生物技术通报

生物固氮：促进化肥减施增效，助力农业绿色发展

燕永亮

2019, 35(10): 0-Ⅱ.

摘要 ( 291 )

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植物固氮细胞器的合成生物学研究

罗利

2019, 35(10): 1-6. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0585

摘要 ( 447 )

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随着合成生物学的兴起,历史悠久的生物固氮研究领域迎来了新的发展机遇。合成生物学的原理和技术引入固氮生物学以后,诞生了固氮合成生物学的新兴交叉学科。共生固氮是生物固氮三种形式中效率最高的一种。在共生固氮体系中,固氮细菌以细胞器的面目出现在宿主植物细胞质中,利用微氧和物质能量充足的有利条件,进行较为稳定长久的固氮反应。但是,共生固氮作用的局限性在于宿主专一性,即共生固氮细菌难以在绝大多数经济作物上完成侵染和固氮作用。因此,固氮合成生物学面临的一个重要挑战是如何突破固氮细菌的宿主专一性,实现主要经济作物共生或者自主固氮。为了解决这一难题,国内外的研究者通过艰难地探索取得了良好的研究进展。本文将就固氮合成生物学的一些主要进展和面临的问题作一简要综述。

根瘤菌铁转运代谢及其调控机制研究进展

焦健, 刘克寒, 田长富

2019, 35(10): 7-17. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0767

摘要 ( 376 )

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根瘤菌是一类可以与豆科植物高效共生固氮的兼性共生细菌,在全球氮循环及绿色可持续农业中发挥重要作用。为了适应土壤、根圈和宿主体内等多变的生活环境,根瘤菌对营养物质的感知和获取能力至关重要。铁不仅是根瘤菌在土壤中生长繁殖的限制性营养元素,更直接参与固氮酶、豆血红蛋白、电子呼吸链等与共生固氮密切相关功能蛋白的合成。因此,根瘤菌在自生和共生阶段如何获取自身所需的铁是生物固氮领域所特别关注的重要研究内容。综述了近年来有关根瘤菌中Fe²⁺、Fe³⁺-铁载体复合物、血红素吸收途径以及RirA/Irr等参与铁稳态调控方面的研究进展并进行归纳分析,以期为后续的研究工作提供借鉴。

基因水平转移在根瘤菌进化中的研究进展

陈雪莲, 江高飞, 钟增涛

2019, 35(10): 18-24. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0742

摘要 ( 406 )

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豆科植物与根瘤菌之间形成的共生固氮是自然界效率最高的一种固氮体系,在农业生产上具有重要的应用价值。由于根瘤菌的宿主专一性较强,每种根瘤菌只能与有限的豆科植物形成共生关系,近来的一系列研究表明共生基因的水平转移和宿主条件下的适应性进化是推动根瘤菌进化的重要方式。综述了基因水平转移的主要方式在根瘤菌进化和扩大宿主范围上的重要作用,以及获得共生性状的菌株在建立共生体系时存在的问题和解决方法,旨为共生固氮在农业生产中更好地应用提供思路。

豆科植物-根瘤菌共生固氮的免疫调控机制

董汝, 曹扬荣

2019, 35(10): 25-33. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0716

摘要 ( 442 )

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在长期进化中,根瘤菌与豆科植物形成一种独特的互惠共生关系——共生固氮。根瘤菌-豆科植物共生互作与病原细菌激发植物病原反应极为相似,然而根瘤菌的入侵和定殖并没有激发宿主豆科植物过度的防御反应,植物也进化出特殊的共生信号转导和根瘤发育途径来“邀请”根瘤菌的入侵和定殖。此外,植物防御反应也很大程度上调控根瘤菌与豆科植物共生的宿主特异性。越来越多的研究表明,植物防御反应在调控根瘤菌匹配识别、入侵、定殖以及类菌体发育等方面起关键调控作用。从植物免疫反应角度综述了根瘤菌与豆科植物共生互作的最新进展,通过与病原菌-植物互作的病原反应对比,论述了根瘤中根瘤菌感知微生物相关分子模式（MAMP,Microbe-Associated Molecular Patterns）和效应蛋白引起的免疫反应的调控机制。

硝酸盐调控豆科植物与根瘤菌共生固氮的机制研究

罗振鹏, 谢芳

2019, 35(10): 34-39. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0780

摘要 ( 421 )

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氮是植物生长发育所需的大量营养元素之一。硝态氮不仅可以被植物直接吸收利用,还可以作为重要的信号分子调控植物对氮素的响应、吸收、代谢相关基因的表达,从而影响植物的生长和发育。豆科植物可以通过与根瘤菌共生互作来获得生长所需的氮,但共生固氮是一个耗费植物能量的过程。当土壤中存在高浓度的氮素时,氮作为信号分子会影响共生固氮基因的功能从而抑制共生固氮过程。目前的研究表明,硝酸盐通过局部和系统的调控方式抑制共生固氮过程;结瘤自主调控（Autoregulation of nodulation,AON）和NLPs（NIN-like proteins）转录因子在硝酸盐抑制豆科植物根瘤形成中有着重要的作用。本文结合最近的研究进展,重点讨论NLPs转录因子和AON途径在硝酸盐抑制共生固氮过程的作用。

高氮抑制豆科植物结瘤固氮机制研究进展

柯丹霞, 徐勤朕, 杨娜, 柏梦焱, 关跃峰

2019, 35(10): 40-45. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0657

摘要 ( 465 )

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豆科植物通过与根瘤菌共生,形成根瘤并进行生物固氮。豆科植物的结瘤固氮作用在农业上具有减肥增效、改良土壤等重大意义。然而,高氮会抑制豆科植物结瘤固氮,形成“氮阻遏”效应。着重论述了高氮抑制豆科植物结瘤的分子机制,包括氮素通过结瘤自调控AON（Autoregulation of nodulation）信号、NLP（NIN-like protein）转录因子、植物激素信号等途径抑制根瘤数目和发育的最新进展;并探讨了高氮抑制根瘤固氮活性的假说及争议,包括亚硝酸盐毒性和碳饥饿等,以期为提高豆科植物应对“氮阻遏”效应提供理论基础。

甘蔗联合固氮的回顾与展望

林丽, 李杨瑞, 安千里

2019, 35(10): 46-56. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0901

摘要 ( 431 )

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在巴西,某些甘蔗品种能通过生物固氮获得生长所需氮素。对甘蔗根际固氮菌和内生固氮菌的研究曾引领了非豆科植物联合固氮的研究。内生固氮菌Gluconacetobacter diazotrophicus表现出很多特性,与Herbaspirillum seropedicae、H. rubrisubalbicans、Nitrospirillum amazonense和Paraburkholderia tropica组成的固氮菌剂能联合甘蔗固氮并促进甘蔗生长。近年来的研究发现分类上属于Bradyrhizobium和Rhizobium等属的根瘤菌在与甘蔗联合的核心固氮菌群之中,以不结瘤的方式在甘蔗体内活跃地表达固氮酶基因。综述了这些甘蔗联合固氮菌的特色研究并探讨优化甘蔗联合固氮的策略。

基于瞬时表达系统的水稻miRNA靶基因快速验证系统的建立

胡积祥, 曹雅倩, 朱秀梅, 余超, 田芳, 杨凤环, 陈华民, 何晨阳

2019, 35(10): 57-63. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0175

摘要 ( 371 )

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旨在建立一种准确且快速的基于瞬时表达系统的水稻miRNA靶基因验证系统,为研究水稻miRNAs的生物学功能奠定基础。已有研究证实osa-miR169o剪切靶基因OsNF-YA4（LOC_Os03g48970.1）的mRNA,以此为参照,在烟草和水稻原生质体瞬时表达系统中将miR169o前体基因分别与LUC表达载体、LUC-48970和LUC-48970m3融合表达载体瞬时共表达,通过CCD活体成像和Luminometor分析了共表达后LUC活性的动态变化。利用茎环qRT-PCR对miR169o的表达水平进行分析,获得靶基因验证的适合体系。在水稻原生质体体系中,LUC活性和miR169o表达水平在原生质体转化后逐渐增高;24 h时LUC活性最高,相应miR169o表达水平上升10倍左右。综合分析,在原生质体转化后24 h-36 h为适宜检测时间段。在烟草瞬时表达体系中,农杆菌注射72 h后LUC活性最强,而miR169o的表达在48 h后即可上调20倍。因此,农杆菌注射后48 h-72 h为适宜检测时间段。本系统为水稻miRNA靶基因的验证提供了一种简便、快速,且更接近于体内真实情况的实验方法。

外源茉莉酸对牛皮杜鹃UV-B辐射缓解作用研究

梁东雨, 王禹佳, 苏敖纯, 徐洪伟, 周晓馥

2019, 35(10): 64-70. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0541

摘要 ( 304 )

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为了探究外源茉莉酸在UV-B辐射中可能的作用及缓解作用机制。茉莉酸预处理牛皮杜鹃4 d,PAR和UV-B下辐射48 h,对叶绿素荧光、过氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、NADPH氧化酶和花青素进行测定。结果显示,UV-B辐射使Fm、Fv/Fm、Fv'/Fm'、Fv/Fo、qP、花青素含量以及CAT活性显著降低,qP和rETR快速光响应曲线下降幅度增大,同时显著提高SOD和NADPH氧化酶的活性。JA预处理显著提高Fm、Fv/Fm、Fv'/Fm'、Fv/Fo、qP、花青素含量以及SOD和NADPH氧化酶活性,并且维持MDA含量和CAT活性在对照水平,且使qP、NPQ和rETR快速光响应曲线呈现出最佳状态。这些结果证实了外施茉莉酸能够使牛皮杜鹃具有抗胁迫能力,部分抵消了UV-B辐射对牛皮杜鹃的负面影响的假说。

外源硫与乙烯缓解马齿苋镉胁迫的生理机制研究

王竹承, 刘辉, 李荣华, 陈新, 李欣, 路致远

2019, 35(10): 71-79. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0303

摘要 ( 308 )

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解析镉（Cd）胁迫下外源乙烯和硫（S）对马齿苋（Portulaca oleracea L.）生理响应的机制。在Cd胁迫下,检测乙烯利（乙烯供体）和（NH₄）₂SO₄对马齿苋叶片氧化胁迫、S同化吸收、葡萄糖含量、乙烯合成、光合作用的影响。结果显示,外源S和乙烯处理,可降低Cd胁迫下马齿苋叶片与根中的Cd含量;增强ATP硫酸化酶（ATP-S）和谷胱甘肽还原酶（GR）活性,提升马齿苋叶片还原型谷胱甘肽（GSH）含量,从而降低叶片H₂O₂与丙二醛（MDA）含量;增强1-氨基环丙烷羧酸合酶（ACS）活性,提升叶片乙烯含量,从而降低葡萄糖含量,提升Rubisco酶活性和光合作用。同时添加外源S和乙烯,对上述指标的促进或者抑制效果加强,而添加乙烯活性专一性抑制剂二环庚二烯（Norbornadiene,NBD）则对上述各指标具有反向作用。外源S和乙烯可以通过降低马齿苋对Cd的吸收,增强体内乙烯信号传导途径,促进GSH的合成,降低葡萄糖含量,从而缓解Cd胁迫诱导的氧化胁迫和葡萄糖介导的光合抑制作用。

不同产地油茶籽油提取物的抗氧化活性比较分析及其营养评价

叶洲辰, 吴友根, 于靖, 张军锋, 杨东梅, 胡新文

2019, 35(10): 80-88. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0433

摘要 ( 305 )

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为探究海南油茶籽油（茶油）与大陆优良品系茶油间品质差异,采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）、高效液相色谱技术（HPLC）对其脂肪酸和活性成分进行检测,并通过4种分析方法评估茶油提取物的抗氧化能力。结果表明,海南（炒）茶油油酸含量（81.353%）显著高于江西（蒸）茶油（70.849%）,亚油酸在海南（蒸）茶油中含量最高（8.080%）,而该成分在海南（炒）茶油中却未检测出。此外,在样品中还鉴定到角鲨烯（2.300%-15.237%）、维生素E（0.400%-2.900%）、豆甾醇（0%-2.507%）及茶多酚（6种）等次生代谢产物,其中,海南（炒）茶油提取物中槲皮素含量高达59.025 µg/g,约为海南（蒸）茶油和江西（蒸）茶油的20倍,差异显著。供试茶油均具有一定程度的抗氧化活性,呈剂量依赖关系,相比其他3种茶油,海南（炒）茶油具有更强的自由基清除能力和还原能力,说明此栽培种具有潜在的开发利用价值和医用经济效益。

烟叶多糖硒化衍生物制备及其体外抗氧化活性研究

张昊, 魏跃伟, 姬小明, 潘婷婷, 王慧

2019, 35(10): 89-94. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0323

摘要 ( 348 )

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以烤后烟叶为原料,通过超声辅助提取烟叶粗多糖,经过纯化得到精制多糖,并对精制多糖进行硒化衍生。采用红外光谱对衍生物进行了结构表征,测其硒化取代度;并对烟叶多糖和烟叶多糖硒化衍生物进行体外抗氧化实验。结果表明：采用0.30 mol/L、0.40 mol/L NaCl溶液对多糖进行洗脱时,分离出两种烟叶多糖TPP1、TPP2,两种多糖的硒化取代度分别为0.20,0.24,体外抗氧化实验表明,硒化烟叶多糖的抗氧化活性明显高于烟叶多糖,并且随取代度增大,·DPPH、·OH自由基清除率明显增加。

小粒咖啡树咖啡碱合成途径中CaXMT1、CaDXMT1、CCS1表达差异及其与咖啡碱含量的相关性

李芬, 李丽江, 徐丹旎, 陈春林, 王玮, 李梅

2019, 35(10): 95-101. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0294

摘要 ( 338 )

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探索咖啡碱合成途径中3个关键酶基因CaXMT1、CaDXMT1和CCS1表达与咖啡碱合成的相关性,探讨小粒种咖啡豆中咖啡碱合成机理,为咖啡树的育种提供理论依据。利用高效液相色谱（HPLC）及实时荧光定量PCR（qRT-PCR）仪分别测定小粒种咖啡植株不同组织不同发育时期咖啡碱含量和CaXMT1、CaDXMT1、CCS1的mRNA相对表达量,并进行相关性分析。结果表明,不同组织不同发育时期咖啡碱含量由高到低依次为嫩叶>幼果>成熟鲜果>成熟叶片,且幼龄组织中的咖啡碱含量皆显著高于成熟期（P<0.01）。CaXMT1在幼龄组织中的相对表达量显著低于成熟期（P<0.01）,而CaDXMT1和CCS1相对表达量在同一组织不同发育时期中差异不显著。CaXMT1在幼果中的相对表达量与咖啡碱的含量呈显著负相关（R²=0.93,P<0.01）,CaDXMT1和CCS1在不同组织不同发育时期中的相对表达量与咖啡碱含量相关性不明显。咖啡碱的合成途径是一个复杂的过程,关键酶基因在不同组织不同时期的表达量及其与咖啡碱合成的相关性差异,可能与酶的特性有关。

小地老虎不同组织表达差异揭示其翅发育机制

郑伟刚, 靳明辉, SwapanChakrabarty, 肖彬, 萧玉涛, 袁海滨

2019, 35(10): 102-110. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0336

摘要 ( 337 )

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小地老虎是典型的迁飞性农业害虫,翅发育在昆虫迁飞行为形成过程中具有重要作用,其具体的控制基因鉴定及功能分析有待深入研究。以小地老虎为材料,对其幼虫整虫,成虫头部、胸部和腹部进行转录组测序并组装。最终组装得到转录组243.4 Mb,N50长度668 bp;共组装出转录本429 288个,独立基因37 744个;KEGG数据库注释通路373个。Wnt信号通路是昆虫翅发育的关键信号通路,小地老虎Wnt信号相关通路中CaN、Frizzled、Siah-1等53个元件被注释出,小地老虎胸部组织与头部组织和小地老虎幼虫组织相比,CaN、Frizzled、Siah-1相关基因都上调表达,与腹部组织相比,CaN、Notum、Siah-1相关基因都上调表达。以上这些基因调控可能与小地老虎肌肉发育及翅的形态建成有关。

芽孢杆菌BS-6基于全基因组数据的分类鉴定及拮抗能力分析

戚家明, 孙杉杉, 张东旭, 徐志文, 徐延平

2019, 35(10): 111-118. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0394

摘要 ( 345 )

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基于全基因组数据,确定芽孢杆菌BS-6的分类地位,验证其对植物病原菌的拮抗作用以及挖掘其潜在的生防功能。通过全基因组中16S rRNA及gyrA基因序列的系统发育分析及基因组分析方法确定芽孢杆菌BS-6的分类地位,通过平板对峙方法研究其对马铃薯枯萎病菌、玉米纹枯病菌和苹果轮纹病菌的拮抗能力;利用antiSMASH软件分析和预测菌株BS-6抑菌物质的相关基因并挖掘其生防潜力。基于16S rRNA及gyrA基因序列的系统发育分析及基因组分析结果,BS-6被鉴定为枯草芽孢杆菌,同时发现BS-6基因组中存在7种芽孢杆菌属重要或特有的次生代谢产物基因簇,4种未知功能的次生代谢产物基因簇,具有良好的抑制真菌生长的能力。枯草芽孢杆菌BS-6具有较强的拮抗植物病原菌的能力及良好的农业应用前景。

棒瑚菌子实体不同发育时期的转录组分析

唐贤, 丁祥, 董明明, 朱淼, 宋志强, 侯怡铃

2019, 35(10): 119-129. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0233

摘要 ( 280 )

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旨为研究棒瑚菌子实体幼菇期（CP-1）和成熟期（CP-2）基因表达的差异,探索棒瑚菌在生长发育过程中的关键基因和关键代谢通路。采用RNA-Seq测序技术对棒瑚菌子实体进行测序并进行生物信息学分析。测序结果显示,共获得8.78 G（CP-1）和8.28 G（CP-2）的分析数据（Clean reads）。KOG功能注释和GO富集分析显示新陈代谢过程、细胞和细胞组分以及氧化还原酶活性是棒瑚菌子实体发育过程中的关键基因门类。基因表达水平分析结果显示,多酚氧化酶、核糖体、糖苷水解酶家族等基因为棒瑚菌子实体幼菇期（CP-1）和成熟期（CP-2）的主要高表达基因,在蛋白质和细胞壁合成中起重要作用。差异表达基因分析结果显示氧化磷酸化和三羧酸循环是棒瑚菌子实体幼菇期（CP-1）生长发育的关键代谢途径,且环境含氧量对棒瑚菌的生长发育有重要影响;同时棒瑚菌成熟期（CP-2）调节一碳化合物浓度和应对各种环境胁迫的分子机制发生了改变。KEGG 通路富集结果显示,MAPK信号通路是参与调节棒瑚菌子实体生长发育的关键信号通路,在调控菌丝的极性生长、细胞周期和真菌细胞形态转换中起重要作用。

环状芽孢杆菌泛基因组分析及次级代谢通路挖掘

姚彩苗, 赵雯雅, 汪步青, 郑利艳, 张丽萍, 刘洪伟

2019, 35(10): 130-136. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0266

摘要 ( 380 )

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旨为对环状芽孢杆菌基因组进行更深入的了解，并探索其次级代谢通路。从NCBI数据库下载了9个环状芽孢杆菌的基因组，利用系统发育分析软件、泛基因组分析软件和次级代谢产物挖掘软件对其进行了分析。9株菌的基因组大小在5.01-9.63 Mb之间，在进化树上被归为了两个分支。通过泛基因组和核心基因组分析，发现其泛基因组含有9 572个基因家族，核心基因组由3 622个基因家族组成；共鉴定出4 593个特有基因，其中菌株NCTC2610的特有基因最多（3 030个），而菌株NBRC 13626的特有基因最少（39个）。通过次级代谢产物合成基因簇分析，9个环状芽孢杆菌基因组中共发现6类、32个次级代谢基因簇，重复出现最多的代谢通路是羊毛硫肽、套索肽和萜烯类化合物合成通路。通过本研究，明确了环状芽孢杆菌的泛基因组和核心基因组大小，预测了其次级代谢通路，有助于我们全面了解环状芽孢杆菌，为进一步更好地利用该菌株提供线索。

一株海洋微小链霉菌群体感应抑制活性及培养条件的研究

周恒, 姜芸, 许叶祥, 钱生辉, 缪莉

2019, 35(10): 137-143. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0341

摘要 ( 381 )

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以一株分离自连云港海区表层海水中的海洋微小链霉菌（Streptomyces parvulus HY026）为研究对象,采用滤纸片法对其进行群体感应抑制活性测试。结果显示S. parvulus HY026的代谢产物能显著抑制群体感应报告菌紫色杆菌产紫色素,表现出较强的群体感应抑制活性;采用单因子实验,对HY026进行培养基碳源及氮源的优化。发现以玉米粉为碳源时,所得粗提物的质量及群体感应抑制活性最高;以黄豆粉为氮源时,所得粗提物的质量及其活性最高。根据单因子实验结果,选取玉米粉和黄豆粉为最佳碳、氮源,连同盐度、磷酸氢二钾共4个因素进行L16（4⁵）正交实验,以各处理所得的发酵液粗提物质量和群体感应活性为指标进行分析。确定4个因素的重要性顺序为磷酸氢二钾>盐度>玉米粉>黄豆粉,最佳培养基配方为：磷酸氢二钾1.0 g/L,盐度34.0 g/L,玉米粉10.0 g/L,黄豆粉5.0 g/L。以此配方培养时,与原高氏一号培养基培养相比,S. parvulus HY026的发酵液粗提物质量和群体感应抑制活性分别提高了398%和19%。

杂交石斑鱼干扰素调节因子3（IRF3）基因的克隆及表达分析

卢晓颖, 黄宝松, 马骞, 陈刚, 王忠良, 黄建盛, ERICAMENYOGBE, 谢瑞涛, 邓文鑫

2019, 35(10): 144-151. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0324

摘要 ( 402 )

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干扰素调节因子家族（IRFs）具有抗病毒、免疫调节功能,干扰素调节因子3（Interferon regulatory factor 3,IRF-3）是IRFs家族中的一员,也是免疫相关因子。为了解IRF3基因在杂交石斑鱼（Epinephelus. fuscoguttatus,♀）× 清水石斑鱼（E. polyphekadion,♂）应对外源病毒刺激的免疫反应,利用cDNA末端快速扩充（Rapid-amplification of cDNA ends,RACE）技术克隆了杂交石斑鱼IRF3基因,该基因cDNA全长为2 529 bp,包含5'非编码区（5'-UTR）325 bp,3'非编码区（3'-UTR）916 bp,开放阅读框（Open reading frame,ORF）1 377 bp,可编码458个氨基酸。氨基酸序列包含N-末端DNA结合区（N-terminal DNA binding region,DBD）（1-108 aa）、1个C-末端干扰素相关区（C-terminal interferon related region,IAD）（255-435 aa）及色氨酸富含区（Tryptophan rich region,SRD）（440-450 aa）3个结构域。系统进化分析结果显示,杂交石斑鱼IRF3与花鲈（Lateolabrax maculatus）IRF3聚为一支,亲缘关系较近。利用实时荧光定量PCR检测IRF3基因在杂交石斑鱼肝、胃、鳃、肠和脾脏等9种组织表达情况,以及在外周血淋巴细胞（Peripheral blood lymphocytes,PBL）的时序性表达情况,结果显示,IRF3基因在9种组织中均有表达,肝、胃和肠中的表达量明显高于其他组织,头肾表达量最低。PBL在PolyI：C刺激1 h后IRF3基因表达量逐渐升高,4 h时表达量达到最大值（约为对照组的9.3倍）,8 h后逐渐下降。

SNaPshot技术检测滩羊双羔群体中与多胎性状相关SNP研究

田得红, 刘思嘉, 丁宁, 李雪, 赵凯

2019, 35(10): 152-161. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0167

摘要 ( 294 )

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对我国地方品种滩羊双羔群体进行SNP检测和多胎性状相关性研究,促进SNPs在双羔家系分子育种中的应用。从实验前期SNP筛选的基础上,利用候选基因飞行质谱法最终确定3种基因13个SNP位点作为候选位点,对滩羊双羔群体的多胎位点进行多态性检测,分析群体差异性,筛选多羔候选基因。关联分析表明：13个位点中有5个位点与多胎性能有关,3种遗传模型也被证实,但BMPR1B基因构建的单倍型却与多胎性能无关。本研究旨在为滩羊双羔分子标记本品种选种选配等分子辅助育种技术提供参考,保护与可持续利用地方家养动物稀有种质遗传资源,加快优质多胎肉羊的发展。

三个绵羊品种LHX3基因多态性与生长性状的关联分析

王燕新, 廖圆圆, 阿依木古丽, 齐骜穹, 李海健, 徐红伟, 杨具田, 蔡勇

2019, 35(10): 162-168. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0384

摘要 ( 357 )

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寻找与绵羊生长性状有关的分子标记,以期为绵羊的分子育种提供理论依据。通过琼脂糖凝胶电泳和一代测序技术,在滩羊（TS）、小尾寒羊（STHS）和兰州大尾羊（LFTS）的LHX3基因中检测到了29 bp片段的插入型（AA）、插入/缺失型（AB）以及缺失型（BB）3种基因型,对3个不同品种绵羊的LHX3基因进行遗传多态性分析,并通过一般线性模型分析了3种基因型与3个品种绵羊不同生长性状的相关性。3个品种绵羊LHX3的多态信息含量（PIC）均为0.25﹤PIC≤0.5,呈中度多态,表明该位点的遗传变异相对较高。LHX3基因型影响3个品种绵羊的一个或多个生长性状,其中LHX3基因型与滩羊的体长（BL）、体重（BW）、胸深（ChD）和管围（CaC）显著相关（P﹤0.05）,且缺失型基因型的生长性状优于插入型基因型和插入/缺失型基因型绵羊;小尾寒羊的缺失型基因型的胸围（ChC）、胸深（ChD）和管围（CaC）显著高于插入型基因型和插入/缺失型基因型绵羊（P﹤0.01）;兰州大尾羊的缺失型基因型的胸围（ChC）、十字部高（HW）、体长（BL）、体重（BW）和管围（CaC）显著高于插入型基因型和插入/缺失型基因型绵羊（P﹤0.01）。由此可见在绵羊分子育种中,LHX3中29 bp的缺失型可作为绵羊选育的DNA标记位点。

CO₂分压对贴壁细胞MRC-5连续传代培养的影响

张伊丽, 刘照平, 陆敏依, 蔡明勇, 吴根鹏

2019, 35(10): 169-173. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0390

摘要 ( 353 )

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研究培养过程中CO₂的使用和pH稳定性对MRC-5 细胞增殖、传代培养及产毒水平的影响。采用不同浓度的NaHCO₃调节细胞培养液pH值,结合CO₂使用,监测细胞培养过程中pH变化情况,以及在连续传代过程中的细胞形态和增殖情况。接种水痘-带状疱疹病毒比较不同状态下细胞的产毒能力。采用碳酸氢盐缓冲体系时,无CO₂分压的封闭培养组细胞培养液pH波动较大,在传代培养中观察到细胞形态较差,细胞状态下滑快;细胞连续传代至35-37代;细胞在31代平均产毒水平4.64 Lg PFU/mL。有CO₂分压的开放组细胞培养液pH相对平稳,在传代培养中细胞活率维持80%以上,细胞状态下滑趋势平缓,可连续传代至41代;31代细胞平均产毒水平4.83 Lg PFU/mL。采用碳酸氢盐缓冲体系的细胞培养液匹配合适的CO₂分压有助于细胞状态的优化提升。

人RhoB基因真核表达载体的构建和表达分析

王梅林, 牛精铃, 金若其, 徐莹莹, 蔡晶晶, 陈群力

2019, 35(10): 174-179. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0213

摘要 ( 324 )

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旨在构建带Flag标签的人RhoB基因真核表达载体并检测其表达。提取人胚肾细胞HEK-293T总RNA并反转录获得cDNA;设计引物并利用PCR技术扩增RhoB基因的ORF序列;将所扩增序列插入到带Flag标签的pCMV5真核表达载体,插入位点位于限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ之间,得到真核表达载体Flag-RhoB。酶切并测序验证该质粒的准确性。将成功构建的Flag-RhoB质粒转染乳腺癌MCF7细胞、宫颈癌HeLa细胞以及结直肠癌HCT116细胞,Western Blotting检测RhoB蛋白的表达情况;转染Mv.1.Lu细胞,免疫荧光技术检测该蛋白在细胞中的定位情况。成功扩增出RhoB基因的ORF序列;连入pCMV5中获得真核表达质粒Flag-RhoB;酶切鉴定得到590 bp大小的片段,测序结果显示连入的是RhoB基因的cDNA序列与GenBank相符。Western Blotting结果显示,该质粒可在MCF7细胞、HeLa细胞及HCT116细胞中正确表达。免疫荧光实验显示过表达的RhoB蛋白主要定位于细胞膜上,细胞质中也有分布。成功构建了带Flag标签的人RhoB基因的真核表达载体,该质粒可在细胞中顺利表达。

植物病毒侵染对生态系统中生物因子及其相互作用的影响

胡亚萍, 周旭, 陈水飞, 葛晓敏, 丁晖

2019, 35(10): 180-188. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0290

摘要 ( 335 )

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植物病毒可以对寄主植物造成危害,也可以对寄主植物增益;植物病毒的侵染可以对节肢动物及其天敌造成生态适应性、生长发育特性和行为特征的改变;植物病毒与介体节肢动物、非介体节肢动物、介体天敌及其他病原微生物间也存在相互作用。对外来物种进行风险评估是预防生物入侵的重要手段,明晰植物病毒侵染对寄主所在生态系统造成影响的各类生物因子及其相互作用关系,是开展植物病毒侵染所造成生态风险评估的研究基础。对植物病毒侵染寄主植株后,对寄主及寄主周边的介体节肢动物、非介体节肢动物、介体天敌,以及病原微生物等各类生物因子的影响及相互作用关系进行了综述,并从入侵生态学及植物病毒生态学的角度,探讨了植物病毒生态学未来的研究方向。以期为植物病毒入侵某一生态系统后所产生的生态风险评估奠定研究基础,并为植物病毒病的防控提供科学依据。

根际促生菌提高植物抗盐碱性的研究进展

姜焕焕, 王通, 陈娜, 禹山林, 迟晓元, 王冕, 祁佩时

2019, 35(10): 189-197. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0860

摘要 ( 600 )

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土壤盐碱化已成为限制作物生长及产量的主要因素之一,严重制约农业的发展。提高作物的抗盐碱性,为提高我国农业持续高效发展奠定基础。从根际促生菌研究现状入手,介绍耐盐碱根际促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR）的多样性。综述根际促生菌诱导植物建立抵抗或忍耐盐碱胁迫的机制,主要是通过产生植物激素、1-氨基-环丙烷-1-羧酸（ACC）脱氨酶、抗氧化防御物质、渗透调节物质、胞外多糖及挥发性化合物等生理活性物质,改变植物生理及物质代谢水平;另外,一些PGPR通过调节植物盐碱抗性相关基因及蛋白的表达,增强植物抗盐碱能力。通过对耐盐碱根际促生菌及其与植物互作进行展望,为大规模利用根际促生菌缓解盐碱土壤中植物的盐胁迫损伤、增加产量提供重要参考。

抗癌药物埃博霉素的生产及工艺发展

田露, 薛仁政, 张志敏, 薛春仙, 沈兰芳, 龚国利

2019, 35(10): 198-204. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0126

摘要 ( 551 )

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埃博霉素（Epothilone）作为一类以大环内酯为中心体的具有抗癌活性的化合物,对乳腺癌及直肠癌等肿瘤细胞具有强烈的抑制作用。它的作用机制与紫杉醇十分相似,即通过诱导微管蛋白多聚体形成超稳定态,从而将有丝分裂阻止在G2-M期,由此达到抑制肿瘤细胞繁殖乃至诱导其死亡的目的,但它的抗肿瘤活性却是紫杉醇的10-1 000倍。并且埃博霉素作为一类细菌次级代谢产物,其可通过微生物大规模发酵生产的这一天然优势,也使得它不会像紫杉醇一样受到来源的限制。除此以外,埃博霉素相对简单的分子结构也使得其具有良好的化学结构修饰潜力,最重要的是,埃博霉素对一些已经产生耐药的肿瘤细胞也表现出了较高的活性。因此,其巨大的药用价值和市场潜力能够使之成为继紫杉醇之后的又一新型抗肿瘤药物,具有重要的应用价值。就埃博霉素的化学合成、生物合成、分离提取及如何提高埃博霉素的产量等方面的研究进展进行综述,从而使得初入本领域的研究者们对于埃博霉素的研究近况有一个大致的了解,并对其后期的研究思路起到一定的引导作用。

花色苷生物转化修饰的研究进展

赵祥杰, 杨文君, 杨荣玲, 吴婷婷, 王朝宇, 许宁宁, 何佳美

2019, 35(10): 205-211. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0262

摘要 ( 396 )

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花色苷是植物界中广泛存在的一种天然的水溶性食用色素,是植物呈现靓丽颜色的重要物质基础,具有多种重要的生理功能和生物活性,药用和保健价值较高,具有巨大的商业应用潜力。花色苷由花色素和糖类物质经糖苷键缩合而成,其结构母核是2-苯基苯并吡喃阳离子,且结构上存在多个活性羟基,稳定性较差,对酸碱度、光照、温度等因素敏感,极易导致色泽或活性的消失。此外,其亲水性较强,在疏水环境中溶解性差,不易透过磷脂双分子层生物膜,导致生物利用度较低。在保持花色苷原有基本骨架结构基础上的酰基化修饰改造,可以获得理化特性改善、稳定性增强且具有良好生物利用度的花色苷酯衍生物,是解决花色苷应用难题的一条重要途径,也是当今研究的热点和难点。目前可用于花色苷类物质生物转化酰基化修饰的方法主要植物细胞转化、酶法转化和微生物全细胞转化。综述了花色苷的稳定性、生物活性及酰基化花色苷的生物合成方法,旨在为进一步开展花色苷的结构稳定性与生理活性研究及其在药品、食品、化妆品等行业中的广泛应用提供有益参考。

纳豆激酶豆乳液体发酵条件优化

倪楠, 辛志宏, 许斌, 张丽静, 王艳, 江均平, 王凤忠, 李淑英

2019, 35(10): 212-219. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0071

摘要 ( 425 )

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心脑血管疾病已经严重威胁人类健康,其发病率和死亡率均居各种疾病之首。纳豆激酶作为一种理想的预防和治疗血栓的天然功能食品被广泛关注,因此研究纳豆激酶的规模化生产对于推进溶栓类功能食品的开发具有重要意义。在前期发酵豆乳工艺优化的基础上,对因素顺序及因素水平稍作调整,以全豆豆乳为发酵基质,以纳豆激酶为功能评价指标,发酵后出渣率及终点pH为参考指标,通过单因素及正交试验确定最佳发酵工艺。结果表明,发酵豆乳的最佳工艺条件为：发酵时间30 h,装液量5%,初始pH5.5,接菌量1.5%。在此发酵条件下,酶活可高达660 184.14 IU/mL,是优化前（79 434.68 IU/mL）的8.31倍,是前期最佳工艺下纳豆激酶表达量（429 869.34 IU/mL）的1.54倍。与前期全豆豆乳最佳工艺条件相比,通过调整初始pH和接菌量的先后顺序,可以在更低接菌量（前期研究,最佳接菌量为1.75%）的基础上,显著增加纳豆激酶表达量。通过本实验研究既节约了成本也提升了纳豆激酶的表达量,对纳豆激酶的规模化生产具有重要意义。

实时无标记肿瘤细胞凋亡筛选技术体系的建立

李艳伟, 宋兴辉, 王佳佳, 刘丽, 黄莹莹, 郭春

2019, 35(10): 220-226. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0399

摘要 ( 292 )

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将xCELLigence-RTCA细胞分析系统的实时无标记技术和流式细胞术结合,建立实时无标记的肿瘤细胞凋亡筛选技术体系。利用顺铂诱导非小肺癌细胞A549凋亡,使用xCELLigence-RTCA系统连续监测96 h获取A549细胞动态生长曲线图谱,分析图谱确定细胞凋亡最佳检测时间点和半有效抑制浓度（IC₅₀）,联合流式细胞术的精准定量技术,分析顺铂作用后A549细胞的凋亡率。结果确定这种实时无标记细胞凋亡筛选技术体系用于肿瘤细胞凋亡筛选的可行性和可靠性。

2019, 35(10): 227-227.

摘要 ( 120 )

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