unigene在4大数据库中得到注释，占79.88%；以KEGG代谢途径数据库为依据，可将13 336个黄秋葵果实的Unigene分成128个代谢途径；在黄秋葵果实转录组中发现3 830个SSR（Simple Sequence Repeats）位点，分布在3 569条Unigenes中，发生频率为4.61％。

晚松不同外植体腋芽诱导的初步研究

杨梦丽, 高茜茜, 刘苑秋, 胡冬南, 李佳俊, 张志坚, 邹贵武, 黄国贤

2018, 34(3):  128-135.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0409

摘要 ( 266 )   HTML   PDF (2887KB) ( 290 )  

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以一年生晚松实生苗春梢不同部位的茎段和种子萌发的顶芽两种材料为外植体，用浓度为0.1%的升汞对外植体进行消毒处理，选择消毒效果较好的外植体作为无菌材料，然后优化最适合腋芽诱导的培养基类型和激素水平组合。结果表明，0.1%的升汞消毒处理10 min的春梢中部茎段最佳，污染率最低，为0.8%，其腋芽诱导的最佳培养基和激素浓度为：MS + 2.5 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA。而种子的最佳消毒时间为4 min，污染率为2.4%，在含有0.7 mg/L NAA和 1.0 mg/L 6-BA的MS培养基中诱导率最高。本文建立了由春梢茎段和种子诱导腋芽的有效方法，为晚松的快速繁育提供理论依据和技术支持。

用于植物病原细菌标记的pBB-GFP载体构建及应用

赵志文, 李艳娇, 户勋, 范晓静, 卓涛, 邹华松

2018, 34(3):  136-141.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0807

摘要 ( 454 )   HTML   PDF (4907KB) ( 494 )  

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扩增青枯劳尔氏菌RipAK基因启动子序列，与lacZ基因融合得到pHM1：PRiPAKLacZ。携带pHM1：PRiPAKLacZ的青枯劳尔氏菌在营养丰富和基本培养基中都有LacZ活性，表明RipAK启动子可以推动lacZ基因的表达。为构建用于标记植物病原细菌的绿色荧光表达载体，把RipAK启动子和gfp基因克隆到质粒pBBR1MCS-5，使得gfp基因在RipAK启动子的驱动下表达；构建的表达载体pBB-GFP在大肠杆菌中即可表达绿色荧光蛋白。pBB-GFP载体能有效标记青枯劳尔氏菌、番茄细菌性斑点病菌和柑橘溃疡病菌，在荧光显微镜下观察到3种植物病原细菌呈短杆状，青枯劳尔氏菌还可形成多个菌体串联的线状结构。荧光标记对3种病原菌在寄主植物上的致病力没有影响，将标记菌株分别滴加在寄主植物叶片的创伤处，可观察到大量的绿色荧光聚集。本研究构建的pBB-GFP载体能用于多种植物病原细菌的绿色荧光标记，标记后的病原细菌在液体培养及侵染寄主植物过程中都能观察到荧光。

牦牛KISS-1基因的克隆及其在生殖轴的表达

杨远潇, 字向东,

2018, 34(3):  142-149.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0968

摘要 ( 258 )   HTML   PDF (2657KB) ( 274 )  

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KISS-1在动物繁殖调控中具有重要作用，旨为探讨KISS-1基因在牦牛季节性繁殖中的调控作用。实验采集5头成年母牦牛和5头黄牛的下丘脑、垂体等组织，利用RT-PCR和qPCR技术研究其KISS-1基因序列及组织表达特性。结果表明，牦牛和黄牛KISS-1基因编码区长度为408 bp，编码135个氨基酸，比对分析发现牦牛和黄牛基因编码区存在7处碱基突变。牦牛KISS-1基因氨基酸序列与黄牛、藏山羊、绵羊、野猪、人和褐家鼠的同源性分别为97%、85%、65%、55%和51.5%。KISS-1基因mRNA在牦牛和黄牛的下丘脑、垂体、卵巢、输卵管及子宫中均有表达。在下丘脑和脑垂体的表达丰度高，但两物种间无显著性差异（P>0.05）。说明KISS-1基因在动物进化中比较保守，对牦牛季节性繁殖的调控作用有待进一步研究。

鲟鱼外周血淋巴细胞的分离及最佳体外增殖性反应条件

董颖, 胡红霞, 田照辉, 王巍, 东天

2018, 34(3):  150-155.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-1000

摘要 ( 355 )   HTML   PDF (1851KB) ( 465 )  

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以小体鲟（Acipenser ruthenus）为研究对象，应用不同浓度的淋巴细胞分离液对鲟鱼外周血淋巴细胞进行分离并探讨其增殖性反应的最佳条件。分别以植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA）和脂多糖（LPS）作为淋巴细胞增殖丝裂原，采用L25（56）五因素五水平正交试验设计，用Enhanced Cell Counting Kit-8法（增强型CCK-8或WST-8）对培养时间、培养温度、细胞密度、胎牛血清浓度及丝裂原浓度等因素进行探索性研究。结果表明：70%的Percoll液（比重为1.092 g/mL）作为淋巴细胞分离液的分离效果最佳。鲟鱼最佳外周血淋巴细胞体外增殖反应条件为：3.625×106初始细胞量、20 μg/mL的PHA或50 μg/mL的ConA或10 μg/mL的LPS作为丝裂原、10%-20%胎牛血清（FBS）、20-25℃培养2 d。

基于SSR标记的海带、裙带菜的遗传构成分析

彭捷, 崔翠菊, 梁广津, 李言, 武瑞娜, 刘延岭, 田萍萍, 李晓捷

2018, 34(3):  156-162.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0785

摘要 ( 264 )   HTML   PDF (3222KB) ( 466 )  

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旨在通过对配子体克隆和孢子体幼苗的初代筛选，以培育出纯度更高、性状更优良的海带与裙带菜品种。以11个海带与裙带菜克隆组合为材料，在筛选出区分亲本♀与♂的数对引物的基础上，对其子代与亲本的遗传构成进行了分析。试验中共选出13对能够区分11个组合亲本♀与亲本♂的SSR标记，分析结果显示，2013年育苗的48号组合中所有子代都是其亲本的后代，49号组合中只有1个子代是其亲本的后代；2014年育苗的22号组合中所有子代都是其亲本的后代；2015年育苗的海带与裙带菜杂交组合中，36号、38号、39号与41号杂交成功，其他组合未杂交成功；2016年育苗的59号组合中有7个子代与亲本无亲缘关系。分析这11个组合中所有个体与亲本的遗传构成发现：部分个体是其亲本的后代，部分个体遗传构成与亲本不一致。

菘蓝内生细菌的分离、筛选和鉴定

王霞, 薛林贵, 张晓华, 何小燕, 范桃桃, 尚海

2018, 34(3):  163-169.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0855

摘要 ( 343 )   HTML   PDF (1998KB) ( 365 )  

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筛选和鉴定药用植物菘蓝中对河西走廊常见植物病原菌禾谷镰刀菌、链格孢霉、大斑凸脐蠕孢有拮抗活性的内生细菌。利用常规分离法对菘蓝根、茎、叶、叶柄、花进行内生细菌的分离，采用同步培养法对分离的内生细菌进行活性菌株筛选，并对筛选的活性菌株进行形态观察，生理生化指标测定以及16S rRNA全序列鉴定。结果显示，共分离得到19株内生细菌，其中10株细菌对禾谷镰刀菌有不同程度的抑制作用，占分离菌总数的52.6%，其中菌株G2对禾谷镰刀菌的抑菌效果最强，抑菌率为94.63%，19株细菌均对链格孢霉，大斑凸脐蠕孢有不同程度的抑制作用，占分离菌总数的100%，其中菌株G2、J1、Y5及B2对这两种病原菌的抑菌率最大，均接近100%，经形态学观察，生理生化检测及16S rRNA序列分析，菌株G2为玫瑰色库克菌（Kocuria rosea）；菌株J1，Y5为黄杆菌（Microbacterium maritypicum）；菌株B2为人参短状杆菌（Brachybacterium ginsengisoli）。从菘蓝中分离筛选到了对河西走廊常见植物病原菌有强抑菌活性的内生细菌，尤其菌株G2、J1、Y5和B2的抑菌性较强，其抑菌活性值得进一步研究。

猪源沙门氏菌耐药性及耐药基因的分析

支威, 马海燕, 仇永凤, 胡素娟, 卫玲玲, 朱爱华

2018, 34(3):  170-176.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0743

摘要 ( 250 )   HTML   PDF (1350KB) ( 351 )  

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为研究猪源沙门氏菌耐药性与耐药基因的关系，采用K-B法测定从猪肉中分离的60株沙门氏菌对10种抗菌药物的敏感性，并通过PCR技术对沙门氏菌的耐药基因进行检测。结果显示，沙门氏菌对环丙沙星的耐药率最高，达98.3%，对复方新诺明、阿米卡星的耐药率在75%左右，而对庆大霉素、氯霉素、诺氟沙星及壮观霉素类药物比较敏感，敏感率达45%以上。耐药基因的检测结果显示，除了tetB、tetC、tetG、cat1和Aaca（3）-Ia这5种耐药基因没有扩增出来，tetA、parC、gyrA、sulI、sulII、floR和aadA1 7种耐药基因的检测率分别为53.3%、98.3%、66.7%、46.7%、33.3%、48.3%和66.3%。对已成功分离的沙门氏菌中几种常见的耐药基因进行克隆及特性分析，得知沙门氏菌的耐药基因可以决定细菌的耐药表型。

戈壁异常球菌Dgl5蛋白生物学功能研究

张亨, 刘盈盈, 陈云, 平淑珍, 王劲

2018, 34(3):  177-184.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0875

摘要 ( 247 )   HTML   PDF (4960KB) ( 214 )  

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LEA5C（Group 5C Late Embryogenesis Abundant）家族蛋白参与非生物胁迫反应并以分子伴侣的形式保护细胞内生物大分子不受损伤。分离于新疆戈壁沙漠的戈壁异常球菌（Deinococcus gobiensis）I-0具有极端的电离辐射、氧化、干燥等抗性。功能基因组注释表明Dgo_CA1605编码蛋白属于LEA5C家族，命名为Dgl5，对Dgl5生理功能展开研究。采用同源重组的方法构建Dgl5重组表达菌株。非生物胁迫实验结果表明，Dgl5能够显著增强表达菌株BL21盐胁迫抗性，最大限度地保护宿主菌免受反复冻融的损伤；体外生理生化实验结果表明在反复冻融条件下，Dgl5能够有效保护苹果酸脱氢酶（MDH）和乳酸脱氢酶（LDH）酶学活性。因此推测，在冷冻、高盐胁迫条件下，Dgl5蛋白通过保护细胞体内相关酶类的活性，增强宿主菌抵抗外界复杂多变的极端环境。

短小芽孢杆菌LC01漆酶基因在毕赤酵母中的胞外表达及重组漆酶酶学性质研究

李成名, 王佳懿, 卢磊,

2018, 34(3):  185-193.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0839

摘要 ( 256 )   HTML   PDF (2839KB) ( 225 )  

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为了获得表达量高、稳定性好及染料脱色效率高的细菌漆酶，通过PCR扩增出短小芽孢杆菌LC01的漆酶基因并构建重组表达载体pPICZαA-lac，转化毕赤酵母菌株SMD1168H后利用甲醇诱导培养重组菌获得重组漆酶，纯化并分析了重组漆酶的性质。重组菌株产漆酶活性在第7天达到最高，为1 390 U/L。纯化的重组漆酶分子量为65 kD，以丁香醛连氮为底物的最适反应温度和pH分别为70℃和6.8。在pH 9.0放置10 d活性没有下降，在70℃保温10 h后仍保留36%的酶活。Al3+、Fe3+和Mn2+完全抑制漆酶活性。在介体乙酰丁香酮参与下该漆酶能够有效脱色RB亮蓝、活性黑5和靛红，在pH 9.0时6 h的脱色率达到了90%以上，表明该重组漆酶能有效应用于染料废水的脱色处理。

碳氮比对固氮菌株WN-F合成胞外多糖的影响

邓超, 杜秀娟, 黄涛, 郭英, 李炳学, 卜宁

2018, 34(3):  194-199.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0583

摘要 ( 262 )   HTML   PDF (2361KB) ( 549 )  

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从沈阳农业大学棕壤长期定位试验站的栽培玉米土壤样品中分离筛选到高产多糖固氮菌株WN-F，从菌株鉴定、培养条件优化和固氮与产糖关系进行初步研究。对其进行形态学观察和分子生物学鉴定，酶标仪分析菌体生物量法确定菌株的生长培养条件，并分析其固氮与产糖之间的关系。结果表明，该菌株为阿氏芽孢杆菌，并命名为Bacillus aryabhattai WN-F。WN-F菌株在37℃，180 r/min情况下12 h时生长量达最高值。其培养基优化配方为（L-1）：蔗糖20.0 g，牛肉膏2.0 g，KH2PO4 0.4 g、MgSO4·7H2O 0.4 g、NaCl 0.4 g、CaSO4·2H2O 0.4 g和CaCO3 2.0 g。菌株WN-F的产糖情况随着初始氮浓度的增加，呈现出抛物线关系，适宜碳氮比促进菌体合成胞外多糖。Bacillus aryabhattai WN-F是长期定位试验玉米土壤中的优势菌株，高产胞外多糖且有固氮作用，是发挥玉米联合固氮作用，减少化肥施用的候选菌株。

植酸酶YiAPPA与生淀粉结合域SBD融合酶的构建及酶学性质分析

袁林, 黄朝, 曾静, 郭建军, 张婷, 吕珺,

2018, 34(3):  200-207.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0795

摘要 ( 242 )   HTML   PDF (3203KB) ( 218 )  

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旨在获得酶学性质改良的植酸酶YiAPPA与生淀粉结合域SBD的融合酶。通过在植酸酶YiAPPA的C末端融合嗜热酸性α-淀粉酶GTamy的生淀粉结合域SBD，获得融合酶YiAPPA-SBD。酶学性质分析表明，YiAPPA-SBD的高温活性和热稳定性得到了提高，并获得了对生玉米淀粉的结合能力。其中YiAPPA-SBD于55-90℃范围内的相对酶活均高于YiAPPA的相对酶活；于80℃的半衰期提高约2倍；在生玉米淀粉浓度大于8%的条件下，YiAPPA-SBD对其结合率达到80%以上。并且YiAPPA-SBD保留有YiAPPA的其它优良酶学性质，最适反应pH为4.5，37℃的绝对酶活高达3 900 U/mg，具有优良的pH稳定性和蛋白酶抗性。

pH和Ca2+协同作用对酵母代谢及细胞膜功能的影响

许艳俊, 李静媛

2018, 34(3):  208-216.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0817

摘要 ( 399 )   HTML   PDF (4305KB) ( 384 )  

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为了探究不同pH下添加不同浓度的Ca2+对酿酒酵母的代谢机制以及细胞膜功能的影响，以酿酒酵母为研究对象，利用模拟葡萄汁培养基，通过调整培养基中pH值和Ca2+含量，研究了酵母菌的代谢特征，并从细胞膜通透性和完整性的角度考察酵母代谢的机制。在确定的发酵条件下进行发酵：温度为28℃、转速为120 r/min，接种量为1×106 mol/L。结果表明，当pH为3.0时，随着Ca2+浓度的增加，酵母菌代谢速率加快，酵母菌细胞膜的通透性和完整性也增强，即Ca2+的添加减弱低pH对酵母的抑制作用。而当pH为5.5时，Ca2+对酵母菌代谢速率以及细胞膜的通透性和完整性作用不明显。结果表明Ca2+能缓解低pH下酿酒酵母的生理毒害作用。

二氧化碳分压和渗透压升高对CHO细胞维持期生长、代谢和产物表达的影响

王晨, 汪嘉琪, 赵亮, 范里, 刘旭平, 陈敏, 张理想, 谭文松

2018, 34(3):  217-224.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0749

摘要 ( 827 )   HTML   PDF (2271KB) ( 1218 )  

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为了深入了解培养体系中二氧化碳分压（pCO2）和渗透压对中国仓鼠卵巢（CHO）细胞产物表达的影响。考察了不同pCO2和渗透压条件下CHO细胞的密度维持、代谢、产物表达量和产品质量（糖型修饰和电荷异质化）的情况。pCO2和渗透压升高均对最终抗体表达产生不利的影响，其中渗透压升高对细胞后期活性维持不利，而pCO2升高则对产物表达期抗体比生成速率产生负面影响。通过对过程中胞内外代谢物的研究，发现pCO2和渗透压升高均会降低碳源有效利用率。在产物的质量方面，当渗透压升高时，产物的糖基化水平下降，产物电荷分析中的中性电荷含量比例升高；而当pCO2升高时，产物的糖型分布无明显变化，但其中中性电荷抗体含量降低。产物表达期的pCO2和渗透压的升高对细胞维持、物质能量代谢及产物表达存在诸多不利影响，因此应尽量避免培养体系中的CO2累积和渗透压升高的情况发生，以确保培养规模放大的正常进行。

葡萄籽中白藜芦醇的提取及其对LO2细胞氧化损伤保护及延缓衰老作用

高原, 王福玲, 徐蓓蕾, 雒江菡, 阎力君, 赵莹莹, 王越

2018, 34(3):  225-229.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0820

摘要 ( 359 )   HTML   PDF (2555KB) ( 1151 )  

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通过超声波辅助双水相法提取葡萄籽中白藜芦醇，酒精（100 mmol/L）诱导LO2细胞构建氧化损伤模型，D-半乳糖构建衰老小鼠模型，采用白藜芦醇提取物干预后，对细胞及小鼠肝匀浆超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）、丙二醛（MDA）含量进行测定。在液料比为1∶10、浸提时间40 min、超声温度50℃、超声功率300 W、超声时间10 min，双水相体系为（乙醇∶硫酸铵=1∶1）白藜芦醇提取率达到2.408±0.088 mg/g。白藜芦醇提取物作用LO2细胞后，能够降低乙醇诱导引起的丙二醛含量升高，能显著提高SOD和GSH-px的活性。白藜芦醇提取物对衰老模型小鼠肝中丙二醛的产生有一定的抑制作用，且能够提升SOD和GSH-px的活性。

金针菇Fv-Afe1基因的功能初探

姜思源, 丑天胜, 李肖, 黄蓉梅, 谢宝贵

2018, 34(3):  230-234.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0019

摘要 ( 280 )   HTML   PDF (2182KB) ( 321 )  

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从金针菇菌株L11基因组数据筛选出一个腺苷酸合成酶超家族基因Fv-Afe1。结合转录组数据分析基因结构，利用生物信息学软件对基因及其氨基酸序列生理生化指标进行预测，与NCBI已公布的其他物种的氨基酸序列进行系统发育分析，运用qRT-PCR技术和转录组表达谱数据对Fv-Afe1在金针菇各发育时期进行表达分析。结果显示，Fv-Afe1全长为967 bp，具有4个外显子和3个内含子，该基因氨基酸三级结构具有两个结构域，属于胞内酶，无跨膜结构，为真菌腺苷酸合成酶超家族成员；该基因在伸长期菌柄高表达，成熟期菌柄次之。

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2018, 34(3):  300. 

摘要 ( 138 )   HTML   PDF (1547KB) ( 189 )  

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2018, 34(3):  400. 

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2018, 34(3):  500. 

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