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2019年 第35卷 第11期    刊出日期：2019-11-26

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研究报告

马铃薯St4CL的克隆及表达分析

谢海娟, 范希德, 叶广继, 周云, 王舰, 杨永智

2019, 35(11):  1-8.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0505

摘要 ( 325 )   HTML   PDF (2988KB) ( 324 )  

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4-香豆素辅酶A连接酶（4CL）是苯丙烷代谢途径中关键酶之一,克隆马铃薯4CL,并分析其表达情况,为马铃薯4CL的功能研究奠定基础。从马铃薯青薯9号中克隆St4CL,并进行生物信息学分析,采用qRT-PCR技术检测St4CL在青薯9号各组织中以及不同马铃薯品种中的表达量。结果表明,St4CL的CDS长度为1 710 bp,编码569个氨基酸,蛋白分子质量约为61.83 kD,等电点为5.53。生物信息学分析表明,St4CL蛋白是稳定的疏水性蛋白,具有无规则卷曲（42.36%）、α-螺旋（28.47%）、延伸连（21%）、β-折叠（8.08%）;亚细胞定位预测显示,St4CL位于叶绿体类囊体膜上;系统进化分析表明,St4CL蛋白与番茄的Sl4CL蛋白亲缘关系最近,二者同源性为97%。St4CL启动子区域含有多种与逆境响应相关的顺式作用元件,如脱落酸响应元件、赤霉素响应元件以及与干旱和黄酮类生物合成相关的MYB结合位点。qRT-PCR结果显示,St4CL在青薯9号各组织中均有表达,叶片中表达量最高,花中次之,根中表达量最低;在不同马铃薯品种中的表达量存在差异,在高抗晚疫病品种青薯10号中表达量最高,感病品种下寨65中的表达量最低。

辣椒胞质雄性不育系线粒体基因CaATP9的克隆与表达

张婧柔, 邵贵芳, 王姣, 张水, 杨婷玉, 邓明华

2019, 35(11):  9-15.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0283

摘要 ( 226 )   HTML   PDF (4010KB) ( 165 )  

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通过克隆辣椒胞质雄性不育系线粒体基因CaATP9及其表达情况,为研究辣椒胞质雄性不育机理提供依据。以辣椒胞质雄性不育系9704A和同型保持系9704B为试验材料,研究CaATP9的一级结构在2个材料之间的差异和RNA编辑现象,并利用实时荧光定量PCR研究了该基因的时空表达。结果表明,CaATP9的一级结构在2个材料之间没有差异;CaATP9在转录过程中存在5个C→T的编辑位点,导致4个亲水性氨基酸（DNA模板）变换成4个疏水氨基酸,增强了蛋白质的稳定性;CaATP9在辣椒的不同组织中均有表达,但表达量存在一定差异,繁殖器官中的表达量要普遍高于营养器官;在花蕾发育过程中,胞质雄性不育系中CaATP9的表达量与同型保持系存在差异,推测这种表达差异导致胞质雄性不育系花蕾能量供应紊乱,影响小孢子的正常发育而表现不育。

梨黑斑病抗病相关基因PpEMS1的克隆与分析

段敏杰, 伊洪伟, 王进, 武峥

2019, 35(11):  16-21.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0240

摘要 ( 255 )   HTML   PDF (3284KB) ( 362 )  

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克隆梨抗病相关基因,并对其在梨黑斑病抗病防御中的作用进行初步分析。基于同源基因克隆方法从“黄冠梨”中克隆获得一个预测为受体样蛋白激“酶EMS1的基因,暂命名为PpEMS1。利用生物信息学、Southern Blot、亚细胞定位和实时荧光定量PCR技术对该基因进行分析。结果表明,该基因CDS全长3 894 bp,编码1 296个氨基酸,开放阅读框3 891 bp。Southern Blot分析表明,在“黄冠梨”、“黄花梨”、“翠玉梨”中,该基因都以单拷贝形式存在,在“爱宕梨”中以多拷贝形式存在。亚细胞定位结果显示,融合蛋白在细胞膜和细胞核均有表达。荧光定量PCR分析表明,接种黑斑病菌1、2、3、4、5、6、7和8 d后,在“黄花梨”和“爱宕梨”中该基因表达均呈现先上升后下降的趋势。推测该基因可能与梨黑斑病抗性相关。

宁夏中宁地区灵武长枣果实多糖的单糖成分GC-MS分析

章英才, 苏伟东, 柴雅红

2019, 35(11):  22-29.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0304

摘要 ( 304 )   HTML   PDF (2115KB) ( 337 )  

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研究宁夏中宁地区灵武长枣果实多糖的单糖成分,为不同地区灵武长枣的开发利用提供试验依据。以不同发育时期中宁产灵武长枣果实为试验材料,采用热水浸提法和气相色谱-质谱联用法（GC-MS）等,探讨不同发育时期果实多糖含量变化规律及其单糖组成成分。结果表明,不同发育时期中宁产灵武长枣果实粗多糖得率分别为：膨大前期0.43%、快速膨大期0.527%、着色期0.80%和完熟期0.618%;果实粗多糖经DEAE-52均得到Ju-0、Ju-1、Ju-2、Ju-3 4个多糖级分,其中Ju-2含量为最高,表明果实多糖的主要形式为酸性多糖;不同发育时期果实各精制多糖总共含有阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸10种单糖,不含果糖,以阿拉伯糖、半乳糖、核糖、鼠李糖、糖醛酸含量较高,岩藻糖、葡萄糖含量次之,木糖、甘露糖含量较低,但其含量各组分有差异。精制多糖含量随着果实的发育进程总体呈现上升趋势;不同发育时期中宁产灵武长枣果实各精制多糖中单糖组成及含量各不相同。

根施SA对番茄幼苗盐害损伤的修复效应

孙德智, 杨恒山, 宋桂云, 范富, 侯迷红, 彭靖, 韩晓日

2019, 35(11):  30-38.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0571

摘要 ( 249 )   HTML   PDF (2605KB) ( 280 )  

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探讨根施水杨酸（SA）缓解番茄幼苗盐胁迫伤害的调节作用,为合理利用SA解决番茄栽培中的盐害问题和培育抗盐番茄品种提供科学依据。以“秦丰保冠”番茄品种幼苗为试材,在营养液栽培条件下,研究50-800 μmol/L SA对100 mmol/L NaCl胁迫下番茄幼苗生长、叶绿素含量、气体交换参数、叶绿素荧光参数、膜脂过氧化及抗氧化酶活性的影响。结果显示,盐胁迫下,不同浓度SA处理的番茄幼苗生长抑制均能得到有效缓解,同时叶片叶绿素含量、光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、蒸腾速率（Tr）、最大荧光（Fm）、PSⅡ最大光化学效率（Fv/Fm）、实际光化学效率（Φ_PSⅡ）和光化学淬灭系数（qP）不同程度升高,细胞间隙CO₂浓度（Ci）、最小荧光（Fo）和非光化学淬灭系数（NPQ）显著降低,其中SA浓度为200 μmol/L时,各指标变幅均达到最大;在盐胁迫下,番茄幼苗叶片超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性、丙二醛含量和电解质渗出率显著升高,过氧化氢酶（CAT）活性变化不显著,施加各浓度外源SA处理促进了上述3种酶活性的升高,同时使叶片丙二醛含量和电解质渗出率显著降低,并以200 μmol/L SA处理时变化最显著。外源SA主要通过增强幼苗叶片的光合能力来缓解盐胁迫造成的氧化伤害,进而提高番茄植株的耐盐性。本试验条件下,以200 μmol/L SA处理效果最好。

CiCHI提高拟南芥总黄酮含量

杨飞芸, 白洁, 刘坤, 王瑞刚

2019, 35(11):  39-45.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0669

摘要 ( 294 )   HTML   PDF (3090KB) ( 176 )  

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查尔酮异构酶（CHI）是类黄酮合成途径中的第二个关键酶,对调控整个代谢途径起着重要作用,明确该基因功能,为进一步揭示中间锦鸡儿的抗逆机制提供理论依据。根据已知CHI基因的保守结构域设计简并引物,以中间锦鸡儿cDNA为模板,克隆得到CiCHI全长,并通过序列分析、系统进化分析进行确认。qRT-PCR检测分析发现,中间锦鸡儿CiCHI的表达受到紫外、NaCl、ABA等胁迫诱导。CiCHI在叶中表达量最高,茎中次之,根中最少。异源表达CiCHI使拟南芥的总黄酮含量明显增加。

牦牛TNFAIP6基因克隆及其在卵巢活动中的时序表达

马鸿程, 熊显荣, 穆松银, 海卓, 秦文昌, 李键

2019, 35(11):  46-54.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0596

摘要 ( 239 )   HTML   PDF (3223KB) ( 303 )  

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旨在探讨牦牛TNFAIP6基因的序列特征,比较分析其在牦牛不同组织以及发情周期卵巢中的时序表达差异性。采集健康雌性牦牛的心脏、肺脏、脾脏、肾脏、肝脏、子宫、小肠、胃、肌肉和不同发情期的卵巢组织,提取各组织总RNA和总蛋白,通过RT-PCR技术克隆获得牦牛TNFAIP6基因序列并对其进行生物信息学分析,用半定量PCR检测其在牦牛不同组织中的表达水平,Western blot和qRT-PCR法分别检测其在不同发情期牦牛卵巢中的蛋白和mRNA表达水平,并进行统计学分析。克隆获得牦牛TNFAIP6基因CDS区全长830 bp,共编码279个氨基酸。蛋白质分析显示,TNFAIP6蛋白为亲水酸性稳定蛋白,无跨膜结构但有信号肽,其中包含Link和CUB两个结构域,其二级结构和三级结构主要由无规卷曲和α-螺旋组成。通过同源性比对分析,发现牦牛TNFAIP6基因与野牦牛和黄牛的同源性较高。半定量PCR结果显示,TNFAIP6基因在牦牛各组织中均有表达,其中在卵巢、子宫、脾脏和肌肉组织中表达显著高于其他组织。qRT-PCR结果显示,TNFAIP6基因在卵泡期卵巢中的表达水平极显著高于其他两个时期（P<0.01）,而红体期与黄体期的表达水平差异不显著（P>0.05）。Western blot结果与qRT-PCR结果基本一致。提示TNFAIP6基因可能参与牦牛卵巢活动调控,为进一步探讨TNFAIP6基因在牦牛卵巢活动中的作用机制提供基础资料。

岷县黑裘皮羊微卫星多态性及与生产性状的关联分析

张瑞, 郎侠, 吴建平, 王彩莲, 梁婷玉

2019, 35(11):  55-63.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0621

摘要 ( 245 )   HTML   PDF (1731KB) ( 271 )  

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分析10个微卫星位点在岷县黑裘皮羊群体中的遗传多样性及与生产性状的关联效应,为该品种种质资源的保护、利用和性状改良提供理论依据。选取12、24和36月龄的岷县黑裘皮羊各48只,测定其体重、体高、体长、胸宽、胸深和胸围性状,利用10对微卫星引物,采用PCR扩增和毛细管电泳技术,对岷县黑裘皮羊进行遗传多样性检测,并分析各位点基因型与生产性状的关联效应。10个位点在该群体中共检测到112个等位基因,平均等位基因数为11.2个,平均有效等位基因数为4.4508,平均观测杂合度为0.521 8,平均期望杂合度为0.765 7,平均多态信息含量为0.728 9;且10个位点均与不同月龄岷县黑裘皮羊体重、体高、体长、胸宽、胸深及胸围具有不同程度的关联效应。所选的10个微卫星位点多态性丰富,可用于评估岷县黑裘皮羊的遗传资源。此外,所选位点与生产性状均具有不同程度的关联性,可用于指导岷县黑裘皮羊的性状改良及育种工作。

京海黄鸡柔嫩艾美耳球虫感染后盲肠转录组分析

于海亮, 邹文斌, 王晓慧, 林雨鑫, 戴国俊, 张涛, 张跟喜, 谢恺舟, 王金玉, 施会强

2019, 35(11):  64-71.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0257

摘要 ( 224 )   HTML   PDF (2297KB) ( 271 )  

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为了探究京海黄鸡感染柔嫩艾美尔球虫（E. tenella）后盲肠组织差异表达基因,以及球虫感染分子应答过程和免疫应答机制,试验采用RNA-seq技术对E. tenella感染和非感染组第7天的盲肠组织进行转录组测序,筛选差异表达基因,并进行差异基因的功能、通路富集分析。结果表明,在感染和非感染组中有显著差异的表达基因2 830个（P<0.05）,其中1 419个基因上调,1 411个基因下调。随机选取10个差异基因进行qRT-PCR验证,结果显示差异基因的表达倍数与RNA-seq检测结果显著相关（r=0.988,P<0.000）,决定系数达0.975。GO分析表明,有2 356个差异基因获得GO功能注释,显著富集的前30个GO terms主要涉及细胞交流、信号转导、血管生成、氧化还原酶活性等。KEGG分析发现差异基因显著富集的信号通路有黏着斑、细胞外基质-受体相互作用、过氧化物酶体增殖物激活受体等。这些通路中的差异基因有ANGPTL4、ACSL5、VEGFC、CD44和MAKP10等,提示这些基因在宿主柔嫩艾美耳球虫感染过程中发挥重要作用。

急性氨氮胁迫下大弹涂鱼解毒代谢途径的研究

杨洋, 孟繁星, 王日昕

2019, 35(11):  72-81.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0313

摘要 ( 219 )   HTML   PDF (3959KB) ( 188 )  

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为探明大弹涂鱼（Boleophthalmus pectinirostris）在氨氮环境适应过程中的氨转化及代谢机制,通过氨氮（8 mmol/L NH₄Cl）胁迫的方法对大弹涂鱼进行了72 h急性实验;利用酶活性测定方法检测了氨代谢相关酶：谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase,GS）活性及血氨浓度;酶联免疫技术检测氨代谢协同转运蛋白：碳酸酐酶（Carbonic anhydrase,CA）、钠氢交换蛋白3（Na⁺/H⁺ exchanger,NHE3）表达水平;运用qPCR技术测定急性氨氮胁迫下大弹涂鱼氨代谢相关基因：GS、CA15、NHE,以及氨转运蛋白（Ammonium transporter Rh type C-1,Rhcg1）基因mRNA的相对表达变化情况。结果表明：在急性氨氮胁迫下,大弹涂鱼血氨浓度呈先上升（12 h）后下降至平稳状态的变化趋势。肝脏GS基因表达量在12 h和48 h显著上升,酶活性在24 h显著上升。鳃中NHE3蛋白表达水平与GS活性变化趋势相同,而CA蛋白水平分别在胁迫后12 h和48 h显著上升。排氨相关基因CA15,NHE,Rhcg1的表达量在氨氮胁迫下均有不同程度的上调,其中NHE基因最早（24 h）上调,而CA15和Rhcg1在48 h显著上升,表明其可能共同参与离子氨的排泄。研究结果表明,氨氮胁迫下大弹涂鱼主要通过两种途径进行氨代谢：（1）在肝脏GS的作用下合成无毒的谷氨酰胺以避免氨在体内过量积累;（2）在鳃组织CA作用下使CO₂质子化提供H⁺,协同NHE3,Rhcg1蛋白复合体实现氨排泄过程。

人HSPA8基因生物信息学分析及亚细胞定位

吴小敏, 赵佳福, 倪锴, 朱晓峰, 许厚强

2019, 35(11):  82-88.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0472

摘要 ( 300 )   HTML   PDF (4040KB) ( 326 )  

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探究人HSPA8基因生物信息学分析与亚细胞定位。利用用RT-PCR方法扩增HSPA8基因CDS区,利用生物信息学工具对其理化性质、二级结构、三级结构进行分析并构建其遗传进化树。运用酶切、连接等方法构建重组真核表达载体pEGFP-C1-HSPA8,转染HEK-293T细胞,采用荧光共定位的方法观察其亚细胞定位。成功克隆人HSPA8基因CDS区,生物信息学分析结果显示：人HSPA8基因CDS区全长1 941 bp,分子式为C₃₁₁₁H₄₉₉₈N₈₆₀O₉₉₄S₁₇,相对分子量为70.89 kD,共编码646个氨基酸;二级结构预测显示HSPA8蛋白以α-螺旋（占41.64％）和无规则卷曲（32.20％）为主;HSPA8核苷酸同源性及遗传进化树分析表明人与黑猩猩亲缘关系最近。荧光共定位结果显示HSPA8蛋白均匀分布于整个细胞。HSPA8蛋白的生物信息学分析及亚细胞定位研究为进一步探究HSPA8基因胞内功能奠定基础。

围脂滴蛋白基因CRISPR/Cas9载体的活性分析

许祥, 董维鹏, 张少华, 冯晨毅, 刘田福, 燕炯

2019, 35(11):  89-95.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0357

摘要 ( 240 )   HTML   PDF (4310KB) ( 393 )  

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设计并验证能够靶向切割PLIN1基因的sgRNA,为建立高效的PLIN1基因敲除动物模型奠定基础。利用预测软件设计3条评分较好的sgRNA。添加T7启动子后体外转录相应的sgRNA,构建酶切体系并验证其体外切割活性。构建相应的基因敲除质粒载体,通过电转染将质粒转到3T3-L1前脂肪细胞内并进行诱导分化。RT-PCR法检测细胞中PLIN1 mRNA的表达,Western blot法检测细胞中PLIN1蛋白的表达。成功在体外转录3条PLIN1的sgRNA并构建酶切体系,测得sgRNA-PLIN1-1的切割效率为61.8%±9.0%,sgRNA-PLIN1-2的切割效率为64.1%±9.6%,sgRNA-PLIN1-3的切割效率为34.1%±7.2%,sgRNA-PLIN1-3组的切割效率明显低于sgRNA-PLIN1-1组和sgRNA-PLIN1-2组（P<0.05）。成功构建3条sgRNA的质粒载体并电转染进入3T3-L1前脂肪细胞内,转染效率约为30%。诱导分化的第4天,各阳性干扰组PLIN1 mRNA的表达量显著降低（P<0.01）;与sgR NA-PLIN1-3组相比,sgRNA-PLIN1-1组和sgRNA-PLIN1-2组PLIN1 mRNA的表达量有显著性差异;各阳性干扰组PLIN1蛋白的表达量显著降低（P<0.01）,阳性干扰组相互之间PLIN1蛋白的表达量无显著性差异。3条sgRNA皆可以靶向切割PLIN1基因的2号外显子,其中gRNA-PLIN1-1组和sgRNA-PLIN1-2组的切割活性略高于sgRNA-PLIN1-3组。体外活性切割实验可以很好的预测细胞内切割效果,是筛选高活性sgRNA的有效手段。

伪狂犬病毒的gE蛋白胞外区真核表达以及单克隆抗体制备

郎巧利, 吴梦, 黄楠, 何琦琳, 葛良鹏, 杨希

2019, 35(11):  96-103.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0310

摘要 ( 273 )   HTML   PDF (5051KB) ( 370 )  

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旨在构建gE基因胞外区真核表达载体,在HEK293F细胞中表达并纯化得到稳定的可溶性蛋白,并通过杂交瘤筛选获得表达gE蛋白的特异性单克隆抗体。生物信息学方法分析gE基因序列,构建gE胞外区真核表达载体pcDNA3.4-gE-6×His和pcDNA3.4-gE-mFc,通过瞬时转染的方法在HEK293F细胞中进行表达并进一步纯化。通过Western blot和SDS-PAGE鉴定和比较gE-6×His和gE-mFc融合蛋白表达情况。利用伪狂犬灭活全病毒免疫小鼠,电融合获得杂交瘤融合细胞,通过gE-mFc蛋白和IFA筛选出稳定且特异性结合gE蛋白的阳性杂交瘤细胞株。结果表明,成功构建pcDNA3.4-gE-6×His和pcDNA3.4-gE-mFc表达载体,表达纯化得到gE-6×His和gE-mFc可溶性蛋白。比较发现gE-6×His蛋白表达量低,稳定性差。而gE-mFc蛋白表达量高,稳定性好,一次性纯化后纯度可达85%。进一步利用gE-mFc筛选获得9株稳定性和特异性高的阳性杂交瘤细胞株。首次利用哺乳动物细胞表达系统表达并获得稳定的可溶性gE蛋白,并利用其筛选获得gE特异性单克隆杂交瘤细胞株。

六种食用菌体外抗氧化及抗细胞增殖活性研究

陈子涵, 刘金娟

2019, 35(11):  104-108.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0407

摘要 ( 310 )   HTML   PDF (1085KB) ( 205 )  

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以海鲜菇、香菇、茶树菇、杏鲍菇、平菇及金针菇6种食用菌为试验材料,比较各食用菌的抗氧化及抗细胞增殖活性。通过测定总抗氧化、总还原能力,以及对自由基的清除能力评价各食用菌体外抗氧化活性,Alamar blue法检测各提取物的抗细胞增殖活性。结果表明,各食用菌的总酚和总黄酮含量分别在155.76 mg/L-283.54 mg/L和5.19 mg/L-49.79 mg/L之间。其中,金针菇、茶树菇和香菇的总酚和总黄酮含量较高,海鲜菇和平菇含量最低。茶树菇和香菇的总抗氧化能力和总还原力（分别是22.94 U/L和20.10 U/L,0.26和0.233）优于其他几种食用菌。金针菇对DPPH·、·OH清除能力高于其他食用菌（分别是48.8%和75.12%）,各食用菌对O₂^-·清除能力没有明显差别。6种食用菌提取物对HepG2、SGC-7901、NCI-H460、MDA-MB-231、LO2细胞均具有一定的增殖抑制作用,其中茶树菇对HepG2和NCI-H460细胞抑制作用最高（IC₅₀=4.62±2.13,4.96±1.84 mL/L）,而金针菇对SGC-7901和MDA-MB-231细胞增殖抑制作用最强（IC₅₀=5.01±1.03,6.95±1.03 mL/ L）,而各提取物对LO2细胞的增殖抑制活性都最低。各食用菌均具有一定的抗氧化和抑制肿瘤增殖能力,其中茶树菇、香菇、金针菇的抗氧化和抑制肿瘤增殖活性最强。

黄绿卷毛菇生境中矮嵩草内生真菌多样性比较研究

郭璟, 谢占玲, 罗涛, 薛治峰, 郭建娟, 李发雄, 张秀娟

2019, 35(11):  109-117.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0385

摘要 ( 280 )   HTML   PDF (4103KB) ( 364 )  

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为研究黄绿卷毛菇生境中矮嵩草的内生真菌多样性,本研究结合传统分离培养法和宏基因组法对矮嵩草内生真菌的多样性进行比较研究。结果显示：传统法在矮嵩草共分离鉴定得到66株内生真菌均属于子囊菌门（Ascomycota）,分类到7目,分别为格孢腔目（Pleosporales）、炭角菌目（Xylariales）、散囊菌目（Eurotiales）、柔膜菌目（Helotiales）、肉座菌目（Hypocreales）、毛霉菌目（Mucorales）、Glomerellales,优势种群为Stagonospora bicolor;根的多样性指数,丰富度指数,均匀度指数分别为1.63、1.56、0.82;未分离到黄绿卷毛菇;宏基因组法检测出587种内生真菌,子囊菌门（Ascomycota）占77.21%、担子菌门（Basidiomycota）占16.21%,剩下的6.58%为unclassified真菌,优势种群为Fusarium sp,多样性指数,丰富度指数,均匀度指数分别为3.13、39.08、0.48;检测到黄绿卷毛菇,相对丰度为11.39;比较两种方法,黄绿卷毛菇生境的矮嵩草植物中,蕴含着丰富的内生真菌资源,黄绿卷毛菇为优势内生真菌种群之一。该研究首次证明黄绿卷毛菇为嵩草属的内生真菌,是研究黄绿卷毛菇的营养类型及其与植物间的互作关系的新突破。

鱼源类志贺邻单胞菌的分子鉴定及耐药性分析

豆朋朋, 王利, 张桦, 郑姚

2019, 35(11):  118-123.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0349

摘要 ( 281 )   HTML   PDF (2319KB) ( 496 )  

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为对患病黄颡鱼分离的菌株（L-1）进行鉴定及耐药性分析,通过形态学观察、生理生化特性分析、16S rDNA基因和23S rRNA基因PCR扩增及系统进化树构建鉴定该菌,药敏试验和耐药基因检测确定菌株耐药性。结果表明：菌株L-1为革兰氏阴性菌,呈短杆状。明胶液化、七叶灵及阿拉伯糖等反应为阴性,精氨酸、色氨酸及葡萄糖等反应为阳性。16S rDNA基因扩增获得长度为1 461 bp的序列片段。BLAST比对结果显示,菌株L-1拼接序列与NCBI中类志贺邻单胞菌相似性为99%。在系统发育树中,菌株L-1与类志贺邻单胞菌亲缘关系最近。23S rRNA基因扩增,仅菌株L-1扩增出大小为280 bp的目的条带,其他菌株均为扩增出。综合判定菌株L-1为类志贺邻单胞菌。菌株L-1对头孢哌酮、庆大霉素等敏感,对四环素中度敏感,对苯唑西林、氨苄西林等耐药。菌株L-1中检测出Sul2、TEM、ant（3''）-Ⅰa和aac（6'）-Ⅰb共4种耐药基因,Sul1、Sul3、aph（3'）-Ⅱa和aac（3）-Ⅱa未检出。

纳米TiO₂和四环素暴露对耐药大肠杆菌的影响

张永丽, 袁伟, 杨清香

2019, 35(11):  124-131.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0528

摘要 ( 248 )   HTML   PDF (2630KB) ( 267 )  

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以耐药大肠杆菌（M13）和敏感质控菌株（E.coli ATCC25922）为研究对象,探究纳米TiO₂和四环素对大肠杆菌生长的影响。结果表明,与单独添加梯度浓度四环素相比,纳米TiO₂的加入进一步抑制了敏感菌的生长,而耐药菌变化不大。纳米TiO₂单独和联合暴露下对耐药菌的抑菌率均在40%以下,而敏感菌在80%-100%之间,耐药菌M13除了耐抗生素,对纳米TiO₂也存在抗性。微生物对抗生素和其它环境毒性因子的抗性机制存在着一些共性,但在共暴露条件下微生物的抗性机制还有待进一步研究。

哈茨木霉SKD-ZX-1的鉴定、发酵及其生防效果

陆洪省, 张雪, 高宇婷, 孙珮铭, 邱萌萌

2019, 35(11):  132-140.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0586

摘要 ( 263 )   HTML   PDF (3229KB) ( 298 )  

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哈茨木霉作为一类重要的生防菌,对蔬菜病害致病菌具有拮抗作用。为确定分离的哈茨木霉SKD-ZX-1的生防效果,利用气质联用技术对菌株的发酵液进行测定和分析,利用宏基因组测序方法分析该菌株对番茄根腐烂病土壤中的细菌菌群的影响,并且采用平板对峙培养法对该菌株与链格孢菌和茄链格孢菌进行了拮抗实验。结果显示,哈茨木霉SKD-ZX-1发酵液中有邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯等抑菌成分,并且其发酵液增大了土壤中细菌菌群的种类,与对照组相比,实验组肠杆菌属提高了46%,而假单胞菌属和梭菌属降低了5.28%和36.1%。该哈茨木霉对两种病原菌的抑制率均达到100%,拮抗系数达Ⅰ级。研究表明哈茨木霉SKD-ZX-1对链格孢菌和茄链格孢菌具有显著的抑制作用,其发酵液具有一定的抑菌效果。

综述与专论

microRNA在植物生长发育中的研究进展

黄俊骏, 刘文文, 郭亚如, 蒋天慧, 任晴, 王华华, 梁卫红

2019, 35(11):  141-149.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0526

摘要 ( 358 )   HTML   PDF (1127KB) ( 538 )  

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microRNA（miRNA）是一类广泛存在于植物体内,长约20-25个核苷酸的内源性非编码小分子RNA,通过定向降解靶基因mRNA和抑制其翻译,从而在转录后水平控制靶向基因的表达来调控多种多样的生物功能,包括植物的生长发育、生殖和对逆境胁迫的响应。已有的研究表明,miRNA及其靶基因不仅在植物的时序转换中是一个关键调控因子,也在茎尖发育、叶形态建成、花器官发育和开花时间等过程中发挥着重要调控作用。重点介绍miRNA在调控植物生长发育过程以及发育可塑性过程中的研究进展,并对植物miRNA研究中有待进一步阐明的问题进行了探讨和展望,以期为深入解析miRNA在调节植物组织和器官模式中的功能,以及植物形态多样性中的作用和分子调控网络提供参考。

调控植物种子发育的转录因子研究进展

吴玉, 沈永宝, 史锋厚

2019, 35(11):  150-159.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0043

摘要 ( 418 )   HTML   PDF (1130KB) ( 412 )  

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植物种子是裸子植物和被子植物所特有的繁殖器官,也是人类赖以生存粮食的最主要来源。植物种子发育的过程包括形态发育和种子成熟,由一个复杂的转录因子网络管控,转录因子调控和监管整个发育过程。转录因子包含DNA结合区、寡聚化位点区、核定位信号区和转录调控区4个功能结构域,通过结构域与顺式元件相互作用调控基因的表达。研究表明,WOX家族调控胚芽发育,HAP3家族调控胚胎形态发生和细胞分化,MADS-box家族调控胚座和胚珠的发育,NAC家族调控胚珠珠被生长发育,bHLH家族调控种皮细胞的大小和形态,MYB家族是种皮发育的正调节因子。HAP家族成员LEC1 和B3超家族的AFL亚家族成员LEC2、FUSCA3、ABI3一起互相作用形成一个调控网络,共同调控种子的成熟发育。Zinc finger超家族的Dof家族调控种子的胚乳发育、贮藏蛋白的合成及脂肪含量的变化,bZIP家族调控种子贮藏基因表达,AP2/EREBP家族调控种子体积与重量、蛋白与油类积累,WRKY家族、IKU、MINI3、SHB1 基因和KLU基因调控种子体积大小。综述了植物种子发育过程中转录因子的结构和种类,分析了其作用顺序和功能,解析了种子发育的分子调控机制,展望了其研究方向和前景,以期为种子品质改良奠定理论基础和提供新的思路。

蓝色花形成的基因工程进展与育种策略

李崇晖, 尹俊梅

2019, 35(11):  160-168.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0450

摘要 ( 279 )   HTML   PDF (1456KB) ( 434 )  

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蓝色花观赏价值高,花色成因复杂。目前,在蓝色花色形成机理和基因工程育种研究方面取得了大量的研究进展。综述了蓝色花形成的化学、生理学和分子生物学机理,利用基因工程技术培育蓝色花的育种实践：包括转入花青素苷合成途径上的关键酶基因,抑制内源竞争酶基因,转入液泡pH值调节基因和金属离子转运蛋白基因等。在此基础上总结出几种蓝色花基因工程育种的基本策略,以期为蓝色花基因工程育种提供参考。

内生真菌提高植物抵御盐胁迫的研究进展

李娥, 胡华冉, 李蛟男, 杜光辉, 刘飞虎

2019, 35(11):  169-178.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0499

摘要 ( 377 )   HTML   PDF (1127KB) ( 469 )  

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土壤盐渍化日趋严重,盐害已成为植物生产中严重的生境胁迫。因此,土壤盐渍化问题的研究成为近年来的热点。盐胁迫主要造成植物对土壤水分和养分吸收障碍。研究发现,植物内生真菌能在盐胁迫下促进植物对土壤养分和水分的吸收,缓解盐胁迫带来的伤害,从而提高植物生物量,维持植物生长和群体结构。本文从提高植物抵御盐胁迫的内生真菌的发掘、内生真菌对植物抵御盐胁迫的影响以及内生真菌的研究前景和目前存在的相关问题进行探讨和综述,期望能为发现和利用协助植物抵御盐害的微生物资源提供参考和依据。

几丁质脱乙酰酶的研究进展

张岩, 关菲菲, 伍宁丰, 田健

2019, 35(11):  179-186.  doi:10.13560/J.cnki.biotech.bull.1985.2019-0449

摘要 ( 305 )   HTML   PDF (4398KB) ( 353 )  

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几丁质是自然界中含量仅次于纤维素的第二大多糖,壳聚糖作为几丁质脱除乙酰基的衍生物,由于其较好的溶解性得到了广泛的应用。本综述通过搜集比对不同来源的多种脱乙酰酶蛋白序列,运用生物信息学方法对其催化活性中心结构域进行深入挖掘分析,阐明了多种脱乙酰酶的生物来源、催化机制和反应条件等方面的异同点。结果表明,目前研究的脱乙酰酶多来源于真菌和昆虫,大多属于CE4家族,具有NodB等催化活性中心,比较容易与聚合度>3的乙酰化低聚糖反应,不易催化难溶性多糖,且该类酶多在pH 8.0左右、40-70℃的环境下酶活达到最大,不同二价金属离子对不同酶的影响不同。最后,提出了从海洋宏基因组文库中快速特异地筛选新酶、分析酶解机理并进行分子改造等研究的新方向,旨为今后该领域科研人员研发高效、高特异性的脱乙酰酶提供了新思路。

核移植介导的哺乳动物体细胞核重编程研究进展

吴霄, 庄站伟, 马晓莉, 黄思秀, 李紫聪, 徐铮

2019, 35(11):  187-194.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0168

摘要 ( 235 )   HTML   PDF (1087KB) ( 349 )  

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哺乳动物的体细胞核移植技术已经发展了20年有余,重构胚发育过程中的核重编程异常是制约这项技术应用的主要障碍。目前,提高克隆效率的方法主要是通过调节重编程过程中的表观遗传修饰来修复重编程的错误,从而提高核移植胚胎的发育效率。综述了核移植后早期胚胎发育过程中供体核重编程的异常,讨论了修复这些异常表观遗传修饰的研究进展,并对可能影响核移植胚胎发育的重编程事件及新兴技术进行展望。

I型干扰素在犬类疾病病原学及治疗方面的研究进展

胡文, 冯珣, 张宝宝, 闫志伟, 徐玉生, 刘永生

2019, 35(11):  195-200.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0851

摘要 ( 320 )   HTML   PDF (1163KB) ( 308 )  

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I型干扰素（Interferons,IFNs）是一类具有免疫学活性的细胞因子。这类细胞因子广泛参与到固有免疫和适应性免疫的激活和调节过程中,从而发挥抗病毒、抑制细胞增殖、调节免疫及抗肿瘤作用。目前I型IFNs主要用于临床治疗肾癌、黑色素瘤及慢性乙肝等疾病。一些I型IFN家族成员也已用于临床治疗犬细小病毒性肠炎、猫白血病病毒及猫免疫缺陷病病毒感染,但I型IFN的临床治疗还没有广泛用于各种犬类疾病的治疗当中。主要综述了犬类动物机体中I型IFN的免疫学活性以及其激活的下游免疫信号通路的最新研究进展,旨为犬类疾病研究人员提供一些有价值的参考信息。

技术与方法

基因组挖掘技术及其在真菌中的研究进展

徐杰, 黄建忠, 李力

2019, 35(11):  201-207.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0170

摘要 ( 286 )   HTML   PDF (2000KB) ( 588 )  

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微生物次级代谢物是药物的重要来源，在当前以活性为导向的传统筛选机制出现停滞时如何采用新的筛选方法减少已知化合物的重复检测，快速得到结构新颖的有特殊生物活性的新化合物是药物开发的关键。基因组挖掘技术可控制编码次级代谢产物基因的定向表达，将科学理论与工业化生产相结合并对其进行指导，有效降低开发成本及周期，有利于最终的市场应用而成为国内外研究的热点。简述了基因组挖掘技术的研究方向和激活沉默基因表达的技术手段，以及真菌在基因组挖掘中的重要地位和最近几年的研究成果，并展望了未来在医药领域的广阔前景。

牛超数排卵技术研究进展

王洋洋, 隋鹤鸣, 赵善江, 许慧韬, 郝海生, 庞云渭, 赵学明, 朱化彬

2019, 35(11):  208-216.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0417

摘要 ( 358 )   HTML   PDF (1114KB) ( 404 )  

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超数排卵是获得牛胚胎移植研究与应用所需可移植胚胎的重要途径。由于影响供体牛超数排卵的因素众多、复杂,几十年来供体牛每次超数排卵所获得的平均可移植胚胎数几乎没有增加,因此,如何提高超排效果成为研究热点。综述了近年来牛超排的最新研究进展,以期为牛超排效果的改善和胚胎移植效率的提高提供参考。

利用重测序技术开发高粱多态性SSR分子标记

王平, 王春语, 张丽霞, 丛玲, 朱振兴, 陆晓春

2019, 35(11):  217-223.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0692

摘要 ( 292 )   HTML   PDF (2507KB) ( 459 )  

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SSR分子标记由于具有成本低廉、容易操作等特性,使其在分子标记辅助育种中广泛应用。目前高粱SSR标记多基于测序已经完成美国高粱品种BTX623基因组开发,在应用中筛选多态性标记的效率低。对不育系和恢复系组成的26个高粱材料进行了重测序,然后进行生物信息学分析,最终开发了在26份材料中至少含有2种多态型的SSR标记24 441个。这些SSR标记在26份材料中表现出的基因型多态类型在2-7种之间,2种的有16 694个,7种的仅有77个。另外本研究还进行了筛选单拷贝基因处的多态性SSR分析,共筛选到6 733个。随机挑选均匀覆盖10条染色体的单拷贝基因处SSR标记50对,利用辽宁高粱杂交种辽糯3号进行测试,其中49对能扩增出产物,成功率高达98%。其后利用2个品种和74份微核心种质资源测试表明,50对SSR标记在2个品种中有18对表现出多态性,挑选了一对引物在74份微核心种质中可见8种多态型。本研究表明利用不育系和恢复系材料进行重测序能有效开发多态性高的SSR标记。

基于地黄转录组数据的SNP标记开发与地黄指纹图谱构建

郭萌萌, 周延清, 段红英, 杨珂, 邵露营

2019, 35(11):  224-230.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0409

摘要 ( 263 )   HTML   PDF (2093KB) ( 334 )  

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地黄（Rehmannia glutinosa）是一种具有较高药用价值和经济价值的植物。准确的品种鉴定对地黄种质管理和育种至关重要,使用SNP分子标记来鉴定地黄种质和构建指纹图谱对地黄分子标记育种提供了新方法。利用地黄转录组数据和SRA数据库中的3个地黄转录组数据比对,寻找候选SNP,用PCR技术扩增和序列分析研究28个地黄品种候选SNP变异。从地黄转录组数据中获得了102 075条Unigenes,其中共有SNP位点35 339个,发生频率为0.51/kb;从中随机选取40个候选SNP位点,设计引物39对,用PCR和序列分析从中筛选出7对好的SNP引物,包含8个多态性好的SNP位点;利用最终筛选出的8个SNP位点构建地黄指纹图谱,可以将17个不同地黄种质区分开,可用于地黄种间和种内品种的鉴定。

CRISPR/Cas9系统介导的miR-155基因敲除细胞的制备

李聪聪, 张永辉, 赵婉霞, 吴姣, 韩浩园, 李梦云, 牛晖, 宋素芳, 李婉涛

2019, 35(11):  231-239.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0609

摘要 ( 313 )   HTML   PDF (4283KB) ( 190 )  

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为研究miR-155基因在猪肺泡巨噬细胞系（3D4/21）中的功能,采用CRISPR/Cas9系统构建miR-155敲除的猪肺泡巨噬细胞系。首先,采用sgRNA-cas9程序,设计4个靶向miR-155的特异性sgRNA引物序列。然后构建sgRNA表达载体,与pEGFP-C1-cas9载体共转染3D4/21细胞,进行流式分选并富集表达绿色荧光蛋白GFP的细胞。最后,采用T7E I酶酶切、Sanger测序、实时荧光定量PCR（qPCR）、western blot等方法检测敲除效率,发现miR-155基因可以被以上4个sgRNA编辑,其中sgRNA39的敲除效率最高,T7E I酶酶切检测流式分选后的敲除效率有42%;Sanger测序显示sgRNA39细胞系敲除31个碱基;RT-qPCR 结果显示miR-155-5p/3p表达量均有下降;western blot结果表明miR-155靶基因SHIP1的蛋白表达量升高。成功构建miR-155敲除的3D4/21细胞为进一步探讨miR-155在巨噬细胞发挥的调控功能研究提供细胞模型。

应用CRISPR技术敲除MDA-MB-231细胞系的NODAL基因的研究

李念峰, 方天星, 倪玉芳, 曾凡才

2019, 35(11):  240-250.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0426

摘要 ( 307 )   HTML   PDF (8746KB) ( 169 )  

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NODAL（Nodal growth differentiation factor）是一种细胞因子,为研究其功能,需建立敲除NODAL基因的细胞系。构建了两种作用于不同靶位点的CRISPR/Cas9表达载体和一种打靶载体,并通过电转法导入三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231,经嘌呤霉素抗性筛选和挑单细胞克隆,再应用PCR和测序技术鉴定基因型,以及Western Blot检测蛋白表达。将等位基因同源重组鉴定为阳性的8个单细胞克隆再经非同源重组和大片段缺失基因型鉴定,仅一个单细胞克隆的靶位点发生移码突变,4个单细胞克隆的靶位点有大片段缺失发生,4个单细胞克隆的靶位点检测到野生型等位基因。蛋白表达检测结果显示,仅有2个单细胞克隆未检测到NODAL蛋白表达,3个单细胞克隆的NODAL蛋白表达降低,另外3个单细胞克隆的NODAL蛋白表达无明显变化。最终获得了基因型和蛋白表达鉴定为敲除NODAL基因的单细胞克隆,为进一步研究NODAL在乳腺癌细胞中的分子机制奠定了基础。

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中英文目录

2019, 35(11):  251-254. 

摘要 ( 101 )   HTML   PDF (562KB) ( 68 )  

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封面

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2019, 35(11):  255-255. 

摘要 ( 82 )   HTML   PDF (224KB) ( 84 )  

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