生物技术通报

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2018, 34(4): 0-0.

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CRISPR/Cas9系统在丝状真菌中的研究进展

王佩, 刘文, 沈祥陵

2018, 34(4): 1-8. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-1128

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丝状真菌（Filamentous fungi）是一种与人类生存密切相关的微生物,除了具有巨大的食用和药用价值外,还被广泛应用于工业开发。近年来,成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统（Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats-associated protein 9,CRISPR/Cas9）以其设计简单、操作方便、精准定位、效率高等诸多优点在各个研究领域中迅速发展,并受到了国内外广泛关注,但由于某些真菌如烟曲霉中极低的同源重组率等,使得对其进行遗传操作相对困难,因而该技术在丝状真菌尤其是大型真菌中的应用鲜少。从CRISPR/Cas9技术入手,结合该技术在丝状真菌研究领域的最新应用和研究进展,对其在丝状真菌中实现编辑的各种机制做了详细介绍,并重点分析了其在各类已报道的模式真菌中的应用,旨在为更多真菌实现基因编辑提供参考。

核盘菌致病机理研究进展

羊国根, 程家森

2018, 34(4): 9-15. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0108

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菌核病（Sclerotinia stem rot,SSR）是我国油料作物生产中主要病害之一,严重制约长江中下游地区油菜主产区的产业发展。菌核病的病原是子囊菌门的核盘菌,是一种世界性分布的重要植物病原真菌。其寄主范围广泛,引起的菌核病对多种作物的产量和品质造成重要影响。核盘菌作为典型的死体营养型病原真菌,侵染寄主植物时通过直接杀死细胞和破坏组织攫取生长所需的营养物质。核盘菌的致病机理相对复杂,前期研究主要集中在其分泌的水解酶类（角质酶、细胞壁降解酶和蛋白酶等）和草酸在核盘菌侵染寄主植物中的作用。近些年来,越来越多的研究证实了分泌蛋白在核盘菌的致病过程中同样发挥着重要作用。分泌蛋白（效应蛋白）主要通过诱导植物细胞死亡或抑制寄主细胞的免疫反应,促进核盘菌的侵染和定殖。综述了水解酶类、草酸和分泌蛋白等在核盘菌致病机制中的作用,并对核盘菌致病机理研究进行了展望,以期为菌核病的安全防控提供理论参考。

竹黄遗传多样性与竹红菌素合成和抗癌作用的研究进展

赵宁, 陈双林

2018, 34(4): 16-23. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0116

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竹黄在我国是一种重要的药用真菌,主要活性代谢产物为竹红菌素等苝醌类光敏色素。前人关于竹黄的研究主要集中在活性成分分析、临床应用和发酵培养等方面。竹黄遗传多样性的存在是不同居群、不同菌株之间竹红菌素生物合成代谢差异的原因,并且随着竹红菌素及其衍生物对肿瘤细胞的抑制机制被不断揭示,对于竹黄的遗传多样性、竹红菌素的合成代谢与抗癌作用机理等研究正持续深入。应用不同的分子标记发现,竹黄遗传多样性既可能来源于居群内,也可能来源于居群间;而通过化学修饰或物理修饰都使竹红菌素在肿瘤的光动力治疗（Photodynamic therapy,PDT）上展现出诱人的前景。同时,影响竹红菌素产生的聚酮合酶基因等新的研究发现最终将会有助于掌握竹黄中竹红菌素的生物合成途径。综述了竹黄的遗传多样性、竹红菌素及其衍生物对癌细胞的作用和竹红菌素生物合成的研究进展,旨在为竹黄的资源保育和竹红菌素的深入研发提供参考。

真菌漆酶在绿色化学中的研究进展

龚睿, 孙凯, 谢道月

2018, 34(4): 24-34. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0824

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漆酶主要是由真菌分泌的一类胞外多铜氧化酶,因其具备多功能特性而被广泛地应用于绿色环境化学。漆酶能够以分子氧作为电子接受体,催化氧化多种酚类和非酚类底物形成自由基中间体,随后这些自由基中间体涉及到氧化耦合或键断裂,最终导致底物发生氧化、分解或聚合反应。目前,主要采用包埋、吸附、共价绑定和交联结合等方法制备固定化漆酶,以增强漆酶在实际环境中的催化活性、稳定性和循环再利用功效。概述了真菌漆酶的分子组成、结构特性及其催化氧化不同底物的作用机理,系统地比较了漆酶的固定化技术及其利弊,重点阐述了漆酶在有机污染物去除、合成染料脱色、造纸废水、食品加工、生物传感器和环境质量指示器等领域的研究进展,旨在为拓展和开发真菌漆酶在绿色环境化学中的多功能应用提供新的理论依据和指导思想。

内生真菌提高禾草抗盐碱性研究进展

陈水红, 曹莹, 陈泰祥, 李春杰

2018, 34(4): 35-42. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0429

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盐碱会导致植株生长缓慢,甚至抑制其正常发育,如何降低高盐和高pH对植物的不利影响,已成为农业持续发展的重大课题。近年来,内生和共生真菌对宿主植物在抗盐碱方面的有益作用也引起了研究人员的广泛关注。综述了内生真菌对宿主禾草植物抗盐碱性影响的研究成果,首先评述了内生真菌对宿主禾草在盐碱胁迫下种子萌发和生长发育影响表现在：提高种子发芽率;促进胚芽和胚根生长;提高宿主禾草的分蘖数、叶片数、株高、生物量、根冠比、成熟花序长度、种子数和种子产量。但也有感染内生真菌对宿主在盐胁迫下无促进作用的。其次,评述了内生真菌在减少禾草盐碱胁迫的原初盐害方面作用表现为：影响膜透性、提高光合作用、增加水分利用效率、改变营养代谢和离子毒害、影响植物激素代谢。最后综述了内生真菌在减少禾草次生盐害方面作用,内生真菌具有促进禾草分泌抗氧化剂、增加抗氧化酶活性、调节有机渗透物质的作用。系统的归纳了内生真菌与宿主禾草抗盐碱性相关研究成果,提出未来可能的研究问题和方向为后期的科研提供参考。

接合菌蓝光受体蛋白研究进展

葛欣, 崔天琦, 李兴旺, 谢录翰, 辛琪

2018, 34(4): 43-50. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0035

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光信号是一种重要的环境因子,尤其是蓝光可以调控真菌的生长发育、生理周期、基因表达及多种代谢活动。接合菌亚门的真菌对环境信号特别是对光刺激感应灵敏,具有明显的趋向性,是研究真菌信号感应的理想材料,而同时具有无性生殖和有性生殖的特点也使之成为研究性别决定的模型。接合菌处于真菌进化的早期,进化地位低,其多拷贝的蓝光受体蛋白在长期进化过程中形成了完善的光受体系统,能够感应不同波长、光强和方向的蓝光和近紫外光,在接合菌的趋光性和类胡萝卜素合成以及无性生殖和有性生殖等光响应过程中发挥承上启下的重要作用。以接合菌中的代表菌株为例,总结了目前在接合菌中报道的蓝光受体蛋白,从基因发现、功能鉴定、光化学特性和调控途径等方面进行了比较分析,进而从3个方面详细阐述了与高等植物不同的接合菌中光受体蛋白调控的特殊生理过程;最后对以后接合菌蓝光受体蛋白的研究重点和难点进行了思考和展望,旨为相关研究者系统了解接合菌蓝光受体蛋白的功能和发展趋势提供线索和参考。

大丽轮枝菌致病及微菌核形成相关基因研究进展

谢成建

2018, 34(4): 51-59. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-1025

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大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）致病力强且宿主范围广,能以微菌核的形式在土壤中存活多年,当遇到合适的宿主就萌发,因此极难防控,对农业生产造成巨大危害。目前已经发现多种影响大丽轮枝菌致病力的基因,最为重要的发现为大丽轮枝菌能够形成侵入钉入侵植物,许多效应因子也是由侵入钉颈环处分泌出大丽轮枝菌并最终调控植物的免疫防御。同时,研究也表明黑色素对于形成成熟的微菌核非常关键,并且许多与微菌核形成相关的基因也与大丽轮枝菌致病相关。但目前的研究尚未完全阐明大丽轮枝菌如何导致植物萎蔫坏死以及微菌核形成的分子机理。综述了近年来有关大丽轮枝菌致病及微菌核相关基因的研究进展,以期为大丽轮枝菌致病及微菌核形成机理的进一步研究奠定理论基础。

酿酒酵母单萜合成的研究进展

伏贝贝, 赵建志, 李琛, 刘新利, 鲍晓明, 侯进

2018, 34(4): 60-69. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0880

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萜类化合物是以异戊二烯为基本单元的一大类天然化合物,广泛存在于植物、微生物及昆虫中。其中,单萜类化合物主要用于高级香料及化妆品、食品添加剂、杀虫剂、除草剂和新型燃料等的生产,具有广泛的应用潜力。近年来,研究人员已构建出多种萜类化合物的酿酒酵母工程菌株,且通过代谢工程和合成生物学的方法有效提高了产品的产量。但是单萜的微生物合成却相对落后,其中前体供给不足及单萜对微生物毒性强等因素限制了其高效合成。主要从以下几个方面阐述了利用酿酒酵母合成单萜类化合物的目前研究进展：包括单萜合成酶在酿酒酵母中的表达,利用动态调控、蛋白质工程等策略增强酿酒酵母中前体香叶基焦磷酸的合成通量,减少单萜的内源性转化,提高酿酒酵母菌株对单萜的耐受性。在此基础上,结合本课题组的前期工作,针对微生物合成单萜过程中依然存在的瓶颈问题提出可能的解决策略,旨在为进一步优化酿酒酵母单萜合成细胞工厂提供参考。

秀珍菇单孢子菌株原生质体制备条件的优化

孙晓瑞, 陈博文, 张小林, 孟俊龙

2018, 34(4): 70-76. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0797

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以秀珍菇单核菌丝为材料,用溶壁酶进行原生质体的制备,考察各因素对原生质体产量的影响,用单因素试验和正交试验确定最佳条件。结果表明,菌龄为8 d菌丝体,0.6 mol/L甘露醇+10 mmol/L Tris-HCl为稳渗剂,酶解温度29℃、酶浓度1.6%的条件下酶解160 min。原生质体产量达到3.5×107 CFU/mL,原生质体再生率达到1.4%。

马铃薯晚疫病菌原生质体制备及再生体系的研究

王伟伟, 肖燕, 张艺夕, 刘晶, 唐唯, 李灿辉

2018, 34(4): 77-82. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0151

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为明确致病疫霉的致病机理需要建立高效的病原菌原生质体制备和再生体系。通过对马铃薯晚疫病菌制备和再生过程的研究,采用两种裂解酶Driselase和Cellulase R-10,以不同菌龄、裂解酶、裂解酶的浓度和裂解酶的反应时间为研究条件,得到原生质体制备的最佳条件为：以培养18 d的菌丝体为材料,用10 mg/mL Driselase处理菌丝60 min后,原生质体产量达9.5×104 个/g;以0.1 mol/L氯化钙和0.4 mol/L甘露醇作为渗透压稳定剂,以黑麦V8固体再生培养基得到的原生质体再生率最高达3.1%。

响应曲面法优化鸡腿菇菌丝发酵液抗菌蛋白及其抗氧化活性

秦楠, 刘羽, 王力宇

2018, 34(4): 83-90. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0850

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以抑菌圈直径为指标,采用单因素试验和响应面法对鸡腿菇菌丝发酵液产抗菌蛋白的发酵条件进行优化。得到最佳发酵条件为：发酵时间5 d,温度24℃,pH 7,接种量5％,摇床转速100 r/min,在此条件下抗菌蛋白的抑菌圈直径达21.14 mm;抗氧化性结果表明,鸡腿菇菌丝发酵液抗菌蛋白对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）自由基的清除能力相对较弱,而对羟基自由基（·OH）有较强的清除作用,其抗氧化能力随着抗菌蛋白浓度的增加而增强。

响应面法优化褐腐真菌竹生薄孔菌产纤维素酶的液体培养基

马鸿飞, 崔宝凯, 员瑗, 陈圆圆, 戴玉成, 司静

2018, 34(4): 91-101. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0067

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竹生薄孔菌是一种褐腐真菌,可产生具有重要应用价值的纤维素酶。以纤维素酶为响应值,通过响应面Plackett-Burman设计、最陡爬坡设计、Box-Behnken设计建立数学模型,获得竹生薄孔菌产纤维素酶的最适液体培养基为：葡萄糖7.44 g/L、蛋白胨5.0 g/L、麸皮35.31 g/L、Tween 80 9.57 mL/L、KH2PO4 1.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、CoCl2·6H2O 0.06 g/L、FeSO4·7H2O 0.03 g/L、CaCl2 0.5 g/L、ZnSO4·7H2O 0.05 g/L、维生素B1 0.01 g/L。在此优化培养基条件下得到的纤维素酶活性为53.17 U/mL,与理论值52.65 U/mL相近,且比优化前提高了2.84倍,说明响应面设计对于优化液体培养基以提高纤维素酶活性切实可行。

稻曲病菌基因组DNA提取方法比较与小文库构建

伏荣桃, 王剑, 陈诚, 龚学书, 卢代华, 罗曦, 郑爱萍

2018, 34(4): 102-106. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0686

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水稻稻曲病是由稻曲病菌引起的真菌病害,现已成为水稻重要的病害之一。旨在寻找一种最佳的稻曲病菌基因组DNA提取方法,并构建基因组小文库。采用CTAB、SDS和真菌DNA试剂盒3种提取方法提取稻曲病菌基因组DNA,并用Illumina系统测序分析,构建基因组小文库。结果显示,CTAB提取法能得到高质量的基因组DNA,小文库测序组装共得29 350 288碱基（bp）和17 908 Scaffold,总碱基的GC含量为49.79%。CTAB提取法是稻曲病菌基因组DNA最佳的提取方法,基因组小文库成功的构建为稻曲病菌的基因组gap的填补和致病相关基因的鉴定提供了数据资源。

草菇芳香醇氧化酶基因vvaao1的序列特征与差异表达

严俊杰, 仝宗军, 刘媛媛, 张磊, 张云, 谢宝贵

2018, 34(4): 107-114. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0166

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对芳香醇氧化酶编码基因vvaao1序列特征及差异表达进行分析,以期为研究vvaao1在草菇基质降解与子实体发育中的生物学功能提供依据。应用ZOOM软件分析基因结构与序列准确性;通过生物信息分析网站预测氨基酸序列的信号肽、亚细胞定位及三级结构;采用MEGA 5.1构建系统发育树;结合数字基因表达谱（DGE）、荧光定量PCR（RT-qPCR）、蛋白质组（iTRAQ）分析进行差异表达分析。结果显示,vvaao1全长3 091 bp,含有9个外显子、8个内含子,开放阅读框长1 803 bp,编码600个氨基酸;生物信息分析结果显示：VvAAO1具备信号肽,为分泌蛋白;其三级结构由20个α-螺旋和19个β-折叠组成,与模式蛋白3FIM的一致性（Identity）达到48%。进化树结果显示,VvAAO1属于AAO家族,与侧耳属菌株Pleurotus. eryngii和P. pulmonarius的AAO序列最为接近。DGE、RT-qPCR及iTRAQ的分析结果表明,vvaao1在可孕异核体菌丝上的表达量分别是两个同核体菌株之和的51.0、49.8和2.13倍;进一步对不同发育阶段的子实体样品进行RT-qPCR检测,结果显示vvaao1在原基时期的表达量均显著高于其他时期的样品。VvAAO1具备信号肽,为分泌蛋白,其编码基因在异核体菌株H1521的表达水平显著高于两个同核体菌株之和,存在协同增效表达,且在原基时期表达量最高,vvaao1的高表达可能有利于草菇子实体的形成。

白灵侧耳子实体发育相关基因的挖掘

荣成博, 赵爽, 宋爽, 王晶, 刘宇

2018, 34(4): 115-120. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0139

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白灵侧耳色泽洁白,营养丰富,且具有抗肿瘤、增强免疫力等多种功效,是我国具有自主知识产权的珍稀食用菌品种。探索白灵侧耳子实体发育相关基因能够为分子辅助育种提供有效、快速标记。实验前期获得了两株白灵侧耳双核菌株,JZB2106010能够结实形成子实体,JZB2106010的单核菌株经自交获得了1株不能形成子实体的双核菌株JZB2106103。以JZB2106010和JZB2106103为实验材料,进行转录组测序,获得了两个菌株的差异表达基因并进行了功能富集分析,其中催化活性和代谢过程本体中差异基因数目最多,选取部分表达差异显著的基因通过荧光定量PCR进行验证,结果显示编码苯丙氨酸裂解酶的基因（CL4509）和编码乙醇氧化酶的基因（CL2173）在JZB2106010中表达量显著提高,推断与白灵侧耳的子实体发育相关;另外还发现一个编码DNA解旋酶的基因（Unigene7793）在JZB2106103中的表达量是JZB2106010的1 046倍,推测该基因与白灵侧耳子实体发育呈负相关。

榆黄菇遗传多样性的ISSR和SRAP综合分析

武海月, 赵爽, 刘宇, 李华敏, 宋爽, 牛玉蓉, 荣成博

2018, 34(4): 121-126. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-1067

摘要 ( 360 )

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榆黄菇味道鲜美,营养丰富,且必需氨基酸含量高,近几年成为食用菌的重要栽培种类之一。通过ISSR和SRAP分子标记方法对全国收集到的19个榆黄菇品种进行遗传多样性综合分析,从而为其杂交育种的亲本选择提供理论指导。筛选出10个ISSR引物和10对SRAP引物,利用筛选的引物,以榆黄菇的基因组DNA为模版进行PCR扩增,共获得194条清晰条带,其中150条是多态性条带,占总条带的77.3%。对条带进行聚类分析,结果表明在相似系数为0.70水平上,可将19个供试榆黄菇菌株分为4大类,表明19个供试榆黄菇菌株间具有较大的遗传差异,聚类分析图为杂交育种的亲本选择提供分子水平的依据。

大球盖菇漆酶的分离纯化及酶学性质研究

钱磊, 张业尼, 陈雪, 刘金福, 张志军, 刘建华

2018, 34(4): 127-132. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0629

摘要 ( 368 )

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从大球盖菇Sr-01菌株液体发酵液中分离漆酶,研究温度、pH和金属离子对酶活的影响。采用硫酸铵分级沉淀、Q-Sepharose阴离子交换层析和Superdex 200凝胶过滤层析对大球盖菇漆酶进行分离纯化。以ABTS[2,2-连氮基-双-（3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸）]为底物,分光光度法测定酶活。结果表明,纯化后的漆酶比活力为152.79 U/mg,回收率为35.8%。SDS-PAGE显示该漆酶为单体蛋白,相对分子质量约40 kD。该漆酶的最适反应温度和pH分别为35℃和4.0,Mg²⁺、Cu²⁺对酶活有激活作用,Fe²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺则有显著抑制作用。在最优反应条件下,纯化后的漆酶比活力可达222.93 U/mg。

拆分网络分析22株蛹虫草亲缘关系及高产虫草素菌株初筛

刘建兵, 戚梦, 杜苑如, 傅俊生, 胡开辉

2018, 34(4): 133-138. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0852

摘要 ( 296 )

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对22株蛹虫草Cordyceps militaris的ITS序列进行分析,并基于拆分网络法splits networks,分析供试菌株的亲缘关系,再进一步比较供试菌株发酵产虫草素能力,筛选出高产虫草素菌株。结果表明,22株蛹虫草的ITS序列长度在518-539 bp之间,对位排列后有39个差异位点,其中有12个简约信息位点,并且都发生在ITS1区;构建的拆分网络显示22株虫草聚为3个类群,每个类群因其特有的碱基替换而区别于其他菌株;22株蛹虫草发酵产虫草素性能差异很大,且虫草素主要存在于胞外液中,MF27的胞外液虫草素含量为332.74 mg/L,显著高于其它菌株（P<0.05）。本研究为研究蛹虫草菌株间的系统关系和种质资源管理提供了依据。

酿酒酵母PMT1与PMT3双基因缺失对细胞寿命的影响

崔红晶, 周涛, 邱堃佩, 宋浩昌, 刘新光

2018, 34(4): 139-143. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0847

摘要 ( 348 )

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研究蛋白质O-甘露糖转移酶（Protein O-mannosyltransferase,PMT）家族中PMT3基因缺失,以及PMT1与PMT3双基因缺失对酵母细胞复制性寿命的影响。采用一步基因置换法构建PMT3基因缺失酵母菌株（pmt3Δ）,基于基因同源重组的原理,构建PMT1和PMT3双基因缺失酵母菌株（pmt1Δpmt3Δ）;显微镜下分离和计数酵母子细胞的数目,统计酵母细胞复制性寿命。与野生型酵母细胞的平均复制性寿命（26代）比较,pmt3Δ菌株（24代,P > 0.05）和pmt1Δpmt3Δ菌株（25代,P > 0.05）的平均寿命均无明显变化,差异无统计学意义。酵母PMT3单基因缺失,以及PMT1和PMT3双基因缺失均不影响细胞的复制性寿命。

深海真菌Dichotomomyces cejpii胶霉毒素生物合成基因启动子的克隆和功能鉴定

黄自磊, 章卫民, 叶伟, 李赛妮, 李浩华, 朱牧孜

2018, 34(4): 144-150. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0941

摘要 ( 367 )

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利用染色体步移技术对深海真菌Dichotomomyces cejpii中胶霉毒素的生物合成基因GliG、GliI和GliO启动子进行克隆,并将其核心区域导入pGL3-basic荧光素酶报告基因载体,通过荧光强度分析发现GliG的启动子转录活性最强。进一步将GliG启动子核心区域导入含潮霉素抗性标记的pAN7-1载体,以替换原有启动子pgpdA,并将重组质粒导入酿酒酵母,用潮霉素抗性平板进行筛选,发现GliG启动子能在酿酒酵母中启动潮霉素抗性基因的表达。

镰刀菌Q7-31T果胶酶PGL1的分离纯化、酶学性质鉴定及结构分析

秦日甜, 谢占玲

2018, 34(4): 151-160. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0864

摘要 ( 316 )

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从镰刀菌Q7-31T中分离纯化和鉴定果胶酶并进行生物信息学分析,旨在探究果胶酶降解植物细胞壁的作用,进一步完善镰刀菌属纤维素降解酶系信息。以0.8 % 蛋白胨为氮源,0.5% 燕麦秸秆为碳源诱导发酵培养镰刀菌Q7-31T;采用Sephacry S-100 凝胶柱层析和 DEAE 琼脂糖弱阴离子交换柱层析对粗酶液进行分离纯化得到果胶酶PGL1;对其进行了酶学性质分析和串联质谱鉴定;最后通过生物信息学分析结构及预测功能。PGL1分子量为36.21 kD,等电点为8.13;PGL1最适反应温度为40℃,最适反应 pH 为8;在20℃ 到50℃ 和pH 8.0到10.0能保持较高稳定性;Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺ 和Fe²⁺对PGL1有抑制作用,串联质谱鉴定表明该蛋白为一种新型PL-1家族果胶酶。PGL1的二级结构构成元件中无规则卷曲和延伸链比例较高,分别占37.96%和31.17%;PGL1两端亲水性强而中间部分疏水性强;磷酸化位点共13个（Ser∶9;Thr∶3;Tyr∶1）;PGL1存在2个潜在的N-糖基化位点;跨膜结构域预测显示其为分泌酶;功能结构域预测出其降解植物细胞壁的作用。从镰刀菌Q7-31T中分离纯化得到一种新型PL-1家族果胶酶PGL1并对其进行了生物信息学分析。

镰刀菌Q7-31T金属蛋白酶FQME14的分离纯化及鉴定

秦日甜, 卢玉丽, 梁高丽, 谢占玲, 雷亚男

2018, 34(4): 161-167. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0896

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从镰刀菌 Q7- 31T 燕麦秸秆诱导发酵的粗酶液中分离、纯化并鉴定金属蛋白酶。研究该蛋白酶的酶学特性,丰富和完善金属蛋白酶的基础资料;探究其在纤维素酶系降解纤维素过程中发挥的作用,旨在丰富和完善纤维素酶系降解机制。以燕麦秸秆为碳源诱导发酵镰刀菌Q7-31T,并在发酵第6天收酶。通过硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S-100凝胶过滤层析和DEAE弱阴离子交换层析对粗酶液进行分离纯化得到金属蛋白酶,随后对其进行了酶学性质分析和串联质谱鉴定。结果显示,从镰刀菌Q7-31T菌株的粗酶液中分离得到一种蛋白酶FQME14,其相对分子质量为30 kD;串联质谱鉴定的结果表明FQME14属于M14家族;蛋白酶酶学性质研究表明：该蛋白酶的比酶活为2.85 U/mg,最适反应pH和温度分别为pH 7.0和40℃,在pH 5.0-pH 9.0的范围内具有很好的稳定性,蛋白酶在50℃以下稳定性很好,超过50℃酶活力降低。该蛋白酶对酪蛋白、卵清蛋白和牛血清白蛋白都有很高的降解能力。金属离子Mn²⁺和Co²⁺对酶活性有激活作用,Mg²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、K⁺、Ca²⁺和Na⁺对酶活性有不同程度的抑制作用。从镰刀菌Q7- 31T 粗酶液中分离纯化得到蛋白酶FQME14,并对其进行了酶学性质的研究和串联质谱鉴定,结果表明FQME14为M14家族蛋白酶,是一种新的金属蛋白酶。

氧化胁迫对粉红螺旋聚孢霉生长和产厚垣孢子的影响

王琦, 冯静红, 孙占斌, 姜维治, 李世东, 孙漫红, 马桂珍

2018, 34(4): 168-173. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0070

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通过改变液体发酵通气量和添加不同种类活性氧（O2-,H2O2,OH·）,研究氧化胁迫对粉红螺旋聚孢霉67-1菌丝生长和产厚垣孢子的影响。结果表明,氧化胁迫对真菌菌丝和孢子的影响不同。低氧胁迫下,67-1菌丝生长状态发生改变,培养液装量越多,菌丝分枝越少,并且厚垣孢子产量越低。发酵过程中添加一定量的活性氧可以调控粉红螺旋聚孢霉厚垣孢子的形成。接种前添加5-6 mmol/L H₂O₂,菌株产厚垣孢子水平显著提高,浓度达到9 mmol/L 时,67-1生长和产孢完全受到抑制。培养16 h后添加,67-1对H₂O₂ 的耐受力增强。培养基中添加甲萘醌能够抑制厚垣孢子的形成,培养16 h 后添加350 µmol/L 甲萘醌则可以提高67-1厚垣孢子的产量。在Fe²⁺-H₂O₂ 体系中,不同添加时间高氧胁迫均能够显著促进厚垣孢子的生成（P < 0.05）。

一株油菜菌核病拮抗真菌的鉴定及生物学特性研究

丁锐, 张浩琪, 陈旭辉, 林浩, 曲波

2018, 34(4): 174-178. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0073

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从兰科植物羊耳蒜根部分离并筛选对油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum 具有较强拮抗作用的内生真菌,确定其分类地位,并对其体外培养特性进行研究。利用常规PDA培养法进行内生真菌的分离、培养,采用平板对峙法筛选具有较强抑菌活性的菌株并对其进行种类鉴定,同时设定不同碳源、氮源、温度和pH值条件研究该菌株的生物学特性。通过筛选获得1株对油菜菌核病菌具有较强抑制作用的真菌菌株,结合形态学特征和ITS分子序列分析将其鉴定为多节孢属Nodulisporium sp.。该菌株对碳源要求不严格,以麦芽糖、果糖、葡萄糖和蔗糖为碳源均能良好生长。氮源对该菌株生长具有显著影响,最适氮源为牛肉膏。其最适培养温度为25℃,且温度低于10℃或高于30℃时菌丝生长均受到明显抑制。同时该菌株能耐受较广的酸碱度范围,在pH5-9范围内均生长良好。

设施番茄根围土样中木霉菌多样性及功能活性分析

张广志, 王加宁, 吴晓青, 周方园, 张新建, 赵晓燕, 谢雪迎, 周红姿

2018, 34(4): 179-185. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0690

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为探索设施栽培条件下蔬菜根围土壤中木霉种群多样性特征及其抗常见植物病原真菌及有机磷农药降解活性,从连续20多年种植番茄的设施大棚根围土样中以及番茄根系内部分离木霉菌,并以tef1-α序列和系统发育分析进行种类鉴定,估算各菌株的相对种群密度;对其生防和农残降解活性进行了测定。结果共分离不同木霉菌株27株,结合形态学特征和tef1-α序列分析,鉴定出分属6个不同的木霉种,即绿色木霉（Trichoderma virens）、深褐木霉（T. atrobrunneum）、西蒙斯木霉（T. simmonsii）、深绿木霉（T. atroviride）、厚木霉（T. crassum）和1个疑似木霉新种（T. sp. nov.）;木霉各菌株产孢簇常呈鲜绿色到暗绿色,分布不均匀,常形成同心圆结构。对峙条件下这些木霉对土壤中常见土传病原菌立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）、尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）均有普遍的不同程度的抑菌活性;除深褐木霉两个菌株对毒死蜱的降解效果不明显外,其它种类的木霉均有菌株能有效降解毒死蜱,木霉菌株在根围土壤中的相对种群密度仅为104 cfu/g,且菌株间差异较大。研究结果表明设施农业土壤中木霉菌具有丰富的种质资源多样性,在形态特征及功能活性方面表现明显的菌株差异;木霉对3种常见植物病原真菌有普遍的抑菌作用,少数菌株对常用有机磷农药降解作用明显,可以发挥生防和农化残留降解方面的协同效应。该结果对于研究设施农业土壤中木霉的多样性,指导功能菌株筛选及应用,更好挖掘利用木霉菌资源有着较好的借鉴意义。

真菌DWL-C010的鉴定及其可溶性红色素热稳定性分析

马博, 张婷婷, 吴宝祥

2018, 34(4): 186-193. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0129

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从广西大王岭自然保护区内原始森林土壤中分离得到一株能够产可溶性红色素真菌DWL-C010,通过形态特征和多基因位点系统发育分析对其进行了鉴定,并分析了该菌红色素的热稳定性,同时还测定了其纤维素半纤维酶和糖化酶酶活。结果表明,菌株DWL-C010形态特征与白二轮蓝状菌基本一致,且其ITS、RBP2、RBP1和BenA序列与白二轮篮状菌CBS133440T相应序列的一致性均高达99%,CaM序列一致性为96%,并且在系统发育树中二者均聚在了一起,故将其鉴定为白二轮篮状菌。菌株DWL-C010红色素具有较好的热稳定性,其不同温度下的热解常数与时间具有良好的线性关系,符合一级动力学模型;依赖温度的热降解常数也符合Arrhenius模型,其活化能为51.82 kJ·mol-1。此外,菌株DWL-C010第6天的木聚糖酶、纤维素内切酶及糖化酶酶活依次为33.098、1.880和0.976 U/mL。

黄曲霉核糖体蛋白基因在不同生长时期的表达分析

耿龙泼, 王鑫旺, 黄路华, 邓基利, 汪世华, 张峰

2018, 34(4): 194-200. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-1049

摘要 ( 466 )

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核糖体是生物合成蛋白质的主要场所。核糖体蛋白是核糖体的重要组分之一。为了探究黄曲霉核糖体蛋白与其生长发育之间的关系,分别收集处于菌丝期、孢子期、菌核期的黄曲霉。在提取了总RNA和反转录获得了cDNA后,利用荧光定量RT-PCR对74个黄曲霉核糖体蛋白基因的表达量进行分析。结果表明,在所有被检测的核糖体蛋白基因中,没有一个基因的表达量在3个时期都是恒定的。与菌丝期相比,在孢子期,有54个核糖体蛋白基因的表达量发生上调,而表达量下调的基因只有2个;在菌核期,有57个基因的表达量上调,而有12个基因的表达量下调。GO功能分析表明,核糖体蛋白基因富集在结构分子活性,结合,细胞,大分子复合物,细胞器,细胞部分,细胞器部分,细胞过程,代谢过程。可见,核糖体蛋白与黄曲霉的生长发育存在紧密联系。

H₂O₂对黑曲霉氧化胁迫机理的研究

陈浩宇, 徐瑞涛, 程志翔, 高强, 张健

2018, 34(4): 201-207. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0026

摘要 ( 363 )

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旨在探究H₂O₂胁迫下,黑曲霉的氧化应激响应,为控制黑曲霉生长和赭曲霉毒素A（OTA）合成提供依据。测定黑曲霉菌体生长、OTA合成、胞内活性氧（ROS）和脂质过氧化水平,以及抗氧化酶活性。H₂O₂能够抑制黑曲霉生长,且抑制作用具有剂量相关性;能促进其合成OTA,尤其是生长第4天时最为明显;能提升胞内ROS水平和丙二醛（MDA）含量;引起胞内过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）的活性增高,其中在生长第5天CAT酶活提高显著,生长第6 天 GPX酶活提高显著;但对超氧化物歧化酶（SOD）活性无显著影响。菌体通过提升胞内抗氧化酶活性及毒素的合成来平衡胞内过多的活性氧,从而在氧胁迫下维持菌体生长及代谢。

一株分离自铀矿酸性浸出液霉菌的鉴定与碳源代谢分析

刘欢, 徐玲玲, 李江

2018, 34(4): 208-213. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0592

摘要 ( 378 )

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旨在通过形态学观察、rDNA ITS序列分析以及Biolog微生物鉴定系统对霉菌进行鉴定,并通过计算平均吸光值（AWCD）了解霉菌的生长情况以及各类碳源的消耗量,运用数据分析霉菌的碳源利用情况。结果表明,结合rDNA ITS序列、形态学观察以及Biolog鉴定系统确定菌株为黑曲霉;比较8类碳源消耗情况,可知对氨基酸类、脂类、酸类的利用最多,根据碳源代谢情况列出15种最先利用碳源。鉴定菌株为黑曲霉,且该菌株的最适碳源为P-羟苯乙酸,可作为耐酸曲霉代谢研究的材料。

黄孢原毛平革菌漆酶基因lac1680的克隆、表达及产酶研究

陈建军, 刘梁涛, 曹香林

2018, 34(4): 214-220. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0946

摘要 ( 366 )

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以先前筛选到的高产漆酶黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）为模板,利用同源克隆技术合成一个全长为1 680 bp的漆酶基因,核苷酸及氨基酸序列比对显示该基因与真菌漆酶基因有较高的同源性,将其命名为lac1680,将该基因连接到构建好的pET24a载体上,并转入表达菌株BL21 Escherichia coli（DE3）中,经对重组菌预表达的全菌裂解物进行SDS-PAGE检测,获得75 kD目的条带,表明诱导表达成功。随后利用NI-NTA层析柱对洗脱下来的lac1680蛋白进行纯化,纯化回收后,漆酶纯度可达98%以上。通过对比基因工程菌和黄孢原毛平革菌野生菌株不同培养时间产酶活力,结果表明构建好的工程菌活力比原菌酶活力有明显的提高,提高了近39%。

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