生物技术通报

RNAi作用机制及应用研究进展

冯小艳，张树珍

2017, 33(5): 1-8. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.001

摘要 ( 283 )

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RNA干扰（RNA interference,RNAi）是由小非编码RNA（small non-coding RNA,sncRNA）诱发的基因沉默现象,广泛存在于真核生物中。RNAi现象自发现以来,很快成为生物学研究的热点,并取得了一定成果。就RNAi的作用机制、作用过程的关键因子及其应用的研究进展进行综述,以期为RNAi的进一步研究提供参考。

耐辐射球菌辐射耐受机制的研究进展

陈晓飞,宁萌,冯菲,向凌云,周伏忠

2017, 33(5): 9-18. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.002

摘要 ( 206 )

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耐辐射球菌（Deinococcus radiodurans,Dr）是迄今为止地球上发现的最具辐射抗性的生物之一,对紫外线、干旱和诱变剂等损伤因子均表现出极强的抗性,备受世界各国科学家的广泛关注。目前关于其抗辐射机理已有大量的文献报道。根据国内外最新的研究成果,从DNA损伤修复机制、抗氧化防御系统、特殊的生存方式及细胞净化系统等方面,对耐辐射球菌辐射抗性机理的研究进行了简单的概述,并对未来Dr耐辐射机制的研究趋势进行了展望,以期为进一步研究该菌的辐射耐受机制奠定基础。

COP9信号复合体在真菌生长发育及次级代谢过程中的作用研究进展

乔玉, 杨水英, 李振轮, 王芳, 徐义

2017, 33(5): 19-25. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.003

摘要 ( 228 )

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COP9信号复合体（CSN）是真核生物中高度保守的蛋白复合物,参与调控整个生命过程,目前的研究主要集中在人类和动植物中,而关于真菌COP9信号复合体的研究主要集中在几个模式真菌,其他真菌相关研究较少,国内对真菌COP9信号复合体的研究更少。从真菌COP9信号复合体的组成和结构特征、调控真菌生长发育的机制以及协调次级代谢等方面进行综述,并对其现存的疑惑进行了分析,以期为进一步研究COP9信号复合体在真菌中的作用提供参考。

半胱氨酸参与生物体重金属抗性的研究进展

张礼, 孙堆, 王晓, 郑春丽

2017, 33(5): 26-33. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.004

摘要 ( 267 )

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半胱氨酸（Cys）是生物体硫酸盐同化途径的终产物,广泛存在于生物体内。生物体将氧化态硫吸收并还原后固定到半胱氨酸分子中,使其能够顺利参与生物体的其他代谢途径。因半胱氨酸结构中含有巯基,使得其能与重金属离子特异性结合,并直接或间接地参与生物体的重金属抗性。由于生物细胞是在异相条件下进行系列的、有序的生理生化过程,进一步研究Cys及其金属离子配合物在分子水平上的结构特征,对于在分子水平上研究Cys及其与金属离子的生理行为有重要的参考价值。近年来,新技术（如原子力显微镜）在生物科学方面的应用使得这一研究成为可能。对半胱氨酸的基本特性、生物合成途径及其参与生物体重金属抗性的研究进展进行了综述,旨为研究Cys在生物体重金属抗性过程中的解毒机制提供一定的科学理论依据。

基于多胺转运系统的抗肿瘤药物研究进展

李建明，丁劲松

2017, 33(5): 34-39. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.005

摘要 ( 240 )

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多胺是维持细胞生长分化等生命活动的必需物质。肿瘤的增殖与细胞内多胺水平密切相关,利用肿瘤细胞膜表面高表达的多胺转运系统介导多胺类似物和缀合物进入细胞,可耗竭细胞内多胺并诱导肿瘤细胞凋亡。也可利用多胺聚阳离子的结构特点进行基因递送,提高外源基因的转染效率。综述了基于多胺转运系统的多胺类似物,缀合物和基因递送的癌症治疗研究进展,旨为以多胺结构为基础的抗肿瘤药物研究提供参考。

等温滴定量热法在蛋白质-配体相互作用中的应用

齐心洁, 王玥, 王彦晟, 方国康, 黄迎春

2017, 33(5): 40-49. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.006

摘要 ( 460 )

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等温滴定量热法（ITC）近年来迅速发展并广泛应用于分子生物学及其相关领域的研究分子相互作用的生物物理技术,它是在恒定温度下唯一能够直接测量复合物形成过程中的热量变化的方法。它可以简单地通过测量两个溶液相互作用时吸收或放出的热量来提供分子相互作用的重要信息,如结合常数、结合位点数、自由能、焓和熵。综述了ITC的工作原理、技术特点,以及在蛋白质-配体相互作用方面的最新应用和未来的发展方向,表明ITC数据结果的有效性及其在该领域的应用价值。

生物转化能源草制取纤维素乙醇的研究进展

白龙,李春美,吕途,杜颖,杨玥,田沈

2017, 33(5): 50-56. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.007

摘要 ( 227 )

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随着化石燃料的日益枯竭和环境污染的日益加剧,寻找一种绿色能源以代替化石能源成为当今世界迫在眉睫的任务。清洁燃料当中的生物乙醇具有车用价值,可作为化石能源的替代品而受到研究学者的广泛关注。而草本能源植物的生物转化被认为是生物质能源产业化发展的最有效途径之一。能源草作为木质纤维素原料之一,由于其具有生长快,产量高,抗性强等优势而备受瞩目。详细论述了近期国内外以能源草为底物进行纤维素乙醇的生物转化研究进展,从纤维素原料预处理到乙醇发酵工艺等各方面的进展及存在的问题,并对木质纤维素制取生物质能源的生物转化效率,以及全纤维素组分的多级利用进行了简单阐述,以期找出一条产业化生产纤维素乙醇的最优生产模式。

两种瞬时表达体系研究拟南芥Profilin-1的亚细胞定位

张晓慧，韩榕

2017, 33(5): 57-62. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.008

摘要 ( 293 )

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使用两种瞬时表达方法研究Profilin-1（PRF1）的亚细胞定位,并比较了2种瞬时表达体系在亚细胞定位研究中的优缺点。利用拟南芥幼叶作为材料,提取叶片的RNA,采用特异性引物RT-PCR的方法克隆PRF1基因,连接到pCAMBIA1300-GFP的改造载体上,成功的构建pCAMBIA1300-GFP-PRF1的表达载体。然后分别利用PEG转化拟南芥原生质体、农杆菌浸染烟草叶片两种技术进行了瞬时表达,并在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白的表达。研究结果表明,将PRF1基因导入拟南芥的原生质体和烟草表皮细胞后,融合蛋白绿色荧光均能被观察到,PRF1基因与GFP融合蛋白的产物在烟草表皮细胞中主要定位在细胞质和外周细胞器中,在拟南芥的原生质体中的细胞核和细胞质中都有定位。两种不同的瞬时表达体系中PRF1蛋白的定位出现了不同,这可能与同源或异源表达的植物的特性相关。

沙冬青种子总黄酮测定方法及纯化工艺研究

陶波,方梅,张嘉男,欧云文,贾宁

2017, 33(5): 63-70. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.009

摘要 ( 174 )

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旨在建立沙冬青种子总黄酮测定方法及沙冬青种子总黄酮纯化工艺。选用常用4种黄酮显色方法,通过紫外波长扫描分别确定槲皮素为对照品及沙冬青种子总黄酮的最佳吸收波长,建立标准曲线,并对各测定方法进行方法学验证,利用新建立的条件方法对沙冬青种子总黄酮进行含量测定;实验选择AB-8、D101、S-8型大孔树脂通过静态吸附及解析试验,筛选出AB-8型大孔树脂进行动态试验,建立大孔树脂纯化工艺条件,进一步通过乙酸乙酯进行萃取,提高其总黄酮纯度。结果显示,以槲皮素为对照品,采用AlCl₃-CH₄O显色法,在检测波长为335 nm条件下可对沙冬青种子总黄酮含量进行有效测定;AB-8型大孔树脂在上样液浓度为6 mg/mL、上样液pH5.5、上样液体积5 BV、上样液流速3.5 BV/h条件下吸附,以70%乙醇、洗脱液流速1.5 BV/h、洗脱液体积6 BV条件下洗脱,沙冬青种子总黄酮含量由纯化前5.69%提高到41.07%;用AB-8树脂纯化后的总黄酮配置成一定浓度溶液后用乙酸乙酯萃取,总黄酮含量达到76.15%。

思茅松转录组SSR分析及标记开发

赵能, 原晓龙, 缪福俊, 王毅, 陈伟, 李江, 吴涛, 王娟

2017, 33(5): 71-77. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.010

摘要 ( 219 )

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基于思茅松转录组测序数据进行其SSR标记开发,为丰富思茅松SSR数据库提供参考。采用MISA软件对思茅松59 636条Unigene进行SSR搜索,共获得3 745个SSR位点,分布频率为6.28%,平均11.36 kb出现一个SSR位点。SSR重复类型以三核苷酸基序为主,其次是二核苷酸基序,所占比例分别为49%和24%,其主要重复单元分别为AGC/CTG和AT/TA。随机挑选224个位点进行引物设计及合成,琼脂糖凝胶检测发现其中29个位点具有多态性且效果良好,但仅12个位点符合SSR重复类型的倍数大小且扩增效率高于85%。利用这12对荧光标记引物,对2个居群42份样本进行遗传多样性分析,共检测到35个等位基因,多态性信息量（PIC）为0.093 2-0.480 9,平均为0.306 9。4个位点为低度多态位点（0<PIC<0.25）,8个位点为中度多态位点（0.25<PIC<0.5）。这12个标记可用于思茅松遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位及克隆等研究,旨为思茅松分子标记辅助育种及变异水平等研究提供技术支持。

利用外源RNA作为内参结合qPCR准确检测SF2蛋白RIP富集RNA的效率

李雨，赵磊，陈利，周宇荀，李凯，肖君华

2017, 33(5): 78-82. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.011

摘要 ( 311 )

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利用实时荧光定量PCR技术（Real-time Quantitative polymerase chain reaction,qPCR）检测0.1%甲醛交联RNA免疫共沉淀（RNA Immunoprecipitation,RIP）富集SF2蛋白相互作用的RNA效率,为研究可变剪接因子SF2相互作用RNA的富集效率提供准确的质检方案。采用RIP技术获取HeLa细胞中SF2蛋白相互作用的RNA,等比例加入外源酿酒酵母（BY4741）RNA,并以其β-actin作为内参基因,利用qPCR检测RIP富集SF2蛋白相互作用RNA的效率。结果显示,0.1%甲醛交联RIP技术特异性捕获得到SF2蛋白-RNA复合物;qPCR技术检测阳性基因PABP、Srsf1在SF2抗体捕获的产物和IgG抗体的产物中相应RNA的浓度差异均在60倍以上。利用qPCR技术,以外源酿酒酵母（BY4741）RNA作为内参,能快速、准确定量检测RNA的富集效率。

利用放线菌酮提高黄素单氧化酶FMO_GS-OX1亚细胞定位的准确性

夏洪宇,孔稳稳,徐蕊,苍炜,李晶

2017, 33(5): 83-88. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.012

摘要 ( 235 )

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研究蛋白质亚细胞定位的常规方法是构建由35S启动子驱动目的基因与绿色荧光蛋白基因（GFP）融合的表达载体,在细胞中瞬时或稳定表达来确定该蛋白质在细胞中的定位。35S启动子的优势是能够获得较强的GFP信号,但同时也可能因为蛋白质合成量过大,导致部分蛋白滞留在运输途径中或出现在其真实定位以外的区域。为了解决这一问题,以模式植物拟南芥中黄素单氧化酶FMO_GS-OX1为例,利用蛋白质抑制剂放线菌酮处理过量表达FMO_GS-OX1-GFP融合蛋白的烟草叶片。结果表明：未经放线菌酮处理的烟草叶片表皮细胞,细胞质和内质网中均呈现了较强的荧光信号,放线菌酮处理后,内质网上的信号消失,而细胞质则呈现出稳定的信号,因此判断FMO_GS-OX1合成后可能是经过内质网运输到细胞质中的。上述结果证明适当的放线菌酮处理,能够避免强启动子驱动报告基因造成的蛋白质合成过量的问题,可有效地提高蛋白质亚细胞定位的准确性。

聚乙二醇沉淀联用双水相萃取法纯化蛋清溶菌酶的研究

闻崇炜,赵烨清,石莉,欧阳臻

2017, 33(5): 89-93. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.013

摘要 ( 223 )

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研究以聚乙二醇（Polyethylene Glycol,PEG）沉淀法联用PEG-硫酸铵双水相萃取体系纯化蛋清溶菌酶的工艺。结果表明,向预处理的鸡蛋清液中加PEG 4000至质量分数为16%时,可选择性沉淀除去蛋清中98.1%的杂蛋白,随后向上清液中加硫酸铵溶液至其质量分数为4.32%,可以构建PEG-硫酸铵双水相体系,分离上相即得高纯度溶菌酶。该法所得产物中96.34%为溶菌酶,其余为PEG 4000,不含有其它杂蛋白,溶菌酶总回收率达70.2%,比活为25 000 U/mg。该法简便易行,易于放大,每毫克精制溶菌酶中仅残留36.6 μg PEG 4000,生物安全性较高。

水稻OsRhoGAP1基因的序列特征及表达特性分析

闫鑫甜,黄俊骏,楼晨,葛慧雯,梁卫红

2017, 33(5): 94-101. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.014

摘要 ( 186 )

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OsRhoGAP1是本实验室前期从水稻幼穗cDNA文库中分离获得的功能未知基因。通过生物信息学和现代分子生物学技术,系统探讨了水稻OsRhoGAP1的组织表达特性和不同激素处理下的表达情况。生物信息学分析表明,OsRhoGAP1具有植物RhoGAP蛋白典型的结构特征,即CRIB基序和RhoGAP结构域。qRT-PCR检测结果显示该基因的表达具有时空特异性,幼苗期主要在根和叶中表达,幼穗期主要在幼穗和叶中表达,成熟期则主要在根中表达。同时,经ABA、SA、GA和MeJA处理后,OsRhoGAP1基因表达量有明显上调,经IAA和6-BA处理后,OsRhoGAP1基因表达量出现显著下调,表明该基因的表达受到多种激素调控。

一氧化氮（NO）对镉胁迫下小麦幼苗氧化损伤的影响

马晓丽, 冀瑞萍, 田保华, 霍建新

2017, 33(5): 102-107. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.015

摘要 ( 170 )

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为探讨一氧化氮（NO）对重金属镉胁迫后小麦幼苗氧化损伤的影响。采用营养液水培法,以“晋麦8号”为材料,一氧化氮供体硝普钠（SNP）,NO清除剂牛血红蛋白（Hb）及SNP类似物亚铁氰化钠（SF）分别处理小麦幼苗,研究NO在镉（Cd）胁迫下对小麦幼苗抗氧化系统的影响。结果显示,SNP处理可以缓解镉胁迫对幼苗生长抑制,显著增加可溶性蛋白、叶绿素和GSH含量,减少丙二醛（MDA）和过氧化氢（H₂O₂）的含量,并降低超氧阴离子（O₂·^-）产生速率、可溶性糖和脯氨酸的积累。而NO清除剂牛血红蛋白（Hb）处理使镉胁迫对小麦幼苗的毒害增强,SNP类似物亚铁氰化钠（SF）处理则没有缓解效应;进一步实验发现,SNP降低了镉胁迫下超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽还原酶（GR）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）等抗氧化相关酶的活性,减轻了镉胁迫的氧化损伤。NO可以通过调节抗氧化酶系统来缓解Cd对植物的毒害。

蒙古沙冬青AmMYB4-like基因的克隆与表达分析

肖自华,高飞,孙会改,周宜君

2017, 33(5): 108-116. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.016

摘要 ( 208 )

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基于已有研究工作基础,从蒙古沙冬青[Ammopiptanthus mongolicus（Maxim）Cheng. f]中分离到1个编码MYB类转录因子基因,命名为AmMYB4-like。该序列长度为1 145 bp,含有一个由960 bp 组成的开放阅读框,编码319个氨基酸,具有R2和R3保守结构域,属于R2R3-MYB转录因子。荧光定量PCR分析结果表明,AmMYB4-like 在叶片中参与低温和干旱胁迫应答,在根中主要参与干旱胁迫应答。构建了pPZP212-AmMYB4-like 植物表达载体,旨为进一步研究AmMYB4-like 的功能奠定基础。

拟南芥FD与14-3-3/GRF7蛋白的相互作用研究

袁敏,王莉,葛伟娜,张岚

2017, 33(5): 117-122. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.017

摘要 ( 172 )

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为了明确拟南芥FD与14-3-3/GRFs家族成员14-3-3/GRF7之间的互作关系,利用酵母双杂交和双分子荧光互补两种技术分别做了研究。在酵母中,与阴性对照相比,共转化FD-BD与14-3-3/GRF7-AD的酵母菌落在-Leu/-Trp/-His/-Ade四缺培养基上生长良好,表明在酵母中FD与4-3-3/GRF7之间存在直接的相互作用。在烟草中,与阴性对照相比,转化FD-cYFP与14-3-3/GRF7-nYFP,以及FD-nYFP与14-3-3/GRF7-cYFP载体的农杆菌共注射烟草细胞之后均在细胞核内观察到很强的荧光信号,表明在烟草细胞中FD与14-3-3/GRF7之间存在直接的相互作用。两种技术的结果共同证实FD与14-3-3/GRFs家族成员14-3-3/GRF7之间存在直接相互作用。

基于rbcL-a和ITS的枸杞鉴别、遗传关系分析及ITS假基因的发现

陈金金, 赵明霞, 姜树, 曹丽丽, 赵庆生, 赵兵, 王晓东

2017, 33(5): 123-130. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.018

摘要 ( 205 )

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利用rbcL-a及ITS序列作为分子标记,对14个枸杞种或品种及1个伪品白刺进行了真伪鉴别及遗传关系分析。CTAB法提取总DNA,用通用引物对rbcL-a和ITS序列扩增、克隆、测序及分析,T克隆解决部分样品ITS无法成功测序问题。rbcL-a和ITS序列通用引物可在所有样品中成功扩增,rbcL-a序列全长643 bp,在14个枸杞种或品种中完全一致,与白刺具有45 bp（7%）的碱基变异。ITS序列在14个枸杞种或品种中长度变异范围为513-692 bp。采用UPGMA法构建系统树,可区分白刺与枸杞,黑果枸杞和宁夏枸杞各品种分别聚为两支,云南枸杞、韩国枸杞及黄果枸杞则聚在宁夏枸杞大分支内。rbcL-a序列可有效进行枸杞真伪鉴别,ITS序列可用于枸杞品种鉴定及遗传关系分析。此外,本研究首次揭示了枸杞品种及个体内的ITS多态性,发现在枸杞中存在ITS假基因这一现象,为未来利用ITS序列进行枸杞系统进化研究提供一些新的参考。

盐穗木盐相关转录因子HcSCL13基因启动子的克隆及活性初步分析

樊寿德,王艳

2017, 33(5): 131-138. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.019

摘要 ( 201 )

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为探明盐穗木盐相关转录因子基因HcSCL13的表达调控规律,利用基因组步移法成功克隆获得该基因2 200 bp 的启动子序列。PlantCARE数据库分析结果表明,该启动子不仅含有启动子区的核心元件 CAAT-box和 TATA-box,还包含多个与逆境应答有关的顺式调控元件。将克隆获得的HcSCL13转录因子基因启动子序列定向替换pBI121载体上的35S启动子,构建融合表达载体并转染模式植物拟南芥,对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色。结果显示转基因拟南芥整株被染色,提示该启动子具有表达活性且可能为组成型启动子。

不同品种绵羊发情周期LEPRb mRNA表达分析

卢守亮，李良远，高磊，沈敏，万鹏程，石国庆，代蓉

2017, 33(5): 139-144. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.020

摘要 ( 177 )

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为了探讨LEPR在绵羊季节性发情中的表达特点,以季节性发情的中国美利奴和常年发情的多浪羊为研究对象,利用实时荧光定量PCR技术检测繁殖季节不同发情阶段LEPRb mRNA在下丘脑、卵巢和子宫组织中的表达变化。结果显示,在发情间期、前期和发情期中国美利奴卵巢和子宫组织LEPRb的相对表达水平都低于下丘脑,但在发情后期卵巢和子宫LEPRb的相对表达水平显著高于下丘脑。不同发情时期,两品种绵羊同一组织的LEPRb的表达变化幅度有所差异,但趋势相似。且中国美利奴各组织LEPRb的表达水平都高于常年发情的多浪羊。LEPRb的表达变化与绵羊发情存在相关关系。

尼罗罗非鱼NITR基因的克隆鉴定与组织表达分析

汪志文,黄瑜,张海艳,汤菊芬,简纪常,鲁义善

2017, 33(5): 145-152. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.021

摘要 ( 162 )

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从尼罗罗非鱼脾脏组织中克隆获得新型免疫受体（NITR,Novel immune-type receptor）基因的编码区序列（GenBank登录号：KX989509;命名为On-NITR）,该基因cDNA全长1 119 bp,ORF为1 026 bp,可编码341个氨基酸,理论分子量为 37.38 kD,等电点为8.28。通过NCBI BLAST比对发现罗非鱼NITR与其他已报道的物种NITR氨基酸序列相似度为27%-46%。氨基酸序列分析显示：On-NITR具有1个信号肽区域、2个胞外Ig-domain区、1个跨膜结构域,以及1个胞质尾区,该胞质尾区含有NITR典型的免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）和一个ITIM类似基序itim,且具有较高的保守性。荧光定量PCR分析显示,On-NITR在健康尼罗罗非鱼组织中均有表达,在肠道、皮肤、肝脏表达水平较高,在胸腺、鳃、脾脏、心脏、脑组织中的表达量较低,在头肾组织中的表达量最低。

SB转座子介导的斑马鱼增强子捕获注解分析

刘帅军,沈丹,钟继汉,陈伟,王伟,张丽,陈才,杨昆仑,高波,宋成义

2017, 33(5): 153-158. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0035

摘要 ( 191 )

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为了建立斑马鱼增强子捕获突变体库及研究功能基因的表达调控模式,制备了SB转座子介导的增强子捕获转基因斑马鱼（F0）,通过繁育建立了组织或器官特异表达报告基因绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）的品系（F1）。选择F1代的SK-3系（脑部特异表达GFP）与野生型TU系斑马鱼交配,收集受精卵（F2）,于24 hpf（Hour post fertilization）、2 dpf（Day post fertilization）、3 dpf、4 dpf、5 dpf、7 dpf 6个发育阶段检测报告基因绿色荧光蛋白的表达模式;然后通过Splinkerette PCR（SP-PCR）方法检测SB转座子在斑马鱼基因组中的插入位置,从而确定捕获的增强子和功能基因;最后通过胚胎原位杂交验证内源基因表达模式。结果表明,在F2代胚胎不同发育阶段,GFP表达具有明显的时空特性,前期在前脑,中脑,后脑三个部位均高水平表达,后期表达部位呈后移趋势,各个发育期表达强度基本无变化,结果提示该捕获增强子具有脑部表达特性。sp-PCR结果分析表明增强子位于基因组1号染色体 35、914、498-35、914、621位置,在内源性基因ednraa位点附近。原位杂交结果表明该基因在胚胎24 hpf阶段具有转录活性。本研究结果提示SB转座子介导的增强子捕获技术可高效获得插入突变斑马鱼,对研究基因功能和获得具有自主知识产权的新基因具有重要作用。

潞党参多糖对宫颈癌细胞SiHa增殖和迁移的影响

胡建燃,李平,雷海英,刘贤瑞

2017, 33(5): 159-163. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-0953

摘要 ( 192 )

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以上党地区道地药材潞党参的多糖成分（Lu Dangshen polysaccharides,LDP）为对象,研究其对人宫颈癌细胞SiHa的增殖及迁移的影响。通过MTT法检测LDP对SiHa细胞增殖的影响。通过细胞黏附试验、铺展试验和划痕试验,分析LDP对SiHa细胞迁移的影响。结果显示,LDP显著抑制了SiHa细胞的增殖,IC₅₀值为0.68 mg/mL;LDP明显抑制了SiHa细胞与外基质的黏附作用,延缓了其铺展过程,并抑制了其体外迁移运动能力。LDP对人宫颈癌细胞SiHa的增殖、黏附、铺展以及迁移运动能力具有显著的抑制效应,具有开发为肿瘤治疗的辅助药物及保健食品的价值。

棉蚜His-CYP6J1融合蛋白的分离纯化及多克隆抗体的制备

王亚美,魏原杰,艾新宇,刘小宁

2017, 33(5): 164-169. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-0920

摘要 ( 173 )

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通过亲和层析法纯化棉蚜His-CYP6J1融合蛋白,制备及鉴定其多克隆抗体。采用镍离子金属螯合亲和层析柱分离纯化棉蚜His-CYP6J1融合蛋白,SDS-PAGE检测纯化产物。用纯化得到的His-CYP6J1融合蛋白免疫小鼠,制备抗棉蚜P450 CYP6J1多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体效价;免疫组化法检测抗血清特异性。结果表明,纯化的His-CYP6J1融合蛋白免疫小鼠后得到多抗血清,ELISA法检测抗血清效价达1∶200 000。免疫组化结果显示,此多克隆抗体能够与棉蚜P450 CYP6J1天然蛋白特异性结合,却在棉铃虫没有发现相应的结合反应。上述结果对研究棉蚜单一P450蛋白结构、功能及其在棉蚜抗药性形成过程的作用奠定基础。

人白细胞介素10受体α基因真核表达及与JAK1蛋白的相互作用的检测

郭欣欣,王刚,邓巧亭,吴涵韬,李坤,吴英松,刘天才

2017, 33(5): 170-175. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-0985

摘要 ( 200 )

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构建含人白介素10受体α（IL-10RA）基因的真核表达质粒pENTER-IL-10RA-His,并在HEK293中进行真核表达,并用免疫共沉淀检测JAK1与IL10RA在细胞内的相互作用。在HeLa细胞中提取人总RNA,通过RT-PCR获得人IL10RA的基因全长,并将其克隆至真核表达载体pENTER-His中。经PCR扩增、双酶切、测序鉴定后,将重组质粒pENTER-IL-10RA-His转染至HEK293细胞中。免疫印迹法检测IL-10RA蛋白在HEK293细胞中的表达。结果显示,经PCR扩增和双酶切,测序鉴定质粒克隆正确。免疫印迹可见63 kD的目的蛋白。共同转染JAK1和IL-10RA的质粒,免疫印迹可见分别为133 kD和63 kD的目的条带,免疫共沉淀鉴定了JAK1和IL-10RA的相互作用。IL-10RA基因成功构建在pENTER-His中,并在HEK293细胞中成功表达,并成功共转染JAK1和IL-10RA质粒,免疫共沉淀检测两者的相互作用。这为JAK1和IL-10RA相互作用的机制研究奠定基础。

C19orf18蛋白的表达与纯化及多克隆抗体制备

童霄霞, 杨远勤, 陈勉, 王怀远, 胡海军, 章康健

2017, 33(5): 176-182. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1031

摘要 ( 221 )

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旨在得到较高浓度和纯度的C19orf18蛋白,再将得到的目的蛋白用于制备其特异性的多克隆抗体。利用PCR技术扩增出C19orf18基因的胞内段和胞外段,中间用柔性肽连接,再将目的片段克隆到pET28a（+）与pET32a（+）载体上,通过诱导表达少量的目的蛋白,筛选出表达量较高的载体,再用筛选得到的表达量较高的载体大量表达目的蛋白,通过镍柱纯化得到较纯的C19orf18蛋白。用得到的蛋白免疫新西兰白兔,得到的抗血清先经过Protein A纯化,再进行抗原亲和纯化得到C19orf18蛋白多克隆抗体。结果显示,载体pET28a-C19orf18 蛋白表达量高于pET32a-C19orf18,经过镍柱纯化后得到了较高浓度与纯度的目的蛋白,利用得到的目的蛋白作为抗原成功制备了其特异性的多克隆抗体。在原核细胞中成功表达了C19orf18重组蛋白,并得到了其特异性多克隆抗体,所制备的多克隆抗体可应用于ELISA、蛋白免疫印迹实验。

一种新型蛋白酶的酶学特性及脱毛应用

郑翔, 杨何宝, 胡美荣, 刘春卯, 吴芳彤, 曹倩荣

2017, 33(5): 183-189. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1098

摘要 ( 195 )

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蛋白酶可作为清洁化产品应用在制革脱毛工艺,旨在明确枯草工程菌株WB800N/pHT43-npr发酵生产重组中性蛋白酶（JW-3蛋白酶）的脱毛效果及脱毛工艺条件,为清洁化脱毛制革工艺提供技术参考。研究了JW-3蛋白酶的热稳定性、pH耐受性,金属离子及化学试剂对酶活力的影响,酶解胶原蛋白的能力,同时对酶法与传统灰碱法黄牛皮脱毛效果进行评价。结果显示,JW-3蛋白酶的耐高温能力差,40℃保存1 h酶活力便开始衰减;在pH6、pH7稳定性良好;Ca²⁺、Mn²⁺对酶活力有激活作用;在表面活性剂Triton X-100、Tween20、Tween80中稳定;JW-3蛋白酶不具有水解胶原蛋白的能力,与传统灰碱法脱毛的皮粒面效果相当,且可以回收完整的动物毛发再利用。JW-3酶法可替代灰碱法脱毛实现清洁化脱毛制革工艺。

水稻恶苗病拮抗菌的筛选、鉴定及其抑菌活性

李玉洋, 辛寒晓, 范学明, 刘丽英, 孙中涛

2017, 33(5): 190-196. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-0826

摘要 ( 205 )

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从水稻根际土壤中筛选出拮抗水稻恶苗病的菌株,初步研究其抑菌作用及生防效果。采用平板稀释法从水稻根际土壤中分离获得菌株,以水稻恶苗病菌为靶标菌采用平板对峙法筛选出拮抗菌;通过形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析对筛选出的拮抗菌进行鉴定;检测拮抗菌无菌发酵液对水稻恶苗病菌菌丝生长的影响,同时测定拮抗菌的抑菌谱及进行盆栽实验。分离得到6株拮抗菌,其中有一株对水稻恶苗病菌拮抗作用较强的菌株SH15,经鉴定菌株SH15为多粘类芽孢杆菌。菌株无菌发酵液对水稻恶苗病菌菌丝生长有显著抑制作用;菌株SH15抑菌谱广,对水稻恶苗病菌、层出镰孢菌、棉花枯萎病菌、辣椒疫病菌、棉花黄萎病、黄瓜黑斑病菌均有一定的抑菌活性。水稻盆栽实验表明,接种多粘类芽孢杆菌SH15可显著降水稻恶苗病的发病指数,平均防效高达65.68%。因此,多粘类芽孢杆菌SH15在水稻恶苗病的生物防治方面具有一定的应用价值。

白腐真菌共培养对磺胺二甲基嘧啶降解的影响

郭晓丹娜,郭夏丽

2017, 33(5): 197-202. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-0905

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磺胺类抗生素是全国检出频率较高的一种抗菌药物,目前对磺胺类抗生素的生物降解方面研究较少,而生物法具有无二次污染、绿色环保的优点。因此本实验对杂色云芝和黄孢原毛平革菌共培养降解磺胺二甲基嘧啶进行研究。采用高效液相色谱（HPLC）和紫外分光光度计分别分析抗生素的浓度与酶活。结果显示,平板对峙实验中两菌种间菌丝呈僵持状,种间区域漆酶酶活始终高于其他区域。两种白腐真菌液体混配4 d时可以获得具有较高漆酶酶活的粗酶液,该粗酶液在48 h内对磺胺二甲基嘧啶的降解率为25.4%,明显高于杂色云芝纯培养粗酶液的降解率（9.6%）。在加入天然助氧剂和人工助氧剂2,2'-联氨双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（简称ABTS）后,混配粗酶液的降解率分别增至49%和93.1%。种间作用可以通过增加漆酶酶活以及产生助氧剂提升抗生素降解率,因此,共培养的白腐真菌可以作为抗生素污染生物治理的主要手段之一。

三株土壤解磷细菌的分离及其解磷效果分析

李白，李军，沈亚强

2017, 33(5): 203-209. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-0915

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旨为解决农业面源污染问题,分离鉴定土壤解磷微生物并开发复合微生物菌剂。以有机磷农药及无机难溶磷作为筛选磷源,对土壤中具有解磷能力的微生物进行分离、鉴定并对其解磷效果进行分析。从土壤中分离得到3株解磷细菌,分别命名为菌株W、Y、B;3个菌株均是革兰氏阴性菌;W菌株对敌百虫的降解能力最强,达到17.39%,B菌株对毒死蜱的降解率最强,为23.06%;3个菌株对固态难溶磷的解磷效果显著,其中B菌株解磷量最高,为96.31 mg/L;复合菌的解磷效果明显优于单菌,另外复合菌对稻田、大棚土壤解磷的促进效果显著,分别增加18.38 mg/L、14.08 mg/L。分离得到3株有效土壤解磷细菌,有一定的有机磷农药降解能力,对无机磷溶解效果较强,构建的复合菌剂对土壤解磷的促进效果显著。

铅锌矿区耐砷细菌的分离、鉴定及性质研究

吴丹，张志鹏，马玉超

2017, 33(5): 210-218. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-0983

摘要 ( 192 )

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旨在从湖南康家湾铅锌矿区的重金属污染土壤样品中筛选出耐高浓度砷的细菌菌株。用稀释涂布法分离耐砷细菌;根据16S rRNA基因系统发育分析鉴定分离得到的砷高耐受性菌株并检测菌株内含有的砷耐受性相关基因;用砷钼蓝法测定耐砷细菌的砷氧化还原能力;并通过吲哚乙酸（IAA）定量实验检测优势菌株产IAA的能力。结果显示,从土壤样品中共分离出152株耐砷细菌,其中6株细菌对As⁵⁺和As³⁺的耐受性值分别高达800 mmol/L和20 mmol/L;并且这6株耐砷细菌分属于5个不同的属：假单胞菌属、苍白杆菌属、芽孢杆菌属、威廉氏菌属和节细菌属;菌株Tw31、Tw133、Sw149和Tw222中存在砷还原酶基因arsC,Bw218和Tw222中存在砷离子外排基因arsB/ACR3（2）;在72 h之内,菌株Tw133和Tw222的As³⁺氧化率（约17 %）和As⁵⁺还原率（约35 %）均高于其他菌株;尤其是菌株Tw133在144 h具有48.66 %的As⁵⁺还原率;且这两株菌分别能产生42.86 μg/mL和24.36 μg/mL的IAA。筛选出的Tw133和Tw222菌株在砷耐受性、砷氧还能力和产IAA能力等方面展现出了较明显的优势,为深入研究细菌的砷耐受性机制提供了实验材料。

鰤鱼诺卡氏菌DmpA基因的克隆及亚细胞定位研究

夏立群, 陈锐敏, 廖保山, 徐亮, 苏泽杰, 童邦卓

2017, 33(5): 219-227. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-0968

摘要 ( 204 )

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鰤鱼诺卡氏菌（Nocardia seriolae）是鱼类诺卡氏菌病的主要病原,为兼性胞内菌。生物信息学分析显示鰤鱼诺卡氏菌DmpA基因的表达产物为分泌蛋白,且可能定位于宿主细胞的线粒体上。通过构建重组质粒pEGFP-DmpA和pcDNA-DmpA、鰤鱼诺卡氏菌胞外产物鉴定、亚细胞定位、过表达等方法,对鰤鱼诺卡氏菌DmpA基因进行了克隆、亚细胞定位及初步功能研究。结果表明在鰤鱼诺卡氏菌胞外产物中鉴定到了DmpA蛋白,证实其为分泌蛋白。亚细胞定位研究发现DmpA-GFP融合蛋白均匀地分布在FHM细胞中,与线粒体分布不重合,说明DmpA蛋白并不定位在线粒体上。DmpA-GFP融合蛋白的表达会改变FHM细胞线粒体的分布为团块状。DmpA在细胞中的过量表达对细胞核无明显影响,表明该基因无诱导细胞凋亡的功能。通过对鰤鱼诺卡氏菌DmpA的克隆、亚细胞定位和过表达研究,为进一步研究该基因的功能和深入了解鰤鱼诺卡氏菌的致病机理奠定了基础。

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