生物技术通报

生物传感器：靶标物质快速检测面临的机遇与挑战

许文涛

2018, 34(9): 1-1.

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功能核酸纳米机器生物传感器的研究进展

张倩, 田晶晶, 罗云波, 许文涛

2018, 34(9): 2-14. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0397

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功能核酸纳米机器是天然或人工设计的通过核酸碱基序列特异性相互作用而自组装形成的核酸组件。功能核酸纳米机器的运转可通过两种方式使其结构或构象发生转化而被激活,一种方式是功能核酸与特定信号分子相互作用使其结构发生变化;另一种方式是在外界环境的刺激下（如改变pH、加入离子、用不同的光照射等）使功能核酸构象发生变化。目前研究的主要有G-四链体功能核酸介导的、适配子功能核酸介导的、脱氧核酶介导的、霍利迪结功能核酸介导的、基于非金属、金属材料的、链置换的、点击反应的、三螺旋核酸的、pH响应的、光诱导的功能核酸纳米机器。综述了这些经典的功能核酸纳米机器的具体运作机理,讨论了在药物靶向递送、生物成像的应用研究中的实际意义及其存在的问题;展望了功能核酸纳米机器的应用前景及可能遇到的挑战。

基于三螺旋核酸的生物传感器的研究进展

田晶晶, 罗云波, 许文涛

2018, 34(9): 15-28. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0381

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三螺旋核酸是在经典的沃森-克里克（Waston-Crick）氢键形成的双链核酸基础上,第三条寡核苷酸链以非经典的胡斯特（Hoogsteen）氢键嵌入到双链大沟（Major groove）中形成的超分子核酸组装体。在近年来发展的众多生物传感方法中,基于三螺旋核酸的生物传感平台凭借其快速、灵敏、简单、可逆等特点而备受瞩目。从生物传感器的角度,综述了三螺旋核酸生物传感器的类别与性质,分类评述了常见的三螺旋核酸生物传感器与三螺旋核酸传感元件的应用,并对三螺旋核酸生物传感器的发展前景进行了展望。

恒温技术介导的功能核酸生物传感器研究进展

张园, 肖冰, 田晶晶, 许文涛

2018, 34(9): 29-38. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0574

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随着社会不断发展,消费者对食品安全的关注度日渐上升,食品多样性日益增加,食品流通量日益增长,对食品安全检测技术的要求不断提升。功能核酸通过形成特定的空间结构,能够发挥除了储存遗传信息以外的多种功能,在检测领域起到重要作用。功能核酸生物传感器是一类利用功能核酸进行信号识别、信号放大或者信号输出的传感器,具有高灵敏度、高特异性、检测时间短、成本低等优势。为了避免对变温仪器设备的依赖,实现现场检测,恒温技术介导的功能核酸生物传感器发展迅速。相对于变温技术,恒温技术无需变温设备,有些在室温条件下即可进行,能够降低检测成本,在一定程度上缩短检测时间。根据恒温技术在功能核酸生物传感器中的功能不同,可以分为恒温介导的信号识别技术、信号放大技术和信号输出技术。就这3个方面对恒温技术介导的功能核酸生物传感器展开论述,并从理论层面、应用层面和学科交叉方面提出展望。

关于双链特异性核酸酶介导的生物传感器研究进展

肖星凝, 朱龙佼, 李相阳, 罗云波, 许文涛

2018, 34(9): 39-47. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0786

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双链特异性核酸酶（DSN酶）是一种能高效识别并酶切完全互补配对的DNA双链或者DNA/RNA 杂交双链中的DNA链,而对单链DNA和单/双链RNA几乎没有作用的核酸酶,所以DSN酶在生物和医学等领域有着广泛的应用。目前,基于DSN 酶对单双链核酸不同的切割特点,搭载不同的信号输出及扩增方式,已经建立了一系列生物传感技术,如比色法、荧光法及电化学法等。实现了miRNAs、mRNA及重金属离子等一系列生物标志物及食品安全风险因子的检测。另外,DSN酶与新兴纳米材料搭载的纳米传感器也在RNA等物质传感中显示出了极大的分析优势。首先从结构、性质和切割方式3个方面介绍了DSN酶,并对近年来基于DSN酶介导的、具有代表性的生物传感器的组建及应用情况进行了综述,主要是根据不同的信号输出方法对DSN酶介导的核酸传感器进行归类综述,包括光学传感器、电化学传感器和光磁传感器等。具体综述内容包括,详细地阐述了各种传感器的传感原理,综合比较了各传感器的检测范围及检测灵敏度等,同时还归纳了目前DSN酶介导的生物传感器能够检测的靶物质类型,有助于人们以后对DSN酶更深层次的使用。最后,对DSN酶介导的生物传感器目前存在的不足及今后的发展趋势进行了展望,旨在指导人们在未来使用DSN酶介导的生物传感器中能避免相关问题,研发出更快捷、更方便、灵敏度更高的生物传感器。

APE1介导的功能核酸生物传感器研究进展

贺万崇, 黄昆仑, 许文涛

2018, 34(9): 48-54. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-1015

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脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1（Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1,APE1）是一种广泛存在于生物体内、在碱基切除修复（Base excision repair,BER）过程中能够在碱基缺失位点（AP site）处识别并切割DNA的蛋白酶,其作用效率高且特异性强。同时,APE1在一些癌症细胞中的活性较正常细胞明显偏高,因此其自身也是一种癌症生物标志物。目前,通过在DNA上人工设计AP位点,利用APE1的切割能力生成理想的功能核酸链,并结合不同的信号输出及放大方式,研究者已经建立了一些APE1介导的电化学、荧光功能核酸生物传感技术,实现了对DNA糖基化酶等的酶活性的检测。另外,也有一些针对APE1自身活性的功能核酸生物传感技术被建立起来。综述了近年来APE1介导的功能核酸生物传感技术以及以APE1为靶物质的功能核酸和免疫生物传感技术的研究状况,讨论了与APE1相关的生物传感技术的意义及存在的问题,并对未来利用APE1实现更多靶物质的检测的发展趋势进行了展望,以期促进APE1成为一种功能核酸生物传感技术中常用的酶工具。

外切酶III介导的功能核酸生物传感器研究进展

宋欢, 罗云波, 许文涛

2018, 34(9): 55-69. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0278

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外切酶III（Exonuclease III,Exo III）是一种可以特异性识别并催化dsDNA从3'-羟基端逐步水解并释放出单核苷酸的核酸酶,而对ssDNA的水解作用十分有限。基于Exo III的外切酶活性,搭载不同的信号输出方式,该酶已被成功运用到DNA、小分子和金属离子等靶物质的放大检测中。本文主要根据所检测的靶物质不同,对Exo III介导的生物传感器进行了分类综述,阐述了各传感器的基本设计原理和灵敏度等方面内容。此外,对Exo III与其他信号放大策略或纳米材料相结合的最新研究进展也做了较为详细的介绍。最后,对Exo III介导的生物传感器的优缺点和发展前景进行了总结和展望,有助于Exo III介导的生物传感器在环境监管、生物分析或临床诊断领域的深层次应用和继续研发。

磁小体介导的生物传感器研究进展

李舒婷, 周子琦, 田杰生, 许文涛

2018, 34(9): 70-78. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0223

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磁小体（Bacterial magnetosomes,BMs）是由趋磁细菌（Magnetotactic bacteria,MTB）合成的用于在其水生栖息地中进行地磁导航的专用细胞器,由外部的脂质双层膜和内部的磁性纳米晶体组成。其具有粒径分布窄、形态均匀、单磁畴、顺磁性、比表面积大及生物相容性高等特点被广泛应用于医疗领域,可作为抗癌药物的递送载体、核磁共振成像对比剂和成像探针等。目前,基于BMs制备生物传感器并应用于生物检测技术领域的研究相对较少,且主要偏向于在BMs膜的表面共价或非共价修饰上抗体,利用抗原抗体之间的特异性免疫反应来实现靶物质的检测。综述了BMs的结构和组成、基本特性、提取和纯化、形态结构表征及其在靶物质富集方面的应用,并着重介绍了几类以BMs为基础的生物传感器如电化学生物传感器、荧光生物传感器、磁生物传感器等,讨论了磁小体介导的生物传感器在应用研究中的实际意义及其存在的问题。展望了磁小体介导的生物传感器的发展前景,面临的机遇及挑战,以期为促进磁小体介导的生物传感器的实际应用提供参考。

光及光热纳米材料在生物传感、药物靶向运输和生物成像中的应用

郑力榕, 罗云波, 许文涛

2018, 34(9): 79-89. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0388

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纳米材料是纳米科学技术的重要发展方向之一。纳米材料的结构赋予了其独特的光学性质,纳米尺寸方便其经EPR效应或表面修饰靶向肿瘤组织,并且部分纳米材料可吸收外部光源能量,将其转化为热能。因此,纳米材料在光学传感器、生物成像、药物靶向运输及肿瘤光热治疗中的应用十分广泛。综述主要分类介绍了光学纳米材料和光热纳米材料的优异特性,阐述了其在以上领域中的应用;最后,对纳米材料未来的发展作出了展望。

基于石墨烯及其相关材料高分析性能传感器研究进展

雷新有, 左国防, 王鹏, 张建斌

2018, 34(9): 90-96. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0452

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基于石墨烯优异的导电性能、大的比表面积、良好的生物相容性,在传感器的构建方面,表现出比其他材料更加优良的性能。石墨烯在传感领域中的应用一般通过功能化来实现,石墨烯与聚合物或纳米粒子的结合可以显著增强传感器的响应,提高检测的灵敏性。综述了近年来石墨烯及其相关材料在临床分析、环境监测和食品安全控制等传感领域中的应用研究进展,通过灵敏度、检测限等分析数据对具有良好水分散性和生物相容性,比表面大,表面修饰灵活以及制备简单的氧化石墨烯及其衍生物（含氧基团）为基础的传感器的分析性能进行了综合评价。同时对石墨烯及其衍生物这一新型传感材料在未来的研究趋势进行了展望：精确控制石墨烯单分散片的尺寸、形状;研究催化作用下的石墨烯与分析物分子电极反应间的传感机制;减少石墨烯片的聚集,精确控制石墨烯基传感系统微结构。未来可望发展具有更加强大特性的便携式、芯片化传感器,实现更短时间内复杂环境样品的多重分析,进一步提高检测灵敏性和选择性,增强传感器的稳定性和重复使用性,克服毒性和生物不容性。

基于适体的石英晶体微天平传感器的研究进展

吴莉婷, 苏雪, 林俊生

2018, 34(9): 97-103. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-1099

摘要 ( 363 )

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适体（Aptamer）是通过指数富集配体系统进化技术（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）从人工合成的随机单链寡核苷酸文库里筛选出来的短链寡核苷酸序列,具有分子量小、结构简单、易进行修饰、靶标范围广泛,并且与靶标分子之间具有高特异性和高亲和力等特点。相应地,适体的这些独特的性质可用于制备各种不同的传感器,根据各种传感器的不同原理,本文着重概述了常用于检测适体与靶标之间亲和力的电化学生物传感器、光学生物传感器和压电晶体传感器。这3种方法的检测都具有检测时间短和检测限低的优势。其中压电晶体传感器又称石英晶体微天平（Quartz crystal microbalance,QCM）,除了在SELEX技术中可应用于表征候选适体的靶向能力外,还可用于构建高灵敏度和高特异性的适体石英晶体传感器。简要介绍了基于适体的石英晶体微天平传感器基本原理,对近年来QCM在表征和检测适体与其靶标,包括小分子、离子、蛋白质、细胞、细菌和病毒等物质相互作用的研究现状进行综述,总结分析了QCM技术的优缺点。旨在为适体的筛选以及适体在基础研究、临床诊断和疾病治疗中的进一步应用提供参考。

Mg²⁺功能核酸生物传感器检测技术的研究进展

王联臻, 张倩, 李凯, 贺万崇, 罗云波, 黄昆仑, 许文涛

2018, 34(9): 104-115. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0205

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Mg²⁺是人体内重要的二价金属阳离子之一,在催化细胞核酸的相关反应中具有重要的作用。在人体体内Mg²⁺的缺失或过量会对人的健康带来危害。同时,Mg²⁺在自然环境中也有多种作用。因此Mg²⁺的检测受到了人们的重视。其中Mg²⁺的仪器检测技术已经发展成熟,但也存在着一些弊端。而近些年,人们发现了功能核酸具有序列易修饰、特异性高、稳定性高、成本低,以及和生物传感器联用可实现现场快速检测等优势,功能核酸也逐渐引起广泛关注。现阶段,针对Mg²⁺已建立多种特异性功能核酸生物传感器,实现了对多种生物标志物进行检测。与新型纳米材料的结合更加提高了检测极限以及检测的广谱性。首先介绍了Mg²⁺功能核酸的作用方式和规律、体外筛选方法和结构性质,并对Mg²⁺特异性功能核酸传感器的组建原理以及应用进行了综述;其次根据Mg²⁺功能核酸传感器中信号放大的方式以及与不同纳米材料结合进行了分类,包括变温传感器、恒温传感器、金纳米传感器、碳纳米传感器等。主要内容涉及传感器的具体传感原理、适用领域、灵敏性以及检测限的比较;最后对Mg²⁺功能核酸在食品和生物医学方面的应用进行了归纳,并对存在的不足以及未来应用进行了展望,旨在为今后研发更便携、更灵敏、更准确的生物传感器奠定理论基础。

汞离子传感器检测技术研究进展

冯瑜祥, 李相阳, 邵向丽, 许文涛

2018, 34(9): 116-128. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0429

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在所有对环境造成污染的重金属离子中,Hg²⁺是最常见的一种。在大气沉降和海洋环流的作用下,Hg²⁺进入淡水或海洋。经过食物链的生物放大作用,最终给人类的生命健康造成威胁。因此,实现Hg²⁺的快速、灵敏检测对环境保护和人类健康具有重要意义。介绍了环境中Hg²⁺的来源、转化及其对人类健康的影响,并以Hg²⁺与荧光分子、纳米粒子、脱氧核酶、抗体、蛋白质、转基因微生物等不同物质相互作用的性质为分类依据,综述了目前主流的Hg²⁺的检测方法,为实现Hg²⁺的快速检测提供方法依据。

金属-有机骨架介导的功能核酸检测技术研究进展

李舒婷, 贺万崇, 许文涛

2018, 34(9): 129-138. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0055

摘要 ( 357 )

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金属-有机骨架（Metal-Organic Frameworks,MOFs）也称为配位聚合物（Coordination polymers,CPs）,是由金属离子或金属簇与有机连接配体在相对温和的条件下自组装形成的一种晶体分子功能材料。其具有超高的孔隙率,优异的结构可调性,巨大的内部表面积,结构多样性,高的化学稳定性和强大的热稳定性等特点;已被应用于化工、医药等各个领域。目前,将MOFs与功能核酸（Functional nucleic acids,FNA）结合制备生物传感器应用于检测技术领域的相关研究主要集中在荧光生物传感器和电化学生物传感器这两大类,其他类型生物传感器鲜有报道。另外MOFs的制备也逐渐趋于小型化以提高它的相关性能。综述了近年来MOFs介导的功能核酸生物传感器研究情况,讨论了MOFs介导的功能核酸检测技术在应用研究中的实际意义及其存在的问题。对该项技术的发展前景,可能面临的机遇及挑战进行了展望,期望能促进MOFs介导的功能核酸检测技术在实际应用中的发展。

介孔二氧化硅介导的功能核酸检测技术研究进展

李舒婷, 贺万崇, 黄昆仑, 许文涛

2018, 34(9): 139-148. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-1075

摘要 ( 301 )

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介孔二氧化硅纳米粒子（Mesoporous silica nanoparticles,MSNs）是一种表面多孔的无机纳米粒子,具有粒子和孔的大小可调节,大的表面积和孔体积,可进行表面修饰以及良好的生物相容性等特点被广泛应用于医疗领域作为抗癌药物的递送载体。目前,将MSNs与功能核酸（Functional nucleic acids,FNA）进行良好结合并制备生物传感器应用于检测技术领域的研究主要偏向于把FNA固定在MSNs表面,通过FNA结构的改变实现介孔中客体分子的可控释放,进一步转换为荧光信号、电信号等进行检测。综述了MSNs的基本属性、制备及其应用,重点介绍了几类基于MSNs的功能核酸生物传感器,讨论了介孔二氧化硅介导的功能核酸检测技术在应用研究中的实际意义及其存在的问题,最后展望了该项技术的发展前景,可能面临的机遇及挑战,以期能够进一步促进介孔二氧化硅介导的功能核酸检测技术在实际中的应用。

数字PCR在功能核酸精准检测中的研究进展

刘晓, 朱鹏宇, 王垚, 朱水芳, 付伟

2018, 34(9): 149-162. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0568

摘要 ( 290 )

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数字 PCR 是近年来迅速发展起来的一种定量分析技术。该技术结果判定不依赖于扩增曲线的循环阈值（Ct）,不受扩增效率的影响,具有很好的准确度和重现性,并且可以实现绝对定量分析。数字PCR已经在功能核酸检测、鉴定等研究领域显示出巨大的技术优势和应用前景。在对数字 PCR 技术的基本原理和定量方法介绍的基础上,对该技术在功能核酸检测的主要应用领域进行综述,并对数字PCR在功能核酸检测领域中的研究前景做出了展望。

梳型阳离子共聚物辅助构建DNA生物传感体系用于检测单碱基错配

张铭珂, 韩佳伦, 刘晨, 吴金, 才杜杰

2018, 34(9): 163-169. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0468

摘要 ( 267 )

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为了快速准确的检测出体系中单碱基错配,利用氧化石墨烯优异的荧光淬灭能力、对单双链DNA吸附能力的差异,搭配与之相配合出现较高的核酸伴侣活性的梳型阳离子共聚物PLL-g-Dex,构建了一个无酶、准确且高效的分析体系。通过荧光检测手段,首先确定了实验设计的可行性。之后依次检测过程中各组分的最优浓度,发现在T-DNA浓度为20 nmol/L的情况下,当GO浓度9 μg/mL,cDNA浓度90 nmol/L,PLL-g-Dex浓度96 nmol/L时为最佳实验点。最后检测体系对单碱基错配的选择性,发现不同碱基错配体系所呈现出的荧光强度不同。而且相比其他碱基,PLL-g-Dex对C-C碱基错配的选择性较强。

米曲霉基因工程技术的进展

张智敏, 庄淼, 金锋杰

2018, 34(9): 170-176. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0252

摘要 ( 464 )

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丝状真菌米曲霉（Aspergillus oryzae）是发酵工业的重要菌株,具有强大的蛋白分泌能力和公认的食品安全性,可作为表达外源蛋白的细胞工厂。然而利用米曲霉分泌生产外源蛋白质常会受限于一些瓶颈问题：包括转录、翻译、蛋白质折叠、易位、降解、运输和分泌等。这些问题的存在导致米曲霉外源蛋白生产很难达到预期的效果。近年来,随着全基因组序列的破译,米曲霉生产相关基础研究以及基因工程技术都得到了较好的发展。如提高同源重组效率、选择性标记基因应用技术、染色体大片段删除技术、菌丝融合技术和DNA芯片技术等。这些技术的开发和建立为米曲霉工业生产应用提供了大量技术支持。针对米曲霉在外源表达蛋白中存在的瓶颈问题,主要通过以下几个方面进行了阐述：转化系统的优化和转化效率的提高、蛋白酶基因缺陷菌株的构建、融合表达策略,以及优化其外源表达系统来提高外源蛋白生产等。这些米曲霉生产相关基础研究以及基因工程技术的进步很大程度上提高了米曲霉的生产应用,并为今后米曲霉生产菌株的育种提供了更多有效的途径和研究空间。

煤地质环境微生物总基因组DNA提取方法的优化

杨秀清, 陈彦梅, 吴瑞薇, 王保玉, 韩作颖

2018, 34(9): 177-183. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-1145

摘要 ( 325 )

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高质量的DNA是进行分子生物学研究的基础。通过对传统DNA抽提方法（酚-氯仿法）进行改进,并以Rhodococcus sp.R04和煤粉为实验材料对细胞破碎条件进行优化,建立了一种可用于煤地质环境微生物基因组DNA高效提取的改良方法。以改良法和商业试剂盒提取煤地质环境微生物基因组DNA,通过琼脂糖凝胶电泳、细菌及古菌特异性片段的PCR扩增来评价所提取DNA的质量。改良法和试剂盒法均能获得煤地质环境微生物基因组DNA,并能用于多种特异性PCR扩增。与试剂盒提取的DNA相比,改良法获得的DNA片段主带明显,约占总DNA含量的50%,分子量大小接近23 kb,并且提取量大,约为试剂盒的5-10倍。同时,能用于如DNA文库构建和宏基因组测序等。此外,改良法所用试剂普通,价格便宜,提取的煤地质环境微生物基因组DNA质量较高,适于实验室和科学研究。

人呼吸道卡他莫拉菌快速检测胶体金试纸的研制

黄莹琪, 张秋, 陶冶, 胡征, 张改平, 张华山

2018, 34(9): 184-189. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0184

摘要 ( 399 )

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旨在研制一种快速、简便检测呼吸道感染病人呼吸道中卡他莫拉菌的试纸,并建立其检测方法。经生物信息学分析找到UspA1胞外结构域单一线性表位UspA1Line,偶联血蓝蛋白KLH形成复合蛋白UspA1Line-KLH,并利用已构建的表达UspA1抗原的工程菌,表达纯化重组蛋白UspA1-His,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,取血清后利用Protein A亲和层析和多肽亲和层析两步纯化抗体,得到纯度高,特异性强的多克隆抗体。采用柠檬酸三钠还原法制备40 nm胶体金颗粒,与多克隆抗体结合,形成双抗体夹心,达到快速检测卡他莫拉菌的目的。结果显示,建立的检测方法可在10 min内完成对样本的检测,特异性检出样本中卡他莫拉菌,与其他常见的呼吸道病原菌无交叉反应,试纸条在24℃保存具有良好的重复性和稳定性。成功研制了可快速检测卡他莫拉菌的胶体金试纸条。

双重实时荧光PCR定量检测动物产品中牛源性成分

高志强, 汪琳, 蒲静, 尹羿, 张伟, 赵相鹏, 姚震宇

2018, 34(9): 190-194. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-1129

摘要 ( 291 )

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旨在建立一种定量检测动物产品中牛源性成分含量的双重实时荧光PCR方法。以牛卫星IV DNA为检测靶基因,以肌肉生长抑制素基因作为内对照合成引物探针,采用基于TaqMan的双重实时荧光PCR技术对已知牛肉添加比例的冻干混合肉粉标准品进行检测并建立线性模型,并应用模拟样品和送检样品进行了验证检测。结果显示,该方法可检出牛源成分含量为0.1%的冻干肉粉,不与其他种动物组织发生交叉反应,重复性试验的相对标准偏差小于5%,方法的扩增效率为93.6%。该方法适用于肉品中牛源性成分的定量检测,可用于测定市场上动物产品中的牛源性成分含量。

利用SSR标记构建枸杞品种分子身份证

尹跃, 赵建华, 安巍, 李彦龙, 何军, 曹有龙

2018, 34(9): 195-201. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0155

摘要 ( 346 )

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以16个枸杞品种为材料,利用SSR标记构建枸杞分子身份证,为枸杞品种鉴定和保护提供参考。从600对SSR引物中筛选出多态性高、稳定性好、均匀分布在枸杞12条染色体上的24对引物,对16个枸杞品种进行扩增,共检测到等位基因155个,每对引物检测到等位基因数在3-10,平均为6.5个;共检测到基因型208个,每对引物检测到基因型在3-14个,平均为8.7个;多态信息含量（PIC）变幅在0.461-0.848,平均为0.682;Shannon’s信息指数变幅在0.939-2.055,平均为1.487。基于最少引物鉴定最多种质的原则,筛选出等位基因数、基因型数和PIC值均大于平均值,且Shannon’s信息指数>1.7引物,最终确定出引物LBSSR0052和LBSSR0423组合可区分全部供试品种。根据这两对引物对所有品种扩增获得等位基因按照由小到大排序,然后将每个品种在这两个SSR位点的赋值依次组合,构建16个枸杞品种的分子身份证。结果表明SSR标记技术可以作为枸杞品种鉴定和分子身份证构建的有效技术手段。

橡胶树HbMC2在酵母中的表达和抗逆性分析

刘辉, 邓治, 杨洪, 代龙军, 李德军

2018, 34(9): 202-208. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0298

摘要 ( 267 )

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Metacaspase介导的程序性细胞死亡在植物生长发育、抵御生物和非生物胁迫过程中发挥重要作用。前期研究发现橡胶树metacaspase基因HbMC2的表达受干旱和高盐等非生物胁迫调控。为明确HbMC2的功能,采用RT-PCR从橡胶树中扩增HbMC2编码区序列并将其插入到pYES2载体中,构建酵母表达载体pYES2-HbMC2。将pYES2-HbMC2质粒转化到酿酒酵母INVSc1菌株中,获得重组酵母INVSc1（pYES2-HbMC2）。PCR及RT-PCR检测结果表明,HbMC2已成功转入重组酵母并能在半乳糖诱导下表达。与对照酵母INVSc1（pYES2）相比,重组酵母INVSc1（pYES2-HbMC2）在氧化、干旱和盐胁迫下的生长受到抑制、细胞死亡率增加。结果表明酵母中表达HbMC2降低了对非生物胁迫的抗性,HbMC2是非生物胁迫抗性的负调节因子。

柠条锦鸡儿CkP5CS基因克隆及表达特性分析

张腾国, 史中飞, 寇明刚, 郑晟, 王娟

2018, 34(9): 209-218. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0349

摘要 ( 254 )

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旨在克隆柠条锦鸡儿Δ¹-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因（P5CS）的全长cDNA序列,研究其组织表达特异性,分析CkP5CS基因在低温、高盐和PEG处理下的表达情况,以阐明CkP5CS基因在柠条锦鸡儿中的生物学功能。利用RACE技术克隆P5CS基因cDNA序列,并对其全长基因进行生物信息学分析;构建系统发育树,研究其与相似序列的同源性;利用实时荧光定量PCR方法,分析CkP5CS基因的组织表达特异性以及在低温、高盐和渗透胁迫下的表达情况。结果显示,克隆得到柠条锦鸡儿P5CS基因全长cDNA 序列,命名为CkP5CS,全长2 604 bp,包括5'非翻译区（5'-UTR）102 bp,3'非翻译区（3'-UTR）363 bp,开放阅读框2 139 bp,能编码712个氨基酸,预测蛋白质分子量为76.8 kD,理论等电点为8.6,二级结构主要包括α-螺旋、延伸链和无规则卷曲。多序列比对和系统进化分析表明,柠条锦鸡儿P5CS与白刺花SdP5CS、大豆GmP5CS、豇豆VuP5CS同源性较高,分别为85.1%、84.2%和82.6%。实时荧光定量PCR结果显示,CkP5CS在柠条锦鸡儿的根、茎和叶中均有表达,没有组织特异性;同时,该基因的表达受低温、高盐和渗透胁迫的诱导。克隆得到柠条锦鸡儿CkP5CS基因,其在柠条锦鸡儿适应低温、高盐和渗透胁迫过程中发挥作用。

藏鸡IRX3基因表达与肌内脂肪的沉积关系

张亚楠, 林亚秋, 许晴, 徐亚欧, 贺庆华

2018, 34(9): 219-223. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0048

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旨在构建藏鸡IRX3基因的组织及时序表达谱,确定该基因与肌内脂肪的沉积关系。利用荧光定量PCR技术检测IRX3基因在不同组织和不同发育阶段肌肉组织中的表达水平,同时采用单因素方差分析方法分析肌内脂肪含量,并分析其时序表达与肌内脂肪含量的相关性。结果表明,IRX3基因在藏鸡各个组织中均有表达,在藏鸡肺组织中相对表达水平较高,极显著高于其他各个组织（P<0.01）。IRX3 mRNA在210日龄公藏鸡腿肌和胸肌中相对表达水平均极显著高于其他日龄的表达水平（P<0.01）,而在1日龄母藏鸡胸肌中相对表达水平极显著高于其他日龄（P<0.01）。藏鸡不同发育阶段肌肉组织中IRX3 mRNA表达水平与其IMF含量的相关性分析显示,公藏鸡腿肌IRX3 mRNA表达量与肌内脂肪含量呈正相关（P<0.01）,而在母藏鸡胸肌IRX3 mRNA表达量与肌内脂肪含量呈负相关（P<0.01）。IRX3基因表达与藏鸡肌内脂肪含量存在相关性,推测IRX3可能对肌内脂肪的沉积具有调控作用。

抗鳞翅目害虫基因cry1C的抗原表位分析及多克隆抗体制备

金永梅, 陈莫军, 刘笑笑, 林秀峰

2018, 34(9): 224-229. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0200

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利用生物信息学方法预测cry1C蛋白的抗原表位区,并命名为Δcry1C。优化Δcry1C的核苷酸序列并进行人工合成,构建重组表达载体pET28b（+）-Δcry1C。在 E.coli中诱导表达His₆-Δcry1C蛋白,纯化后免疫新西兰大白兔,分离、纯化获得cry1C多抗血清。ELISA测定结果表明,抗体效价最高可达1∶512 000。Western Blot分析结果表明,cry1C多克隆抗体能够与cry1C转基因抗虫水稻蛋白特异性结合。利用生物信息学筛选抗原表位区并优化序列、原核表达重组蛋白、免疫制备cry1C多克隆抗体,为深入研究抗鳞翅目害虫植物提供了前提条件。

塔里木盆地5个生态小区稀有放线菌分离及合成抗生素基因分布

朱荣贵, 关统伟, 姜秀娟

2018, 34(9): 230-236. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0011

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为调查塔里木盆地5个代表性生态小区的稀有放线菌分布,并评估它们产生抗生素类活性物质的潜力。采集塔里木盆地5个生态小区混合土样5份,采用 7 种培养基分离样品中的稀有放线菌。通过检测分析I型PKS、II型PKS、NRPS、APH、HMG-CoA五种抗生素合成相关基因的分布,评估该地区稀有放线菌产生抗生素的潜力。结果表明：（1）基于分子鉴定,经合并重复,共分离得到18种稀有放线菌,属于放线菌的10个属。（2）塔里木河河岸林生态小区土样稀有放线菌分离种类最多（10种）,为8个属,塔克拉玛干沙漠塔里木河东部生态小区最少（4种）,为4个属。（3）18株稀有放线菌中有9株含有I型PKS基因、4株菌含有II型PKS基因、4株菌含有APH基因、3株菌含有NRPS基因,有一株链孢囊菌同时含有I型PKS、II型PKS、NRPS、APH 4种基因。5个生态小区稀有放线菌种类较多,并含有较为丰富的与抗生素合成相关的基因。

毕赤酵母糖基化对布鲁菌P39抗原诱导巨噬细胞吞噬的影响

刘思阳, 王岩, 付玉芹, 胡祥坤, 王茗宇, 卢天成, 王秀然

2018, 34(9): 237-243. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0170

摘要 ( 323 )

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P39蛋白是通过蛋白组学从布鲁菌中鉴定出的具有较高免疫原性的优势抗原蛋白之一。本研究对布鲁菌的优势抗原蛋白P39基因在毕赤酵母中进行表达,并对其进行纯化及Western blot鉴定,利用核磁共振接合PNGaseF糖苷酶进行蛋白糖基化鉴定,并研究其与巨噬细胞相互作用的速度。结果表明,P39蛋白在毕赤酵母GS115中呈分泌表达,表达量可达5.05 g/L。核磁共振结果表明,重组P39蛋白被糖基化修饰。修饰后的蛋白被巨噬细胞捕获效应明显强于原核蛋白,说明糖基化修饰可能影响目标蛋白与细胞相互作用的效率,为进一步研究糖基化对P39蛋白的影响及布鲁菌糖基化疫苗候选抗原的研究提供参考。

海鞘真菌的形态鉴定及其代谢产物抗菌活性研究

罗国聪, 黄蕴怡, 柴慧子, 雷晓凌, 聂芳红

2018, 34(9): 244-248. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0173

摘要 ( 262 )

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为寻找产生新颖抗菌活性物质的海洋真菌,以海鞘为原料,采用平板涂布法分离出14株真菌,并对其进行形态学鉴定和抗菌活性的初筛。结果显示：从海鞘中共分离出14株真菌,根据形态观察初步鉴定其分属青霉属（Penicillium sp.）、曲霉属（Aspergillus sp.）、枝孢属（Cladosporium sp.）、麦轴梗霉属（Tritirachium sp.）等4个属。14株菌中有抗菌活性的共11株,优选出抗菌活性较强抗菌谱较广的4株菌分别是Asc-2-4（青霉属）、Asc-2-12（青霉属）、Asc-1-1（青霉属）和Asc-2-1（曲霉属）。青霉属菌株Asc-2-12的抑菌活性最明显,抑菌圈直径最大达到21.91 mm。海鞘共附生真菌是寻找抗菌物质的一个资源,其中的3株青霉属和1株曲霉属的抗菌活性有深入研究的价值。

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2018, 34(9): 300-300.

摘要 ( 115 )

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2018, 34(9): 400-400.

摘要 ( 122 )

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2018, 34(9): 500-500.

摘要 ( 83 )

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