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2015年 第31卷 第12期    刊出日期：2015-12-19

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综述与专论

欧盟转基因生物安全检测技术现状及启示

吴刚,金芜军,谢家建,沈平,李文龙,宋贵文

2015, 31(12):  1-7.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.001

摘要 ( 258 )   HTML   PDF (1792KB) ( 957 )  

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为了了解欧盟转基因生物安全检测技术发展现状，提高我国转基因安全监管水平。本研究根据对欧盟8家转基因检测相关机构现状的调查和分析结果，阐述了转基因检测过程中的关键技术要点及欧盟的实施情况，具体包括抽样与制样方法，转基因检测方法的循环验证与参数要求，样品的检测策略与实验室环境要求，以及检测结果的表述与不确定度评估。并结合我国转基因生物安全检测发展现状，提出了开展检测方法的实验室联合验证和加强转基因定量PCR检测技术的研发和应用的建议。

植物醛脱氢酶在逆境胁迫中的研究进展

黄世平,曾幼玲

2015, 31(12):  8-14.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.002

摘要 ( 342 )   HTML   PDF (1461KB) ( 814 )  

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干旱、盐和病虫害等逆境胁迫已成为制约植物生长和作物产量的主要因素。植物在生长过程中进化出从形态到生理的一系列机制以缓解胁迫对自身的损害。逆境胁迫下醛类物质的富集会产生一系列的过氧化链式反应，危害细胞膜系统正常生理功能。过量的醛也会与蛋白质和核酸反应，破坏蛋白质和核酸的正常结构和功能，甚至直接导致植物死亡。植物体内醛脱氢酶基因(Aldehyde dehydrogenase，ALDH)在胁迫诱导条件下表达水平增加，大量累积的醛脱氢酶蛋白(ALDHs)将醛物质氧化成相应的羧酸，减少脂类物质的过氧化，参与到植物对生物及非生物的胁迫以及植物的发育调节。从ALDH的分类、功能及作用途径展开详细论述。

植物无融合生殖研究进展

贾宁,唐研耀,曾燕如,赵国淼,徐亚楠

2015, 31(12):  15-24.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.003

摘要 ( 313 )   HTML   PDF (1233KB) ( 611 )  

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无融合生殖是一种不发生雌雄配子核融合而产生种子的一种无性繁殖过程。有些无融合生殖产生的种子是其母本的克隆，可以保留母本的基因型，因此无融合生殖可用于杂种优势的固定。尽管无融合生殖具有潜在的应用价值，但其形成机理十分复杂，表现在无融合生殖有多种表现形式，且受控的途径多样，遗传机制复杂，至今尚无定论，研究方法也多种多样。对近年来无融合生殖研究方面取得的进展进行了概述，旨在为深入研究无融合生殖提供参考。

白蚁内源性纤维素酶基因资源研究进展

刘小琳,李志强,张丹丹

2015, 31(12):  25-33.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.004

摘要 ( 259 )   HTML   PDF (1238KB) ( 663 )  

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能源短缺是人类关注的焦点问题之一，而纤维素是自然界最为丰富的可再生资源。白蚁已进化出了独特而高效的纤维素消化系统，具有丰富的纤维素酶及其基因资源，因而，近年来白蚁内源性纤维素消化体系的重要性被逐渐认识，不断有内源性纤维素酶基因的研究报道。为了进一步推动有害白蚁控制新技术的研发，以及纤维素生物质新能源的应用探索，综述了白蚁内源性纤维素酶基因克隆、表达等研究进展。

脂肪氧合酶结构、分子改造与发酵研究进展

刘松,陆信曜,周景文,堵国成,陈坚

2015, 31(12):  34-41.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.005

摘要 ( 246 )   HTML   PDF (2697KB) ( 1260 )  

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脂肪氧合酶(EC 1.13.11.12)能专一催化氧化含有Z，Z-1，4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸，形成具有共轭双键的脂肪酸氢过氧化物，广泛应用于食品加工、化工、医药等领域。1932年首次在大豆中发现脂肪氧合酶以来，人们已在多种动植物组织和微生物中检测到脂肪氧合酶。广泛的来源使脂肪氧合酶结构亦呈现多样性，包括经典结构、融合结构、无N端Β-折叠结构及含锰离子结构等。为提高应用性能，定点突变和融合自组装双亲短肽等分子改造技术已用于提高脂肪氧合酶比酶活和热稳定性。基于发酵法的天然优势，构建高产脂肪氧合酶的重组菌成为近年研究的热点。总结了典型脂肪氧合酶的结构、分子改造及发酵法生产研究进展，旨为后续研究提供参考。

超长链单不饱和脂肪酸的生物合成和代谢工程

田德雨,王士安,王立昊,王家林,李福利

2015, 31(12):  42-49.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.006

摘要 ( 464 )   HTML   PDF (1908KB) ( 1425 )  

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超长链单不饱和脂肪酸(Very long chain monounsaturated fatty acid，VLCMFA)是指主碳链上碳原子数大于或等于20，有且只有一个不饱和双键的脂肪酸。VLCMFA较多的存在于各种油料植物及少数微藻中，目前发现的有鳕油酸(C20:1)、芥酸(C22:1)、神经酸(C24:1)和西门木烯酸(C26:1)。VLCMFA具有独特的工业用途和潜在药用保健功效。主要综述VLCMFA的生物合成和代谢工程研究进展，旨为应用开发提供参考。

膜蛋白原核表达的基因序列优化

王世山,陈艳可,杨俊

2015, 31(12):  50-55.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.007

摘要 ( 291 )   HTML   PDF (1225KB) ( 517 )  

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膜蛋白的结构与功能研究是当前的热点之一。目前获取膜蛋白的最主要途径是通过原核系统进行表达。但是膜蛋白在原核系统中表达水平相对较低，通过对基因序列进行优化促使膜蛋白正确高效表达是一项非常重要的技术手段。归纳了近些年来膜蛋白原核表达技术在基因序列优化研究上的最新进展，并从稀有密码子的优化、mRNA的稳定性与翻译起始、mRNA与核糖体行为、翻译的效率与膜蛋白的折叠4个方面对基因序列上影响膜蛋白表达的因素进行了总结，旨在为膜蛋白的原核表达提供一定的思路和参考。

肝癌转基因小鼠模型的应用研究进展

赵颖华,孙薇

2015, 31(12):  56-62.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.008

摘要 ( 267 )   HTML   PDF (1229KB) ( 801 )  

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肝细胞癌是全球范围内的恶性肿瘤，由于其进展迅速、易于复发转移，早期诊断和有效治疗一直是临床难题，对于肝癌的发病机制也亟待进一步阐明。利用基因工程手段构建的肝癌转基因小鼠模型，为肝癌发病机制研究和药物筛选提供了宝贵的研究材料。结合经典研究与近年进展，对常用肝癌转基因小鼠模型的构建方法、模型特点、特别是应用研究状况进行了分类介绍，并展望了未来发展的方向。

rAAV规模化包装系统的研究进展

占申标,唐明青,甘娜,曹苑青,李招发

2015, 31(12):  63-69.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.009

摘要 ( 318 )   HTML   PDF (2648KB) ( 2025 )  

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重组腺相关病毒(rAAV)作为唯一一种通过欧盟FDA认证的基因治疗载体，具有宿主范围广、转染效率高、非致病性、免疫原性低、能够长期表达外源基因的优点。随着以rAAV基因治疗临床试验的深入与扩大，传统rAAV包装系统产能不足的缺点逐渐凸显出来，急需可放大、易规模化的rAAV包装系统来解决现有的供需矛盾。鉴于此，在介绍传统rAAV包装系统的基础之上，着重阐述了杆状病毒昆虫细胞系法、酵母法以及痘苗病毒-腺病毒法，尤其对后者寄予厚望。旨在介绍几种较好的rAAV规模化包装方案，探讨其规模化制备的发展趋势。

技术与方法

基于HUVEC细胞表面ELAM-1表达的抗TNF-α抗体活性检测方法

陈坤,徐军,谢灿,周冬梅,杨彬,孙文正

2015, 31(12):  70-74.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.010

摘要 ( 378 )   HTML   PDF (2092KB) ( 645 )  

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旨在建立抗TNF-α单克隆抗体生物学活性测定的方法。肿瘤坏死因子TNF-α能刺激人脐静脉内皮细胞HUVEC表达黏附分子ELAM-1，通过抗TNF-α抗体中和TNF-α来抑制这种表达，从而建立该抗体的生物学活性检测方法，并进行验证。结果表明，建立抗体活性检测方法，验证方法的特异性较好、回收率为92.1%-102.1%，方法重复12次，RSD为7.66%。在50%-150%的线性良好，相关系数为0.99。该活性检测方法适于抗体体外活性的检测。

两步串联层析法纯化抗TNF-α 单克隆抗体

杨辉,杨彬,马旭通,孙文正,林小鹊,谭世杰

2015, 31(12):  75-80.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.011

摘要 ( 362 )   HTML   PDF (2520KB) ( 1043 )  

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旨在建立从重组CHO细胞发酵培养液中纯化抗TNF-α单克隆抗体的两步串联层析法。将含有抗TNF-α单克隆抗体的料液经两次离心、一步过滤的预处理后，用protein A填料捕获，阳离子填料Sourec30精细纯化。精细纯化过程中利用DoE的方法，采用CCF(Central composite face)设计，探讨了洗脱pH值及盐浓度对纯化的影响。纯化后的抗TNF-α单克隆抗体经HPLC以及毛细管电泳，检测其浓度、纯度以及多聚体含量。结果显示，亲和层析的最佳洗脱条件为pH4.0。通过DOE优化，为达到质量目标(回收率90%以上，纯度97%以上，多聚体0.3%)，筛选出最佳洗脱范围为0.05-0.13 mol/L NaCl以及pH5.7-6.0，选定pH6.0与0.10 mol/L NaCl作为Source洗脱条件，此时回收率94.3%，纯度97.3%，多聚体0.3%，其质量与参比制剂接近。

一种检测线粒体核酸酶靶向剪切活性的新方法

魏迪,高敬,池振奋,张癸荣,聂凌云

2015, 31(12):  81-90.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.012

摘要 ( 241 )   HTML   PDF (3501KB) ( 697 )  

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旨在建立一种简便检测线粒体DNA(mtDNA)核酸酶靶向剪切活性的方法。利用转基因技术，将一段含有两个靶向目标序列(T1、T2)的线粒体DNA序列随机整合到宿主基因组中，通过实时荧光定量PCR筛选单拷贝或低拷贝的单克隆转基因细胞株。将含有T1、T2的CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9质粒分别瞬时转染到所选细胞株中，靶向剪切核基因组，在靶向目标序列处造成DNA双链断裂，引发非同源末端连接修复机制，引入插入或缺失突变。观察测序峰图，证明两个靶向目标序列T1、T2均有剪切效率，且T1高于T2。建立了一种高效快速检测线粒体核酸酶靶向剪切活性的新方法。

农杆菌介导大豆子叶节影响因素的研究

杨晓倩,李桂兰,刘晨光,董秋平,张锴,乔亚科

2015, 31(12):  91-96.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.013

摘要 ( 224 )   HTML   PDF (2537KB) ( 422 )  

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为提高大豆遗传转化效率, 采用农杆菌介导遗传转化的方法，以大豆子叶节为外植体，研究共培养阶段浸染液浓度及外界培养条件(共培养温度和天数)和培养基添加物对转化效率和芽诱导率的影响。结果显示，浸染液OD₆₀₀=0.5的诱导率最高，共培养温度为24℃，共培养天数为10 d具有较高转化效率，共培养基中加入一定浓度的单壁碳纳米管(Single-wall carbon nanotube，NM)对诱导卡那霉素抗性不定芽有促进作用。PCR检测表明PHR1基因已整合到T1代大豆基因组中，初步证明可在大豆基因组中稳定遗传。

'易丰'女贞组培快繁技术体系的建立

孙英坤,代其林,张俊林,王劲,沈柏春,陈林敬,钱飞,吴光洪

2015, 31(12):  97-104.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.014

摘要 ( 237 )   HTML   PDF (2487KB) ( 360 )  

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以'易丰'女贞(Ligustrum lucidum'Yi Feng')当年新发半木质化带腋芽茎段为外植体，以芽繁芽的方式，建立了较为完善的可用于大规模工厂化生产的组培快繁技术体系。研究表明，最佳诱芽(启动)培养基为WPM+0.3 mg/L Kinetin(KT)+0.1 mg/L 6-Benzylaminopurine(6-BA)+0.05 mg/L 1-Naphthylacetic acid(NAA)，腋芽萌发率达到95.6%；最佳的增殖培养基为WPM+0.5 mg/L KT +1.0 mg/L 6-BA +0.05 mg/L NAA，平均增殖系数达到5.63；最佳的生根培养基为1/2WPM+1.5 mg/L 3-Indolebutyric acid(IBA)+0.1 mg/L NAA，生根周期约为20 d，生根率约为95.4%，炼苗移栽后成活率达到95%以上。建立的组培技术体系能够满足产业化生产的需要，得到的组培苗后代能够稳定地遗传亲本的优良变异性状。

研究报告

转基因甘蔗植株Southern杂交体系的优化

崔学强,张树珍,沈林波,冯翠莲

2015, 31(12):  105-109.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.015

摘要 ( 421 )   HTML   PDF (2061KB) ( 604 )  

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对甘蔗Southern杂交体系的优化，旨为转基因甘蔗Southern杂交鉴定分析提供参考。以转基因甘蔗为材料，就探针不同标记方法的比较、甘蔗基因组DNA的提取、基因组DNA酶切量、酶切时间及杂交过程等方面，对地高辛标记的Southern杂交技术进行了优化研究。结果表明，改良的CTAB法提取的甘蔗DNA能满足后期实验的要求；PCR法标记探针的效率较随机引物法标记探针的效率高，更适合用于Southern杂交；40 μg的DNA在400 μL酶切体系中，酶切10 h可获得良好的酶切效果；杂交温度40℃，杂交18 h，可获得清晰的杂交条带。

铅铬胁迫对小麦种子萌发及幼苗脯氨酸含量的影响

杨文玲,岳丹丹,李冠杰,刘莹莹,宁萌,刘莉,巩涛,王继雯,陈国参

2015, 31(12):  110-114.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.016

摘要 ( 280 )   HTML   PDF (1920KB) ( 585 )  

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旨在探讨铅铬胁迫对小麦的毒害效应以及对幼苗脯氨酸的影响。用不同浓度的铅铬溶液处理小麦，研究铅铬单一及复合胁迫对小麦种子萌发及幼苗脯氨酸含量的影响。结果表明，铅铬单一及复合胁迫均使得小麦种子萌发率降低，幼苗株高、根长降低，鲜物质量和干物质量减少。铅铬处理1 d后，各处理组小麦体内的脯氨酸含量较对照都有升高，尤其是复合胁迫下 100 mg/L Pb+100 mg/L Cr处理组，其小麦脯氨酸含量较对照升高了32.81%。铅铬处理3、5和7 d后，100 mg/L Cr、50 mg/L Cr、200 mg/L Pb+100 mg/L Cr、100 mg/L Pb+100 mg/L Cr这4个处理组的小麦脯氨酸含量较对照均显著升高，其它各处理组与对照相比差异不显著。铅铬胁迫抑制了小麦种子的萌发和幼苗生长，使得小麦体内脯氨酸含量升高，因此建议脯氨酸含量的变化可以作为监测植物铅铬胁迫的指标之一。

胡麻重组自交系脂肪酸含量的遗传分析

张琼,王利民,张建平,裴新梧,党占海

2015, 31(12):  115-121.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.017

摘要 ( 272 )   HTML   PDF (1473KB) ( 531 )  

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以油用品种陇亚8号和纤用品种阿里安为亲本构建的含有162个家系的胡麻重组自交系(Recombinant inbred lines，RIL)为研究材料，利用气相色谱法测定了该RIL群体的脂肪酸含量，对其遗传变异与分布特征进行了分析，并应用主基因+多基因混合遗传模型，对粗脂肪和5种脂肪酸含量进行了初步遗传分析，旨在为该RIL群体后续研究利用提供参考。结果表明，RIL群体的粗脂肪与脂肪酸含量存在广泛变异，表现超亲分离现象，其分布近似为正态分布，呈现数量性状连续变异的典型分布特征；运用主基因+多基因遗传模型分析结果表明，粗脂肪含量为3对等加性主基因遗传，主基因遗传率为85%；5种脂肪酸组成中，亚麻酸含量为2对重叠作用主基因遗传，主基因遗传率为36%；亚油酸含量为3对等加性主基因遗传，主基因遗传率为80%；油酸、棕榈酸和硬脂酸含量均表现为无主基因效应的多基因遗传；同时筛选出高油高亚油酸、高亚麻酸优良品系材料11份，为胡麻品质育种提供了新的材料。

樟芝挥发油的微波辅助双液相萃取及其抗菌活性研究

刘琳,陈慧黠,郭立忠

2015, 31(12):  122-130.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.018

摘要 ( 243 )   HTML   PDF (2349KB) ( 569 )  

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采用微波辅助石油醚/乙醇双液相萃取技术提取樟芝发酵液中的挥发油，并考察了其对7种皮肤癣菌的最低抑制浓度(MIC)。优化的提取条件为:乙醇体积浓度56%，石油醚体积浓度30%，固液比1:50，微波功率380 W，微波时间90 s。此时，挥发油的提取率为0.69%，真菌MIC为5-20 mL/L。微波辅助双液相萃取挥发油耗时短，提取率高，且获得的挥发油抗皮肤癣菌效果显著。

饲喂Bt水稻的褐家鼠肠道中cry1Ab/Ac基因和蛋白的残留检测

徐灯,耿丽丽,李宁,刘晓辉,卢凡,张杰

2015, 31(12):  131-137.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.019

摘要 ( 227 )   HTML   PDF (2625KB) ( 325 )  

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分别用含有转cry1Ab/Ac基因水稻和亲本水稻的饲料饲喂野生褐家鼠，旨在检测外源cry1Ab/Ac基因和蛋白在褐家鼠雌鼠雄鼠空肠、回肠、盲肠中的残留情况。检测结果显示，饲喂转基因水稻50 d和110 d的雌雄褐家鼠肠道3个部位中没有检测到cry1Ab/Ac基因残留，在体外消化实验中过量外源基因全长及片段在4 h后开始逐步降解，约12 h全部降解。3个肠道部位提取的蛋白进行ELISA和Western blot分析，结果显示肠道内容物中无Cry1Ab/Ac蛋白残留。因此外源基因和蛋白不会在饲喂了转基因水稻的野生褐家鼠肠道中残留。

棉铃虫Β-actin基因的克隆、表达及多克隆抗体制备

黄丽娜,程婷婷,王新绘,魏原杰,赵洁,李金耀,刘小宁

2015, 31(12):  138-145.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.020

摘要 ( 285 )   HTML   PDF (3428KB) ( 471 )  

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克隆获得了棉铃虫Β-actin基因，生物信息学分析表明，基因序列长1 131 bp，编码376个氨基酸，理论分子量为41.77 kD，理论等电点5.16。氨基酸序列与其他物种肌动蛋白比较有98%-99%的一致性，与鳞翅目的家蚕具有99%的一致性。分析棉铃虫Β-actin和小家鼠Β-actin的抗原决定簇位点，发现两者抗原表位有70.63%的一致性。同时原核表达、纯化了棉铃虫Β-actin蛋白，Western-blot结果表明表达正确。将纯化后的蛋白免疫ICR小鼠4次后，小鼠抗血清效价最高可达388 800，并且能与天然棉铃虫蛋白特异性结合。

九香虫醇提物对运动大鼠骨骼肌抗氧化酶活性及其基因表达水平的影响

高颖晖,周万红,窦鹏,戚一曼,王敦

2015, 31(12):  146-149.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.021

摘要 ( 241 )   HTML   PDF (1459KB) ( 425 )  

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旨在探讨补充九香虫醇提物对运动大鼠骨骼肌抗氧化酶活性及其基因表达水平的影响。对大负荷游泳训练大鼠补充剂量分别为各组平均体重的0.5、1.0和1.5 g/kg的九香虫提取物，在8周大负荷训练结束后测定骨骼肌抗氧化酶活性与表达水平。8周大负荷训练后，相比单纯大负荷运动组，补充九香虫提取物组SOD、CAT、GST三种抗氧化酶活性均显著增加，同时3种酶的编码基因表达水平也显著上调。说明补充九香虫提取物提高运动大鼠骨骼肌抗氧化酶系活性的机理之一是上调了编码基因的表达水平。

荷包猪SLA-DRB基因cDNA的克隆及分子进化特征分析

姜平,额尔敦木图,高凤山

2015, 31(12):  150-157.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.022

摘要 ( 243 )   HTML   PDF (2482KB) ( 425 )  

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旨在研究荷包猪SLA-DRB基因的分子特征，设计引物用RT-PCR扩增3头荷包猪DRB基因cDNA，并克隆至pMD18-T Vector，阳性克隆测序并做序列分析，分别进行同源性、分子进化及主要氨基酸变异位点分析。结果表明，成功从3头荷包猪中扩增得到SLA-DRB基因，分别命名为SLA-DRB-HB01-03，经序列测定后，证实cDNA全长为836 bp，其中1-801为ORF区，共编码266个氨基酸。同源性分析显示，SLA-DRB-HB与其他SLA-DRB等位基因的同源性介于90.3%-99.8%之间。分子进化分析表明，荷包猪SLA-DRB-HB独立分支，与其他等位基因相比较，进化更加原始。氨基酸变异位点和多态性分析结果显示，SLA-DRB-HB本身存在一定的多态性。

锦鲤Δ6脂肪酸去饱和酶基因克隆及表达研究

张萍,薛伟伟,蒋雪薇,朱双,刘江东

2015, 31(12):  158-166.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.023

摘要 ( 242 )   HTML   PDF (2102KB) ( 526 )  

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旨在揭示变温鱼类合成HUFAs过程中的关键酶及其功能，以锦鲤(Cyprinus carpiokoi)为材料，通过RT-PCR扩增获得了一段长度为854 bp的Δ6脂肪酸去饱和酶基因的cDNA 序列片段，并对其进行了序列分析和蛋白产物结构预测。结果显示，该片段与南亚野鲮(Labeo rohita)Δ6脂肪酸去饱和酶基因有93.5%的同源性，编码的蛋白产物具有典型的Δ6脂肪酸去饱和酶结构特点，包含2个组氨酸保守区(HDFGH、HFQHH)和2个跨膜结构域。荧光定量PCR表明，Δ6脂肪酸去饱和酶在锦鲤肝脏中的表达量最高，在肠、脑和心脏中表达量依次降低，而在肌肉和鳃的表达量相对较低。幼鱼在不同培养水温下，各组织中该基因的表达量均随温度的下降而升高，以适应低温环境。

乌鳢(Channa argus)MHC Class I 全长cDNA序列的克隆及表达特征

汪强强,贾伟章,黄泽波

2015, 31(12):  167-173.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.024

摘要 ( 233 )   HTML   PDF (1927KB) ( 491 )  

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旨在探究乌鳢(Channa argus)MHC基因的分子特征、表达方式及多态性。应用抑制差减杂交(SHH)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆并鉴定了乌鳢全长MHC I cDNA序列Char-Ia-1、Char-Ia-2和Char-Ib，推测氨基酸序列与已知硬骨鱼MHC I基因同源。Char-Ia-1和Char-Ia-2 cDNA序列包含1 167和1 083 bp的开放阅读框，分别编码388和360 aa的膜型Ⅰ类分子；而Char-Ib cDNA序列包含978 bp的开放阅读框，编码325 aa，显著截短的羧基末端显示Char-Ib为潜在的分泌型Ⅰ类分子。比较发现Char-Ia与Char-Ib在3'非转录区存在显著差异，在细胞外区、跨膜区和细胞质区的氨基酸序列同源性均较低，推测二者来自不同的MHC I基因座。氨基酸序列比对显示乌鳢MHC I分子与抗原肽结合的关键氨基酸残基较保守，在α1和α3结构域均出现硬骨鱼特征性的氨基酸残基缺失。进化树分析表明Char-Ia-1和Char-Ia-2聚为一簇，与Char-Ib处于不同的进化分支上，进一步证实Char-Ia与Char-Ib分别由不同MHC I基因座编码。RT-PCR分析显示乌鳢MHC I在组织中呈现组成型表达。设计基因专一性引物检测乌鳢Char-Ia与Char-Ib两类MHC I基因在组织中的表达水平，结果显示Char-Ia以较低的浓度表达于所有被检测组织，而Char-Ib主要表达于脾、肠、鳃和外周血，呈现明显的组织表达特异性，提示两类MHC I分子在鱼类免疫反应中发挥不同的生理功能。

红鳍东方鲀干扰素γ基因的原核表达

马普,孙赛红,王玉芳,李慧,刘海映,姜志强,仇雪梅,刘洋,张涛,王秀利

2015, 31(12):  174-179.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.025

摘要 ( 246 )   HTML   PDF (2774KB) ( 504 )  

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旨在探究一种简单高效的获取重组红鳍东方鲀IFNγ蛋白的方法。提取红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)肾脏组织的总RNA，并以其为模板进行RT-PCR扩增干扰素γ(IFNγ)基因序列。将IFNγ成熟肽序列与表达载体pET-32a(+)相连，成功构建了重组表达载体PET-32a-IFNγ。将其转化入E. coli BL21(DE3)感受态细胞后获得了重组表达IFNγ的基因工程菌。经IPTG诱导，pET-32a-IFNγ在BL21中得到了表达。通过对表达产物的纯化和Western blotting检测，结果显示红鳍东方鲀IFNγ基因在大肠杆菌中的表达准确，且目的蛋白表达量较高。

应用于miRNA靶标检测的双荧光素酶报告载体的构建及鉴定

印翠,张俊玲,施志仪,孙文慧,孙近近

2015, 31(12):  180-185.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.026

摘要 ( 384 )   HTML   PDF (2518KB) ( 1154 )  

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以牙鲆空通气孔同源框2基因(empty spiracles homeobox 2，emx2)为例，构建包含emx2 3'UTR区的野生型和突变型双荧光素酶重组报告表达载体，以期应用于miRNA靶标的检测。利用Trizol 法提取牙鲆成鱼精卵巢混合组织总 RNA，参照已克隆出来的 emx2 基因cDNA 序列，设计并合成 emx2 3'UTR片段的引物并进行 PCR 扩增，将得到的基因片段和 psiCHECK-2 载体双酶切后，用T4 DNA Ligase 酶进行连接反应，并转化入 DH5α 感受态细胞，筛选后得到野生型重组质粒；同时采用定点诱变法对emx2基因进行体外定点诱变并采用同样的方法形成突变型重组质粒。对野生型和突变型重组质粒进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序分析。成功克隆了emx2 3'UTR区，并将emx2 3'UTR区的miRNA靶点序列GACTTGA突变为 AGTCCAG，成功构建了野生型和突变型包含emx2 3'UTR区的miRNA靶标检测载体。通过RT-PCR、基因重组及定点诱变技术成功构建了应用于miRNA靶标验证的野生型和突变型双荧光素酶报告载体 psiCHECK-emx2-3'UTR 和 psiCHECK-mutated-emx2-3'UTR。

重组骆驼蓬脂转移蛋白与顺铂联合抑制黑色素瘤B16细胞增殖效应的研究

常晨晨,王燕,管珊,孙素荣

2015, 31(12):  186-192.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.027

摘要 ( 245 )   HTML   PDF (2128KB) ( 397 )  

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旨在探讨重组骆驼蓬脂转移蛋白(Recombinant Peganum harmala lipid transfer protein，rPhLTP)与顺铂(DDP)联用对鼠黑色素瘤B16细胞增殖抑制和凋亡诱导作用。MTT法检测rPhLTP、顺铂单独及联用后对鼠黑色素瘤B16细胞增殖的影响；流式细胞术检测细胞凋亡，活性氧(Reactive oxygen species，ROS)和线粒体膜电位(Δψm)的变化情况。结果显示，rPhLTP和DDP联用后细胞生长抑制率和凋亡率显著高于DDP单独处理组(P < 0.01)；而且胞内ROS升高的水平均高于单独处理组(P < 0.01)，胞内Δψm水平均低于单独处理组，但无显著性差异。rPhLTP可增强顺铂对B16细胞的生长抑制并促进细胞凋亡，与顺铂具有协同作用。

共表达透明颤菌血红蛋白对毕赤酵母产Β-甘露聚糖酶发酵过程的影响

张晓龙,肖静,王瑞明,汪俊卿,王兴吉,王正祥

2015, 31(12):  193-199.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.028

摘要 ( 235 )   HTML   PDF (2675KB) ( 597 )  

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为了改善高密度发酵生产Β-甘露聚糖酶过程中的溶氧限制，提高Β-甘露聚糖酶产量，将VHb和Β--甘露聚糖酶基因置于AOX1启动子调控之下，进行VHb和Β--甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的共表达。经密码子优化合成VHb基因，插入表达载体pPICZαA，整合到Β--甘露聚糖酶工程菌中，通过G418和Zeocin抗性筛选共表达VHb基因的重组酵母工程菌。在30 L发酵罐水平上分析共表达VHb菌株(VHb⁺)与初始菌株(VHb^-)对Β--甘露聚糖酶表达的差异。结果显示，限氧条件下，VHb⁺菌株的Β--甘露聚糖酶的表达量比对照菌株VH b^-高90%，且透明颤菌血红蛋白提高了甲醇耐受性，缩短发酵周期约40 h。

不同温度培养下酿酒酵母细胞壁蛋白质差异分析

谷月,朴永哲,杜维,王小瑜,王春艳

2015, 31(12):  200-206.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.029

摘要 ( 246 )   HTML   PDF (2557KB) ( 769 )  

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生物体在其生长过程中要经受一系列非生物环境的胁迫，这些胁迫条件都将影响细胞的基因转录、蛋白质表达物等一系列的变化，以尽快适应周围变化的环境。利用双向电泳和质谱技术考察了高温胁迫对酿酒酵母细胞壁蛋白质组的影响。结果表明，高温胁迫的酿酒酵母FFC2146细胞壁蛋白质中新增Ssa2和小分子鸟苷三磷酸酶，无机焦磷酸酶上调表达，而丙酮酸激酶缺消失，同时6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶下调表达。上述结果说明热休克蛋白Ssa2保护细胞壁在高温下保持完整，使细胞继续生长繁殖；高温胁迫下酿酒酵母的糖酵解途径受阻，在转酮醇酶的作用下糖酵解途径转向磷酸戊糖途径途径，获取足够的能量，维持细胞正常的新陈代谢。

大肠杆菌menA敲除对CoQ积累的影响研究

刘永青,任琳,张子锋

2015, 31(12):  207-213.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.030

摘要 ( 267 )   HTML   PDF (2782KB) ( 608 )  

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通过同源重组敲除大肠杆菌的menA基因，增加菌体CoQ合成量，用于构建CoQ高产菌株。以pKD4质粒为模板，PCR扩增kan^r片段；在pKD46的辅助下，kan^r片段转化大肠杆菌，利用抗生素筛选和PCR验证重组子；以紫外诱变菌为对照，发酵menA基因敲除菌株，分析CoQ种类和产量变化。成功获得menA基因敲除菌株，CoQ种类不变，产量增加约为38%。首次敲除menA基因，改良株CoQ产量得到提高，达到预期目标。

解淀粉芽孢杆菌LJ1摇瓶发酵条件优化

李娟,夏凯丽,王远宏,董蕴琪,郝蕾

2015, 31(12):  214-220.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.031

摘要 ( 262 )   HTML   PDF (2122KB) ( 921 )  

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解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LJ1是从天津土壤中分离筛选出的一株具有广谱抑菌效果的生防菌株，该实验旨在明确B. amyloliquefaciens LJ1的抑菌谱并通过优化发酵培养基和发酵条件提升其抑菌效果。通过对峙培养检测菌株LJ1对14种病原真菌的抑制效果；采用单因素试验、正交试验优化发酵培养基和摇瓶发酵条件；最后用孢子萌发法和盆栽试验验证优化后发酵液的抑菌效果。实验结果表明B. amyloliquefaciens LJ1对黄瓜灰霉病菌(Botrytis cinerea)、苹果炭疽病菌(Glomerella cingulata)、苹果腐烂病菌(Valsa ceratosperma)等11种病原真菌有抑制作用；优化后的摇瓶发酵条件为温度30℃、初始pH 5、转速200 r/min、装液量50 mL/250 mL；优化后的发酵培养基为马铃薯 200 g，蔗糖10 g，黄豆粉20 g，MgCl₂·6H₂O 1.5 g，蒸馏水 1 000 mL。经发酵条件与培养基优化后，B. amyloliquefaciens LJ1发酵液对Botrytis cinerea孢子萌发的抑制率达99.7%，盆栽实验防效达51.08%。

产D-乳酸重组大肠杆菌ptsG基因的敲除及其混合糖同步发酵

丁小云,顾健健,王永泽,赵锦芳,王金华,赵筱

2015, 31(12):  221-226.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.032

摘要 ( 264 )   HTML   PDF (2158KB) ( 778 )  

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为构建能够同时高效利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸的重组大肠杆菌工程菌，以能高效利用五碳糖发酵产D-乳酸的大肠杆菌工程菌E.coli JH13为出发菌株，通过Red同源重组技术敲除葡萄糖跨膜转运基因ptsG。实验结果表明，ptsG缺陷菌株E.coli JH15在10%混合糖(5%葡萄糖和5%木糖)培养基中发酵，可同时利用五碳糖和六碳糖以完成发酵；而对照菌葡萄糖消耗完才利用木糖，发酵结束还有 18 g/L木糖残留；JH15乳酸产量为83.04 g/L，相比于对照菌株提高了25.86%；在稻草秸秆水解液中发酵，JH15同时利用葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖，乳酸产量为25.15 g/L，转化率为86.42%。JH15 作为能利用混合糖同步发酵产D-乳酸的大肠杆菌工程菌，它的成功构建为利用廉价的木质纤维素水解物为原料发酵生产D-乳酸提供参考依据。

产脂肪酶黑曲霉摇瓶发酵条件优化研究

张谦,贾佳,林智,杨晓锋,郭宏涛,王剑英,Carol Sze Ki Lin

2015, 31(12):  227-233.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.033

摘要 ( 270 )   HTML   PDF (3531KB) ( 695 )  

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黑曲霉Aspergillus niger G62s是一株具有遗传稳定的高产脂肪酶菌株。针对于G62s摇瓶发酵条件进行统计学优化研究，以提高该菌株的产脂肪酶能力。首先，采用单因素方法对发酵接种量、摇瓶装量、培养温度、培养时间等因素进行考查，在此基础上进行4因素3水平的响应面分析(Response surface methodology，RSM)的统计学优化。得到的优化发酵条件是接种量1.9 %，摇瓶装量56 mL(500 mL摇瓶)，培养温度30 ^oC，培养时间75 h。在该优化条件下，脂肪酶活性达到(212 9 ± 39.9)U/mL，相比初始的发酵条件提高16.7%。针对于影响G62s菌株产脂肪酶的4个发酵条件，在单因素实验的基础上通过RSM方法优化，显著提高了目标菌株脂肪酶产量。

高效解磷菌的筛选及其促生机制的初步研究

银婷婷,王敬敬,柳影,梁亚杰,王兴彪,韩一凡,王夏,程美娟,黄志勇

2015, 31(12):  234-242.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.034

摘要 ( 414 )   HTML   PDF (2210KB) ( 901 )  

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旨在研制出可替代化学肥料的新型肥料。利用无机磷固体培养基从环境中筛选到27株解无机磷菌；采用钼锑抗比色法进行溶磷能力分析，发现27株解磷菌中qzr14的解磷能力最高(270 mg/L)；盆栽试验结果表明27株解磷菌中qzr14对黄瓜苗的促生效果较好，与对照相比，可提高黄瓜苗株高27.71%、干重98.46%、鲜重57.01%；通过对qzr14发酵液中的有机酸进行实时监测，发现qzr14主要通过分泌葡糖酸溶解不溶性磷；通过对盆栽土壤中磷组分的分析，发现接种qzr14 4 d后的土壤中有效磷占总磷的百分比(19.62%-22.57%)均显著高于空白对照的百分比(12.53%-17.35%)，说明qzr14可溶解土壤中不溶性磷；生化实验结果表明qzr14还具有固氮和解钾能力；通过16S rDNA序列分析初步鉴定qzr14为葡糖醋杆菌属。从环境中筛选到一株高效解磷的葡糖醋杆菌qzr14，并首次报道了其促生机制。糖醋杆菌qzr14可能通过分泌葡糖酸溶解土壤中的磷，为黄瓜苗提供较多的有效磷，从而促进黄瓜苗生长，还可能通过解钾和固氮作用促进黄瓜苗生长，是一种潜在的微生物肥料。

东亚飞蝗虫病原褪色沙雷氏菌的鉴定与检验

吴楠,郭杨柳,王晓珊,李艳云,卢会鹏,陈翠珍,张东林,房海

2015, 31(12):  243-248.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.035

摘要 ( 234 )   HTML   PDF (1784KB) ( 540 )  

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病原褪色沙雷氏菌的有效分离与鉴定对控制由褪色沙雷氏菌引起的养殖东亚飞蝗感染病均具有一定的参考与应用价值，同时将为对蝗灾的生物防治研究提供借鉴。对从发病死亡的养殖东亚飞蝗中分离的10株细菌，进行了表观分类学指征、16S rRNA基因序列与系统发育、人工感染的致病作用等方面的检验与分析。结果表明为沙雷氏菌属的褪色沙雷氏菌，对供试养殖东亚飞蝗显示强致病性。褪色沙雷氏菌对东亚飞蝗有强致病性，是蝗虫养殖的重要致病菌。

常压室温等离子体诱变选育类胡萝卜素高产菌株及其性质研究

金玮玥,宋明凯,矫文豪,江凌,李霜,徐娴

2015, 31(12):  249-255.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.036

摘要 ( 267 )   HTML   PDF (3463KB) ( 551 )  

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采用新型常压室温等离子体(Atmospheric and room temperature plasma，ARTP)诱变产类胡萝卜素菌株Deinococcus wulumuqiensis R12，通过深孔培养板进行高通量筛选，并结合菌株类胡萝卜素含量复筛获得突变菌株M1。与出发菌株相比，突变菌株M1的类胡萝卜素含量检测为612 μg/g 细胞干重(Dry cell weight，DCW)，是出发菌株类胡萝卜素含量(212 μg/g DCW)的2.8倍，且遗传性稳定；突变菌株M1类胡萝卜素的高铁离子还原能力(OD₇₀₀=0.52)高于出发菌株类胡萝卜素的高铁离子还原能力(OD₇₀₀=0.34)，且M1的类胡萝卜素对DPPH自由基清除率为33.33%高于出发菌株类胡萝卜素的清除率(23.09%)，结果显示突变菌株M1具有更强的抗氧化能力；在相同γ辐射与UV辐射剂量下突变菌株M1具有比出发菌株更高的存活率。研究表明突变菌株M1在类胡萝卜素产量、菌株抗氧化性能及抗辐射性能方面均优于出发菌株D. wulumuqiensis R12。

pH对重组CHO细胞生长、单抗表达及质量的影响

肖尚,邓崇飞,柯军,鄢成伟,孙文正,杨彬

2015, 31(12):  256-261.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.037

摘要 ( 530 )   HTML   PDF (2337KB) ( 1412 )  

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在1 L反应器中探究pH对CHO细胞生长、单抗表达及质量的影响。在1 L反应器中对pH进行探究，实验研究表明当pH为7.05时最适合CHO细胞生长和抗体表达，在此条件下培养时第9天获得最高细胞密度1.54×10⁷cells/mL，在第11天获得最高抗体浓度1 355.71 mg/L。pH对pCO₂、乳酸积累、抗体的单体含量、电荷异质性和糖基化也有较大影响，当pH在6.95至7.25之间时，高pH培养能够降低乳酸积累和pCO₂，但是会导致抗体的碱性峰增加。pH两项培养能够降低细胞活力，从而提高抗体表达量。

我国主要农业机构作物学科科技产出能力对比研究

刘敏娟,袁雪,王婷,颜蕴,续玉红,陈露

2015, 31(12):  262-267.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.038

摘要 ( 222 )   HTML   PDF (2258KB) ( 515 )  

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结合科技论文、发明专利、国审品种以及植物新品种权多项作物学科主要科技产出类型数据，基于逐条人工辨别学科领域归属的结果，运用多个指标进行计量分析，从不同角度对比分析2008-2012年我国8个主要农业科研机构及大学作物学科科技产出情况与机构实力，旨在为作物学科科研工作者与决策者提供数据参考。结果表明，中国农业科学院在不同领域多项指标的对比中都展现出强劲的实力；中国科学院SCI高水平论文和专利产出的实力不俗，特别在药用作物领域表现突出；另外，中国农业大学在玉米领域，南京农业大学在大豆和棉花领域以及华中农业大学在油菜领域的表现也非常值得关注等。

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2015, 31(12):  300. 

摘要 ( 177 )   HTML   PDF (3933KB) ( 244 )  

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2015, 31(12):  500. 

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