生物技术通报

植物AP2/ERF转录因子家族的研究进展

张麒, 陈静, 李俐, 赵明珠, 张美萍, 王义

2018, 34(8): 1-7. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-1142

摘要 ( 1088 )

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作为植物最大转录因子家族之一,AP2/ERF转录因子广泛存在于植物中,并因其在基因育种等方面具有重要作用而倍受关注。AP2/ERF转录因子家族成员至少含有一段60个左右氨基酸构成的AP2保守结构域,根据结构域的数量和识别序列的不同可以将其分为AP2、ERF、DREB、RAV和Soloist 5个亚家族,且在拟南芥、水稻、玉米和番茄等植物中,AP2/ERF转录因子及其各个亚家族成员的数量各不相同。研究发现,AP2/ERF转录因子可通过响应乙烯、细胞分裂素和生长素的调节从而直接或间接参与种子发育过程、花和果实等器官的形态建成等植物发育的多个进程;除了初生代谢,AP2/ERF转录因子还在植物次生代谢尤其是在调控药用植物主要药用活性成分（如青蒿素、紫杉醇和木质素）合成方面效果显著。同时,有报道称拟南芥AP2/ERF基因具有正向调节抗灰霉病的功能,一些AP2/ERF基因也被报道在植物应对高盐、干旱、缺氧、低温等非生物胁迫方面具重要功能;另外,AP2/ERF类转录因子还参与了乙烯等介导的非生物信号传导。介绍AP2/ERF转录因子的结构分类特征、在不同植物中的数量分布,并阐述其在植物发育、次生代谢、生物与非生物胁迫和信号传导等方面的研究进展,以期为培育出兼具高产、抗病的实用型转基因作物提供理论依据。

植物病毒互作研究及基因编辑技术在抗病育种中的应用进展

杨一舟, 李魏, 易图永, 李峰

2018, 34(8): 8-16. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0462

摘要 ( 390 )

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病毒病害是危害农作物生长的重要病害,最经济有效的防治策略是选育对病毒有抗性的品种。随着病毒与植物互作研究的深入,我们对于病毒在其生活周期中与其所依赖的植物基因的互作有了深入的认识。病毒进入植物细胞后,其病毒颗粒的解聚、基因的表达、基因组的复制、其核酸蛋白复合体通过包间连丝和韧皮部的移动等过程都依赖病毒基因与植物特定基因的相互作用。这些植物基因的隐性突变可以导致植物对病毒的抗性。这类变异存在于作物的自然变异群体中,可以直接应用于抗病育种。CRISPR/Cas介导的基因编辑技术是一种可以在动植物体内对DNA序列进行定点突变的新技术,在过去几年里得到了突飞猛进的发展。利用该技术对病毒所依赖的植物基因进行定点突变或编辑,从而打破病毒与植物基因的互作关系,为创造抗病毒的作物提供了一条行之有效的途径。植物病毒互作研究和基因编辑技术的结合可以克服自然变异群体中,病毒依赖基因隐性突变频率小的问题,加速相关种质资源的创新步伐。因此它们正成为两支有力的翅膀,推动抗病育种的腾飞。拟通过对基因编辑研究领域近两年的研究进展以及植物与病毒互作研究领域的研究成果进行归纳总结,为基因编辑技术在抗病毒植物种质创新提供参考。

园林植物microRNA研究进展

罗小宁, 翟立娟, 李想, 史倩倩, 张延龙

2018, 34(8): 17-26. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0002

摘要 ( 351 )

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microRNA（miRNA）是一种长度为19-24个核苷酸的内源性非编码小RNA,它能够在转录后水平通过剪切、翻译抑制和DNA甲基化3种作用方式负调控目标基因,广泛存在于植物器官中,对植物的生长发育和响应环境刺激具有重要的调控作用。目前在园林植物中关于miRNA的研究还相对较少,但也取得了一定的成果。已有的研究表明,miRNA不仅能够参与园林植物胚胎发育、叶片发育、分枝发育、花发育、果实发育以及发育时序的转变等生长发育过程;而且对园林植物的次级代谢及信号转导具有一定的调控作用,其靶基因通常为一些与次级代谢产物相关的信号分子。除此以外,许多miRNA在园林植物感受生物及非生物逆境胁迫并产生适应性的过程中也发挥重要作用。因此,综述了植物miRNA的生物合成和作用机制,重点介绍了miRNA在园林植物生长发育、次级代谢及信号转导及逆境胁迫等方面的生物学功能,以期为园林植物中miRNA的深入研究提供一定的借鉴和参考。

生物丁醇发酵研究进展

高越, 郭晓鹏, 杨阳, 张苗苗, 李文建, 陆栋

2018, 34(8): 27-34. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0033

摘要 ( 422 )

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随着化石燃料的枯竭及环境污染的日趋严重,生物燃料等清洁可再生能源已成为世界各国研究开发的热点。生物丁醇以其燃烧值高,能量密度大,污染轻,以及可与汽油以任意比例互溶等特点,成为新一代可再生资源研究开发的重点。尽管生物丁醇目前前景广阔,但传统丙酮-丁醇-乙醇（Acetone-butanol-ethanol,ABE）发酵途径生产成本高且产率低限制了其商业化生产。为了有效降低原材料成本,实现廉价生物材料的工业转换,基于生物质资源的经济型发酵工艺成为研究热点;通过外源添加的技术手段,快速揭示发酵体系下菌株表型及发酵性能变化对于系统阐述菌株代谢水平与基因水平交叉作用规律具有一定理论意义。此外,随着全基因组测序及相关组学工程技术手段的发展,围绕代谢网络结构改造,阻断非丁醇代谢合成通路,明确胁迫调控机制,解除相关代谢调控等方面内容,对产丁醇梭菌进行内源改造,以期提高丁醇代谢合成能力及丁醇耐受性的研究也逐步深入。基于丁醇发酵生物质资源开发,代谢宏观调控策略及菌种选育等方面研究进展,讨论了生物丁醇生产代谢过程中的瓶颈问题,并对生物丁醇发展前景进行展望,旨为工程菌的构建和基于过程工程技术的代谢调控提供理论依据。

宏基因组学结合合成生物学法挖掘新型生物催化剂的研究进展

王叶, 贾振华, 宋水山

2018, 34(8): 35-42. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0027

摘要 ( 365 )

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生物催化剂是具有催化活性的细胞和酶的统称,因其高效和环境友好的特性被广泛应用于工业、农业、医药和能源等领域。传统的生物催化剂挖掘技术依赖于生物分离及体外培养,在一定程度上阻碍了生物催化剂的发展。宏基因组学挖掘新型生物催化剂通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA,构建宏基因组文库,再基于功能活性和序列分析筛选新型生物催化剂,避免了微生物的分离培养。合成生物学是利用工程学原理,通过元件的设计,组合和系统的构建对生物途径、有机体或生物系统进行重新设计。综述了宏基因组学方法挖掘新型生物催化剂的最新研究进展,并对利用合成生物学方法改进宏基因组筛选新型生物催化剂的效率进行了讨论,以期提高挖掘新型生物催化剂的效率。

主要协同转运蛋白超家族的研究进展

李纯, 孙春玉, 陈静, 林彦萍, 王义, 张美萍

2018, 34(8): 43-49. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0069

摘要 ( 510 )

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主要协同转运蛋白超家族（Major facilitator superfamily,MFS）是目前已知最大的膜转运蛋白超家族之一,包括100万个测序成员,其长度大都分布在400-600个氨基酸残基之间。根据TCDB数据库显示,MFS已经扩展到95个家族,它们可以促进糖、药物分子、肽、三羧酸循环代谢产物、有机阴离子和无机阴离子等溶质在电化学梯度下进行跨膜运输。目前,对于MFS转运蛋白的晶体结构及转运机制的研究较多,研究发现MFS转运蛋白家族通常具有12个跨膜螺旋单位,并拥有其独特的折叠方式（MFS折叠）,蛋白呈现向胞内、胞外开口或闭合的构象,以“摇杆开关”的转运方式进行物质的运输。MFS转运蛋白超家族在动植物中的生理作用较为广泛,在近期,人源MFS转运蛋白的研究更是引发关注,一些MFS转运蛋白家族成员的缺失可导致大脑萎缩和发育迟缓等;还有一些MFS蛋白具有调节细胞酸碱平衡、促进抗癌和消炎药物吸收等作用,关于人源MFS转运蛋白的研究为糖尿病、疲劳综合征、心血管疾病、癌症等人类疾病的防治提供了依据。主要介绍MFS转运蛋白超家族的发展,阐述其晶体结构、转运机制及生理作用,并在此基础上进行展望,以期为MFS的进一步深入研究及探讨提供理论依据。

鱼类低温耐受机制与功能基因研究进展

刘丽丽, 朱华, 闫艳春, 王晓雯, 张蓉, 朱建亚

2018, 34(8): 50-57. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0098

摘要 ( 649 )

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不同鱼类适应环境温度的能力不同,这是经过长期适应和进化的结果,是遗传信息特异性表达的具化表现,也是鱼类自身生理生化性能差异的反映。当前,对低温下鱼类的生理反应已经有深入研究,同时,对鱼类适应低温环境和耐受低温胁迫的分子生物学机制的研究方兴未艾,引起研究人员的广泛兴趣。高通量测序技术成本的降低和生物信息学技术的应用,允许研究者利用组学方法研究低温胁迫下鱼类的代谢途径和分子信号通路,在生物整体水平上分析鱼类响应低温胁迫的分子机制,挖掘低温耐受功能基因。研究发现,极地鱼类在长期适应环境的过程中,基因组不断进化,通过功能基因的获得、缺失和大规模扩增,适应长期低温环境;在转录调控水平上,低温胁迫下鱼类转录表达谱既表现出多细胞动物的保守性,同时又具有明显的物种特异性和组织特异性。抗冻（糖）蛋白、分子伴侣、代谢酶类和膜通道蛋白等都参与鱼类响应低温胁迫的过程。但是,不同种类蛋白质的编码基因结构与表达、功能与应用研究不尽相同。从进化、遗传表达和表观遗传学角度分别综述鱼类低温耐受的分子机制,总结鱼类低温耐受相关功能基因,预测鱼类低温耐受机制和应用研究热点,旨在为本领域研究人员提供思路。

鱼类肽聚糖识别蛋白的研究进展

夏洪丽, 程俊, 喻大鹏, 陈文捷, 鲁义善

2018, 34(8): 58-66. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0218

摘要 ( 365 )

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肽聚糖识别蛋白（Peptidoglycan recognition proteins,PGRPs）是一类高度保守的模式识别受体（Pattern recognition receptors,PRRs）家族,能够识别细菌细胞壁的主要成分肽聚糖,进而激活并调节机体的先天性免疫反应。目前已报道的鱼类PGRP共23种,根据氨基酸序列的不同,PGRPs主要分为3类,分别是短型、中型和长型PGRPs。尽管鱼类PGRPs在大小、结构域布局及亚细胞定位方面有一定差异,但其C端的PGRP结构域是高度保守的。鱼类PGRPs在不同组织中广泛表达,在不同细菌的刺激下,鱼类PGRPs在各免疫组织的表达量均明显改变,推测鱼类PGRPs参与了机体的免疫应答过程。此外,鱼类PGRPs在生理过程、胚胎发育的先天性免疫调节中也扮演了重要角色。目前有关鱼类PGRPs的功能研究主要集中在病原识别能力,酰胺酶活性、杀菌抑菌性和免疫调节机制四个方面,尽管已经取得了一定的进展,然而对其作用机制的研究还不够深入,未来需要进一步深入的研究。针对鱼类PGRPs的结构、表达及功能进行综述,旨在为今后深入研究鱼类PGRPs的功能及应用提供思路。

生物法制备三羟基雄甾烯酮的分离提取工艺研究

倪瑜, 尹思淇, 李会, 史劲松, 许正宏

2018, 34(8): 67-74. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0106

摘要 ( 361 )

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三羟基雄甾烯酮（7α,15α-diOH-DHEA）是第四代女用口服避孕药“优思明”有效成分屈螺酮的关键中间体,具有重要的市场价值。采用生物转化法可以将底物去氢表雄酮（DHEA）转化成7α,15α-diOH-DHEA,该方法具有转化效率高、环境友好等优势。本研究对发酵液中产物的分离提取工艺进行了优化,确定了三羟基雄甾烯酮最适的分离提取工艺。结果表明,添加4%（V/V）的氢氧化钠-乙醇溶液预处理,发酵液上清和沉淀分别用1.5倍和2倍的乙酸乙酯和乙醇萃取,洗脱剂选择二氯甲烷：乙醇=15∶1,产物分离后纯度达98.1%,纯化收率可达91.4%。通过质谱（MS）,红外光谱（IR）以及氢谱（¹H-NMR）对产物结构进行鉴定,与7α,15α-diOH-DHEA标准品结构一致。

胱抑素C抗体制备及化学发光免疫检测方法的建立

王云龙, 徐瑞芳, 李玉林, 王继创, 程春杰, 高玉红

2018, 34(8): 75-79. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.1017-1084

摘要 ( 311 )

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制备胱抑素C的单克隆抗体并建立可用于肾损伤早期诊断的化学发光检测方法。合成胱抑素C多肽制备单抗隆抗体,用竞争抑制法筛选优化配对抗体并建立化学发光胱抑素C检测方法。获得胱抑素C单抗细胞共39株,经筛选确定出可配对抗体,通过线性范围、最低检测限、精密性、准确度等分析性能评价,建立了线性范围为50-20 000 ng/mL、最低检测限为3 ng/mL的化学发光胱抑素C检测方法。成功制备胱抑素C配对抗体,并以此为基础建立了化学发光检测方法,为早期肾损伤提供了一种新检测技术和方法。

葡萄细胞悬浮培养体系的建立和优化

王玲, 李琰, 代伟娜, 严静, 张朝红

2018, 34(8): 80-86. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0075

摘要 ( 368 )

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为了利用葡萄愈伤组织建立快速稳定的葡萄细胞悬浮体系,以无核白和黑比诺葡萄无菌幼苗的茎段、叶片以及叶柄为外植体,通过基本培养基、不同植物生长调节剂配比及其浓度、PVP等优化疏松型愈伤组织的诱导方法并建立稳定的细胞悬浮培养体系。结果表明,以无核白和黑比诺葡萄茎段为外植体,在添加2.0 mg/L NAA和0.3 mg/L 6-BA的MS培养基上适合疏松型愈伤组织的诱导。以B5为基本培养基添加1.0 mg/L 2,4-D和0.5 mg/L 6-BA 以及0.2% PVP的优化培养条件下,建立了快速稳定的无核白葡萄悬浮培养体系。葡萄悬浮培养细胞生长曲线呈S形,接种后6-18 d处于对数生长期,第21 天细胞增长量达到最大值。细胞活力测定与TTC染色结果一致表明,接种后培养9 d细胞活力最强。建立了快速稳定的无核白葡萄悬浮培养体系,选择细胞活力最强且细胞快速增值的对数期7-9 d的细胞进行葡萄悬浮细胞遗传转化,效率较高。

普通野生稻根特异启动子的克隆与鉴定

黄珂, 黄格格, 薛满德, 龙艳, 袁潜华, 裴新梧

2018, 34(8): 87-92. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0382

摘要 ( 283 )

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通过普通野生稻转录组文库筛选到一个普通野生稻（Oryza rufipogon Griff.）根特异表达基因,并克隆启动子序列,命名为OrRSGp,长度为896 bp,含有CAAT-box、TATA-box等主要功能元件,还有参与茉莉酸甲酯反应的响应元件,以及抗旱、抗逆等响应元件。将其与gus报告基因融合转化拟南芥,GUS组织化学染色与定量分析结果表明,OrRSGp调控gus基因在根部特异表达。

甜瓜雄性不育系不同发育时期雄蕊转录组分析

戴冬洋, 袁丽伟, 盛云燕, 郑群

2018, 34(8): 93-100. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0306

摘要 ( 304 )

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从分子水平探讨甜瓜雄性不育雄蕊发育不同时期差异表达基因与花粉败育的相关性,为探究甜瓜雄性不育发生机理提供依据。通过对甜瓜雄性不育系（Male sterile,MS）花蕾（直径为2和5 mm时期）雄蕊进行转录组测序,筛选差异表达基因,并对差异表达基因进行荧光定量分析。共发现224个差异表达基因,对差异表达基因进行GO功能分析显示,全部基因均归属于生物合成、分子功能和细胞组分3大分支,其中与酶类相关的差异基因为9个,2个差异表达基因为羧酸酯酶同源基因,4个为碳水化合物相关酶类的表达基因,细胞信号传导相关表达基因和玉米素生物合成相关表达基因各1个;qRT-PCR（Quantitative real-time PCR）验证表明,与碳水化合物相关酶类的表达基因和玉米素生物合成相关表达基因在雄性不育株2 mm花蕾雄蕊中的表达量均低于5 mm花蕾雄蕊中的表达量,与细胞信号传导相关表达基因在雄性不育株2 mm雄蕊中的表达量高于5 mm雄蕊中的表达量。雄性不育的发生与能量代谢相关基因表达量的上升和细胞信号传导相关表达基因表达量的减少存在一定的相关性。

硝酸银对‘凤丹’牡丹愈伤组织褐变过程中酚类物质合成及相关基因表达的影响

毛沛琪, 李厚华, 李嫒, 曹志秀, 韩美玲, 张延龙

2018, 34(8): 101-107. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0307

摘要 ( 333 )

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以‘凤丹’牡丹的组培苗为材料,在含有0-5.0 mg/L硝酸银的基础培养基中进行培养后,通过测量总酚含量、单体酚种类及其含量的变化和相关基因的表达情况,确定不同浓度的硝酸银对抑制愈伤组织褐化的作用。结果表明,培养基中加入硝酸银能够抑制相关基因的表达,明显降低愈伤组织中多酚类物质的含量进而减轻植物组织褐变程度,其中2.0 mg/L的综合效果最好;硝酸银对组培苗褐变过程中产生影响的单体酚有绿原酸、芦丁、香豆酸、对香豆酸、表儿茶素、二氢槲皮素;硝酸银处理后的的愈伤组织中,转录因子MYB2、WD40-1、WD40-2与结构基因苯丙氨酸解氨酶（PAL）、黄烷酮醇还原酶（DFR）、查耳酮合酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）、3-二氢黄酮羟化酶（F3H）、黄酮醇3'-羟化酶（F3'H）的表达量与褐变等级和总酚含量之间存在显著的相关性（P<0.05）。

三种地卷响应Cu²⁺胁迫的差异分析

吉米拉木·加马力, 古海尼沙·买买提, 柔鲜古丽·乃再尔, 帕孜来提·拜合提

2018, 34(8): 108-114. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0271

摘要 ( 257 )

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基于谷胱甘肽（Glutathione,GSH）含量变化和铜吸附性分析地卷、平盘软地卷和犬地卷响应Cu²⁺胁迫的差异,以了解谷胱甘肽在低等生物地衣抗重金属胁迫中的作用。分光光度法和火焰原子吸收方法分别测定地衣体的GSH与细胞内、外的铜含量。结果显示,低浓度Cu²⁺胁迫下,3种地卷GSH均呈上升趋势,4 mmol/L时达最高;5-8 mmol/L时,地卷和犬地卷的GSH逐步下降较明显,但仍显著高于对照组,而平盘软地卷GSH在3-5 mmol/L Cu²⁺范围差异不显著,Cu²⁺>5 mmol/L时才出现较明显的下降（P<0.05）。4 mmol/L Cu²⁺处理时间不同时,犬地卷的GSH变化与处理时间正相关,而地卷和平盘软地卷的GSH出现波动式变化（6 h增加,12 h下降,18-24 h上升）。3种地卷胞外铜与Cu²⁺浓度和处理时间呈正相关并显著高于胞内铜（P<0.01）,而胞内富集的铜与地衣GSH变化相对应呈高-低-高的变化趋势。菌藻共生的特殊生物-地卷类似于高等植物可诱导合成GSH缓解胁迫产生的伤害,3种地卷的铜耐受性差异与其铜吸附性和GSH合成能力密切相关。

广谱性多环芳烃降解真菌Aspergillus flavus AD-X-1的筛选及其性能研究

田晶, 徐小琳, 康彦顺, 汤伟华, 刘思琪

2018, 34(8): 115-122. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0125

摘要 ( 278 )

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筛选了一株具有广谱性多环芳烃的降解菌株,并研究了其降解特性,为复合污染治理提供了菌种保障和技术支持。以多环芳烃为唯一碳源和能源,筛选出1株多环芳烃高效降解菌,经鉴定为黄曲霉,命名为Aspergillus flavus AD-X-1。实验表明,该菌株AD-X-1对多环芳烃的去除以降解为主,菌丝体吸附也起到一定作用。以蒽为底物优化条件,蒽浓度为50 mg/L时,在温度35℃,转速170 r/min,pH值7时,72 h菌株AD-X-1对蒽的去除率可达到88%。研究发现该菌株有较好的耐受性,当盐度为9%时,菌株对蒽的去除率仍保持在50%,并且AD-X-1可耐受较高浓度的重金属离子（Cu²⁺、Cr³⁺和Pb²⁺）。除蒽、菲外,AD-X-1还可去除高环的芘、苯并蒽和二苯并蒽,去除率分别为71%、68%和63%。因此,菌株AD-X-1具有广谱的多环芳烃降解能力,同时具有很好的耐盐、耐重金属特性。

酿酒酵母糠醛耐受性状相关微卫星标记的筛选

李莎莎, 张梁, 石贵阳

2018, 34(8): 123-129. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0107

摘要 ( 277 )

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筛选两株表型差异单倍体菌株作为亲本,二者杂交获得F₂群体共200株,利用具有多态性的微卫星位点对表型分布在两极端的菌株（39株）进行PCR扩增,运用t检验分析不同位点的基因型在两基因池中的差异显著性,以此获得与糠醛耐受性相关的微卫星位点。结果发现两个与糠醛耐受性有关的微卫星位点,其中2P3位点在两基因池中达到显著差异（P=0.039﹤0.05）,而位点2P5达到极显著差异（P=0.000﹤0.01）;对于微卫星位点2P5,耐受亲本P1在该位点的基因型（333 bp）在子代耐受群体中出现率为72.2%,而敏感亲本P2的基因型（318 bp）在子代敏感群体中出现率达100%（333 bp出现率为零）。上述结果表明微卫星位点2P5的基因型在群体分离中达到极显著差异可能与控制该性状的基因相连锁,在分子设计育种方面可用来选择有利等位基因,提高育种的准确性和预见性。

土壤假单胞菌亚磷酸盐脱氢酶的基因克隆和原核表达及其酶活分析

袁航, 罗著, 杨玉梅, 刘延娟, 高艳秀, 刘娴, 龚明, 邹竹荣

2018, 34(8): 130-137. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0250

摘要 ( 290 )

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亚磷酸盐脱氢酶（PTDH）以NAD⁺为辅助因子催化亚磷酸盐氧化生成正磷酸盐和NADH,在辅酶再生和基于亚磷酸盐的磷利用等方面有着潜在重大的应用价值。以土壤宏基因组DNA为模板,采用两轮PCR扩增得到全长亚磷酸盐脱氢酶基因PsPtx。通过酶切将它克隆到质粒pET32a（+）中,构建了原核表达载体pET（PsPtx）。序列分析表明,PsPtx基因的完整编码区大小为1 011 bp,其推导蛋白由336 个氨基酸组成,理论分子量大小为36.5 kD。保守结构域预测分析表明PsPtx编码蛋白属于亚磷酸盐脱氢酶,含有保守的NAD⁺结合基序和催化功能残基。系统进化树分析显示PsPtx基因来源于一无法确定种名的土壤假单胞菌。另外,PsPtx基因经IPTG诱导能在大肠杆菌BL21（DE3）中获得高效表达,重组PsPtx蛋白用组氨酸标签亲合层析纯化,其以亚磷酸钠盐为底物的酶比活性为3.75 U/mg。该PsPtx功能基因的获得为其后续应用研究打下了必要的基础。

不同“桑黄”类真菌水提取物的抗肿瘤活性研究

武晓林, 王超儀, 包海鹰

2018, 34(8): 138-143. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0145

摘要 ( 335 )

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用H₂₂荷瘤小鼠对6种“桑黄”类真菌的水提取物进行了抗肿瘤活性研究。结果表明,除鲍姆木层孔菌水提取物低剂量组外,粗毛纤孔菌、椭圆嗜蓝孢孔菌、山野木层孔菌的水提取物高、低剂量组以及火木层孔菌、鲍姆木孔菌、瓦尼木层孔菌的水提取物高剂量组均具有显著抑瘤作用,抑瘤率均大于40%,其中;椭圆嗜蓝孢孔菌水提取物高剂量组（1 000 mg/kg）的抑瘤效果最佳。与阳性组和生理盐水组相比,粗毛纤孔菌高剂量组小鼠的胸腺指数均有极显著性差异（P<0.01）,其余各组小鼠胸腺指数无显著性差异。6种“桑黄”类真菌水提取物均对提高小鼠肿瘤细胞中Bax的表达起到了促进作用;对Bcl-2的表达起到了抑制作用。

基于酶热稳定性系统计算的乳酸氧化酶热稳定性改造

华晨, 李新新, 涂涛, 杨虹, 罗会颖, 陈家明, 姚斌, 柏映国, 彭书传

2018, 34(8): 144-150. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0177

摘要 ( 472 )

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乳酸氧化酶能够催化乳酸氧化为丙酮酸,具有重要的工业应用价值,但已有研究表明,不同来源的乳酸氧化酶均存在热稳定性不好的问题,影响了其在工业当中的应用。目前对于乳酸氧化酶的研究报道较少,对其热稳定性的改造更未见报道,因此提高乳酸氧化酶的热稳定性具有重要意义。克隆表达了一个高比活乳酸氧化酶（EgLOD）,通过生物信息学辅助分析及表面电荷分析软件（ETSS）对乳酸氧化酶的蛋白结构进行理性分析,基于蛋白表面电荷分布优化设计了9个突变体尝试对其进行热稳定性改良。通过对突变体的筛选获得了两个有效提升热稳定性的突变体D250N,D281N,在60℃下处理30 min仍然能够保持50%以上的酶活,而野生型EgLOD酶活仅剩20%左右。

伊枯草菌素A发酵过程中游离氨基酸的HPLC分析

赵杰, 岳华, 苟学磊, 周金燕, 谭红

2018, 34(8): 151-158. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0012

摘要 ( 394 )

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建立一种快速、高效测定游离氨基酸含量的异硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生高效液相色谱法,并利用此方法分析检测iturin A发酵过程中游离氨基酸的动态变化。以异硫氰酸苯酯（PITC）为衍生化试剂,采用Venusil-AA（4.6 mm × 250 mm,5 μm）氨基酸分析专用柱,并优化HPLC检测色谱条件。结果表明：梯度洗脱程序、流动相pH值、色谱柱温对分析时间、色谱峰分离及峰型具有重要影响。当最优色谱条件为：流动相A为0.1 mol/L无水乙酸钠缓冲溶液（pH6.4±0.1）-乙腈（66∶5）,流动相B为乙腈-水（4∶1）,流速1.0 mL/min,检测波长254 nm,色谱柱温40℃,梯度程序洗脱,35 min内可完全分离16种氨基酸,且各氨基酸在一定浓度范围内线性关系良好（R²均大于0.9986）,加标回收率在83.84%-108.02%之间,RSD值均小于2.77%。该方法耗时短、操作简便、准确可靠,具有良好的精密度和稳定性。通过此方法研究分析伊枯草菌素A发酵过程中各游离氨基酸含量变化规律,发现其氨基酸浓度变化规律大致分为三类。

产2,3-丁二醇高木糖耐性肺炎克雷伯氏菌转录组学分析与发酵优化

郭学武, 张玉, 关翔宇, 倪晓丰, 汪庆, 陈叶福, 肖冬光

2018, 34(8): 159-169. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-1111

摘要 ( 310 )

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选育高木糖耐性肺炎克雷伯氏菌并对其进行转录组学分析与产2,3-丁二醇发酵条件的优化。首先通过适应性进化定向筛选出了具有高木糖耐受能力和2,3-丁二醇产量提高的肺炎克雷伯氏菌（KP2）,然后对其进行转录组学分析与发酵条件优化。结果显示,筛选出的高木糖耐性的肺炎克雷伯氏菌木糖的转化率提高了174.5%,2,3-丁二醇的产量提高了227%。转录组分析结果表明亲本菌株KPG和KP2菌株差异表达基因中有242个基因上调和263个基因下调。Pathway分析表明,转录水平的变化主要表现在信号转导、碳水化合物代谢、能量代谢和其它物质代谢等。在1L反应器中,初始木糖浓度120 g/L时最优发酵条件为：温度35℃,转速230 r/min,通气量0.7 L/min,最适pH值5.9。在最优条件下,2,3-丁二醇产量达43.75 g/L,相比优化前提高了32.7%。本研究获得了高效利用木糖生产2,3-丁二醇的菌株,对表型变化产生的机理在分子水平上进行阐述,并得到了最优的发酵条件,结果可以为2,3-丁二醇的生物转化提供参考,对2,3-丁二醇的生物法生产具有一定的指导意义。

p53基因敲除大鼠模型的构建及表型分析

霍桂桃, 杨艳伟, 吴曦, 刘甦苏, 李芊芊, 周舒雅, 柳全明, 王三龙, 沈月雷, 吕建军, 范昌发

2018, 34(8): 170-174. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0086

摘要 ( 272 )

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使用TALEN技术制作p53基因敲除大鼠模型,建立种群并分析大鼠表型。设计特异性识别p53基因外显子2的TALEN蛋白并构建相应载体,将体外转录的TALEN mRNA注射SD大鼠受精卵,出生后从仔鼠中通过测序筛选靶位点正确剪切的阳性小鼠。结果显示,注射得到11只新生仔鼠,通过测序发现其中有10只靶位点发生剪切。选取其中4只作为首建鼠进行繁殖。p53基因敲除纯合子表现出肿瘤易发性,主要自发性肿瘤类型为恶性纤维组织肉瘤。此外,p53基因敲除纯合子大鼠表现出眼睛发育异常,视网膜变性及晶状体纤维排列紊乱。通过TALEN技术高效地获得了p53基因敲除大鼠模型,纯合子敲除大鼠除了易发肿瘤并伴有眼发育异常,因而该敲除大鼠模型除了可用于研究肿瘤发生机制外,也可用于研究p53基因在眼发育过程中的功能。

DLL4蛋白真核表达及多克隆抗体制备

金巧, 甘志凯, 周鹏, 刘霞

2018, 34(8): 175-180. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0376

摘要 ( 342 )

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该研究旨为克隆、表达和纯化出人源DLL4蛋白,并制备出相对应的多克隆抗体。采用搭桥PCR,构建带有tPA信号肽的DLL4基因,并克隆到pGZX表达载体上,经过酶切和测序鉴定后,瞬时转染到HEK293F细胞中,转染48 h后对发酵上清液进行镍柱亲和纯化。利用Dot blotting、Western blotting和Fortebio大分子互作仪检测DLL4的生物活性;免疫兔子制备DLL4多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价,Western blotting检测抗体特异性。PCR扩增出1.6 kb的tPA-DLL4-6His目的片段,测序结果表明,与NCBI数据库中的DLL4序列（NM_019074.3）相同。一步亲和纯化后,得到纯度为95%的DLL4蛋白,Dot blotting和Western blotting检测到发酵上清液中含有DLL4蛋白,DLL4蛋白和DLL4抗体之间的亲和力在1.848E-10,R²= 0.999,ELISA法获得DDL4抗体效价为1∶12 800,Western blotting检测DLL4抗体具有良好的特异性。成功制备出具有免疫原性的DLL4蛋白及其多克隆抗体。

鳜不同孵化时期miRNA转录组分析及生长相关miRNA鉴定

赵岩, 曹晓颖, 周昊天, 宋凌元, 涂翰卿, 黄思颖, 赵金良

2018, 34(8): 181-189. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0261

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MicroRNA是一类20-24 nt核苷酸长度的参与基因转录后水平调控的非编码小分子RNA。利用高通量测序技术获得鳜（Siniperca chuatsi）孵化后第3天、第17天和第28天全鱼miRNA转录组,共鉴定出1 084个miRNAs,其中432个已知、624个保守、28个新发现。第17天时鉴定出的miRNA个数最多,为926个。在3个发育时期都表达的有628个miRNAs,只在各时期中特异表达的分别有71、104和70个miRNAs。一些与鳜发育相关的miRNAs在上述3个时期呈现持续上调或下调的表达特点。进一步的实验表明,miR-199-5p和miR-203可能与鳜生长发育相关,相应的靶基因分别是WnT 和 MyoD。

人尿源干细胞的分离与鉴定

王福平, 张锋, 赵同标

2018, 34(8): 190-198. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0312

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为建立高效简便的人尿源干细胞（Human urine-derived stem cells,hUSCs）培养和鉴定体系,在无菌条件下收集青年志愿者的尿液分离培养人尿源干细胞,然后用克隆计数、形态观察、核型分析、生长曲线测定、表面标志物检测、成骨和成脂分化等方法对hUSCs进行鉴定。人尿源干细胞克隆具有纤维样、鹅卵石样和丝连样三种形态。第二代hUSCs高表达抗原CD44、CD73和CD90,阳性率均高于99.6%;而低表达抗原CD34和CD45,阳性率均低于0.3%。第六代hUSCs高表达抗原CD44和CD73,阳性率均高于99.5%;而低表达抗原CD34和CD45,阳性率均低于0.5%。第六代hUSCs仍然具有很强的增殖能力和稳定的核型,并经诱导可分化为骨细胞和脂肪细胞。该研究建立了高效简便的hUSCs培养和鉴定体系。

衰老进程中小鼠造血干/祖细胞特征性改变对老年免疫失衡的影响

张立杰, 李晓玉, 岑由飞, 周祖平, 蒲仕明

2018, 34(8): 199-203. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0149

摘要 ( 247 )

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为探索小鼠造血干/祖细胞（Hematopoietic stem/progenitor cells,HSPCs）在衰老过程中的年龄相关性变化,并揭示衰老进程中免疫“老化”的发生、发展规律。分别利用流式细胞术对不同年龄小鼠的骨髓来源的造血干细胞（Hematopoietic stem cells,HSCs）及其下游祖细胞进行了细胞丰度和增殖活性测定。结果显示,HSCs和MPP（Multipotent Progenitor Cells,多能祖细胞）、GMPs（Granuiocyte/macrophage progenitor cells,粒细胞/巨噬细胞祖细胞）在骨髓细胞中的丰度随着年龄的增加而显著升高,其进入分裂期（G1、G2/S/M）的细胞数也随之增加。此外,GMPs下游的髓源性抑制细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）积累。结果揭示了HSCs在衰老进程中被活化,促进细胞增殖并偏向髓系抑制细胞分化与积累,抑制机体免疫功能。本研究可能为理解衰老免疫下降提供参考。

食源性致病菌安全事故处置与警示——以“2011年德国肠出血性大肠杆菌感染暴发疫情”为例

汤初美, 朱龙佼, 郭顺堂, 苗敬, 许文涛

2018, 34(8): 204-214. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-1106

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在全球范围内,随着生活水平的提高,食品安全问题受到了越来越多的关注。而在当今世界的食品安全事件中,由食源性致病菌引起的安全事故以其广泛性、频发性和强致病性成为突出的食品安全问题。首先,概述了食源性致病菌的特点,以及历史上几例食源性致病菌导致的食品安全事件来简介食源性致病菌与食品安全之间的关系;接着,以2011年德国肠出血性大肠杆菌感染暴发疫情为示例,详细展开介绍食源性致病菌的致病特点、检测技术及溯源方法,并总结防控措施、政府应对及消费者应对指南;最后,在案例基础上探讨了食源性致病菌安全案例同时实现教学与科普任务的可能性。通过对案例的多角度分析,旨在为食源性致病菌安全事故处置与警示起到推动作用。

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2018, 34(8): 300.

摘要 ( 113 )

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