生物技术通报

付瑜华, 卢加举, 李向勇

2014, 30(2): 1-6.

摘要 ( 311 )

PDF (1199KB) ( 1111 )

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甘蔗生产长期受到病害的严重影响，这些病害不仅降低蔗茎产量和糖分，还影响宿根性，甚至造成品种种性退化，而抗病品种的选育是保证甘蔗生产的有效途径。概述了甘蔗花叶病、黑穗病、宿根矮化病和梢腐病4种主要甘蔗病害在病原物检测、种质筛选和基因工程技术等抗病育种工作方面的研究进展。

杆状病毒-昆虫细胞表达系统在复合体重组表达应用中的研究进展

万婧, 相兴伟, 江玲丽, 周向阳

2014, 30(2): 7-14.

摘要 ( 248 )

PDF (6275KB) ( 949 )

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真核细胞大部分生命活动是通过复合体催化的。因此，系统了解这些复合体的生物学功能，将在健康和疾病方面具有重要意义。由于内源性复合体存在低丰度和异质性特点，因而直接提取复合体存在一定的困难。杆状病毒-昆虫细胞表达系统可成功表达复合体，为研究复合体的结构和功能提供新的手段。综述近年来利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统进行蛋白质复合体结构和功能研究的进展。

昆虫热激蛋白90的研究进展

张珂, 翁群芳, 付昊昊

2014, 30(2): 15-23.

摘要 ( 265 )

PDF (1276KB) ( 1241 )

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热激蛋白90（Heat shock protein 90，Hsp90）是细胞内最为广泛的分子伴侣之一，间接调控细胞内多条与细胞增殖、分化、存活、滞育以及与凋亡相关的信号转导通路。近年来，对Hsp90家族成员在分子水平上的认识不断深入，Hsp90已成为细胞免#br#疫、信号转导以及抗肿瘤研究的前沿课题。昆虫功能基因组的研究正在世界范围内掀起热潮，与昆虫滞育相关热激蛋白的研究也不断深入。对近年来国内外Hsp90的生物学特性、生物学功能及其在昆虫防治中的研究现状及前景进行综述，以期为害虫综合防治的研究提供参考信息。

腺相关病毒Rep78/68蛋白功能的研究进展

占申标, 吕颖慧, 李招发

2014, 0(2): 24-29.

摘要 ( 310 )

PDF (1279KB) ( 802 )

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Rep78/68是腺相关病毒（AAV）基因组编码的具有多种调控功能的非结构蛋白。主要参与了AAV DNA定点整合到人类19号染色体，抑制病毒的生物活性，如腺病毒、类猿病毒SV40等，调节AAV DNA的复制和转录等。重点阐述了定点整合的作用机制，Rep78/AAV ITR /ICP8复合物的形成机制以及Rep68蛋白的寡聚化特性，Rep78蛋白对p53核输出的限制，AAV Rep78蛋白与人乳头瘤病毒（HPV）E1蛋白相互作用从而促使Rep78和ITR DNA的结合，Rep78对乙型肝炎病毒（HBV）的抑制。这些作用的详细机制仍需完善和充实，对Rep78/68蛋白的相关作用机制的深入研究有助于rAAV基因药物的研发。

水产动物重要经济性状相关功能基因的研究进展

刘月星, 马洪雨, 马春艳, 蒋伟, 李淑娟, 马凌波

2014, 0(2): 30-40.

摘要 ( 317 )

PDF (1293KB) ( 1262 )

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随着基因组学技术的快速发展，已经在水产动物中鉴定出了大量的功能基因，并通过建立基因多态性与重要经济性状之间的关联，挖掘出了与经济性状连锁的优势等位基因和基因型。对基因资源的研究不仅有助于理解经济性状的分子调控机制，而且将为分子辅助育种提供理论指导和技术支持。综述了近年来水产动物重要经济性状相关基因的研究进展，以期为解析功能基因的分子调控机制和分子辅助育种提供基础理据和参考资料。

土壤因子对绿僵菌生命活动的影响研究进展

李振轮, 李鑫强, 杨水英

2014, 0(2): 41-46.

摘要 ( 233 )

PDF (1162KB) ( 730 )

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绿僵菌是一种重要的昆虫病原真菌，它广泛分布于世界各地的土壤之中，在调节和控制土壤中有害昆虫方面发挥着重要作用。但在农业实际应用过程中，绿僵菌杀虫剂的施用效果很不稳定，原因之一是受到了土壤因子对其生命活动的影响。从土壤温度和水分、土壤pH、土壤微生物和土壤质地4个方面归纳总结了土壤因子对绿僵菌生命活动影响的研究进展，并对土壤因子影响绿僵菌生命活动的新研究方向进行了初步讨论，以期为进一步研究土壤因子影响绿僵菌生命活动的作用机理及绿僵菌在实际生物防控地下害虫领域的广泛和高效应用研究提供理论参考。

分子生物学方法在浮游病毒多样性研究中的应用

高恶斌, 王子乾

2014, 0(2): 47-55.

摘要 ( 191 )

PDF (1185KB) ( 655 )

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病毒是海洋及淡水微生物群落的重要组成部分，在调控微生物环路、驱动生物地球化学循环、维持浮游植物与细菌多样性等方面扮演着重要角色。然而，传统的病毒培养及定量技术难以对浮游病毒群落结构与多样性进行深入而全面的解析。微生物分子生态学技术的快速发展及广泛应用为此提供了新的途径。概述了克隆文库分析方法、凝胶脉冲场电泳（PFGE）技术、DNA指纹图谱、DNA微阵列、宏基因组技术等分子生物学方法的基本概念及其在研究浮游病毒的种群结构与遗传多样性及其与环境因素之间的相互关系等方面的应用状况。

鲟鱼种质鉴定方法研究进展

郭向贺, 董颖, 胡红霞, 赵艳珍

2014, 0(2): 56-63.

摘要 ( 223 )

PDF (1218KB) ( 1047 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

鲟鱼是一类古老的大型经济鱼类，由于过度捕捞和人类对其生态环境的破坏及其鲟鱼自身具有的性成熟时间长、幼体成活率低等特点，使世界范围内的鲟鱼自然资源日趋枯竭。人工养殖鲟鱼已是鲟鱼制品的主要来源，但由于种质来源不清及大量杂交鲟的存在导致种质混乱情况比较严重，目前国内外均未有一套比较完善可行的鲟鱼种质鉴定体系。总结了目前进行鲟鱼种质鉴定的一些常用方法，分析了各个方法的优缺点，为确立一套稳定可靠的鲟鱼种质鉴定方法奠定基础。

黄颡鱼“裂头病”病原二重PCR检测方法的建立及应用

隗黎丽, 吴华东, 刘毅

2014, 0(2): 64-68.

摘要 ( 238 )

PDF (2740KB) ( 539 )

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“裂头病”是黄颡鱼养殖业的主要病害之一，其病原为鮰爱德华氏菌或迟钝爱德华氏菌。以GenBank所收录鮰爱德华氏菌与迟钝爱德华氏菌16S rRNA基因为模板，优化设计两对特异性引物，经多重PCR反应体系优化及特异性与敏感性检测，建立了检测鮰爱德华氏菌和迟钝爱德华氏菌的二重PCR检测方法。结果显示，阳性对照样品的琼脂糖凝胶电泳条带同时检测到鮰爱德华氏菌和迟钝爱德华氏菌，扩增产物大小分别为470 bp及268 bp，灵敏度为1.38 ng/μL。此法用于检测江西南昌地区多个养殖场所患“裂头病”黄颡鱼脑部DNA，11份患病黄颡鱼的脑部组织均检出鮰爱德华氏菌，表明该地区黄颡鱼所患“裂头病”的病原菌为鮰爱德华氏菌，此结果与常规细菌分离鉴定的检测结果一致。所建二重PCR检测法敏感度高，特异性强，检测成本低，对黄颡鱼“裂头病”的快速诊断与流行病学调查有较好的应用价值。

环介导等温扩增技术在转基因水稻Bt63检测中的应用

张明哲, 陈曦, 徐俊锋, 陈吴健, 吴蓉, 吴志毅

2014, 0(2): 69-74.

摘要 ( 236 )

PDF (14706KB) ( 283 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

采用环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）对转基因水稻Bt63进行应用检测。研究表明，环介导等温扩增技术检测转基因水稻Bt63特异性好，并且灵敏度达到0.01%（W/W），具有简便、快速、准确等特点，可以在进出口检验检疫、食品安全监测等领域进行应用。

利用SSR标记鉴定热研二号油绿苦瓜杂交种纯度

刘子记, 詹园凤, 杨衍

2014, 0(2): 75-78.

摘要 ( 225 )

PDF (5724KB) ( 635 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

利用SSR分子标记技术对热研二号油绿苦瓜进行杂交种纯度检测技术研究。研究结果表明，5对SSR标记在热研二号亲本间表现明显的多态性，其中4对为共显性标记，1对为显性标记。为确保鉴定结果的准确性和可靠性，利用4对共显性的SSR标记对热研二号进行纯度鉴定，杂交种纯度为98.82%，与田间形态学鉴定结果完全一致。该研究表明利用SSR标记对热研二号油绿苦瓜进行纯度鉴定是切实可行的。

根癌农杆菌介导的虎杖茎尖转化研究

柳忠玉, 赵树进

2014, 0(2): 79-84.

摘要 ( 249 )

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为了建立根癌农杆菌介导的虎杖茎尖遗传转化体系，以虎杖的茎尖为转化受体，研究了携带白藜芦醇合酶基因（PcRS）的根癌农杆菌载体介导的虎杖遗传转化若干因素对转化效果的影响。结果显示，较适宜的转化系统为预培养2 d，农杆菌菌液（OD600 值为0.6）侵染10 min，共培养3 d，在含8 mg/L 潮霉素的培养基上诱导不定芽。利用该体系从 300 块茎尖外植体中共转化获得 15株抗性再生植株，经 PCR 和 Southern 杂交检测，有 6 株虎杖的基因组中已整合进了目的基因。

牡丹WD40类转录因子基因PsWD40-1和PsWD40-2的分离与序列分析

张超, 高树林, 杜丹妮, 吴凡, 董丽

2014, 0(2): 85-90.

摘要 ( 252 )

PDF (1933KB) ( 1038 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

利用已构建的牡丹‘洛阳红’花瓣转录组数据库，筛选得到2个与植物花青素苷合成WD40蛋白同源性较高的Unigene序列，分别命名为PsWD40-1和PsWD40-2。利用RT-PCR技术，设计特异性引物对PsWD40-1和PsWD40-2最大阅读框（ORF）序列进行扩增，测序结果表明PsWD40-1序列包含一个1 035 bp的ORF，编码一个344 aa的肽链；PsWD40-2序列包含一个1 032 bp的ORF，编码一个343 aa的肽链。牡丹PsWD40-1和PsWD40-2基因推测所编码蛋白序列均具有典型的WD40结构域。PsWD40-1蛋白序列与葡萄VvWDR2相似性为96%，PsWD40-2蛋白序列与葡萄VvWDR1相似性为87%。系统进化树分析发现，PsWD40-1与葡萄VvWDR2、拟南芥AtAN11、陆地棉GhTTG2等序列聚在MP1分支，而PsWD40-2与葡萄VvWDR1、矮牵牛PhAN11、紫苏PfWD40等序列聚在另一分支TTG1/PAC1分支。

农杆菌介导亚洲百合转化体系的建立及转GsZFP1基因研究

张焕, 郑佳, 阚丹丹, 樊金萍

2014, 0(2): 91-96.

摘要 ( 222 )

PDF (8138KB) ( 408 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

以亚洲百合‘耀眼’（Cedeazzle）无菌苗小鳞片为遗传转化受体，并利用农杆菌介导法将锌指转录因子基因GsZFP1转化‘耀眼’无菌苗小鳞片，初步建立亚洲百合‘耀眼’的遗传转化体系，通过筛选获得了50株疑似转化植株，通过用PCR方法对获得的50株疑似抗性植株进行检测，结果显示20株呈阳性，PCR阳性转化率为40%；将得到的阳性植株进行RT-PCR检测，获得12株RT-PCR阳性植株。结果表明，锌指转录因子基因GsZFP1在亚洲百合‘耀眼’中得到表达。

合作猪SLA-DQA基因第4外显子多态性分析

张国华, 马小军, 吕伟丽

2014, 0(2): 97-101.

摘要 ( 207 )

PDF (3628KB) ( 727 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

合作猪的MHC-DQA基因的适应性变异，其抗原识别区域（即外显子4）通过PCR扩增和随后的单链构象多态性（SSCP）和序列分析，结果显示在439个合作猪个体，SLA-DQA第4外显子检出4个等位基因和6个基因型（AA、BB、DD、AB、AC和AD），其中A等位基因和AA基因型的频率最高，为优势基因和优势基因型。对不同型的PCR-SSCP条带测序分析，发现7个突变位点（5 068 bp T→C，5 109 bp和5 149 bp处缺失C，5 131 bp A→G导致丝氨酸变为甘氨酸，5 135 bp C→T，5 234 bp G→A，5 136 bp 处插入A）。遗传学分析发现，合作猪多态信息含量（PIC）为0.240 1，属于低度多态，各种基因型的分布不显著。研究结果证实，合作猪SLA—DQA基因第4外显子为低度多态。

ISAAA 2013年最新发布

2014, 0(2): 101-101.

摘要 ( 172 )

PDF (1002KB) ( 375 )

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2013年是转基因作物成功商业化的第18年：种植面积比2012年上升500万公顷或3%，从1996年的170万公顷增加到2013年的1.75亿公顷。全球27个国家1 800万农民选择种植转基因作物，其中19个为发展中国家，美国种植面积达到7 010万公顷，占全球种植面积的40%。
巴西连续五年成为转基因作物第二大种植国，相比2012年，其转基因作物种植面积增加370万公顷，增幅达10%，种植面积超越其他国家。巴西更首次开始220万公顷抗虫和耐除草剂复合性状大豆的商业化种植。

长白山林蛙输卵管糖蛋白ROGP-III的分离纯化及鉴定

李稼晖, 刘回民, 赵宏宇, 刘景圣

2014, 0(2): 102-106.

摘要 ( 269 )

PDF (5359KB) ( 755 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

通过正交试验确定最佳的粗提工艺，并将林蛙输卵管水提液先后通过盐析，透析，阴离子交换层析、阳离子交换层析和葡聚糖凝胶过滤层析，获得了一种分子量大小约为66 kD的单一蛋白，高碘酸-Schiff试剂法鉴定其为糖蛋白。经HPLC分析，纯度为97.2%，将其命名为ROGP-III，经PNGase F糖苷肽酶处理后推测其糖含量约为17%。

家蝇泛素结合酶基因的生物信息学分析

国果, 吴沁怡, 吴建伟, 赵学军, 付萍, 张勇

2014, 0(2): 107-111.

摘要 ( 208 )

PDF (1554KB) ( 741 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

利用EST测序技术从家蝇幼虫cDNA文库中获得家蝇泛素结合酶基因（MD-E2）cDNA序列，采用NCBI、ExPASY中的相关工具，对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、二级结构和亚细胞定位等方面进行预测和分析，MEGA软件构建了进化树。结果表明，家蝇泛素结合酶基因的cDNA序列具有完整的ORF框，全长480 bp，一共编码159个氨基酸。其编码的蛋白质理论分子量为18.117 9 kD，等电点8.64，无信号肽及跨膜区，属于亲水性蛋白，具有泛素结合酶家族的活性位点（FHPNVYPSGTVCLSLL），主要分布于细胞核；二级结构以无规则卷曲为主，β折叠较少。

荧光标记红鳍东方鲀可行性研究

陈雷, 刘海映, 王秀利, 张红, 张嵩, 杨贵福, 张秀芹

2014, 0(2): 112-115.

摘要 ( 196 )

PDF (3780KB) ( 546 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

2012年7月13日至10月1日，注射荧光染料（Visible implant elastomer，VIE）标记体重（13.58±1.19）g、体长#br#（7.15±0.61）cm的红鳍东方鲀。标记部位为左侧尾柄的上、下半部，分别记为标记Ⅰ、Ⅱ组。标记30 d、55 d、80 d后标记组的存活率、体重、体长与对照组均无显著差异（P>0.05）。标记30 d后无论是通过紫外光源照射还是肉眼观察标记组的保持率均为100%；55 d和80 d时的保持率均有所下降，并表现为紫外光源照射识别的保持率高于肉眼观察的，80 d时通过紫外光源照射识别标记Ⅰ、Ⅱ组红鳍东方鲀的荧光标记保持率均在93%以上，可见荧光标记红鳍东方鲀具有可行性。

无乳链球菌诱导吉富罗非鱼分泌型免疫球蛋白M（sIgM）重链基因的克隆及原核表达

王培, 鲁义善, 王蓓, 汤菊芬, 蔡佳, 吴灶和, 简纪常

2014, 0(2): 116-123.

摘要 ( 263 )

PDF (4114KB) ( 950 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

以灭活的无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）诱导后的吉富罗非鱼（Oreochromis niloticus）为材料，构建其头肾SMART cDNA文库，应用同源性克隆和RACE-PCR技术克隆到吉富罗非鱼（O. niloticus）分泌型免疫球蛋白M（sIgM）重链基因的全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析。sIgM基因cDNA全长为1 921 bp，开放阅读框（ORF）为1 740 bp，5'端非编码区#br#（5'-UTR）41 bp，3'端非编码区（3'-UTR）140 bp，编码579个氨基酸，N端有信号肽结构。预测分子量（MW）为64.26 kD，理论等电点（pI）为5.36。系统进化树分析显示，吉富罗非鱼（O. niloticus）sIgM与牙鲆（Paralichthys olivaceus）和军曹鱼（Rachycentron canadum）的亲缘关系较近。sIgM基因有4个恒定区。将吉富罗非鱼（O. niloticus）sIgM基因恒定区序列克隆到原核表达载体pET-28a（+）中，构建原核表达质粒pET28-sIgM，诱导表达后确定最优条件为37℃条件下，IPTG浓度为0.05 mmol/L时诱导4 h蛋白表达量最大。纯化蛋白后经Western blot分析，sIgM融合蛋白与鼠抗His-Tag发生特异结合，表明目的蛋白成功表达。

Tgf2转座子多克隆位点的克隆与表达

陶然, 常玉梅, 梁利群, 唐然, 窦新杰, 王楠, 李明云

2014, 0(2): 124-129.

摘要 ( 219 )

PDF (6322KB) ( 624 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

以金鱼pTgf2-EF1α-EGFP转座子为基础，构建含有多克隆位点（Multiple cloning sites，MCS）序列以及外源目的基因肌醇-3-磷酸合成酶（Myo-inositol-3-phosphate synthase，MIPS）的重组表达载体并注射到斑马鱼1-2期受精卵，检测重组表达载体pTgf2-EF1α-MCS-EGFP和pTgf2-EF1α-MCS-MIPS-EGFP在斑马鱼中绿色荧光蛋白基因（EGFP）的表达情况以及外源基因MIPS在斑马鱼体内的整合情况。荧光观察结果显示，两个重组载体均不影响EGFP的表达，只是表达强度存在一定差异，表明对Tgf2转座子的改造是有效的。转基因斑马鱼PCR检测结果显示，靶基因MIPS的编码区能够完整地整合到斑马鱼基因组中，整合效率达31.4%。重组表达载体的成功构建显示金鱼Tgf2转座子可以介导外源基因在斑马鱼中的表达，为以后Tgf2转座子在鱼类基因功能研究方面奠定了基础。

斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）LEAP2成熟肽在大肠杆菌中的融合表达

高北, 陶妍

2014, 0(2): 130-135.

摘要 ( 227 )

PDF (2428KB) ( 482 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

以斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）肝脏为基因克隆的材料，通过RT-PCR对编码LEAP2成熟肽区域41个氨基酸的cDNA片段（mLEAP2）进行克隆。根据斑点叉尾鮰与其他鱼类、哺乳动物及两栖动物等其他物种LEAP2成熟肽区域氨基酸序列的比对结果，发现存在14个保守的氨基酸残基，其中4个高度保守的半胱氨酸残基位于成熟肽的羧基端区域，在空间上可形成两对二硫键，推测与LEAP2的抗菌活性有关。进一步构建重组表达质粒pET32a-mLEAP2，使mLEAP2基因与携带有6 × His-tag标签和肠激酶识别位点的硫氧还蛋白trxA基因融合，转化至大肠杆菌BL21（DE3）后，在25℃下，经0.7 mmol/L IPTG诱导培养16 h后，成功表达了trxA-mLEAP2融合蛋白。Tricine-SDS-PAGE显示，细胞经超声破碎后，上清和沉淀中均含融合蛋白，采用固化金属离子亲和层析（IMAC）对其进行纯化，得到了纯化的融合蛋白。

噬菌体展示抗克伦特罗抗体文库的构建及单克隆抗体的筛选

董金华, 唐玉海, 乔宁, 韩金宏, 董美华, 董益阳

2014, 0(2): 136-142.

摘要 ( 267 )

PDF (2249KB) ( 881 )

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利用小白鼠免疫和噬菌体展示技术构建了噬菌体展示抗体文库，从文库中筛选获得了一株抗克伦特罗单克隆抗体。该抗体的氨基酸序列尚未在世界基因数据库中登录，是一个新的抗体。该抗体对于游离克伦特罗的半抑制率IC₅₀为0.602 μg/mL。该噬菌体展示的抗体片段可以用于竞争法检测克伦特罗的含量，其能够检测出的最低浓度为15.6 ng/mL，具有较大的实用价值。

多功能M13KE噬菌体展示系统的建立

方月琴, 郭娟宁, 陆豪杰, 朱国强

2014, 0(2): 143-147.

摘要 ( 404 )

PDF (3374KB) ( 964 )

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以M13KE噬菌体为起始载体，建立一种无需辅助噬菌体的较长片段多肽库展示系统，以解决当前噬菌体展示仅能筛选短肽库现象，并扩大靶向高通量筛选范畴。根据M13KE次要外壳蛋白（Minor coat protein of wild-type M13KE，wt-pIII）基因III（wt-gene III）结构与功能关系，设计并扩增出能发挥其基因功能的截短基因III（Truncated gene III，tgIII）；通过拼接-重叠-延伸PCR（Splice-overlapping-extension polymerase chain reaction，SOEing-PCR）获得含启动子、信号肽和结构基因的融合基因片段，将其插入至M13KE载体的合适部位，进行蛋白质诱导表达，SDS-PAGE和Western blot分析。同时在wt-gIII和tgIII部位分别插入HA和c-Myc多肽标签，再次进行表达和检测。结果显示，tgIII被插入到M13KE的非必需部位，利用抗蛋白III（anti-M13 pIII）抗体进行Western blot检测发现，wt-gIII和tgIII均能表达pIII（protein III，pIII）；anti-HA和c-Myc抗体都能检测到2个标签蛋白和pIII蛋白质的表达。获得一种多功能M13KE载体，具有既能表达短片段多肽库，也能表达较长片段多肽库的潜能，而且无需辅助噬菌体，可用于更大范围的高通量靶向筛选。

动物内源性多肽CGA-N46对念珠菌细胞增殖的影响

阎晓慧, 李瑞芳, 张慧茹, 尹艳杰, 卢研博, 卢亚丽

2014, 0(2): 148-152.

摘要 ( 235 )

PDF (2596KB) ( 542 )

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CGA-N46是人嗜铬粒蛋白N端具有抗真菌活性的多肽片段。采用MTT法检测CGA-N46对克柔念珠菌生长的抑制作用，以β-1，3-葡聚糖酶活性检测克柔念珠菌细胞壁的完整性，采用PI检测克柔念珠菌细胞膜通透性，用罗丹明123检测线粒体膜电位。试验结果证实，0.5 mg/mL的CGA-N46能够明显抑制克柔念珠菌的细胞增殖能力；对其细胞壁的完整性及细胞膜的通透性没有影响；CGA-N46能明显降低线粒体膜电位。推测CGA-N46可能通过影响线粒体膜电位来抑制克柔念珠菌的生长。

利用不同启动子控制木糖代谢关键酶基因构建可共代谢葡萄糖木糖重组酿酒酵母

金怡, 王震, 莫春玲, 杨秀山, 田沈

2014, 0(2): 153-160.

摘要 ( 227 )

PDF (2479KB) ( 977 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

利用不同强度的启动子调控木糖代谢关键酶活性，构建稳定代谢葡萄糖和木糖产乙醇的重组酿酒酵母。以本实验室专利菌株Saccharomyces cerevisiae Y5为宿主菌，将树干毕赤酵母Pichia stipitis CBS6054的木糖还原酶基因XYL1和木糖醇脱氢酶基因XYL2置于磷酸甘油酸激酶基因启动子（PGKp）控制下，酿酒酵母Y5内源的木酮糖激酶基因XKS1分别由己糖激酶基因启动子（HXK2p）及其内源启动子（XKS1p）控制。这3个基因连同各自表达元件导入宿主细胞中，打通其木糖上游代谢途径。酶活测定结果显示，HXK2p对木酮糖激酶表现出更强的启动效率。重组菌Y5-X3-1中木糖还原酶/木糖醇脱氢酶/木酮糖激酶（XR/XDH/XK）的酶活比值为1∶5∶4，其木糖消耗量是宿主菌的5倍，最高乙醇产量为24.35 g/L，达到理论值的73%。结果表明，通过调节XYL1、XYL2及XKS1启动子的强度，调控其表达水平，进而改变3种酶的活性水平，对于提高重组酿酒酵母利用木糖发酵产乙醇有明显效果。

微生物蛋白质谷氨酰胺酶的初步分离纯化

关静, 孙仁强, 宋佳雯, 黄迪, 成楠, 岑院汉凤, 张扬, 陈曦乐, ,赵怡姗, 朱晨旦, 郑烨, 康立, 高红亮

2014, 0(2): 161-165.

摘要 ( 293 )

PDF (2431KB) ( 758 )

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蛋白质谷氨酰胺酶可以特异性地水解蛋白质和多肽的谷氨酰胺残基，研究了产吲哚金黄杆菌产生的微生物蛋白质谷氨酰胺酶的代谢曲线和初步的分离纯化。发酵过程中pH升高，氨浓度增加，到14 h时酶活达到最高为0.359 U/mL。发酵液离心去上清液经3 kD滤膜超滤4倍时，纯化倍数和得率都最高。超滤液加入4倍体积无水乙醇沉淀蛋白质，酶的得率最高为72.7%。沉淀用缓冲液复溶后，经过SP-Sepharose Fast Flow离子交换层析分离，得到单一峰。经过多步纯化后酶得率为31.72%，纯化倍数为124倍，经SDS-PAGE电泳鉴定为单一条带，分子量约为20 kD。

不同豆类细菌型豆豉的功能性成分分析

杨胜远, 韦锦

2014, 0(2): 166-170.

摘要 ( 238 )

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对细菌型黄豆豆豉、黑豆豆豉、绿豆豆豉、豌豆豆豉、足豆豆豉、红豆豆豉和赤小豆豆豉的功能性成分进行了分析。结果显示，7种豆豉的水分含量均在45%-55%的范围内；黄豆豆豉、黑豆豆豉、豌豆豆豉和绿豆豆豉具有较强纤溶酶和酰胺酶活性，其中黄豆豆豉的纤溶酶和酰胺酶活力最高，分别为（149.07±6.63）IU/g和（120.07±0.39）U/g；7种豆豉都具有一定[DPPH?]清除能力，清除能力大小为黄豆豆豉 > 黑豆豆豉 > 绿豆豆豉 > 豌豆豆豉 > 足豆豆豉 > 红豆豆豉 > 赤小豆豆豉，黄豆豆豉[DPPH?]清除率达到（98.14±1.01）%；不同豆豉的酸可溶性多肽含量差异较大，黄豆豆豉为（82.79±3.14）mg/g，豌豆豆豉为（42.63±1.17）mg/g，其它5种豆豉的多肽含量均在25-29 mg/g之间；黄豆豆豉、黑豆豆豉、绿豆豆豉和豌豆豆豉的总游离氨基酸含量较高，分别达到了（38.89±2.27）mg/g、（32.91±1.13）mg/g、（27.80±0.79）mg/g和（34.12±1.57）mg/g，而其它3种豆豉的总游离氨基酸含量相对较低，仅为黄豆豆豉的1/2左右。功能性成分分析表明，黄豆是制备细菌型豆豉的最适原料。

沙根骨中碳酸钙矿化微生物分离筛选及鉴定

胡伟莲, 戴德慧

2014, 0(2): 171-175.

摘要 ( 227 )

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沙根骨（自命名）是在宁夏中卫地区发现的以碳酸钙为主的胶结物质将周围的沙子凝聚在一起形管状物。对沙根骨中碳酸钙矿化微生物进行了分离筛选，共分离到12株菌株，其中3#菌株有较强碳酸钙矿化能力，在经1.0% CaCl₂液体培养基中振荡培养的72 h后，能形成矿物沉淀并形成薄膜挂壁。沉淀物质经扫描电镜（SEM）及X射线粉末衍射（XRD）分析，确定为方解石和球霞石混合晶型的碳酸钙晶体。根据其形态特征、生理生化以及16S rDNA对3#菌株进行了鉴定，初步认定了该菌为类芽孢杆菌属，命名为Paenibacillus sp.s3，为进一步研究沙根骨的形成机理奠定了良好基础。

pH对米根霉发酵厨余垃圾生产L-乳酸的影响

周群, 盛莉

2014, 0(2): 176-180.

摘要 ( 276 )

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为了强化厨余垃圾发酵L-乳酸的产量和光学纯度，研究了pH对米根霉AS3.819发酵厨余垃圾生产乳酸及其光学特性的影响。结果表明，在中温条件下（34℃），米根霉生长的最适pH为7，最适发酵条件为8。用米根霉发酵非灭菌的厨余垃圾生产乳酸，发酵液中还原糖浓度低，且呈先升高，后下降到最低的趋势。pH 调节到近中性和偏碱性（pH6、7、8）的各组还原糖浓度高于偏酸性组（pH 5和对照组）。控制pH为8时，总乳酸产生速率达1 g/（L?h），L-乳酸是主要的异构体形式，L-乳酸在总乳酸中的比例在整个发酵时间段内都保持在0.75以上，L-乳酸浓度最高达到59.8 g/L，L-乳酸光学纯度可达到0.99。控制pH为8时，可以同时获得高的乳酸产量和光学纯度。

基于流感病毒PAN蛋白的高通量药物筛选

张国防, 李真真, 姚伟利, 王丽君, 朱显明

2014, 0(2): 181-186.

摘要 ( 291 )

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流感病毒的PAN蛋白高度保守，并且具有核酸内切酶活性，是抗流感药物研发的潜在靶点。通过高通量药物筛选体系，从372种化合物中筛选出3种对流感病毒H5N1的PAN蛋白抑制作用较好的化合物。将这3种化合物分别与PAN蛋白进行分子对接模拟，结果显示它们均可以与PAN蛋白活性位点的二价金属离子和氨基酸残基相互作用，从而为抗流感病毒药物的发现提供了先导化合物。

人内皮素受体A基因克隆及表达

潘晓菲, 时丽丽, 谭初兵, 吕超君, 徐为人, 汤立达

2014, 0(2): 187-192.

摘要 ( 301 )

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为了建立内皮素受体拮抗剂筛选系统，克隆人ETA基因，构建真核表达载体，并实现pTag-Lite SNAP-ETA在CHO-K1细胞中的瞬时表达。从人肺腺癌细胞系A549中克隆人ETA基因，连接到pTag-Lite SNAP质粒，构建表达载体pTag-Lite SNAP-ETA，用FuGENER HD转染试剂将表达载体pTag-Lite SNAP-ETA转染入CHO-K1细胞内，通过荧光显微镜检测融合蛋白SNAP-ETA的表达。DNA测序结果表明pTag-Lite SNAP-ETA表达载体构建成功，荧光显微镜检测结果表明人ETA在CHO-K1细胞中有效表达。

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