生物技术通报

植物叶绿素降解机制研究进展

丁跃, 吴刚, 郭长奎

2016, 32(11): 1-9. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.001

摘要 ( 451 )

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叶绿素降解与作物产量密切相关,叶绿素降解延迟,能延长作物后期的光合能力,并提高作物产量。近年随着结构生物学、基因组测序和生物信息学的发展,人们已经在植物叶绿素降解机制的研究上取得了一系列进展,特别是对叶绿素降解的主要生化途径—— 脱镁叶绿酸氧化酶（pheide a oxygenase,PaO）途径已有深入的了解。主要对近年来叶绿素降解代谢、调控机理、滞绿突变体等三方面的研究进展进行综述,并对未来研究方向进行了展望,旨为作物育种和光高效利用提供理论依据。

植物富含半胱氨酸的类受体激酶的研究进展

郑超, 李登高, 白薇

2016, 32(11): 10-17. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.002

摘要 ( 367 )

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类受体激酶（receptor-like kinase,RLK）是植物体内普遍存在的一类蛋白激酶,是许多信号识别传递途径中的关键组分,作为识别信号的质膜受体,能够感受外界刺激,通过磷酸化作用参与胞内信号传递。富含半胱氨酸的类受体激酶（cysteine-rich receptor-like kinase,CRK）又被称为DUF26（domain of unknown function 26）类受体激酶,是RLK中的一大类。近几年,越来越多的研究发现CRK参与了植物的抗病防御反应。综述了植物CRK蛋白的结构特征,总结了目前已发现的CRK在生物胁迫、非生物胁迫及生长发育中的功能,并对CRK未来的研究进行了展望,旨为后续阐明CRK的功能和分子机制提供参考。

功能性分子标记在小麦育种中的应用

刘国圣, 张大乐

2016, 32(11): 18-29. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.003

摘要 ( 446 )

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功能标记是根据与表型紧密相关的功能基因内部特定区域的多态性序列,利用关联分析、表达谱分析、RNA干扰和QTL作图等方法开发而出的一种新型显性分子标记,此类标记可以对不同遗传背景下目标等位基因的有无作直接、快速的判定。简单介绍了功能标记的概念及特点,着重探讨功能标记作为一种辅助育种手段在小麦育种中的应用及其开发前景,以期为相关分子标记的开发提供参考。

海洋鱼类种群基因组学研究进展

柳莹, 高丽, 冯俊荣

2016, 32(11): 30-37. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.004

摘要 ( 339 )

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近年来,高通量测序技术的发展及大数据分析能力的提高使得生物基因组水平上的研究日趋广泛。通过基因组测序、单核苷酸多态性识别、种群转录组学研究等方法,有助于进一步了解生物群体内部的适应性状相关基因的进化历程及调控机制,对于理论研究与生产实际均具有重大意义。通过海洋鱼类种群基因组学的研究,可以加深对于微观进化的重要环节,如遗传分化的产生、杂交带的维系及物种形成等机制的理解。因此,相关研究将有助于人们更好地理解海洋生物的进化过程,并且为水产养殖业的发展及海洋渔业资源的管理和保护提供理论依据。

海洋微生物多糖降解酶的研究进展

文霞, 周少璐, 杨秀茳, 孙廷丽, 谢小保

2016, 32(11): 38-46. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.005

摘要 ( 363 )

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多糖降解酶是一类能够催化多糖分子内糖苷键断裂,使聚合度不断降低,最终产生寡糖的水解酶。地球上微生物数量庞大,其产多糖降解酶种类丰富,尤其是海洋微生物多糖降解酶因其特异性的催化活性,在工业生产中具有重要的应用前景。随着海洋生物技术的快速发展,海洋微生物多糖降解酶的开发和利用已逐渐引起研究者的关注。综述了海洋微生物多糖降解酶的主要类型及研究现状,并讨论了未来应用及发展趋势,以期为海洋微生物多糖降解酶的研究与开发提供参考。

细菌信号分子N-酰基高丝氨酸内酯调控植物抗病反应的研究进展

靳晓扬, 侯鹏飞, 张肖晗, 赵芊, 宋水山

2016, 32(11): 47-51. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.006

摘要 ( 243 )

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N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）在生物信息交流中发挥了重要作用,为革兰氏阴性细菌种内和种间的相互作用提供了化学基础并参与细菌多种生理行为的调控。不仅是细菌,植物同样可以感知AHLs,并作出反应。综述近几年来AHLs调控植物抗病反应的研究进展,有助于探究AHLs对寄主植物的影响途径和机理,旨为在农业上的应用奠定理论基础。

p53参与代谢调控的研究进展

陈珂, 丁艳平, 王建林, 邵宝平

2016, 32(11): 52-58. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.007

摘要 ( 262 )

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p53作为肿瘤抑制因子,其不仅参与遗传毒性应激调节,而且在代谢平衡调控中也发挥重要作用。当机体或细胞处于不同生理逆境时,活化的p53通过参与糖代谢、脂肪酸代谢、ROS水平等相关调节信号通路影响各种代谢途径,进而通过诱导细胞周期阻滞、修复、衰老或凋亡的发生,最终调控机体或细胞产生代谢应激。总结了近年来p53途径的相关报道,对p53与癌症、代谢综合证的关系进行了阐述,以期为进一步理解p53参与的代谢调控提供参考。

脂肪酶的固定化及其在食品领域的应用

魏雪, 孙丽超, 李淑英, 王凤忠, 辛凤姣

2016, 32(11): 59-64. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.008

摘要 ( 456 )

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脂肪酶（lipase,EC 3.1.1.3）是一类能将长链脂肪酸甘油酯水解成脂肪酸和单甘油酯、甘油二酯或甘油的生物酶,主要来源于动物、植物和微生物。脂肪酶在食品领域的应用有巨大潜能,改善脂肪酶的性能对于实现工业上连续化和低成本的生产具有重要的意义。固定化酶技术可以通过提高脂肪酶的酶活力、稳定性及回收率显著改善脂肪酶的性能。固定化脂肪酶在食品领域中被广泛应用于糖酯合成、油脂改性、芳香味酯类化合物及抗坏血酸酯类抗氧化剂的合成。介绍了脂肪酶及固定化酶技术,并综述了近7年固定化脂肪酶在食品领域中的应用。最后对如何提高脂肪酶性能进行了展望。

基因分离及克隆技术在热带果树中的应用研究进展

安娜, 吴友根, 陈萍

2016, 32(11): 65-71. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.009

摘要 ( 283 )

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以常见的几种热带水果（香蕉、番木瓜、芒果、菠萝和荔枝等）为例,总结了近年来利用常见的技术手段如cDNA末端快速克隆技术（repid-amplification of cDNA ends,RACE）和实时逆转录聚合酶链式反应技术（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）等方式进行基因分离,并将成功克隆出的目的基因或片段进行基因分析与表达研究,最后阐述了基因分离与克隆技术的优势与缺陷,对基因分离及克隆技术提出了展望,旨为今后科研人员进行进一步的基因分子生物学水平上的热带果树研究与热带农业科学研究奠定基础。

基因侧翼序列扩增技术的应用进展

蒲远波, 郭翠, 平淑珍

2016, 32(11): 72-79. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.010

摘要 ( 295 )

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扩增基因的侧翼序列在分子生物学研究中具有重要作用。到目前为止,克隆基因侧翼序列的方法主要可以分为3类：反向PCR、外源接头介导PCR、半随机引物PCR。对这些技术的原理以及近期的应用情况进行了较为系统的综述,旨在为研究者选择更可靠、更合理的方法提供依据。

致病性大肠杆菌现状分析及检测技术研究进展

卫昱君, 王紫婷, 徐瑗聪, 许文涛

2016, 32(11): 80-92. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.011

摘要 ( 441 )

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致病性大肠杆菌是一类常见的致病菌,能够通过多种感染渠道导致大肠杆菌感染疫情大规模爆发,其耐药性的出现引起广泛担忧的同时,也促进了新型抑菌方式的研究。目前大肠杆菌风险毒力因子作为致病的直接因素,备受国内外研究人员的关注。大肠杆菌检测技术也相应获得了较快的发展,相较传统方法,新型的病原菌检测技术能够快速、特异、准确地检测目标菌。结合国内外研究现状从大肠杆菌的污染情况、感染途径及症状、耐药性、风险毒力因子及检测方法等方面综述了大肠杆菌毒力评估及检测技术研究进展。

端粒长度检测方法及其应用

张彬, 王长利

2016, 32(11): 93-98. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.012

摘要 ( 571 )

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人类的衰老与肿瘤的发生是影响人寿命的重要因素,几十年来的研究表明端粒长度的变化在这两个进程中扮演了极其重要的角色,因此熟知分析端粒长度的方法就显得非常重要。目前,有多种端粒长度检测的方法,包括端粒末端限制性片段分析（terminal restriction fragment,TRF）,定量PCR（qPCR）,荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）和单链端粒长度分析（single telomere length analysis,STELA）等。但每种方法都有适用的范围,在研究和应用过程中需要熟知各种方法的原理、优势和局限,从而选择合适的检测方法,才能达到我们的研究目的,解决具体问题。因此将对目前常用的端粒长度检测方法进行综述。

短小芽孢杆菌实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选

贺婷停, 宋婷, 王超, 张长斌, 王海燕

2016, 32(11): 99-106. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.028

摘要 ( 380 )

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为了利用荧光定量PCR方法分析短小芽孢杆菌的基因表达水平,需要首先确定适合该菌株的荧光定量PCR分析内参基因。以短小芽孢杆菌的16S rRNA、mecA、cadR、rpoB及sphP 共5个基因作为候选内参基因,利用实时荧光定量PCR的方法分析这5个候选基因在短小芽孢杆菌发酵培养不同时间点的表达情况,再用geNorm和NormFinder 软件评估它们的表达稳定性。结果显示,利用geNorm软件分析得出16S rRNA和mecA是表达最稳定的基因,最适内参基因数为2。NormFindr软件分析得出mecA为最稳定的基因。对短小芽孢杆菌3个功能基因的差异表达分析结果表明,16S rRNA和mecA都是合适的内参基因,而mecA基因由于表达丰度适中,更适合于作为内参基因研究结构基因的表达。为了得到更准确的差异表达结果,也可用两个基因同时进行校正。

分子信标-TaqMan探针法实时荧光定量PCR新型探针及引物

姜文灿, 岳素文, 江洪, 葛素君, 王成彬

2016, 32(11): 107-114. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.029

摘要 ( 333 )

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在TaqMan探针法实时荧光定量PCR中,排除由引物探针聚合延伸引起的假阳性问题以及由引物二聚体（Primer Dimer,PD）引起的假阴性问题。首先对不同探针进行引物探针聚合实验;然后通过双重PCR的干扰实验选择合适的内标基因,并使用内标质粒检测验证中部同序引物排除PD干扰的实用性;最后比较探针法不同体系检测HBV基因的灵敏度。结果表明,引物与探针聚合实验中,含有反义碱基的HBVP4在重复实验中未出现假阳性;竞争性双重PCR和非竞争性双重PCR两模板开始出现干扰作用的浓度差分别为20倍和100倍;对于内标基因,使用中部同序引物对以及普通引物对分别可以检测到10^-9和10^-8稀释度;3种HBV基因检测体系,使用普通引物对可以检测到Ct33左右,加入内标系统和使用中部同序引物对均可检测到Ct35左右。在TaqMan-分子信标结构调整的基础上引入反义碱基可以在排除由引物和探针聚合延伸引起的假阳性问题;在探针法中,使用中部同序引物对和加入内标系统均可降低PD的干扰程度,提升检测的灵敏度。

利用原生质体融合技术构建耐酸絮凝性产乙醇酿酒酵母

苟敏, 杨白雪, 汤岳琴, 木田建次

2016, 32(11): 115-123. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.013

摘要 ( 238 )

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为获得具有多种优良性状的高效乙醇生产菌株,以絮凝性酿酒酵母RHZ-1及耐酸耐温酿酒酵母SEB2为亲本,通过紫外诱变获得营养缺陷型标记菌株,并利用原生质体融合技术选育耐酸絮凝性酿酒酵母。通过对融合子的筛选获得一株优秀的耐酸絮凝性酿酒酵母菌株RS-1;该菌株在30℃,pH2.2,15% YPD条件下发酵24 h,乙醇产生量为47.87 g/L,糖消耗速率和基于糖消耗的乙醇收率分别比亲本菌株RHZ-1提高了19.5%和9.8%。在35℃,pH2.2,15% YPD条件下发酵48 h,乙醇产生量为38 g/L,糖消耗速率和乙醇收率分别比亲本菌株RHZ-1提高了46.8%和21.6%。结果表明,获得的菌株可为提高燃料乙醇的生产效率奠定基础。

不同沉淀方法处理胶乳总RNA对基因扩增效率的影响

吴春太, 黎瑜, 冯伟瑜, 曾日中

2016, 32(11): 124-129. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.014

摘要 ( 246 )

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为探明沉淀方法对胶乳总RNA提取及PCR扩增效率的影响,并寻求较好的RNA沉淀方法,针对胶乳中蛋白、多糖、橡胶粒子含量高的特点,在本实验室改进的SDS法的基础上,分别用LiCl、NaCl+异丙醇、NaCl+NaAc+无水乙醇和NaAc+无水乙醇对橡胶树胶乳总RNA进行沉淀,并对所得RNA的完整性、纯度、含量和RT-PCR扩增效率进行比较。结果表明,4种方法均可获得完好的RNA,但其纯度、含量和PCR扩增效率随方法不同而有所差别,其中NaCl+NaAc+无水乙醇沉淀的橡胶树胶乳总RNA纯度、产率和18S、REF基因扩增效果均较高,故认为用NaCl+NaAc+无水乙醇沉淀胶乳总RNA是一种较为有效的方法。

极端嗜酸热古菌Acidianus manzaensis膜蛋白提取方法的建立及应用

杨云, 刘红昌, 夏金兰, 马亚龙, 聂珍媛

2016, 32(11): 130-136. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.015

摘要 ( 239 )

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以万座嗜酸两面菌（Acidianus manzaensis）为研究对象,探索并优化其膜蛋白提取方法,以优化后的方法提取该菌分别以单质硫（S⁰）和亚铁（Fe²⁺）为能源底物进行生长时的膜蛋白质,并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）研究膜蛋白在两种能源底物培养下的表达差异。首先通过80℃水浴60-70 min对A. manzaensis胞外黏附蛋白进行初步分离。其次比较了不同提取剂（Triton X-110,SDS和Triton X-114）对膜蛋白的提取效果,结果表明Triton X-114的提取效果较好,其最佳浓度为10%（w/v）;比较了不同沉淀剂（三氯乙酸（TCA）,丙酮,三氯乙酸/丙酮,甲醇和乙醇）对膜蛋白质沉淀的效果,结果表明TCA/丙酮的沉淀效果最不理想,会导致沉淀后低分子量蛋白发生缺失,而其他几种没有明显差别,综合比较选择较常用的丙酮作为膜蛋白提取的沉淀剂。最后基于优化后膜蛋白提取方法,分别对S⁰和Fe²⁺培养的A. manzaensis膜蛋白质进行提取及SDS-PAGE,结果发现分子量为35.6 kD 和16.9 kD的蛋白只在A. manzaensis以S⁰生长时出现,表明这些蛋白质很可能在A. manzaensis硫氧化中发挥了重要作用;分子量为72 kD 和26 kD的蛋白质在A. manzaensis以Fe²⁺生长时比其以S⁰生长时显著表达上调,表明此蛋白可能与A. manzaensis铁氧化相关。

宏基因组靶向测序分析皮肤表面微生物群落方法优化

姚雪, 刘文丽, 裴广倩, 童贻刚, 罗亚平

2016, 32(11): 137-143. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.016

摘要 ( 261 )

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通过实验设计和数据分析,筛选出尽可能真实反映含量较低的皮肤微生物群落的高通量测序分析方法。使用多因素多水平完全随机实验设计,分析DNA提取、PCR扩增、样品采集、测序过程中各种实验因素对微生物群落组成特征分析结果的影响。结果显示,在样品采集方面,筛选出了最佳的采集拭子与采集液体;在DNA提取方面,筛选出了最佳的前处理方法及试剂盒种类;在PCR反应方面,筛选出了最佳的模板浓度及退火温度;在测序方面,筛选出了合适的测序深度。通过一系列的实验条件筛选,确定了适合分析低含量细菌群落结构组成特征的方法,并成功地应用于人类手掌面皮肤。

黑果枸杞果实成熟发育过程表达谱差异分析

彭勇, 陈尚武, 马会勤

2016, 32(11): 144-151. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.017

摘要 ( 232 )

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对黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）3个不同发育时期的果实进行转录组测序,分析对比黑果枸杞果实不同发育时期相关基因表达谱的变化。提取果实RNA进行Illumina高通量测序,利用GO、KEGG等公共数据库进行功能注释、分类,利用数字基因表达谱技术对比分析。结果显示,KEGG pathway 富集分析表明亮氨酸生物合成途径在变色期对比青果期有7个差异表达基因,黑熟期对比变色期有35个差异表达基因,且全部为上调表达。在糖酵解途径中3个不可逆的反应步骤限速酶基因在黑熟期均为上调表达。对黑果枸杞亮氨酸合成和糖酵解涉及到的基因进行了功能和代谢通路的分析,为黑果枸杞种质资源探索提供理论基础。

花粉介导法获得耐草甘膦玉米植株及其耐性研究

杨慧珍, 任志强, 肖建红, 卜华虎, 刘惠民

2016, 32(11): 152-161. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.018

摘要 ( 196 )

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为获得耐草甘膦转基因玉米植株,进而研究其除草剂耐性及外源基因的遗传特性,以质粒pBI101-aroA-M12为外源基因供体,以玉米自交系昌‘7-2'为受体,采用花粉介导法将外源基因导入玉米自交系中。PCR扩增、Southern杂交分析的结果证明获得了54个转基因植株;对其后代株系的分子检测及田间生物学鉴定,结果证明目的基因可以稳定遗传给后代植株,且赋予和提高了转基因植株的除草剂耐性。目的基因在转化体中的遗传规律研究,结果显示导入的目的基因在F₂受体植株中以3∶1的比例发生遗传分离,符合孟德尔单因子显性遗传分离规律。ELISA分析和蛋白质浓度测定的结果证实目的基因在转化植株中得到表达,表达量介于40.5-112.6 ng/g 叶片鲜重之间,目的基因表达量与该植株的除草剂耐性性状间呈极显著相关,r=0.942 3（P<0.01）。最终研究获得了4个高草甘膦耐性的转基因纯合株系。

植物表皮毛发育控制基因GL2遗传互作因子的筛选和鉴定

侍双月, 陈子玉, 安丽君

2016, 32(11): 162-169. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.019

摘要 ( 379 )

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表皮毛广泛存在于陆生植物的地上部分,是植物与环境之间的一道天然屏障,具有多种重要的生物学功能。拟南芥HD-Zip家族转录因子GLABRA 2（GL2）是调控表皮毛形成和发育的关键因子,通过筛选和鉴定GL2的遗传互作因子,可以为进一步研究植物表皮毛发育调控的分子机制奠定基础。通过大规模的遗传筛选和图位克隆,获得了一个叶片上完全没有表皮毛的突变体M12-01,遗传分析表明M12-01 single突变表型受隐性单核基因控制。M12-01 single突变体表型与拟南芥TRANSPARENT TESTA GLABKA 1（TTG1）基因的功能缺失突变体表型相似。对TTG1基因的测序结果显示其+445位碱基由鸟嘌呤突变为腺嘌呤,从而使编码的甘氨酸变为精氨酸。本研究证实TTG1突变能增强gl2-3突变体的表型,GL2基因与TTG1基因之间存在遗传互作,这为进一步研究GL2调控植物表皮毛发育的分子机制提供了新的遗传材料。

红麻MYB21基因的克隆、表达及载体构建

钱景华, 周步进, 孔祥军, 李增强, 史奇奇, 廖小芳, 周瑞阳, 陈鹏

2016, 32(11): 170-179. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.020

摘要 ( 269 )

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克隆红麻不育系和保持系的MYB21基因,分析MYB21基因在红麻不育系和保持系各器官的表达量,并构建过表达载体和RNAi载体,旨在为进一步研究该基因在红麻中的功能奠定基础。以同源克隆的方法克隆MYB21基因;用实时荧光定量的方法分析MYB21基因在红麻不育系和保持系不同组织器官的表达模式;根据酶切-连接的方法,构建过表达载体和RNAi载体。结果显示,红麻MYB21基因在不育系和保持中的基因序列没有差异,其cDNA全长序列为922 bp,包含843 bp的开放阅读框,DNA全长序列为1 108 bp,包含3个外显子和2个内含子（NCBI序列登录号为KT898146）;MYB21基因主要在花药中表达,在不育系和保持系花药之间表达量呈极显著差异;成功构建MYB21过表达载体和RNAi载体。成功克隆MYB21基因的全长序列;实时荧光定量结果表明MYB21基因主要在花药中进行表达;构建的植物过表达载体PBI121-MYB21和RNAi载体pART27-PK-R1-F2可用于该基因的功能研究。

大黄鱼酪氨酸激酶基因克隆及原核表达分析

张在鹏, 林鹏, 郭松林, 王艺磊, 张子平, 冯建军

2016, 32(11): 180-187. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.021

摘要 ( 232 )

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为了研究大黄鱼（Larimichthys crocea）T淋巴细胞酪氨酸激酶（lymphocyte cell kinase,LCK）的基因结构和功能,通过RT-PCR和RACE技术克隆了大黄鱼LCK（LcLCK）基因cDNA 全长序列,并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对该基因在大黄鱼各组织器官和胚胎发育各时期的表达情况进行了检测与分析,同时构建了LcLCK基因的原核表达载体,在大肠杆菌中进行了高效表达。结果表明,获得的LcLCK基因全长为2 334 bp,开放阅读框为1 503 bp,编码501个氨基酸。该蛋白具有非受体酪氨酸激酶Src家族典型的SH3、SH2和TyrKc三个结构域,其N端含有GCXCS和CXXC基序,C末端出现2个与人类LCK基因中的Tyr³⁹⁴和Tyr⁵⁰⁵相一致的保守酪氨酸位点。系统发育树表明LcLCK与红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）LCK聚为一支;LcLCK基因在雌雄大黄鱼各组织器官中均有表达,其中在主要免疫器官脾脏、头肾和鳃有高丰度表达,雌性个体的表达量要高于雄性个体;胚胎发育过程中,LcLCK基因表达水平在多细胞期、囊胚期和原肠期较高,囊胚期达到峰值,卵黄栓形成期显著降低,眼泡出现期至孵出期持续下降,而初孵仔鱼期则有所回升;构建的原核表达载体pGEX-4T-2-LCK在大肠杆菌中成功表达,其新增LcLCK重组蛋白条带在SDS-PAGE电泳检测中约为84 kD,与预期表达的分子量相符。大黄鱼LcLCK在雌雄成熟个体的细胞免疫应答以及胚胎发育过程中T淋巴细胞免疫器官的形成密切相关。

CKS1B参与拟穴青蟹性腺发育的研究

韩坤煌, 戴燕彬, 邹志华, 张子平, 王艺磊

2016, 32(11): 188-193. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.030

摘要 ( 253 )

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CDC28蛋白激酶调节亚基1B（CDC28 protein kinase regulatory subunit 1B,CKS1B）是高度保守的CKS1家族成员之一,在细胞周期中作为细胞周期蛋白激酶的调节亚基参与调控真核生物的细胞分裂。因此,研究CKS1家族基因参与甲壳动物性腺发育调节的分子机制具有重要的意义。从已构建的拟穴青蟹性腺EST数据库中筛选到CKS1B基因片段,继而克隆出其全长cDNA序列（Sp-CKS1B）,并利用qRT-PCR技术检测其在不同组织和性腺不同发育阶段中的差异表达。结果显示,获得Sp-CKS1B的全长cDNA序列722 bp,其中5' UTR为82 bp,3' UTR为379 bp,开放阅读框261 bp,编码86个氨基酸,包含一段典型的CKS保守序列,属于CKS家族蛋白。在不同组织qRT-PCR结果显示,Sp-CKS1B 基因在O5期雌蟹卵巢中的表达水平最高,并与其他组织具有极显著差异（P<0.01）;同时,在性腺不同发育阶段的表达结果显示,Sp-CKS1B 基因在精巢T1期的表达量最高,其次为O5期,二者显著高于卵巢O1-O4期的表达水平（P<0.05）;而在精巢T3期的表达量最低,并显著低于T1、T2以及卵巢O4、O5期的表达水平（P<0.05）。结果说明了Sp-CKS1B在拟穴青蟹的性腺发育过程中可能具有十分重要的作用。

抗金黄色葡萄球菌单链抗体（scFv）的原核表达及蛋白纯化

李晶泉, 徐永平, 王熙涛, 李媛, 王丽丽, 李晓宇

2016, 32(11): 194-201. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.022

摘要 ( 358 )

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旨在将来源于鸡的金黄色葡萄球菌单链抗体（scFv）进行原核诱导表达,获得有抗体活性的目的蛋白。构建含有目的抗体基因的重组质粒,将此质粒进行原核诱导表达并鉴定所获得蛋白的生物活性。结果显示,（1）成功构建了含有金黄色葡萄球菌单链抗体（scFv）的重组质粒pCold I-scFv,质粒成功转化到大肠杆菌表达菌株中;（2）经过诱导表达后,目的蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中;（3）使用4 mol/L 尿素成功地将包涵体变性溶出;（4）通过柱层析法及透析法获得了纯化及复性效果较好的目的蛋白;（5）间接ELISA鉴定证实所获蛋白具有金黄色葡糖球菌抗体活性。通过质粒构建及原核诱导表达、包涵体溶出和复性等步骤,最终获得了有金黄色葡萄球菌抗体活性的目的蛋白。

重组人βNGF在大肠杆菌中的可溶表达、纯化及活性鉴定

白羊, 章永垒, 邹有土, 黄奋飞, 陈胜亮, 阮卡, 葛平辉, 马燕玲, 王明灶, 陈星

2016, 32(11): 202-207. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.023

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旨在大肠杆菌中可溶表达重组人神经生长因子（Recombinant human β nerve growth factor,rhβNGF）,并对表达产物进行分离纯化和生物学活性鉴定。成功扩增hNGF β亚基基因,将其克隆入pMAL-c2X表达载体,构建了hβNGF-MBP的大肠杆菌表达体系并进行诱导表达,表达产物经纯化后以Factor Xa酶切去除麦牙糖结合蛋白（MBP）,Western blot鉴定后以TF-1细胞法检测生物学活性。结果显示,pMAL-c2X-hβNGF经酶切和测序证实构建正确,25℃、180 r/min、0.5 mmol/L IPTG诱导下可溶表达hβNGF-MBP融合蛋白。hβNGF-MBP经Factor Xa酶切后可去除MBP标签,SDS-PAGE分析纯化的hβNGF位于13 kD左右,纯度可达95%。Western blot鉴定为hβNGF,结果表明,比活约为1×10⁶ U/mg。在大肠杆菌中成功可溶表达hβNGF,并具有较高的生物学活性。

马尾松毛虫质型多角体病毒NSP1蛋白在昆虫细胞表达及定位

靳亮, 许翠萍, 王金昌, 关丽梅, 张稳超, 黄朝, 高学梅, 王洪秀

2016, 32(11): 208-214. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.024

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马尾松毛虫质型多角体病毒（Dendrolimus punctatus cytoplasmic polyhedrosis virus,DpCPV）基因组S5片段编码一个由881个氨基酸组成、分子量为101 kD的非结构蛋白（NSP1）。为探寻DpCPV NSP1蛋白的功能,将DpCPV 1基因组S5-1片段的抗原区（1-600 bp）进行了原核表达,并将纯化蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。将稀释后的病毒液感染甜菜夜蛾幼虫,感染后每天解剖甜菜夜蛾并取中肠样品,通过Western blot检测NSP1蛋白的合成时间曲线。Western blot检测结果显示,S5片段表达的蛋白在病毒感染第1天就有合成,并且除了检测到全长的蛋白（101 kD）外,也检测到了80 kD和20 kD的蛋白条带,说明NSP1蛋白为早期表达蛋白,并且蛋白发生了切割。另外,首次对DpCPV 1 S5片段进行了在昆虫细胞中表达和昆虫亚细胞定位,结果显示,昆虫细胞定位于细胞的细胞质。

低温木糖苷/阿拉伯呋喃糖苷酶AX543的基因克隆及性质研究

张明慧, 李中媛, 仇海燕, 王翠琼, 王惠, 张同存

2016, 32(11): 215-223. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.025

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旨在获得在低温条件下具有高催化能力的低温木糖苷酶,并对其进行异源表达研究和酶学性质分析。利用Touch down PCR和TAIL PCR方法,从枝顶孢菌中克隆得到一个序列新颖的GH43家族双功能木糖苷酶/阿拉伯呋喃糖苷酶基因ax543,该酶基因在毕赤酵母中成功表达。酶学性质分析发现重组酶AX543的最适温度为25℃,在15℃和4℃仍有54%和21%的相对酶活;具有木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶活性,并可以降解木二糖、木三糖、桦木木聚糖、榉木木聚糖和小麦阿拉伯木聚糖;可以与木聚糖酶Xyn11-1协同作用,协同度达1.46;具有高木糖/阿拉伯糖耐受性,抑制常数K_i分别为84.78 mmol/L和54.01 mmol/L。

脂环酸芽孢杆菌A1的分离鉴定及其对中低品位磷矿的溶磷研究

李凌凌, 吕早生, 杨忠华, 左振宇, 李尧益

2016, 32(11): 224-234. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.026

摘要 ( 208 )

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微生物溶磷技术为充分利用我国丰富但难选的中低品位磷矿开辟了一条新的途径。旨在筛选出针对中低品位磷矿的高效溶磷菌,从湖北宜昌磷矿的酸性矿坑水中分离出一株兼性嗜酸异养菌A1。经菌株形态特征、生理生化指标和16S rDNA序列分析,鉴定属于Alicyclobacillus aeris。分析A1菌在4 种不同培养基的生长及浸磷情况,结果显示,菌株A1在YSG培养基中生长及溶解中低品位磷矿的情况最佳,其中磷的浸出率高达77.22%,与无菌对照的化学浸出相比约提高了62%。根据原始磷矿和A1菌在YSG培养基中溶解的磷矿矿渣的物相分析及相应浸矿液的高效液相色谱检测,结果表明,A1菌发酵有机碳源代谢产生以草酸和柠檬酸为主的混合有机酸,磷矿石中的氟磷灰石、碳氟磷灰石经过这些有机酸的溶解,析出可溶性磷酸盐并同时生成石膏。

产几丁质酶菌株S68-CM5产酶条件优化研究

胡基华, 曹旭, 孟力强, 陈静宇, 姜威, 刘宇帅, 张淑梅, 李晶

2016, 32(11): 235-240. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.027

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为提高黏质沙雷氏菌株S68-CM5产几丁质酶能力,对产酶发酵条件进行优化研究。利用Plackett-Burman设计和响应面法对培养基和发酵条件进行摸索。结果显示,获得最佳发酵产酶培养基：胶体几丁质1.5%,牛肉膏7 g/L,酵母膏2 g/L,葡萄糖8 g/L,氯化钠 3.5 g/L,蛋白胨2 g/L,磷酸氢二钾3.5 g/L;最佳产酶培养条件为：pH6.88,温度27.32℃,摇床转数155.82 r/min,培养时间60 h,接种量1%,装液量50 mL/250 mL。优化后产酶量达到7.131 U/mL,比优化前产酶量提高了1.43倍。

纳豆菌发酵制作鱼内脏有机肥与抑制立枯丝核菌的应用

叶日英, 孙力军, 王雅玲, 吉宏武, 徐德峰, 廖建萌

2016, 32(11): 241-247. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.031

摘要 ( 364 )

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为了探索纳豆菌有机肥对作物的生长作用及其提高作物对茎基腐病原菌-立枯丝核菌的抗性能力,以纳豆菌作为发酵菌兼功能菌制作鱼内脏有机肥,将成品有机肥进行作物对立枯丝核菌的抗性应用实验：将番茄和辣椒种子播种于感染立枯丝核菌的园土及原园土中,对比植株在两种园土中的生长情况,并进行纳豆菌与立枯丝核菌平板对峙培养试验。结果发现,成品有机肥对两种种子发芽的作用都不明显,两种作物在两种园土中加肥组的植株生长量均达到无肥组的3倍左右,染菌园土中不加肥的番茄和辣椒苗茎基腐病苗率分别是55%和50%,加肥组的番茄和辣椒苗茎基腐病苗率分别是11%和17%;平板对峙培养的菌落状况显示立枯丝核菌生长受到抑制。结果表明,纳豆菌对立枯丝核菌生长具有抑制作用,用纳豆菌发酵制作的有机肥提高番茄和辣椒的生长量,并减少这两种作物的茎基腐病苗率。

维生素K₂合成途径中主要酶对MK-7产量的影响

徐建中, 王颖妤, 严为留, 张伟国

2016, 32(11): 248-254. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.032

摘要 ( 239 )

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对菌株Y-2维生素K₂合成途径中的6个主要酶基因分别进行克隆和表达,以探索不同酶基因对MK-7产量的影响。参照《分子克隆实验指南》完成对基因重组质粒的构建,并对spizizen转化法进行改进,实现重组质粒对菌株Y-2的转化。结果表明,分别过量表达维生素K₂合成途径中的6个基因均能提高MK-7的产量。需要指出的是,过表达基因hep S对MK-7产量的影响最大,其中在摇瓶培养组的产量提高了38%,静置培养组的产量提高了48%。其余几个基因过表达后对MK-7产量的影响则根据培养方式的不同而各有差异。

CydDC蛋白的表达及对谷胱甘肽运输的影响

全聪, 张静, 吴辉, 李志敏, 叶勤

2016, 32(11): 255-260. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.033

摘要 ( 246 )

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在重组大肠杆菌中共表达了谷胱甘肽运输蛋白CydDC与双功能合成酶GshF,通过增强对谷胱甘肽的运输作用,提高谷胱甘肽产量。实验结果表明,目的蛋白CydDC及GshF均成功表达;重组菌MG1655（pTrc99a-as/pBAD33-cydDC）总谷胱甘肽产量为0.22 mmol/L,胞外谷胱甘肽含量显著增加,达到81.9%,分别是对照菌MG1655（pTrc99a-as/pBAD33）的1.11倍和1.29倍。

谷胱甘肽合成酶系CLEAs的制备及应用

田慧, 杨峰晨, 卢泓宇, 徐期, 杨勇

2016, 32(11): 261-270. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.034

摘要 ( 329 )

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为在谷胱甘肽合成工艺中降低成本,同时能够实现酶的可存储性、商品化性,将谷胱甘肽合成酶系经过合适的沉淀剂沉淀,戊二醛交联制备成共固定交联酶聚集体。通过优化沉淀条件,交联条件,蛋白浓度及添加剂的使用,最终得到最优的制备方法为：在4℃,30 g/L蛋白浓度条件下,加入PEI-600（添加剂w∶酶液蛋白w=1∶5）与酶液进行充分混合,然后加入60%饱和度硫酸铵沉淀4 h,最后以0.5%戊二醛进行交联。最终蛋白沉淀率为94.9%,酶活回收率为48.2%,单位CLEAs的酶活为4.9 U/g,分别相比对照组的28.7%及2.57 U/g提高了19.5%和2.33 U/g,GSH最高产量达到11.26 g/L,在转化第12批次时GSH产量为9.03 g/L,相对酶活力为78.4%,4℃条件下储藏33 d后相对酶活力为92.12%。经优化制备条件后得到的谷胱甘肽合成酶系CLEAs有较高的初始酶活力,能稳定转化10批次以上,储藏稳定性佳,具有优良的工业化前景。

纳米硒抗胰岛β细胞凋亡作用与机制的研究

饶磊, 饶敏, 仇红红, 李红辉, 刘静, 庄满娇

2016, 32(11): 271-277. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.035

摘要 ( 242 )

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旨在研究纳米硒（SeNPs）抗二型糖尿病胰岛β细胞凋亡的作用及机制。通过电子显微镜,纳米粒度仪等技术方法对SeNPs的表征进行鉴定,并运用相关分子生物学技术验证其对于胰岛β细胞凋亡模型的保护作用及机制。结果表明,壳聚糖（CS）修饰后的SeNPs表面电荷增加到24.8 mv,其保存期延长到100 d以上。另外,细胞学实验表明浓度在2 μmol/L以下SeNPs不具有毒性,38.1 nmol/L SeNPs可通过激活硫氧还蛋白还原酶（TrxR）活性,从而减轻胞内氧化应激（ROS）水平,最终使胰岛β凋亡模型细胞存活率提高了31.75%。动物学实验也表明SeNPs能抗胰岛β细胞凋亡。因此,SeNPs可有效减轻二型糖尿病中胰岛β细胞凋亡,对于二型糖尿病具有潜在的治疗价值。

精确自组装纳米标记分析方法在前列腺癌早期检测与预后中的应用研究

樊春海, 徐静娟, 刘庄, 鲁娜

2016, 32(11): 278-280.

摘要 ( 160 )

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无标记纳米化学发光新一代体外诊断技术及其在急性心肌梗死快速诊断中的应用

崔华, 邵元华, 徐国宝, 杨笛

2016, 32(11): 281-283.

摘要 ( 193 )

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肿瘤微环境响应型磁性纳米粒子组装用于肝癌的可视化治疗

凌代舜, 孔学谦, 孙晓莲

2016, 32(11): 284-286.

摘要 ( 156 )

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2016, 32(11): 300.

摘要 ( 117 )

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