生物技术通报

催化混杂性驱动的酶功能重塑

曲戈, 孙周通

2023, 39(4): 1-9. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1305

摘要 ( 558 )

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作为生物催化剂，酶蛋白介导的生化反应具有条件温和、绿色环保等优点。然而相比化学催化剂，天然酶功能的局限性制约了它在生物制造领域的广泛应用。前期研究表明，酶蛋白除了催化专一性外，同时还展现出混杂性的一面，可在特定条件下催化非天然模式反应。这一特性为酶分子功能重塑提供了新思路，可用来指导人工酶设计，拓展天然酶的催化边界，实现新颖酶促反应类型，以扩大酶催化应用场景。本文从酶催化功能混杂性背后可能的进化机制入手，综述了当前诱导酶催化功能混杂性的常用策略，如定向进化、构象动力学、反应条件诱导及祖先酶重构等技术，并从催化机制、构效关系及适应性进化等多个角度，结合近年来相关研究实例，探讨了催化功能混杂性背后的分子机制，为突破天然酶促反应局限性、创制催化非天然反应的高效人工酶元件提供参考。

氧化还原伴侣工程：P450低效问题的解决方案之一

张岩峰, 叶丽丹, 于洪巍

2023, 39(4): 10-23. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0985

摘要 ( 439 )

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细胞色素P450酶（CYPs或P450s）可将O₂的一个原子插入有机底物同时将另一个原子还原为水，广泛参与各种合成代谢和分解代谢过程，所以一直以来都是生物技术领域关注的焦点。在催化循环底物的氧化依赖于氧化还原伴侣向血红素铁传递电子，因此电子转移是P450s催化过程中的限速步骤。利用不同方法优化蛋白质-蛋白质相互作用以提高P450系统的电子转移效率，被称为“氧化还原伴侣工程”，是目前工程化P450s的重要手段之一，并取得了卓有成效的进展。本文将着重介绍关于氧化还原伴侣组分替换组装、P450酶与氧化还原伴侣融合及P450酶与氧化还原伴侣作用界面修饰等方面的进展，期望为未来该方面的工作提供一定的指导作用。

细胞色素P450酶在香精香料绿色生物合成中的应用

郁慧丽, 李爱涛

2023, 39(4): 24-37. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1248

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细胞色素P450酶是一类含亚铁血红素的蛋白超家族，来源广泛，几乎存在于所有的生命形式中。P450酶被誉为“黄金催化剂”，主要参与生物体内源物质合成、异源物质代谢及天然产物的生物合成，具有底物谱广、催化反应类型多样、催化立体专一性强等优点，使得它们在药物/毒物代谢、工程化生物合成等方面受到越来越多的关注。其中，P450酶可以实现常温、常压、中性条件下特定惰性C-H键选择性羟化，在高附加值精细化学品的生物合成中具有重要应用价值。本文介绍了P450选择性羟化的催化机制及几种常见的P450电子传递系统，并结合蛋白质工程与代谢工程，以柠檬烯含氧衍生物、诺卡酮、檀香醇、4-羟基异佛尔酮、大环内酯麝香等高附加值化合物的生物合成为例，综述了单酶催化的生物转化或全细胞从头合成的方式在天然香精香料生物合成中的探索与应用，探讨其面临的挑战并展望了其应用前景。

机器学习方法在酶定向进化中的应用进展

王慕镪, 陈琦, 马薇, 李春秀, 欧阳鹏飞, 许建和

2023, 39(4): 38-48. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0724

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定向进化法通过模拟自然界的进化过程，可提高酶的进化速度，成为酶分子改造的关键技术。定向进化在生物催化以及药物设计等方面发挥着重要作用，但因突变的随机性所产生的数量庞大的突变体，使得实验筛选的能力面临巨大挑战。近年来，人工智能、大数据处理等新兴技术也发展成为生物催化领域的重要研究手段。其中，机器学习是一种统计学习的方法，通过数据驱动的方式获得序列/结构到酶功能的映射，为提高酶分子工程的效率提供帮助。本文综述了机器学习模型中所涉及的数据处理、描述符和算法等内容，重点叙述了机器学习方法在酶工程方面的研究与应用进展。随着机器学习算法和应用技术的进步，有望提出更加精准和有效的模型，助力新酶筛选与生物催化剂的精准设计改造。

CRISPR相关转座酶及其细菌基因组编辑应用

周晓杰, 杨思琪, 张译文, 徐佳琪, 杨晟

2023, 39(4): 49-58. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1163

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CRISPR-Cas能够在RNA引导下靶向DNA或RNA的特定序列，改变RNA序列即可改变靶向位点，利用这一可重编程特性已开发出了各种强大的遗传学工具。最近发现CRISPR元件在进化过程中被Tn7转座子劫持，由此衍生出的CRISPR相关转座酶（CRISPR-associated transposases, CASTs）系统具有RNA引导DNA整合的能力，被部署为靶点可重编程的基因组整合工具，在大片段和多重基因整合上具有广阔的应用前景。本文追溯了CASTs的发现历程，总结了不同类型CASTs的基因座结构特点、介导基因整合的机制模型以及其在多种革兰氏阴性细菌中的部署和应用。

NAD依赖型去乙酰化酶SRT在植物表观遗传调控中的作用

魏明, 王欣玉, 伍国强, 赵萌

2023, 39(4): 59-70. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0971

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SRT（sirtuin）是一类与酵母沉默信息调节蛋白2（yeast silent information regulator 2, Sir2）高度同源的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide, NAD）依赖型蛋白质去乙酰化酶。真核生物中，SRT通过催化特异组蛋白或非组蛋白赖氨酸（Lys）残基的去乙酰化反应，调控染色体稳定、基因转录及相关蛋白的活性状态。研究表明，SRT介导的去乙酰化在植物代谢、生长发育和逆境胁迫响应等过程中起重要作用。本文对植物SRT的鉴定、结构与分类、生物进化、表观遗传调控机制和生物学过程调控方面的研究加以综述，并对该蛋白未来研究方向进行展望，以期为今后SRT介导的表观遗传学生物过程的研究提供基础。

新型GH5家族多结构域纤维素酶的结构与功能研究

杨俊钊, 张新蕊, 赵国柱, 郑菲

2023, 39(4): 71-80. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0641

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纤维素酶能够将纤维素转化为可发酵的糖类，为丰富纤维素酶的序列与结构资源、揭示纤维素酶结构与功能之间的关系，本研究对两个新型GH5家族多结构域内切纤维素酶TlCel5和ReCel5进行了克隆表达和酶学性质测定，并对其结构域开展了突变研究。序列和结构分析显示，Tlcel5和Recel5分别编码了655个和632个氨基酸，理论分子量分别为68.3 kD和65.9 kD，均包含了CBM1区、CD区、CBMX2区和一个未知结构域，这与以往报道的多数单一结构域或双结构域纤维素酶显著不同。为了解附加结构域对酶功能的影响效果，以ReCel5为研究对象，分别构建了N端CBM1结构域的截断突变体TM1，和C端未知结构域的截断突变体TM2。酶学性质分析显示，TlCel5和ReCel5的最适作用pH和最适作用温度分别为pH 3.0、50℃和pH 4.0、70℃，在50℃和70℃下能够保持良好的稳定性，并且对多种类型的纤维素类底物、半纤维素类底物表现出水解能力。虽然突变体TM1和TM2的酶学性质较野生型没有发生显著变化，但其对羧甲基纤维素钠、大麦葡聚糖、地衣多糖的水解比活值降低了23%-68%，由此说明，在多结构域酶中，附加结构域与酶的水解能力之间存在密切关系。

短链脱氢酶Lvchun的分子改造及其在氯霉胺合成中的应用

韩惠, 张舰, 任宇红

2023, 39(4): 81-92. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0771

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2-氨基-1-（4-硝基苯基）-1,3-丙二醇俗称氯霉胺（ANP），由于具有两个手性中心，且结构中的O原子和N原子有良好的配位能力，具有广泛的应用价值。针对化学合成法存在生产成本高、原子经济性低、环保压力大等诸多缺点，旨在通过化学水解法与生物催化法相结合的方式，构建以对硝基-α-乙酰氨基-β-羟基苯丙酮（p-NAH）为底物合成（1R）-ANP的新途径。首先采用化学法水解p-NAH制备1-（4-硝基苯基）-2-氨基-3-羟基苯丙酮（AHNA），并筛选对水解产物具有催化活性的羰基还原酶，通过分子改造提高该酶的催化活性，并对突变体mut-V112Y的酶学性质进行研究；然后构建mut-V112Y与甲酸脱氢酶的双酶共表达及融合表达重组菌株，并对重组菌株的催化效率进行比较；最后优化催化反应条件，并进行制备反应。结果表明，化学法可水解p-NAH生成AHNA，筛选到的短链脱氢酶Lvchun可催化AHNA生成（1R）-ANP，通过对该酶进行定点突变获得了催化效率提高3.47倍的突变体mut-V112Y，其最适温度为30℃，最适pH为7.5，具有良好的温度和pH稳定性。成功构建了mut-V112Y和甲酸脱氢酶CbFDH的双酶共表达和融合表达重组菌株，通过比较发现共表达菌株mut-V112Y-CbFDH的催化效率最高。通过优化催化反应条件，最终可在最适条件下反应30 min催化50 mmol/L AHNA生成14.56 mmol/L（1R）-ANP，收率为29.12%。化学水解法与生物催化法相结合的方式可有效地催化p-NAH合成（1R）-ANP，该方法为合成光学纯的ANP提供了新途径。

枯草芽孢杆菌WTX1胞外酶降解AFB₁酶学特性及降解位点分析

杨冬, 唐璎

2023, 39(4): 93-102. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1384

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为丰富生物降解黄曲霉毒素B₁（AFB₁）资源，研究已筛选到的枯草芽孢杆菌WTX1降解AFB₁的胞外酶特性及其降解位点。通过降解与AFB₁毒性位点结构相似的3种化合物，采用液相色谱串联三重四级杆质谱（UPLC-MS/MS）检测降解液。经层析分离，降解AFB₁胞外酶主要有Ea、Eb两种。最适降解条件：降解酶Ea 降解温度为50℃，pH 5，降解率高达88.4%；降解酶Eb降解温度为37℃，pH 5，降解率为73.4%；Ea酶的作用位点为AFB₁的呋喃环双键、香兰素内脂环、戊烯酮环结构，Eb酶的作用位点为AFB₁的香兰素内脂环、戊烯酮环结构。酶组降解途径为通过水解作用，加氢及连续脱去-CO基团。菌株WTX1胞外酶通过水解作用破坏AFB₁毒性位点，起到降解作用，该酶具有很好的抗逆性，温度和pH适应性适合工业化加工的苛刻条件。

高产硝酸盐还原酶Staphylococcus simulans ZSJ6的复合诱变选育及其酶学性质研究

赵赛赛, 张小丹, 贾晓妍, 陶大炜, 刘可玉, 宁喜斌

2023, 39(4): 103-113. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1270

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硝酸盐还原酶可以将天然肉制品中的硝酸盐还原为亚硝酸盐，避免了直接添加亚硝酸盐导致其含量骤增，降低产生亚硝胺的概率，对天然肉制品的品质和安全非常重要。以腊肠中筛选出的模仿葡萄球菌（Staphylococcus simulans D14）为出发菌株，探究了单一诱变条件包括紫外、微波、氯化锂诱变，以及紫外-微波-氯化锂联合诱变的两种复合诱变方式对菌株的不同影响，以期获得硝酸盐还原酶高产菌株，并通过摇瓶发酵初步探究其酶学性质，以期为天然肉制品的发酵剂提供菌株选择。确定了紫外、微波和氯化锂诱变的最佳条件：紫外照射60 s，微波辐照80 s，氯化锂浓度1.5%。筛选出诱变菌株Staphylococcus simulans ZSJ6，菌株酶活力可达603.29 U/mg蛋白，是出发菌株酶活力的3.59倍，且突变菌株连续传代8次后，其酶活力并无显著变化（P>0.05），表明其遗传稳定性较好。酶学性质结果显示，其最适作用温度为30℃，最适作用pH为7.5，且稳定性良好，在pH 7.5下孵育2 h，酶活力仍保留90%以上。Mg²⁺、Ca²⁺、K⁺均能促进酶活力，其中Ca²⁺对酶活力的促进作用最大，相对于空白组酶活力提升了1.63倍。Cu²⁺、Fe²⁺、Hg²⁺、Mn²⁺均能抑制酶活，其中Cu²⁺和Hg²⁺对酶活力的抑制作用最大，酶活力均被抑制到30%以下。研究结果为天然肉制品中硝酸盐的转化，以及生产初期使用亚硝酸盐带来的亚硝酸盐浓度过高等问题提供了解决思路，具有研究价值和应用潜力。

赭曲霉11α羟化酶的克隆表达及关键氨基酸位点分析

艾露, 陈文慧, 史京辉, 任志远, 沈文琦, 杨嘉凝, 骆健美, 王敏

2023, 39(4): 114-123. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0572

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11α，17α-双羟基黄体酮是甾体激素类药物的重要中间体，工业上主要利用霉菌对17α-羟基黄体酮的11α羟化反应制备。对赭曲霉的11α羟化酶及其关键氨基酸位点展开研究，为深入解析酶的催化机理提供基础数据。利用底物转化实验探究了10个羟化反应常用霉菌对17α-羟基黄体酮的转化能力，考察了赭曲霉来源的11α羟化酶CYP68J5在不同表达系统中的活性，借助结构预测、分子对接和定点突变等手段对CYP68J5的关键氨基酸位点进行解析。结果表明，赭曲霉的转化能力最强，转化时间60 h的摩尔产率达到最大值，为78.55%；其羟化酶CYP68J5在酿酒酵母中的表达活性最高；位于底物结合口袋附近的D118、F216、M488是CYP68J5的关键氨基酸位点，这些位点在维持酶的结构稳定性上发挥重要作用，是后续分子改造的潜在重要靶点。

具有辅助降解纤维素功能的大斑刚毛座腔菌糖苷水解酶GH61的鉴定、异源表达及功能分析

马玉倩, 孙东辉, 岳浩峰, 辛佳瑜, 刘宁, 曹志艳

2023, 39(4): 124-135. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0996

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糖苷水解酶61家族（GH61）属于一类同时具有氧化作用和水解作用的纤维素降解酶类，既具有微弱的纤维素内切酶活性，也可通过氧化作用破坏纤维素晶体结构促进纤维素酶对木质纤维素的降解，在生物质资源的利用方面具有潜在的应用价值。对大斑刚毛座腔菌Setosphaeria turcica的GH61家族基因进行鉴定及生物信息学分析，通过转录组数据分析及荧光定量PCR验证，筛选出受玉米秸秆木质纤维素底物诱导表达的GH61家族基因StGH61-11。将StGH61-11进行重组表达，使用2,6-二甲氧基苯酚氧化反应测定其酶活力并优化诱导条件，表征其酶学性质并检测其对纤维素酶水解木质纤维素的促进作用。结果表明，在S. turcica基因组中存在21个GH61家族基因，且S. turcica在玉米秸秆的诱导下滤纸酶活明显增加，对其进行转录组分析发现，在以玉米秸秆为碳源时GH61家族基因中有11个基因的表达量增加。将其中StGH61-11基因在大肠杆菌中诱导表达，最佳诱导条件为25℃、1 mmol/L IPTG诱导9 h，此时获得的蛋白比活力可达到（54.08±1.67）U/g。重组蛋白StGH61-11的最佳催化条件为温度50℃、pH 5，在最佳催化条件下可以显著提高纤维素酶水解玉米秸秆的活性，协同度最高可达2.5，糖化率最高可达46.5%。

猕猴桃过氧化氢酶基因家族全基因组鉴定与表达分析

赖瑞联, 冯新, 高敏霞, 路喻丹, 刘晓驰, 吴如健, 陈义挺

2023, 39(4): 136-147. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0533

摘要 ( 316 )

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过氧化氢酶（Catalase，CAT）是植物主要的抗氧化酶之一。为揭示猕猴桃CAT（AcCAT）基因家族序列特征和潜在功能，对其进行了全基因组鉴定和表达分析。对AcCAT基因家族进行全基因组鉴定和生物信息学分析，并研究其在不同器官以及果实贮藏过程中的表达变化。从猕猴桃基因组中鉴定出9个AcCAT基因并根据其在染色体上的位置分别命名为AcCAT1-AcCAT9，不同成员之间蛋白理化性质、基因结构、保守基序、启动子作用元件等存在较高相似性。AcCAT基因不均匀地分布在猕猴桃的4条染色体上，其中的5个AcCAT基因形成2个串联基因簇，6个AcCAT基因发生片段复制。基于psRNAtarget分析，AcCAT基因可能主要受miR166家族调控。系统进化分析结果显示，来源于猕猴桃、茶树、棉花和水稻的23个CAT蛋白分为3个类群，其归类并未完全按物种划分。在不同猕猴桃器官中，AcCAT3主要在根中表达，AcCAT1和AcCAT4主要在花中表达，AcCAT2、AcCAT5、AcCAT6、AcCAT8和AcCAT9主要在叶中表达，AcCAT7则同时在根和花中高水平表达；在猕猴桃果实贮藏过程中，AcCAT5和AcCAT6表达水平逐渐降低，AcCAT1和AcCAT2主要在贮藏前期表达，而AcCAT3、AcCAT4和AcCAT8主要在贮藏后期表达。此外，miR166家族成员在果实贮藏过程中的表达量逐步升高。AcCAT基因在进化过程中存在保守性，其在猕猴桃生长发育和果实贮藏软化过程中发挥调控作用。

斑地锦查尔酮合酶基因及启动子的克隆与分析

郭三保, 宋美玲, 李灵心, 尧子钊, 桂明明, 黄胜和

2023, 39(4): 148-156. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1130

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黄酮类化合物槲皮素是斑地锦主要药效成分之一，而查尔酮合酶（CHS）是槲皮素生物合成过程中的关键酶。为阐明斑地锦中槲皮素生物合成机制，本研究以斑地锦为材料，根据转录组测序数据结合3' RACE、Tail-PCR技术，克隆了CHS基因及其启动子，将该基因命名为EmCHS（GenBank登录号为ON652865）。对EmCHS蛋白进行氨基酸序列比对、理化性质、跨膜结构域、亚细胞定位和系统进化树等分析，并采用实时荧光定量PCR技术检测EmCHS在不同生长期不同组织中的表达情况。结果显示，EmCHS开放阅读框（ORF）全长为1 194 bp，编码397个氨基酸，EmCHS蛋白定位于细胞质，理论等电点为5.96，相对分子质量为43.48 kD，不含跨膜区域，为结构稳定的亲水性蛋白。氨基酸序列比对和系统进化树分析结果显示，EmCHS与同为大戟科的木薯氨基酸序列相似性最高（91.92%），符合植物分类学的特点。RT-qPCR实验表明，EmCHS基因在斑地锦不同生长期不同组织中均有表达，且存在明显差异，在生殖生长期叶内表达水平最低，生殖生长期根内表达水平最高。克隆到的EmCHS启动子（GenBank登录号为OP626754），长度为971 bp，生物信息学分析结果显示，其既含TATA-box、CAAT-box等基本序列，也含有MYB、MYC等转录因子结合位点、多个光反应元件（G-box等）和激素反应元件（ABRE等）等顺式作用元件。实验结果为进一步研究斑地锦CHS基因功能及表达调控奠定基础。

植物基因上游开放阅读框的研究进展

薛皦, 朱庆锋, 冯彦钊, 陈沛, 刘文华, 张爱霞, 刘勤坚, 张琪, 于洋

2023, 39(4): 157-165. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0832

摘要 ( 520 )

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上游开放阅读框（upstream open reading frame, uORF）是一类能够精确控制蛋白质翻译的mRNA元件，位于mRNA的5'端前导区，主要通过抑制翻译起始来调节下游主体开放阅读框（main open reading frame, mORF）的翻译。目前对植物uORF的预测和鉴定主要集中于生物信息学和翻译组学鉴定技术。植物uORF广泛参与调节生长发育、营养代谢、抗病免疫等多个生命活动过程。本文对植物uORF的分类、功能机制、预测和鉴定方法、植物规避uORF的方式以及植物uORF的工程应用等进行综述归纳，旨在更系统和深入地理解植物uORF的功能与机制，并为uORF应用于作物分子育种工作提供参考。

种子内生细菌多样性与植物互馈作用研究进展

李善家, 雷雨昕, 孙梦格, 刘海锋, 王兴敏

2023, 39(4): 166-175. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0982

摘要 ( 381 )

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种子作为植物重要的繁殖器官，是多种有益微生物的载体，其内部普遍存在种类丰富多样且对植物具有一定作用的内生菌群落。种子内生细菌可以直接或间接地促进种子萌发和植物生长、提高植物对各种病原菌和环境胁迫的抗性、促进活性成分产生和累积，并产生各种生物学效应，它们的分布和种群结构受寄主植物的遗传特性和健康状况以及周围环境生态的影响。本文从种子内生细菌的多样性，种子内生细菌促进植物生长、提高植物抗性、促进活性成分累积以及在农业生产和生物防治方面的应用前景，对种子内生细菌研究领域所取得的进展进行论述并提出展望，为后续种子内生细菌相关研究提供参考。

RNA修饰及其在秀丽隐杆线虫中的研究进展

安磊, 赵金玲, 任晓亮

2023, 39(4): 176-186. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1001

摘要 ( 317 )

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RNA修饰是表观遗传学（epigenetics）领域重要的探索方向，其种类繁多，过程复杂，在调节生物生长发育、新陈代谢等方面起着重要作用。近些年，针对RNA修饰的检测方法由传统的实验定量检测技术发展为与二代、三代高通量测序平台相结合的检测技术，以此为基础，人们对RNA修饰类型、相关调控蛋白以及调控机制和功能有了更为深入的了解。当前基于秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的RNA修饰研究表明，RNA修饰水平与秀丽隐杆线虫的寿命长短、应激性强弱、生育率高低等有着密切关联。对RNA修饰的常见类型和检测技术进行综述，总结其在秀丽隐杆线虫中的研究成果，并对将来的研究趋势进行展望。

胆汁酸生理功能及其与肠道微生物互作研究进展

熊淑琪

2023, 39(4): 187-200. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0931

摘要 ( 578 )

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胆汁酸（bile acids, BAs）是由胆固醇代谢产生的，在肝脏中胆固醇转化为初级胆汁酸，进入肠道后又经肠道菌群代谢为次级胆汁酸，并通过肠肝循环在体内维持稳态。胆汁酸分子既有亲水端又有亲脂端的结构，可发挥洗涤剂的作用，有助于溶解和吸收膳食中的脂类及脂溶性维生素等，这也使得胆汁酸具有一定的抗菌特性。胆汁酸与肠道菌群的互作不仅体现在其自身的生理功能上，而且肠道细菌的组成及数量也调控着胆汁酸代谢，并通过激活不同的受体信号调节糖脂代谢、能量代谢以及免疫炎症反应等。本文综述了胆汁酸的代谢过程及其如何通过FXR、TGR5等受体信号调控宿主生理功能等，为后续通过科学合理地调控肠道菌群及其代谢物来维护动物健康、促进畜禽生产提供参考。

水稻内生细菌新资源分离培养方案探究

李怡君, 吴晨晨, 李睿, 王喆, 何山文, 韦善君, 张晓霞

2023, 39(4): 201-211. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0961

摘要 ( 316 )

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为了探究适用于分离水稻内生细菌的方案以获得水稻内细菌新资源，本研究基于培养组的方法，以水稻3个品种种子及幼苗为材料，从材料表面消毒、菌悬液的制备和培养基配比3个方面进行探究，并对分离获得代表性纯培养物的16S rRNA基因进行测序鉴定。结果表明，75%乙醇和含2%有效氯的次氯酸钠溶液组合对种子先后处理90 s和12 min，对植株组织先后处理90 s和5 min即可获得良好的消毒效果。水稻种子内生细菌量为10⁵-10⁶CFU/g，其中90%-95%分布于颖壳内，不同品种或同一品种的不同生境来源的种子之间内生细菌群落组成有明显差异；在制备种子菌悬液时需注意控制研磨程度以获得种类丰富的菌落，剥去颖壳有利于分离培养糙米中的内生菌。对于根、茎、叶内生细菌的分离，需要根据材料不同控制接种菌悬液的浓度以获得其中微量的内生细菌；在培养基中添加组织浸提液和延长培养时间至两周以上，可促进根、茎、叶内生细菌的分离培养。采用调整后的方案，本研究对3个水稻品种的种子和它们的植株根、茎、叶内生细菌进行分离培养，分别完成了71、14、10和2个代表性纯培养物的16S rRNA基因测序鉴定，其中有8株与已知类群模式菌株同源序列相似度在97.22%-98.74%，新种获得率为8.25%。研究结果为分离培养水稻内生细菌新资源提供了方法参考。

洋葱种子消毒和无菌苗培养新方法

孙亚玲, 李瑞平, 王振宝, 张庶, 刘冰江, 霍雨猛

2023, 39(4): 212-220. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0983

摘要 ( 454 )

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为了获得简便、高效、低污染的洋葱种子消毒及无菌苗培养方法，通过控制植物组培抗菌剂（PPM）的pH值、消毒浸泡时间及培养浓度，对洋葱种子消毒及无菌苗培养进行研究。结果表明，PPM（20 mL/L，pH 2）浸种24-48 h消毒效果可以达到10% NaClO消毒10 min水平，且不影响种子发芽，8 d发芽势超过90%。污染微生物分析鉴定了4种真菌（Alternaria alternata、Fusarium proliferatum、Fusarium oxysporum、Stemphylium vesicarium）和2种细菌（Phytobacter diazotrophicus、Atlantibacter hermannii）可以通过洋葱种子进行传播，抑菌试验明确了PPM可有效的抑制污染微生物的生长。培养基中添加PPM可以有效的降低污染率，高浓度PPM（1-9 mL/L）可以抑制洋葱幼苗的生长，而低浓度PPM（0-0.5 mL/L）对洋葱幼苗生长无明显抑制作用。探索开发了一套操作简便无需繁琐冲洗的洋葱种子消毒以及高发芽率、低污染率无菌苗培养方法。

辣椒苗期炭疽菌接种方法

李月, 余婉贤, 李宁, 姚明华, 李峰, 邓颖天

2023, 39(4): 221-226. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0994

摘要 ( 284 )

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炭疽病是辣椒生产上所面临最严重的病害之一，迫切需要可靠的方法在辣椒发育早期筛选抗病资源。炭疽病菌株CD的分生孢子采用两种接种方法，对辣椒‘ST-8’不同苗龄材料进行接种，通过对发病率、叶片卷曲率以及病斑大小的比较分析最佳的接种方法。结果表明，使用浓度为1×10⁶个/mL的孢子悬浮液进行针刺点接法效果最佳，有望应用于大规模高通量辣椒抗炭疽病种质筛选。

低起始量的免疫共沉淀技术研究进展

张新博, 崔浩亮, 史佩华, 高锦春, 赵顺然, 陶晨雨

2023, 39(4): 227-235. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0940

摘要 ( 294 )

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将染色质免疫共沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）和第二代测序技术相结合的染色体免疫共沉淀测序技术（co-immunoprecitation followed by sequencing, ChIP-seq）是分析全基因组表观遗传学变化的重要方法，它可以快速、有效地检测到在全基因组范围内DNA与蛋白结合位点、转录因子结合位点（transcription factor binding site, TFBS）、组蛋白翻译后修饰（histone post-translation modifications, hPTMs）、核小体定位和DNA甲基化等。然而，长期以来ChIP-seq需要大量细胞来生成高质量数据集，这限制了ChIP在一些细胞数较低的样本如卵母细胞、早期胚胎细胞等研究领域的应用。近年来，在ChIP的基础上，研究人员提出了一系列降低样品起始量和实验成本、提高测序质量的低起始量ChIP-seq方法，促进了表观基因组学的发展。本文综述了ChIP原理和降低起始量的ChIP的方法学发展，并对其中几种比较重要的方法进行了比较，并总结了低起始量的ChIP-seq在表观遗传学研究中的应用。本文最后对低起始量ChIP技术的应用和发展进行了展望，为低细胞数样品在低起始量ChIP的选择提供了参考。

低温胁迫下番茄SlMYB96的功能分析

胡明月, 杨宇, 郭仰东, 张喜春

2023, 39(4): 236-245. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1051

摘要 ( 317 )

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研究SlMYB96在抗寒中的作用，为研究番茄的抗寒分子机制及选育番茄抗寒品种提供理论依据。以番茄cDNA为模板克隆SlMYB96，利用生物信息软件分析该基因的理化性质，利用实时荧光定量（RT-qPCR）技和病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS）技术研究低温胁迫处理后SlMYB96的表达特征及其在番茄抗寒过程中的作用。结果表明，SlMYB96在番茄的根、茎、叶、花和果实中均有表达，且在花中表达水平最高；随着4℃低温处理时间的增加，SlMYB96的表达量升高，其中在低温处理3 h时表达量达到最大。借助TRV病毒介导的基因沉默技术将SlMYB96沉默，对野生型组（WT）、空载组（CK）以及基因瞬时沉默组（pTRV-MYB96）3组不同类型番茄植株进行低温胁迫后，外观性状结果显示，在4℃低温处理5 d后，与野生型组（WT）、空载组（CK）相比，基因瞬时沉默组（pTRV-MYB96）植株表现出更为明显的冷害症状；生理水平鉴定结果表明，4℃低温处理番茄幼苗5 d时，基因瞬时沉默组（pTRV-MYB96）植株叶绿素、丙二醛、可溶性蛋白含量和超氧化物歧化酶活性明显变低，而可溶性糖、相对电导率、游离脯氨酸含量以及过氧化氢酶、过氧化物酶活性增加，说明基因瞬时沉默组（pTRV-MYB96）植株与野生型组（WT）、空载组（CK）相比抗寒性较低。证明SlMYB96能够响应低温胁迫，将其沉默后番茄植株抗寒性降低。

茶树SMAS基因家族的鉴定及互作分析

王艺清, 王涛, 韦朝领, 戴浩民, 曹士先, 孙威江, 曾雯

2023, 39(4): 246-258. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1045

摘要 ( 384 )

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S-腺苷甲硫氨酸合成酶（S-adenosylmethionine synthase, SAMS）是催化甲硫氨酸和ATP合成S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的唯一酶，研究表明SAMS参与木质素的生物合成。本研究对‘黄棪’茶树（Camellia sinensis）中鉴定的SAMS基因家族，进行表达模式及蛋白互作网络分析，挖掘可能参与木质素合成的 CsSAMS候选基因。以‘黄棪’茶树基因组为参考基因组，通过生物信息学鉴定CsSAMS基因家族成员，并分析其蛋白理化性质、系统进化树、染色体定位、基因结构、蛋白结构、表达模式，通过酵母双杂交技术（Y2H）研究其蛋白互作网络，通过紫外分光光度计方法对‘黄棪’‘铁观音’‘金观音’‘福鼎大毫茶’一芽二叶部位的木质素含量进行测定。生物信息学分析结果表明，‘黄棪’茶树中共鉴定到4个CsSAMS家族成员，其编码氨基酸个数为345-519，等电点为6.12-6.47。亚细胞定位预测结果表明，CsSAMS1定位于叶绿体，CsSAMS2、CsSAMS3定位于细胞质，CsSAMS4定位于细胞骨架。通过对不同茶树品种的CsSAMS表达量和木质素含量检测发现，CsSAMS2、CsSAMS3、CsSAMS4可能潜在调控木质素的含量，另外酵母双杂交结果表明，CsSAMS4可以与自身形成同源二聚体。本研究鉴定并分析了4个CsSAMS成员的理化性质并预测其功能，明确了不同组织部位和氮、氟处理下CsSAMS基因的表达模式，以及CsSAMS对木质素合成过程的潜在参与作用。

玉米ZmDHN15基因在烟草中的遗传转化及抗冷性分析

陈楠楠, 王春来, 蒋振忠, 焦鹏, 关淑艳, 马义勇

2023, 39(4): 259-267. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1083

摘要 ( 452 )

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玉米起源于亚热带，是喜温作物，易受低温胁迫的影响，脱水素（dehydrin，DHN）作为胚胎发育晚期丰富蛋白（late embryogenesis abundant protein, LEA）Ⅱ家族成员，是一类在植物非生物胁迫中发挥重要功能的蛋白。本研究克隆获得ZmDHN15基因，使用生物信息学手段，实时荧光定量PCR等技术对该基因的基本特性、组织表达特性进行分析，并进行植物过表达载体的构建及烟草的遗传转化，对T₂代阳性植株进行抗冷性功能验证。结果表明，ZmDHN15基因全长1 442 bp，共编码290个氨基酸，分子量为31.44 kD，理论等电点为6.05，是亲水性非跨膜蛋白，具有脱水素家族特有保守结构域。RT-qPCR分析表明ZmDHN15基因的在玉米叶片中表达量较高且在冷胁迫条件下表达量增加；获得T₂代转基因烟草植株9 株；在冷胁迫下转基因烟草与野生型相比，萌发率提高1.40 倍，根长提高1.58 倍，其叶片萎蔫程度更低，脯氨酸含量、丙二醛含量和过氧化物酶活性分别降低41.17%、28.47%和23.33%，可溶性糖含量、氧化物酶活性和超氧化物歧化酶活性分别升高58.97%、47.85%和47.53%，H₂O₂ 和O₂^-积累量分别减少34.78%和47.00%。综上所述，过表达ZmDHN15 基因可以有效提高烟草植株对冷胁迫的耐受性，为进一步研究ZmDHN15基因在玉米中的功能奠定基础。

大豆膜系统cDNA文库的构建及大豆疫霉效应子PsAvr3a互作蛋白的筛选

侯筱媛, 车郑郑, 李姮静, 杜崇玉, 胥倩, 王群青

2023, 39(4): 268-276. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0972

摘要 ( 287 )

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植物质膜是响应侵染的第一道屏障，其受体蛋白是感知病原菌入侵的雷达，是植物免疫系统的重要组成部分。大豆疫霉（Phytophthora sojae）通过分泌效应子干扰寄主免疫反应以促进自身侵染定殖。构建大豆膜系统酵母双杂交cDNA文库，为进一步探究大豆疫霉效应子与寄主膜蛋白靶标互作机制奠定基础。以大豆疫霉无毒效应子PsAvr3a为诱饵蛋白筛选文库，初步获得198个候选寄主靶标。酵母一对一验证试验表明，有5个候选靶标蛋白与PsAvr3a互作，包括酪氨酸分解酶、囊泡转运蛋白、乙烯合成调控酶、细胞代谢结合蛋白、抗逆的渗透蛋白等。通过双分子荧光互补试验（bimolecular fluorescence complementation, BIFC）与荧光素酶互补试验（luciferase complementation assay, LCA）验证得出GmACO、GmSec61与PsAvr3a均存在互作。确定2个寄主大豆膜蛋白乙烯前体ACC氧化酶GmACO、三聚体易位子GmSec61是大豆疫霉无毒效应子PsAvr3a的互作靶标。

芒果炭疽病拮抗菌分离、鉴定及生防机制研究

章乐乐, 王冠, 柳凤, 胡汉桥, 任磊

2023, 39(4): 277-287. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0908

摘要 ( 481 )

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从环境中分离获得芒果炭疽病病原菌的拮抗细菌，明确菌株RL-LL04对病原菌的拮抗机理并探索菌株的生物防治应用潜能。通过稀释法与平板对峙法，分离筛选出胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）的拮抗细菌并进行系统鉴定，采用平板对峙法研究菌株对多种常见热带水果病原菌的抑制作用，通过胞外酶检测以及固相微萃取气质联用检测挥发性有机物成分，进行生防机制研究，并在光学显微镜下观察菌株对病原菌菌丝生长的影响，开展离体芒果接种试验进行芒果炭疽病生物防治应用。分离获得73株具有拮抗效果的细菌，5株对胶孢炭疽菌的抑制率达到70%以上，其中以菌株RL-LL04的抑菌率最高（82.2%），经菌落形态特征、生理生化特征与16S rRNA、gyrB和rpoB基因序列分析，鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），该菌对多种常见热带水果病原真菌具有拮抗能力，该菌通过产生含有苯甲醛、3-甲基丁酸和苯酚等具有抑菌活性的挥发性有机物与纤维素酶、蛋白酶和木聚糖酶等胞外酶抑制病原菌生长，通过光学显微镜观察到病原菌菌丝畸形、扭曲及断裂，且离体芒果炭疽病防治效率达52.7%。该结果为芒果炭疽病的生物防治提供了菌种资源，也为阐明菌株RL-LL04对芒果炭疽病的拮抗机理提供了依据。

恩诺沙星胁迫下嗜水气单胞菌的比较蛋白质组学研究

姚近东, 汤华妹, 杨文霄, 张丽珊, 林向民

2023, 39(4): 288-296. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0917

摘要 ( 240 )

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为深入了解喹诺酮类抗生素胁迫下细菌产生的耐药机制，本研究以水生病原菌嗜水气单胞菌为研究对象，利用定量蛋白质组学方法比较嗜水气单胞菌在有无恩诺沙星处理下的蛋白表达差异。质谱结果发现446个差异蛋白，其中233个蛋白表达上调，213个蛋白表达下调。生物信息学分析显示，嗜水气单胞菌可能通过DNA修复和硫代谢相关蛋白的上调表达，促进细菌存活。进一步通过生长曲线测定发现，参与硫代谢的半胱氨酸与恩诺沙星联用能更好地抑制细菌的生长。同时，利用qPCR技术验证硫代谢相关基因在mRNA水平的表达量，发现大部分相关基因在转录水平上的差异表达与蛋白水平一致。以上研究结果表明硫代谢对嗜水气单胞菌在ENR胁迫下起着重要作用。

益生菌菌粉贮存活性影响因素研究

严涛, 陈珂可, 杨恒飞, 朱建国, 夏九学, 方曙光

2023, 39(4): 296-303. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0954

摘要 ( 392 )

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对乳杆菌、双歧杆菌、球菌3种类型的益生菌粉的贮存活性影响因素进行研究，为其菌粉的质量指标控制及应用提供指导。以嗜酸乳杆菌LA85、植物乳杆菌Lp90、鼠李糖乳杆菌LRa05、干酪乳杆菌LC89、乳双歧杆菌BLa80、长双歧杆菌BL21、短双歧杆菌BBr60、婴儿双歧杆菌BI45、嗜热链球菌ST81、乳酸片球菌PA53、戊糖片球菌PP06、乳酸乳球菌LLa61为研究对象，以菌体的存活率、蛋白酶活性为指标，考察益生菌菌粉质量指标（水分、水分活度）、贮存温度及封装方式对其贮存过程中菌体的存活率及蛋白酶活性的影响。菌粉的水分、水分活度在一定范围内对其储存的存活率及蛋白酶活力无显著影响（P<0.05），超过一定范围，随着水分、水分活度的提升，其菌粉的储存存活率、蛋白酶活力显著下降（P<0.05）；不同的贮存温度（-18℃、4℃、25℃）对菌粉的贮存存活率、蛋白酶活性有显著性影响（P<0.05）；真空封装方式菌体的存活率优于普通封装（P<0.05）。确定了乳杆菌、双歧杆菌、球菌菌粉的最佳水分、水分活度的质量控制指标、贮存温度及封装方式，保证益生菌菌粉储存过程中的存活率，为益生菌厂家的菌粉质量控制标准的制定及其应用提供指导。

鸡 BMP15 基因克隆、表达模式及启动子活性分析

杨岚, 张晨曦, 樊学伟, 王阳光, 王春秀, 李文婷

2023, 39(4): 304-312. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1224

摘要 ( 242 )

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为了解鸡骨形态生成蛋白15（bone morphogenetic protein 15, BMP15）基因的功能、结构及启动子活性区域，探究该基因的转录调控机制。通过RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术克隆鸡 BMP15 基因cDNA全长序列，生物信息学分析其编码蛋白的性质及结构。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测鸡 BMP15 基因在不同组织中的表达情况，双荧光素酶报告系统确定该基因的核心启动子区。结果表明，鸡 BMP15 基因存在一个长度为1 865 bp的转录本，编码350个氨基酸，其遗传距离与火鸡最近。该蛋白为水溶性蛋白，其结构主要由无规则卷曲构成；存在信号肽区域，无跨膜结构域。构建的组织表达谱结果表明，BMP15 基因在鸡的卵巢组织和颗粒细胞中表达极显著（P<0.01）。双荧光报告结果显示，BMP15 基因启动子-153 - -1 bp为核心区域。为进一步确定 BMP15 基因功能及探究其转录调控机制奠定基础。

2023, 39(4): 313-313.

摘要 ( 95 )

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