生物技术通报

微生物单细胞分离方法研究进展

张坤, 闫畅, 田新朋

2023, 39(9): 1-11. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1506

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自然界中大多数微生物处于未培养状态，被称为 “微生物暗物质”。随着微生物单细胞分离方法的不断更新，利用新技术、新方法应对微生物纯培养的挑战获得了重要进展，这些新的分离及培养策略对推动微生物资源学的发展具有重要意义。尽管宏基因组学和基因组学数据相关成果日益增多，但微生物单细胞的分离与培养对于系统研究微生物的生态功能、遗传进化等仍至关重要。本文主要概述了目前使用的或正在研发的膜扩散培养法、微流控分选、荧光激活细胞分选、单细胞拉曼分选、光镊技术、显微操作技术等单细胞分离技术的原理与应用，及其在微生物单细胞分离和培养方面的优点与不足，同时展望了这些单细胞分离技术未来的发展和应用前景。

化学蛋白质组学在天然产物分子靶标鉴定中的应用

周璐祺, 崔婷茹, 郝楠, 赵雨薇, 赵斌, 刘颖超

2023, 39(9): 12-26. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0188

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绿色新农药的开发和利用有利于农业的可持续发展，基于天然产物进行活性先导发现及作用机制研究是重要的新农药创制策略，然而其作用靶标和作用机制难以确定，阻碍了其在新农药中的应用。因此发现化合物新靶点对于新农药创制来说是一项既重要又艰巨的任务。化学蛋白质组学作为后基因组时代的新技术，目前已经成为研究药物靶点的重要手段之一。本文对基于化学蛋白组学的化合物作用分子靶点发现方法和典型案例进行探析，介绍这些技术的主要原理、应用以及各自的优点和局限性，旨在阐述基于化学蛋白质组学发现药物作用靶标的最新方法，并为天然产物靶点及新农药创制研究提供参考。

基于杨木（Populus sp.）的二代燃料乙醇技术研究进展

徐发迪, 徐康, 孙东明, 李萌蕾, 赵建志, 鲍晓明

2023, 39(9): 27-39. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0121

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木质纤维素类生物质作为一种廉价且储量丰富的可再生原料，可通过预处理、酶解和微生物发酵等过程转化为纤维素燃料乙醇，近几十年来受到世界各国的广泛关注。杨木是一种人工广泛种植的速生硬木，主要用于造纸工业，而伴随产生大量枝桠等废弃物。因其富含纤维素和半纤维素组分，被认为是纤维素乙醇生产的优良木质纤维素原料。聚焦于杨木在纤维素乙醇生产中的应用，介绍了杨木的组成及结构特点，重点综述了杨木在预处理技术、预处理原料的酶解、微生物发酵等方面的研究进展。最后，归纳总结了限制杨木在纤维素乙醇应用中的技术障碍及困难，进而分析提出了相应解决对策并展望了其应用前景。

基于CRISPR/CasX介导的水稻基因组编辑技术的建立

李雪琪, 张素杰, 于曼, 黄金光, 周焕斌

2023, 39(9): 40-48. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0413

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Cas蛋白作为核酸酶发挥其切割活性需要识别特定的PAM序列，如SpCas9识别NGG PAM位点，LbCas12a识别TTTV PAM。已挖掘到新的能够识别TTCN PAM序列的蛋白—CasX蛋白，扩展了基因组编辑技术的编辑范围。本研究利用CasX的两个衍生型蛋白PlmCasX和DpbCasX，建立基于CRISPR/CasX介导的水稻基因编辑系统。通过PEG介导的水稻原生质体瞬时表达分析其编辑活性发现，PlmCasX和DpbCasX两个蛋白能够对水稻内源基因OsCPK16实现有效编辑。后通过水稻稳定遗传转化进一步验证，在TTCA PAM识别位点，DpbCasX蛋白对水稻内源基因OsCPK21的编辑效率为17.5%，PlmCasX蛋白对水稻内源基因OsCPK21的编辑效率为66.07%；在TTCG PAM识别位点，PlmCasX蛋白对OsCPK4的编辑效率为23.21%，而DpbCasX蛋白不能实现有效的基因编辑。并且基于MIDAS方法对PlmCasX蛋白的优化并不能提高其编辑活性。本研究证明了CRISPR/CasX系统在水稻中具有编辑活性，且其能识别TTCR PAM这一特性，扩大了基因编辑技术在水稻中的应用范围。

谷氨酸棒杆菌中胞嘧啶碱基编辑工具的PAM拓展

刘佳慧, 刘叶, 花尔并, 王猛

2023, 39(9): 49-57. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0106

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碱基编辑是一种新兴的基因组编辑技术，具有不产生双键断裂、不依赖同源重组且不需要添加外源模板的优势，在真核及原核生物中得到了广泛的开发与应用。为了进一步扩展碱基编辑技术在谷氨酸棒杆菌中的基因组覆盖范围，本研究将3种PAM限制较为宽松的新型Cas9突变体应用于胞嘧啶碱基编辑工具中，分别为近乎PAMless的SpRY突变体（NRN>NYN PAM）、SpG突变体（NGN PAM），以及ScCas9⁺⁺蛋白（NNG PAM），实现对碱基编辑工具的PAM拓展。结合SpRY突变体的碱基编辑系统展示出了更宽松的PAM识别，除对CAT、CAC、TAA PAM的位点完全没有编辑外，对其他NRN种类的PAM位点均出现了不同程度的识别，但整体编辑效率低，难以推广应用；结合SpG突变体的碱基编辑系统可实现对所有NGN种类 PAM位点的编辑，且编辑效率优于SpRY突变体，但对NGG PAM位点的编辑，相比原始Cas9蛋白，编辑效率下降9.3%-55.9%；结合ScCas9⁺⁺蛋白的碱基编辑系统，除对TCG、CTG PAM的基因组位点没有编辑外，可实现对其他测试NNG PAM的基因组位点编辑，大部分位点基因组编辑效率均较高，最高可达100%。本研究的开展不仅有助于碱基编辑工具在谷氨酸棒杆菌中覆盖更多的基因组位点，同时也为其他基于CRISPR/Cas系统的基因组编辑工具的PAM拓展提供有力的参考。

多菌种联用发酵燕麦麸皮工艺优化及发用功效评价

张岳一, 兰社益, 裴海闰, 封棣

2023, 39(9): 58-70. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0163

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为开发燕麦麸皮的综合利用价值，本研究采用单因素和正交试验法，优化了多菌种联用发酵法共提取燕麦麸皮β-葡聚糖和燕麦多肽的工艺条件，并对发酵提取液的抗氧化能力、抑菌性和应用于发用化妆品的效果进行评价。通过对发酵过程中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）与地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）活菌数的测定，确定了适合燕麦麸皮发酵的最优发酵组合为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌与酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）联用，接种比7∶3∶5。以多肽与β-葡聚糖综合得率为评定指标，通过单因素试验与四因素三水平正交试验，确定最佳发酵工艺条件为料液比1∶7.5、温度30℃、接种量2%、发酵时间42 h，β-葡聚糖和燕麦多肽得率分别为5.98%和16.21%。燕麦麸皮发酵液的DPPH、ABTS和羟自由基清除率分别为89.00%、99.50%和93.01%，IC₅₀分别为89.35、1.315和91.26 mg/mL。此外，发酵液对大肠埃希菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄链球菌（Staphylostreptococcus aureus）和马拉色菌（Malassezia furfur）具有抑制效果，最小抑菌浓度分别为12.5、25和12.5 mg/mL。发酵提取液在增加发丝光泽度、修护毛鳞片、改善干梳理性、增加α-角蛋白还原能力方面均有显著效果。综合3种提取工艺的目标活性物质含量的检测及功效评价，实验发现发酵提取工艺相较于热提取法与酶解提取法，对β-葡聚糖与多肽的综合提取效率提升，且在抗氧化、抑菌、修护毛鳞片与还原角蛋白功能上有更高的活性，为燕麦麸皮在发用化妆品领域的应用提供依据。

一株高效溶磷产红青霉培养条件优化及其溶磷特性

赵光绪, 杨合同, 邵晓波, 崔志豪, 刘红光, 张杰

2023, 39(9): 71-83. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0268

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为了减少农业生产中化学肥料的使用，本研究利用无机磷培养基对富磷的茶树（Camellia sinensis L.）根际微生物进行筛选，获得一株对磷酸三钙具有高效降解能力的真菌菌株JL-1，经鉴定为产红青霉（Penicillium rubens）。通过检测菌株JL-1在溶磷过程中发酵液的pH值、磷含量和有机酸含量变化发现，该菌株在无机磷培养基中，发酵液pH值与葡萄糖酸含量、pH值与磷含量以及葡萄糖酸与磷含量分别呈显著负相关、显著负相关和显著正相关，且在电子显微镜下观察到磷酸三钙颗粒表面存在被侵蚀痕迹，深入分析发现菌株JL-1通过分泌葡糖糖酸实现侵蚀磷酸三钙与溶磷的目的。通过单因素试验、Plackett-Burman设计试验、最陡爬坡试验和中心组合试验等一系列试验对培养条件进行优化发现，菌株JL-1溶解磷酸三钙的最佳碳源和氮源分别是葡萄糖和硫酸铵。葡萄糖含量、磷酸三钙含量和温度是影响菌株JL-1溶磷能力的主要因素，在葡萄糖29.8 g/L，磷酸三钙7.1 g/L，温度31.9℃的条件下，菌株JL-1在无机磷培养基中的溶磷能力达到最佳，溶磷量达到1 194.15 mg/L，是初始值的近3倍。在缺磷土壤中，该菌株能显著促进小麦（Triticum aestivum L.）生长，其根长、株高和总鲜重分别提高57.9%、36.4%和42.9%，进一步说明产红青霉JL-1具有良好的解磷、促生功能。菌株JL-1优良的溶磷特性与溶磷能力为其在生物肥料方向的开发和应用提供了参考。

乳酸乳球菌生产2'-岩藻糖基乳糖的途径构建及发酵培养基优化

程亚楠, 张文聪, 周圆, 孙雪, 李玉, 李庆刚

2023, 39(9): 84-96. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0149

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2'-岩藻糖基乳糖（2'-fucosyllactose, 2'-FL）是一种含量最丰富的人乳寡糖，微生物全细胞合成是生产2'-FL的重要方法。乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）作为一种可直接用于乳制品的食品级微生物，目前还没有用于生产人乳寡糖的报道。首先，在两种常用L. lactis底盘NZ3900和NZ9000中利用含有基因fkp、futC、lacF的重组质粒pNZ8148-2f构建2'-FL补救合成途径，在添加10 g/L岩藻糖和5 g/L乳糖的发酵培养基中，测得2'-FL的摇瓶产量分别为0.16 g/L与0.4 g/L，结合对二者生长状况等综合分析，选取NZ9000作为优势底盘。然后，在NZ9000中构建2'-FL从头合成途径，利用同源重组技术并借助L. lactis中特有的敲除整合载体pNZ5319，在敲除非必需基因upp的同时将基因manA、manB、gmd和wcaG整合到染色体上，借助载体pNZ8148-1将基因manC、futC和lacF以质粒的形式引入到细胞中，同时利用不同启动子P32、Pnis对酶的表达水平进行组合调控。获得最优菌株NZ9000 6，在添加20 g/L葡萄糖和5 g/L乳糖的发酵培养基中，测得2'-FL的摇瓶产量为0.28 g/L。最后，在发酵培养基中对氯化高铁血红素、胰蛋白胨和酵母粉的浓度进行了优化，在添加2.5 μg/mL氯化高铁血红素、15 g/L胰蛋白胨、6 g/L酵母粉时2'-FL的摇瓶产量达到1.58 g/L，为相关报道的较高水平。该研究证实了L. lactis合成2'-FL的可行性，为2'-FL的生产提供了新思路。

固定化脂肪酶的创制及其在乙酸肉桂酯无溶剂制备中的应用

陈金行, 张逸, 张军涛, 未本美, 王宏勋, 郑明明

2023, 39(9): 97-104. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0028

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采用模板法结合辛基（C8）表面修饰制备疏水有序介孔SiO₂载体（OMS-C₈），在此基础上制得固定化脂肪酶（CSL@OMS-C₈），成功应用于乙酸肉桂酯的无溶剂酶法制备。利用扫描电镜（SEM）、透射电镜（TEM）、N₂-吸附脱附、傅里叶红外（FTIR）对载体材料和固定化酶进行表征。结果显示，OMS具有整齐有序的介孔结构，比表面积达149.9 m²/g，平均孔径为15 nm。经过疏水改性后，接触角从20°提高到120°。优化获得了乙酸肉桂酯的最佳反应条件为温度50℃，肉桂醇与乙酸乙烯酯的摩尔比1∶5，固定化酶添加量2 g/L，反应时间2 h，转化率达到96.6%。催化剂经过5次重复使用肉桂醇的转化率仍能达到80%。

转录组分析转录因子AtbHLH68调控细胞壁发育的分子机制

林红妍, 郭晓蕊, 刘迪, 李慧, 陆海

2023, 39(9): 105-116. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0091

摘要 ( 201 )

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细胞壁是植物细胞特有的结构，在参与形态建成、水分和营养物质运输以及抵御生物和非生物胁迫中发挥重要作用。前人研究表明AtbHLH68作为bHLH蛋白的第10亚家族成员，在拟南芥茎维管组织中表达。为探究其在细胞壁发育方面的分子机制，本研究建立了雌二醇诱导pER8-AtbHLH68拟南芥表达系统，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）结果显示，10 μmol/L雌二醇处理4 h能够有效诱导AtbHLH68的表达，并且随着诱导时间的增加AtbHLH68的mRNA水平进一步积累，处理8 h后达到对照组29倍。利用转录组测序分析得到了在拟南芥茎中AtbHLH68诱导表达后产生的差异基因。与对照组相比，10 μmol/L雌二醇处理8 h后，共得到差异基因2 334个，其中831个基因显著上调，1 503个基因显著下调。显著富集的GO词条主要与细胞壁组分、防御响应、果胶修饰与降解以及激素响应有关。KEGG分析表明DEGs参与了果胶修饰或木质素生物合成代谢等过程。这些结果表明参与以上过程的差异基因可能被AtbHLH68直接或间接调控，从而导致拟南芥茎细胞壁组分相关基因表达量的变化。该研究为阐明转录因子AtbHLH68在细胞壁发育中的分子机制提供了理论依据。

利用酵母双杂交系统筛选水稻中与OsCRK5互作蛋白

王子颖, 龙晨洁, 范兆宇, 张蕾

2023, 39(9): 117-125. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0090

摘要 ( 266 )

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水稻是重要的粮食作物，研究水稻生长发育调控机制可为水稻品种改良奠定理论基础。钙依赖蛋白激酶（calcium dependent protein kinases, CDPKs）是植物中重要的蛋白激酶，参与植物生长发育以及对环境反应的应答。水稻中的CRK5（CDPK-related kinase 5）在蛋白序列和结构上与CDPK高度同源。为进一步研究OsCRK5在水稻干旱反应中的功能，本研究利用酵母双杂交筛库技术筛选了OsCRK5的互作蛋白。首先将OsCRK5的1-1 332 bp片段克隆至pGBKT7载体中，获得诱饵载体pGBKT7-OsCRK5，经测序无误后，转化至酵母菌株Y2H Gold中。在营养缺陷培养基中观察到重组蛋白不具有毒性作用及自激活活性，同时利用Western blot分析重组蛋白的表达。进一步利用水稻cDNA文库筛选OsCRK5的互作蛋白，共得到77个阳性克隆。功能预测结果显示，互作蛋白涉及蛋白质合成、贮存和降解过程、转录调控、植物细胞生长和分裂过程、能量代谢和细胞代谢等方面的功能。最后，从阳性克隆中选取参与植物干旱胁迫应答的两个蛋白OsWR1和OsDi19-1，利用酵母双杂交和双分子荧光互补的方法验证其与OsCRK5的相互作用。研究结果为水稻抗旱的遗传改良奠定了基础。

水稻幼苗酵母单杂文库构建及LAZY1上游调控因子筛选

黄小龙, 孙贵连, 马丹丹, 闫慧清

2023, 39(9): 126-135. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0001

摘要 ( 197 )

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LAZY1通过促进生长素的横向极性运输来调控水稻分蘖角，形成紧密直立的株型，从而提高水稻产量。为了研究LAZY1表达的分子调控机制，本研究利用酵母单杂筛库技术筛选水稻LAZY1的上游调控因子。首先以水稻粳稻品种日本晴基因组DNA为材料，经PCR扩增得到LAZY1的启动子序列，接着连接到pHIS2构建诱饵载体，并转化到AH109酵母菌株得到pHIS2-LAZY1诱饵菌。同时以萌发3 d的日本晴幼苗为材料，采用SMART技术构建cDNA文库，再将纯化的cDNA文库和pGADT7-Rec共转化酵母菌株Y187获得酵母单杂文库菌，接着将上述诱饵菌和文库菌进行接合完成酵母单杂筛库，共筛选得到21个候选的上游调控因子，进一步对其中的转录因子多蛋白桥梁因子OsMBF1进行双荧光素酶实验验证，结果显示OsMBF1可在体内促进LAZY1的转录。本研究得到LAZY1的上游正调控因子OsMBF1，为揭示LAZY1介导的生长素极性运输和分蘖角决定的调控网络提供了理论基础，将有助于揭示水稻由散生变为直立生长的奥秘，具有重要的理论和实践意义。

小麦叶锈菌与小麦互作的酵母双杂交cDNA文库构建与应用

温晓蕾, 李建嫄, 李娜, 张娜, 杨文香

2023, 39(9): 136-146. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0251

摘要 ( 124 )

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为筛选小麦叶锈菌效应蛋白的互作靶标蛋白，解析效应蛋白干扰寄主的防御反应机制。本试验以小麦叶锈菌菌株13-5-28-1（JHKT）与感病品种Thatcher在0-12 d互作的供试样本为材料，利用SMART方法构建三框均一化的、用于筛选与小麦叶锈菌互作的小麦cDNA文库，采用同源重组的方法构建效应因子Pt34084重组诱饵载体pGBKT7-Pt34084，并以其为诱饵蛋白，利用共转化方法筛选互作的靶标蛋白。结果表明，构建的小麦叶锈菌与小麦互作的cDNA文库库容约1.05×10⁷ CFU/mL，滴度为1.2×10⁹ CFU/mL，平均插入片段大于1 kb，重组阳性率为100%，符合cDNA建库要求。构建的诱饵重组载体pGBKT7-Pt34084在SD/-Trp-His-Ade培养基中添加20 mmol/L 3-AT及400 ng/mL ABA可抑制其自激活性。利用该文库共筛选获得16个来自小麦及叶锈菌的不同候选互作蛋白，这些蛋白涉及植物代谢、激素信号转导、抗病反应等多个方面。预示Pt34084可通过多种渠道干扰寄主的防御反应，促进叶锈菌侵染。研究结果有助于解析小麦叶锈菌致病机理，为创造新的有效防控小麦叶锈菌策略奠定基础。

马铃薯StCIPK11的克隆及响应干旱胁迫分析

刘雯锦, 马瑞, 刘升燕, 杨江伟, 张宁, 司怀军

2023, 39(9): 147-155. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0062

摘要 ( 180 )

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明确马铃薯StCIPK11在响应干旱胁迫信号传导中的功能和作用机制，为深入研究StCIPK11响应马铃薯抗旱调控的分子机制提供理论依据。利用同源重组法和人工microRNA技术构建马铃薯StCIPK11过表达载体和干扰表达载体，通过根癌农杆菌介导法分别将其转入马铃薯栽培品种‘大西洋’中。RT-qPCR结果表明，过表达植株StCIPK11的表达量是非转基因植株（NT）的11.59和21.76倍，干扰表达植株StCIPK11干扰程度达到78%。经PEG模拟干旱胁迫，过表达植株叶片中丙二醛含量显著高于NT植株，脯氨酸含量、抗氧化酶（超氧化物歧化酶、过氧化物酶）活性均低于NT植株；StCIPK11干扰表达植株则表现出相反的趋势。StCIPK11参与了干旱胁迫应答过程，StCIPK11干扰表达可以降低马铃薯植株对水分胁迫的敏感性。

抗、感品种棉花根系分泌物对尖孢镰刀菌生长及基因表达的影响

娄慧, 朱金成, 杨洋, 张薇

2023, 39(9): 156-167. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0284

摘要 ( 140 )

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为探究抗、感品种棉花根系分泌物对尖孢镰刀菌生长及基因表达的影响，以棉花感病品种新海14号（XH-14）和抗病品种新海41号（XH-41）为材料，将棉花根系分泌物与尖孢镰刀菌（F327）共培养，观察尖孢镰刀菌的生长；取培养0、6、12、24和48 h样本，进行RNA-seq。结果表明，与XH-41根系分泌物处理的菌落相比，XH-14根系分泌物处理的菌落生长速率快、孢子萌发率高、产孢量显著增加。GO（gene ontology）分析发现，XH-14根系分泌物处理的差异表达基因（differentialy expressed genes, DEGs）主要富集在氨基酸转运、脂肪酸生物合成过程、膜的组成部分、离子通道活性；XH-41根系分泌物处理的DEGs主要富集在跨膜转运、三羧酸循环、膜的组成部分、ATP酶活性。KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）分析发现，XH-14根系分泌物处理的DEGs主要富集在TCA循环、类胡萝卜素生物合成、谷胱甘肽代谢、核黄素代谢等代谢通路；XH-41根系分泌物处理的主要DEGs富集在碳代谢、其他聚糖降解、脂肪酸代谢、ABC运输工具等代谢通路。综合分析结果，获得24个与细胞壁降解酶相关的基因，其中感病品种棉花根系分泌物处理6 h下“水解酶活性、水解O-糖基化合物”基因富集数目最多。研究结果为筛选棉花枯萎病菌潜在的关键致病基因奠定基础，为棉花枯萎病的防控提供理论依据。

启动子RD29A对转雪莲SikCDPK1基因烟草抗逆性的影响

刘玉玲, 王梦瑶, 孙琦, 马利花, 朱新霞

2023, 39(9): 168-175. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0150

摘要 ( 121 )

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探究逆境诱导启动子RD29A对转雪莲SikCDPK1基因烟草抗逆性的影响，为SikCDPK1基因在植物遭遇低温、干旱时更好发挥作用奠定基础。采用基因重组技术构建RD29A启动子驱动SikCDPK1基因的植物表达载体，通过农杆菌介导法遗传转化烟草，分别观察、测定和比较分析低温、干旱处理后，RD29A∷SikCDPK1转基因烟草、35S∷SikCDPK1转基因烟草和非转基因烟草的表型、POD活性、SOD活性、叶绿素含量、MDA含量和相对电导率的差异。结果显示，干旱和低温胁迫后，RD29A∷SikCDPK1转基因烟草的生长状况优于35S∷SikCDPK1转基因烟草，更优于非转基因烟草；同时，RD29A∷SikCDPK1转基因烟草的POD活性、SOD活性、叶绿素含量显著高于35S∷SikCDPK1转基因烟草，极显著高于非转基因烟草；但MDA含量与相对电导率显著低于35S∷SikCDPK1转基因烟草，极显著低于非转基因烟草。表明启动子RD29A可通过减缓叶绿素降解速率、提高抗氧化系统酶活性、减小膜通透性，使转基因烟草表现出更强的干旱、低温耐受性。

基于极端混合池（BSA）全基因组重测序的羽衣甘蓝白色叶基因定位

王腾辉, 葛雯冬, 罗雅方, 范震宇, 王玉书

2023, 39(9): 176-182. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0275

摘要 ( 141 )

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筛选羽衣甘蓝白色叶形成相关的关键基因和位点以及心叶颜色性状的遗传规律，以羽衣甘蓝红叶亲本WR、白叶亲本WB及其构建的F₂分离群体为试验材料，从F₂群体中挑选红叶和白叶植株各20株，分别构建2个DNA混合池，对子代混合池和亲本分别开展50×和20×覆盖深度的全基因组重测序，定位白叶性状关联区间，并根据基因注释信息预测候选基因。结果表明，重测序获得3 987 718个单核酸多态性（SNP）标记，获得位于第2、3和9染色体的8个显著关联区间，根据基因注释和功能分析，筛选到8个候选基因（Bol030253、Bol029431、Bol012077、Bol007709、Bol030318、Bol030235、Bol030286和Bol005195）。将8个基因确定为羽衣甘蓝白叶的候选基因，可能在羽衣甘蓝叶片颜色形成过程中起着重要作用。

核桃JrSnRK1α1.1调控种子油脂合成与积累

王贵芳, 姚元涛, 许海峰, 相昆, 梁家慧, 张淑辉, 王文茹, 张明娟, 张美勇, 陈新

2023, 39(9): 183-191. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0043

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为探讨核桃SnRK1蛋白激酶对种子油脂合成与积累的调控机理，本研究以‘香玲’核桃种仁cDNA为模板，克隆分离得到SnRK1蛋白激酶α亚基的一个编码基因JrSnRK1α1.1，其CDS序列全长为1 539 bp，编码512个氨基酸。构建植物超表达重组载体PBI121- JrSnRK1α1.1，转化并获得了超表达核桃JrSnRK1α1.1基因的拟南芥株系J-1、J-2和J-3。与野生型拟南芥相比，转基因植株表型无明显差异。采用数码显微镜对转基因拟南芥株系种子进行观察，结果显示，相对于野生型，转基因拟南芥株系的种子瘪小、表皮皱缩；株系J-1、J-2和J-3瘪小种子占比分别为43.69%、60.80%和45.87%，显著高于野生型WT（8.43%）；种子的千粒重比野生型降低了27.95%-29.32%，差异显著；种子平均粒长和粒宽也显著变小；因此JrSnRK1α1.1可能参与了种子的发育进程。进一步对种子的粗脂肪含量进行测定，结果表明，与野生型相比，转基因拟南芥株系J-1、J-2和J-3的种子粗脂肪含量显著下降，分别比野生型下降9.66%、23.86%和17.61%。荧光双分子试验结果表明，核桃JrSnRK1α1.1与油脂合成关键转录因子JrWRI1互作。综上所述，超表达核桃JrSnRK1α1.1对拟南芥植株生长发育影响不明显，显著影响了拟南芥种子的发育，负调控种子油脂的合成与积累过程。

类胡萝卜素降解菌株的原位筛选及其在雪茄提质增香中的应用

吴巧茵, 施友志, 李林林, 彭政, 谭再钰, 刘利平, 张娟, 潘勇

2023, 39(9): 192-201. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0258

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通过筛选可降解类胡萝卜素的烟草内生菌，并应用于国产雪茄烟叶发酵从而实现烟叶香韵和感官质量提升。首先，原位培养基中添加烟叶粉末模拟原位生长环境以富集烟叶内生菌，结合流式分选技术，从优质雪茄烟叶内生菌中筛选具有β-胡萝卜素降解能力的菌株；将菌株接种至国产雪茄烟叶发酵，检测发酵烟叶类胡萝卜素降解产物含量并进行感官评价。结果显示，共筛选获得21株内生菌对β-胡萝卜素的降解率超过50%，主要为农杆菌属、根瘤菌属、鞘氨醇杆菌属、肠杆菌属等。菌株C31、C11、H4能够增加烟叶香韵类型，明显改善烟叶香气质、香气量、杂气、刺激性等指标，发酵烟叶类胡萝卜素降解产物含量分别是对照的1.38、1.28、1.43倍，其中法尼基丙酮、香叶基丙酮、巨豆三烯酮的增加强化了烟叶焦甜香、花香、木香香韵。综上，原位筛选获得的3株类胡萝卜素降解内生菌C31、C11、H4能够较好地改善国产雪茄烟叶品质，可作为新型雪茄工业微生物制剂和特征香韵雪茄微生物制剂进一步开发应用。

不同抗性烟草品系Rubisco及其活化酶对赤星病胁迫的响应

杨志晓, 侯骞, 刘国权, 卢志刚, 曹毅, 芶剑渝, 王轶, 林英超

2023, 39(9): 202-212. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0278

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本研究以抗、感烟草品系JYH、CBH为试验材料，分析赤星病胁迫对光合作用和核酮糖-1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）、核酮糖-1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活化酶（RCA）活性及基因表达的影响。结果表明，胁迫9 d，JYH的光合作用及Rubisco、RCA活性、基因表达水平和蛋白含量受到明显抑制。赤星病胁迫显著降低CBH的光合作用及Rubisco、RCA活性和蛋白含量，Rubisco大、小亚基基因（rbcL、rbcS）、RCA基因（rca）的相对表达量也持续下降。JYH的Rubisco、RCA活性、基因表达水平和蛋白含量均显著高于CBH。相关性分析结果显示，P_n与Rubisco、RCA活性及基因表达量呈显著、极显著正相关。在赤星病胁迫下，JYH可维持较高的P_n与Rubisco、RCA活性，从而具有较强抗性。

枯草芽孢杆菌Ya-1对辣椒枯萎病的防治及其对根际真菌群落的影响

赵志祥, 王殿东, 周亚林, 王培, 严婉荣, 严蓓, 罗路云, 张卓

2023, 39(9): 213-224. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1457

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探究生防菌枯草芽孢杆菌Ya-1对辣椒枯萎病的防治效果，及对辣椒受尖孢镰刀菌侵染后根际真菌群落和多样性的影响。以枯草芽孢杆菌Ya-1为接种菌，探究了枯草芽孢杆菌Ya-1对辣椒枯萎病的防治效果，并通过高通量测序研究了接种前，接种后10 d，20 d时受尖孢镰刀菌侵染后辣椒根际真菌群落变化。与FOC处理（C）相比，Ya-1+FOC（D）在第10天和第20天的相对防治效果分别为77.93%和77.26%。同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1和辣椒枯萎病菌组真菌α多样性在10 d和20 d时真菌香农指数均高于接种辣椒枯萎病菌组。在进行处理后真菌群落组成发生了显著变化，同一时间点处理组和对照组真菌群落具有显著差异，接种辣椒枯萎病菌组和同时接种辣椒枯萎病菌和枯草芽孢杆菌Ya-1组也具有显著差异（P < 0.05）。各处理土壤优势真菌种群分别为子囊菌门、接合菌门、担子菌门。在10 d和20 d，接种病原菌（OTU_1）相对丰度在接种辣椒枯萎病原菌组和同时接种辣椒枯萎病菌组和枯草芽孢杆菌Ya-1组间具有显著差异，相比较接种辣椒枯萎病原菌组，OTU_1相对丰度降低，被孢霉菌（Mortierella）的相对丰度升高。相比较对照组，接种辣椒枯萎病菌处理后连接数减少，而在加入枯草芽孢杆菌Ya-1处理后，正连接数降低。枯草芽孢杆菌Ya-1处理对辣椒枯萎病有较好的防治效果，同时它也改变了接种病原菌辣椒根际真菌群落多样性和结构，降低了真菌群落的复杂度和根际土壤中病原菌的丰度。

生防菌株DZY6715在不同生长期的代谢差异分析

周嫒婷, 彭睿琦, 王芳, 伍建榕, 马焕成

2023, 39(9): 225-235. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0148

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特基拉芽孢杆菌DZY6715是对油茶炭疽菌有较好抑制作用的生防菌，为明确该菌株在生长前期和生长后期的差异代谢物质及其调控功能。以菌株DZY6715的生长曲线为基础，先利用平板对峙法测定该菌株在生长前期和生长后期对油茶炭疽菌的抑制活性，然后通过非靶代谢组学技术，对这两个时期的发酵液进行生物信息学分析。结果表明，菌株生长前期的抑菌活性弱于生长后期，差异代谢物共注释到32条通路，前20条富集到183个差异代谢物，其中潜在重要性高的代谢通路有5条，富集的差异代谢物有84个，27种，涉及的代谢物以氨基酸和有机酸为主，并伴有诺氟沙星、N-乙酰-d-氨基葡萄糖、腺苷、苯酚等物质。另外，生长前期氨基酸的总表达量显著高于生长后期，而有机酸及其他差异代谢物在生长后期的总表达量则明显高于生长前期。因此，本文认为氨基酸主要参与细胞结构的构建，同时附有抑菌功能，而有机酸、诺氟沙星、腺苷等更多的是作为抵抗胁迫过程的重要调节剂。

盐碱胁迫诱导的猴樟酵母cDNA文库构建及CbP5CS上游调控因子筛选

韩浩章, 张丽华, 李素华, 赵荣, 王芳, 王晓立

2023, 39(9): 236-245. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0022

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盐碱土壤环境是限制猴樟引种推广的主要因素，脯氨酸是植物适应盐碱胁迫过程中主要的渗透调节物质，筛选并鉴定出调控脯氨酸合成的转录因子对于猴樟耐盐碱分子机理研究具有重要意义。以猴樟实生苗为材料，在水培培养基础上，采用0 mmol/L和10 mmol/L的Na₂CO₃溶液分别进行处理，选取处理6 h、48 h的根系组织，提取总RNA，构建盐碱胁迫诱导的猴樟根系酵母cDNA文库；以猴樟根系总DNA为模板，克隆CbP5CS启动子序列，采用Y1H酵母单杂交技术筛选出与CbP5CS启动子存在互作的蛋白，并通过高通量测序技术鉴定出调控猴樟脯氨酸合成的转录因子。结果表明，所构建的cDNA文库库容为4.88×10⁷CFU/mL，总克隆数为9.76×10⁷ CFU，文库插入片段平均长度在1 000 bp左右，cDNA片段重组率为100%，符合酵母杂交试验的要求。克隆出的CbP5CS启动子序列长2 012 bp，成功构建出诱饵质粒pHIS2-CbP5CS，利用共转化方法从文库中筛选到31个与CbP5CS互作的EST序列。经酵母回转验证，31个EST序列均与CbP5CS存在互作。经NGS测序和BLAST比对搜索，获得6个转录因子基因，分别为锌指CCCH结构域蛋白25异构体 x1、AtbHLH104、转录因子 TFIIIC、RING/FYVE/PHD锌指超家族蛋白、GATA型锌指转录因子家族蛋白、AtbHLH96。以上结果为进一步研究植物脯氨酸代谢响应盐碱胁迫的分子机制奠定基础。

NH₃和H₂S降解功能菌的分离鉴定及降解特性研究

江海溶, 崔若琪, 王玥, 白淼, 张明露, 任连海

2023, 39(9): 246-254. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1202

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为了减少厨余垃圾堆放时恶臭气体的排放，本研究利用富集驯化、定性初筛和定量复筛法从厨余垃圾中分离筛选到2株对NH₃和H₂S均具有高效降解作用的菌株CN5和CS2。通过16S rDNA序列分析，分别鉴定为肠球菌属（Enterococcuss sp.）和假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。通过单因素实验，确定两株菌的最佳除臭条件为:培养温度为35℃、pH为7、碳氮比25∶1、碳源为蔗糖、氮源为氯化铵，对NH₃和H₂S的降解率均能达到85%左右。菌株CN5和CS2在2∶3的混合状态下生长状况最好，pH值稳定，OD₆₀₀最大值为1.342。通过氨氮含量和硫酸盐含量测定实验发现，最终氨氮含量为50.5 mg/L，菌剂对氨氮降解率为85.3%；硫酸盐含量为302.7 mg/L，菌剂对硫酸盐生成率为89.2%。结果表明，从厨余垃圾中筛选得到的2株菌对NH₃和H₂S具有良好的降解能力，且两菌株相互之间具有协同作用。

枯草芽孢杆菌BBs-27发酵液性质及脂肽对黄色镰刀菌的抑菌作用

苗永美, 苗翠苹, 于庆才

2023, 39(9): 255-267. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0086

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枯草芽孢杆菌BBs-27从药用植物石豆兰中分离，对黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）具较强抑菌活性。为进一步掌握发酵液中抑菌成分及抑菌机制，对发酵液耐酸碱、紫外照射、酶解等特性进行研究，在此基础上，借助LC-MS技术对发酵液中脂肽类型进行鉴定，并从形态、生理和转录组3个层面上分析抑菌机制。结果表明，发酵液pH=6时抑菌活性最强，pH<4或>10时活性明显降低。超过10 min紫外照射活性显著降低。易被其他3种蛋白酶水解，但对胃蛋白酶不敏感，推测抑菌物是以脂肽类为主且包含少量蛋白质，LC-MS分析证实，抗菌肽主要是伊枯草菌素和丰原素两大类。SEM结果显示，脂肽处理下菌丝卷曲、畸形、异常膨大。脂肽对菌丝体内SOD、POD、CAT及可溶性蛋白、可溶性糖均有显著影响，5项生理指标均与抑菌率极显著相关。以禾谷镰刀菌基因组为参照组装，样品中Q20>96%，Q30>91%，GC含量在52.27%-52.87%，比对率>78%。共筛选出712个DEGs，包括393个上调基因和319个下调基因。Go功能注释分类显示，712个DEGs主要涉及到6个生物学过程、11个细胞组分和12个分子功能。KEEG分析显示，DEGs显著富集在碳水化合物、脂、氨基酸、辅助因子和维生素代谢等途径，筛选出了重要的脂肽响应基因GAO、CHS3、MPG1、FGSG_02016、IPDH、ODC，它们通过干扰细胞壁、细胞膜、氨基酸、抗氧化酶的正常合成来影响菌体生长。该结果为进一步开发和利用安全微生物农药奠定理论基础。

多基因同步调控结合高通量筛选构建高产L-苯丙氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株

薛宁, 王瑾, 李世新, 刘叶, 程海娇, 张玥, 毛雨丰, 王猛

2023, 39(9): 268-280. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0280

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L-苯丙氨酸（L-Phe）是重要的食品及医药中间体，但由于其生物合成途径较长且调控机制复杂，仅依靠质粒或者周期漫长的基因组逐轮改造，难以实现各个模块之间的通量平衡，在一定程度上限制了其产量的进一步提升。本研究将L-Phe生物合成途径中的7个携带组成型启动子PF11及核糖体结合位点（ribosome binding site, RBS）为GGGGGGGG的关键基因ppsA、tktA、aroF^fbr、aroE、aroL、pheA^fbr和tyrB，整合到谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）的基因组中；利用课题组前期研发的基于CRISPR/Cas系统和胞苷脱氨酶的无模板基因表达调控技术（base editor-targeted and template-free expression regulation, BETTER），对每个关键基因的RBS进行同步编辑，生成富含G/A的RBS突变文库；利用前期开发的荧光蛋白型L-Phe生物传感器结合液滴微流控系统（droplet microfluidics）对RBS突变文库进行高通量筛选。最终，从大约7万个RBS突变文库中筛选到4株L-Phe产量提升不同程度的突变菌株，其72 h摇瓶发酵产量分别为2.06、1.30、4.42和7.44 mmol/L，相比对照菌株C.g-2（0.6 mmol/L）分别提高了2.43、1.17、6.37、11.40倍。利用碱基编辑器同时调节多基因的表达水平并筛选组合文库，可以为L-Phe工程育种提供一种可行策略。

杰氏棒杆菌L-天冬氨酸α脱羧酶半理性改造及全细胞催化合成β-丙氨酸

刘浩, 马世杰, 周哲敏, 崔文璟

2023, 39(9): 281-290. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0085

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β-丙氨酸是多个药物合成的重要砌块，可以通过天冬氨酸α脱羧酶（PanD）催化L-天冬氨酸脱羧来合成，但普遍在用的PanD酶活性不高是制约全细胞催化合成β-丙氨酸的瓶颈。因此，本研究通过酶的挖掘，选择将杰氏棒杆菌来源（Corynebacterium jeikeium）PanD在Escherichia coli中异源表达。对杰氏棒杆菌来源PanD进行AlaphFold2建模和分子对接，采用Rosetta虚拟突变确定突变热点，结合薄层层析初筛和纯化后复筛，最终筛选到突变体L39A，其比酶活为13.45 U/mg，相比野生型酶的比酶活（9.6 U/mg）提升了1.4倍。酶学性质表征数据表明，野生型酶和L39A突变体最适pH均为6.5，且在pH 6.0-7.0 之间酶活性稳定；两者最适温度为55℃，但L39A热稳定性较野生型提高；突变体酶的催化效率比野生型提升了1.4倍。对突变体进行结构解析发现，39位取代为侧链基团更小的丙氨酸，亲水性增强，增加了关键催化氨基酸58位酪氨酸与其他氨基酸的相互作用，使活性中心周围的区域稳定性提高，从而提高了催化活性。全细胞催化数据表明，在OD₆₀₀=40的菌体浓度下，L39A在4 h能够转化70%的L-天冬氨酸，而野生型4 h仅能转化约50%，L39A在10 h能够转化90% L-天冬氨酸，在12 h能够完全转化1 mol/L的L-天冬氨酸，这种全细胞转化效率的提升在1.5 mol/L的底物条件下更加明显。本研究筛选到的突变体具有工业化应用潜力，建立了绿色、高效的β-丙氨酸生物合成法，为生物法大规模合成β-丙氨酸提供了重要的技术基础。

褪黑素缓解空肠黏膜上皮细胞氧化损伤的效果研究

康凌云, 韩露露, 韩德平, 陈建胜, 甘瀚凌, 邢凯, 马友记, 崔凯

2023, 39(9): 291-299. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0190

摘要 ( 114 )

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肠道黏膜氧化损伤与畜禽的生长发育和腹泻等疾病的发生密切相关，而褪黑素作为一种吲哚胺类化合物，具有明显抗氧化保护作用。为探究褪黑素对肠黏膜上皮细胞氧化损伤时的保护作用，本研究选取原代小鼠空肠黏膜上皮细胞，利用硫酸亚铁和过氧化氢处理建立氧化损伤模型，并通过添加不同浓度的褪黑素预处理上皮细胞，检测细胞损伤、氧化产物、抗氧化酶和炎性相关细胞因子的表达变化。结果发现，硫酸亚铁和过氧化氢处理后，黏膜上皮细胞明显受损，丙二醛含量显著增加、抗氧化酶表达水平降低。而褪黑素能明显减轻细胞氧化损伤程度、抑制丙二醛的产生并增加抗氧化酶的表达。同时，褪黑素还能显著减少炎性因子白介素-6的表达，并增加趋化因子白介素-8的表达。因此，褪黑素可以缓解自由基增加诱发的空肠黏膜上皮细胞氧化损伤，并能够减轻细胞损伤引起的炎症反应。

罗氏沼虾蜕皮周期中内分泌调控和蜕皮信号通路相关基因的表达分析

丁丽, 都婷婷, 唐琼英, 高权新, 易少奎, 杨国梁

2023, 39(9): 300-310. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0169

摘要 ( 137 )

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蜕皮是罗氏沼虾重要的生理过程，为了探究罗氏沼虾蜕皮周期中内分泌调控与蜕皮通路中相关基因在蜕皮周期中的表达模式，阐明罗氏沼虾蜕皮的分子调节通路。本研究测定了罗氏沼虾肝胰腺和血淋巴组织中蜕皮周期内蜕皮相关酶活性（谷氨酰胺合成酶，β-N乙酰氨基葡萄糖苷酶和几丁质酶）与蜕皮激素含量，并通过RT-qPCR分析了蜕皮信号通路中Mr-ETHR、Mr-FTZ-F1以及RXR、ECR和MIH基因在罗氏沼虾不同蜕皮周期内的表达模式。酶活测定结果表明，谷氨酰胺合成酶在血淋巴组织中活力高于肝胰腺组织（P<0.05）；β-N乙酰氨基葡萄糖苷酶在肝胰腺和血淋巴组织中蜕皮前期的活力远高于蜕皮后期（P<0.05）。在肝胰腺中几丁质酶在蜕皮后期活力显著高于其他时期（P<0.05）。肝胰腺和血淋巴组织中蜕皮激素含量在蜕皮间期最低，蜕皮后期达到最高，呈上升趋势。通过PCR扩增与测序验证获得了Mr-ETHR、Mr-FTZ-F1基因ORF全长序列，Mr-ETHR基因ORF全长1 173 bp，编码390个氨基酸；Mr-FTZ-F1基因ORF全长为1 206 bp，编码401个氨基酸。荧光定量结果表明Mr-ETHR、Mr-RXR和Mr-ECR在蜕皮后期表达量达到最高，而Mr-FTZ-F1在蜕皮前期表达量达到最高。Mr-MIH在蜕皮间期表达量达到最高，蜕皮后期表达量最低，呈下降趋势。聚类分析及相关性分析结果表明Mr-ETHR与Mr-RXR和Mr-ECR表达模式相近且呈极显著正相关（r=0.7030，P<0.01；r=0.8680，P<0.01），Mr-FTZ-F1和Mr-MIH表达模式相近且呈极显著正相关（r=0.6665，P<0.01），而Mr-FTZ-F1与Mr-ECR和Mr-ETHR呈极显著负相关（r=-0.8339，P<0.01；r=-0.6275，P<0.01）。研究表明罗氏沼虾的蜕皮过程受谷氨酰胺合成酶、β-N乙酰氨基葡萄糖苷酶和几丁质酶的调节，Mr-ETHR、Mr-RXR、Mr-ECR、Mr-FTZ-F1和Mr-MIH参与调控罗氏沼虾蜕皮过程，Mr-ETHR、Mr-RXR和Mr-ECR在蜕皮信号通路中起正向调节作用，而Mr-FTZ-F1和Mr-MIH起负调节作用。本研究结果为甲壳动物蜕皮信号通路下游基因的蜕皮调控机制研究提供了基础资料。

柠檬酸铁铵对悬浮HEK293细胞转染的影响机制探究

陈中元, 王玉红, 代为俊, 张艳敏, 叶倩, 刘旭平, 谭文松, 赵亮

2023, 39(9): 311-318. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0177

摘要 ( 164 )

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基于聚乙烯亚胺（polyethyleneimine, PEI）的悬浮人胚胎肾细胞（human embryonic kidney 293 cells, HEK293）转染技术前景广阔，但培养基组分会影响转染效率。简单的离心换液存在污染风险，且影响细胞状态。探究抑制转染效率的关键组分对转染过程的影响机制，有利于从根本上解决该问题。首先通过探究培养基中对转染效率具有潜在影响的组分确定关键组分柠檬酸铁铵（ferric ammonium citrate, FAC）的抑制作用，然后通过考察柠檬酸铁铵添加对细胞状态、PEI与DNA形成的复合物（PEI-DNA complex, PEI-DNA复合物）结合情况、目的基因表达情况的影响，分析其抑制转染效率的机制。结果表明，高浓度的柠檬酸铁铵对细胞转染存在明显抑制作用，且该抑制作用随着柠檬酸铁铵浓度的升高而逐渐增强。当柠檬酸根和铁离子同时存在时才会抑制细胞转染过程。过高浓度的柠檬酸铁铵使PEI-DNA复合物的粒径显著增加，复合物进入细胞更加困难，导致进入细胞的复合物数量减少，最终引起细胞转染效率的大幅下降。柠檬酸铁铵通过影响PEI-DNA复合物的大小限制DNA进入细胞，从而抑制PEI介导的悬浮HEK293细胞转染过程。控制转染时柠檬酸铁铵浓度在20 μmol/L内可解决其对转染过程的抑制作用。本研究深入认识了柠檬酸铁铵对PEI介导的悬浮HEK293细胞转染过程的影响及其机制，为悬浮HEK293细胞转染培养基的开发和理性设计提供有力参考。

2023, 39(9): 319-319.

摘要 ( 68 )

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