生物技术通报

外源基因在转基因玉米中的整合位点分析

王翠云, 刘艳, 刘允军

2019, 35(3): 1-5. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0756

摘要 ( 267 )

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玉米是我国第一大作物,在保障我国粮食安全中发挥重要作用。通过转基因技术培育具有抗病虫等性状的转基因玉米新品种,可有效减少产量损失。培育的转基因玉米需要鉴定外源基因整合位点,为转基因玉米的安全性评价提供重要依据。以一个抗虫转基因玉米事件IE34为材料,采用热不对称PCR（TAIL-PCR）和遗传定位方法,鉴定外源基因整合位点及旁侧序列。通过TAIL-PCR得到一段长度为776 bp的玉米基因组序列。分别在旁侧序列和外源基因上游序列设计特异性引物,建立了转基因玉米事件特异性的PCR鉴定方法。将旁侧序列在MaizeGDB中进行比对分析,发现此序列是重复序列而且存在于多条染色体上。构建转基因玉米IE34与自交系B73的F₂代遗传分离群体,通过BSR-Seq方法确定外源基因整合在玉米第5染色体短臂2.32-2.70 Mb区间内。通过精细定位将外源基因整合位点缩小在第5染色体2.35-2.61 Mb约260 kb的区间内。本研究结果表明,对于整合位点旁侧序列复杂的转基因事件,TAIL-PCR结合遗传定位方法能够有效鉴定外源基因的整合位点。

转cry1C基因抗虫水稻吉生粳3号外源基因整合分析与品系特异性检测

金永梅, 马瑞, 于志晶, 林秀峰

2019, 35(3): 6-12. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0788

摘要 ( 272 )

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利用染色体步移方法分离获得转cry1C基因抗虫水稻吉生粳3号外源基因旁侧序列及其水稻基因组中的插入位点,并建立了吉生粳3号品系特异性PCR检测方法。通过对吉生粳3号外源基因左、右边界旁侧序列分别与水稻基因组序列和T-DNA序列的比对分析确定其插入位点,发现T-DNA在水稻基因组（日本晴）2号染色体上的基因间区2790685-2790589位点（GenBank登记号：NC_029257.1）。根据T-DNA插入位点,在插入位点两侧基因组区域和T-DNA左边界设计特异性引物,建立了吉生粳3号事件特异性PCR检测方法,为吉生粳3号的身份识别提供了准确、快速的检测技术手段。

抗松针褐斑病湿地松体细胞的悬浮培养

方珞, 吴小芹

2019, 35(3): 13-18. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0694

摘要 ( 255 )

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为了获得大量的抗松针褐斑病胚性愈伤组织试验材料,完善抗性湿地松体胚发生技术,以抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织为材料,探究抗性湿地松体细胞悬浮培养的较适条件,建立抗性湿地松体细胞的悬浮培养体系。研究结果显示：悬浮培养的胚性细胞较分散,利于胚性细胞充分获取营养,可产成熟体胚153个/g,而固体培养的胚性细胞产胚仅为56个/g。抗性湿地松悬浮细胞的较佳培养周期为7-9 d,较适宜的基本培养基为1/4 DCR,麦芽糖添加量为15 g/L,NAA添加量为0.5 mg/L;较佳的继代添加比为1/2;同时研究还发现不同基因型的抗性湿地松悬浮细胞在相同的培养条件下,细胞活力有一定差异,其中无性系13#-9活力最佳。

平顶后增温对烤烟上部叶生长发育的影响

贺文俊, 杨铁钊, 田培, 段杜薇, 李晓辉, 何佳, 周健飞

2019, 35(3): 19-23. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0776

摘要 ( 236 )

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研究平顶后增温对烤烟上部叶生长发育相关氨基酸含量和酶活性的影响,为促进上部叶生长发育,提高烟叶产量产值提供参考。以云烟116为试验材料,共设置2个处理：云烟116常温（T1）;云烟116大棚增温（T2）,研究上部叶胞壁羟脯氨酸（Hyp）含量、胞壁过氧化物酶（POD）活性、吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性对增温的响应。结果显示,平顶后增温能够显著地降低上部叶胞壁Hyp含量、胞壁POD活性和IAAO活性,提高上部叶叶长、叶宽和叶面积,增加上部叶的产量和产值,T2与T1相比,分别提高了8.6%、3.9%、12.9%、7.0%和13.8%。平顶后适当增温能够有效地促进烤烟上部叶生长发育。

花生根际多功能固氮菌的分离及其耐盐碱特性研究

姜焕焕, 祁佩时, 王通, 迟晓元, 陈明娜

2019, 35(3): 24-30. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0770

摘要 ( 296 )

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旨在获得具有固氮、溶磷及分泌IAA的多功能耐盐碱根际促生菌（PGPR）,提高盐碱地花生产量。采用平板涂布法对盐碱地花生根际固氮菌进行了分离,结合16S rDNA序列鉴定和乙炔还原法测定固氮酶活。共获得22个固氮菌株,其固氮酶活性为125.82-346.32 nmol C₂H₄ /（h·mL）。所有菌株均具有产ACC脱氨酶及溶解难溶性磷源活性。其ACC脱氨酶活性为0.12-1.26 U/mg;溶解磷酸三钙量为1.45-53.58 mg/L,溶解磷酸铁量为1.45-8.27 mg/L,溶解磷酸铝量为1.1-22.82 mg/L。其中,10株具有分泌IAA的能力,分泌量在1.36-17.80 μg/mL,占供试菌株的55%。对这10株促生菌进行NaCl、pH耐受性测定,结果显示最大pH耐受力为9,最大NaCl耐受力为1.5 mol/L。这10菌株具有较强的耐盐碱性,具有在盐碱地中应用的潜力。

林木根际细菌JYZ-SD5的促生抗逆性能及种类鉴定

徐秀倩, 吴小芹, 吴天宇, 曾梦嫚

2019, 35(3): 31-38. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0844

摘要 ( 269 )

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旨在探究林木根际细菌JYZ-SD5促生抗逆性能,以期揭示该菌在野外应用的价值。采用特定培养基定性检测该菌的固氮解磷解钾特性,测定该菌产IAA能力;平板对峙法检测菌株拮抗病原真菌活性;检测该菌重金属耐受性;将根际细菌JYZ-SD5施用于水杉盆栽幼苗,观测对水杉生长的影响;采用形态、生理生化测试及 16S rRNA 基因序列分析,对菌株JYZ-SD5进行种类鉴定。结果显示,菌株JYZ-SD5具有固氮、解磷、解钾的能力;不加色氨酸前提下产IAA量可达6.818 6 μg/mL;对链格孢（Alternaria sp.）、异色状拟盘多毛孢（Pestalotiopsis vesicolor）有一定拮抗活性,可产生蛋白酶和纤维素酶;对重金属Mn⁷⁺、Cr⁶⁺耐受性强,最高均可达400 mg/L;温室盆栽试验表明,根际细菌JYZ-SD5可提高水杉苗木叶绿素相对含量,对水杉株高和地径增长具有促进作用。结合形态学、生理生化和分子鉴定的方法初步确定该菌为拟蕈状芽孢杆菌（Bacillus paramycoides）。根际细菌JYZ-SD5具有良好的促生抗逆特性,具有成为新型生物菌肥的开发潜力和野外应用价值。

铀胁迫下伊乐藻的生理响应与富集特性研究

杨昊, 罗学刚, 丁翰林, 王焯

2019, 35(3): 39-46. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0773

摘要 ( 279 )

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为了检验伊乐藻是否具有富集铀的能力,通过水培实验,研究了伊乐藻在不同初始铀（U）浓度胁迫下对铀的富集特征与抗逆性。结果表明,随着初始铀浓度的上升,伊乐藻对铀的富集量上升,当水体中初始铀浓度为 30 mg/L时,铀的富集量达到最大为 14 mg/kg（DW）,对抗氧化酶活性影响最为明显,其中SOD较对照组下降 86.3%,POD较对照组上升 202.4%,CAT较对照组上升 291.6%,伊乐藻细胞膜受到严重伤害,其中MDA含量较对照组上升 117.8%,光合色素影响最为明显,其中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素分别较对照组下降 27.7%、26.7%、35.6%,伊乐藻的PSⅡ受影响较为严重,其中荧光动力学指数F_v/F_m、PI_ABS、ABS/CS_o、RC/CS_o、TR_o/CS_o、ET_o/CS_o分别较对照组下降 47.7%、83.8%、68.7%、90.0%、87.7%、87.3%,光合指数P_n、G_a、C_i较对照组下降 82.1%、20.5%、6.4%。因此,从该实验可以看出伊乐藻对水体中铀具有较好的富集效果,铀对伊乐藻的生理影响较为明显。

产黄酮番木瓜内生真菌的筛选和鉴定

柯树炜, 吕金慧, 陈萍, 张荣萍, 俞悦

2019, 35(3): 47-52. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0857

摘要 ( 274 )

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为开发植物内生真菌这一微生物资源,采用组织分离法从番木瓜植株的叶片、果实和茎中分离内生真菌。通过黄酮类化合物显色反应、薄层层析法（TLC）、紫外光谱法（UV）,对番木瓜内生真菌的次生代谢产物进行初步分析,筛选出1株产黄酮类物质的内生真菌菌株,并利用分生孢子形态特征和真菌内转录间隔区序列（Internal transcribed spacer,ITS）对该菌株进行分析鉴定。结果表明,从番木瓜果实中分离获得编号为G41的内生真菌菌株可归类为青霉属橘青霉（Penicillium citrinum）。研究证实番木瓜果实中存在可产黄酮类物质的内生真菌菌株,具有进一步开发利用的潜在价值。

龙脑樟树叶内生真菌的分离及生物活性菌株的筛选鉴定

金宏杰, 曹红, 刘红, 郑爽, 姜超

2019, 35(3): 53-58. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0750

摘要 ( 294 )

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旨在从龙脑樟树叶片中分离内生真菌并对其发酵产物的体外抑菌、抗肿瘤和抗氧化活性进行测定,筛选鉴定具有较强生物活性的菌株。对分离出的内生真菌,用K-b纸片法测定其抑菌活性,MTT法测定抗肿瘤活性,紫外分光光度法测定其抗氧化活性,ITS（Internal transcribed spacer）序列测序分析确定活性菌株的种属。结果显示,共从龙脑樟树叶片中分离得到内生真菌39株,其中具有对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌较强抑制活性的菌株7株。又从7株真菌中筛选出具有较强抗肿瘤活性和抗氧化活性的菌株ZS14,其对人乳腺癌细胞MCF-7抑制率达到73.00%,对DPPH清除率70.92%,对羟自由基清除率78.83%,过氧化氢清除率81.36%,据ITS测序结果将其命名为Diaporthales sp. ZS14。分离得到的菌株Diaporthales sp. ZS14具有较强的抑菌、抗肿瘤、抗氧化活性,可以作为药物开发的潜在来源进行进一步研究。

海洋生物共附生真菌的分离、鉴定及抗菌活性分析

张圣良, 楚肖肖, 赵友兴, 孔凡栋, 黄小龙

2019, 35(3): 59-64. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0856

摘要 ( 284 )

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对海南文昌海域采集的海草、海绵和石珊瑚的共附生真菌进行分离、鉴定及抗菌活性分析。采用3种分离培养基分离海草、海绵和石珊瑚的共附生真菌,利用ITS序列分析对分离的真菌进行鉴定,采用滤纸片扩散法对分离真菌的发酵产物进行抗菌活性分析。结果从10种海草、9种海绵和11种石珊瑚中共获得113株真菌。ITS序列分析初步确定了32株独立菌株的分类地位,归属于3个门（子囊菌门、担子菌门和半知菌门）,8个目和10个属,其中子囊菌门所占比例最高为58.82%,半知菌门次之为32.35%,担子菌门最少为8.83%;抗菌活性测试显示12株真菌的发酵产物对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌具有较强的抗菌活性。初步揭示了海南文昌海域海草、海绵和石珊瑚的共附生真菌的多样性以及其发酵产物的抗菌活性。

戈壁异常球菌角蛋白酶基因的克隆及功能研究

耿秀秀, 周正富, 刘盈盈, 平淑珍, 王劲

2019, 35(3): 65-70. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0976

摘要 ( 238 )

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旨为深入发掘角蛋白酶重要的基因资源,进一步提高其水解酶活,为工业生产提供理论基础。从分离于新疆戈壁沙漠的戈壁异常球菌（Deinococcus gobiensis）I-0中克隆出一个编码角蛋白酶的基因并命名Dgker。构建原核表达载体pET -22b -Dgker并进行体外诱导表达纯化,通过对羽毛水解活性的测定探究粗酶液的最适温度和pH。结果显示,Dgker蛋白N端前50个氨基酸对蛋白的表达纯化有很大影响。Dgker的重组菌株3d完全分解羽毛,在奶粉平板上重组菌株粗酶液比空载菌株粗酶液降解圈更显著。Dgker适应的温度和pH较为广泛其中最适温度是60℃、最适pH是5.0。Dgker能降解羽毛在以后的工业生产及处理废弃羽毛有极大的应用空间。

一株嗜麦芽寡养单胞菌的分离及其生物学特性

徐敬昭, 陈贝, 杜秉海, 赵东英, 汪城墙, 丁延芹

2019, 35(3): 71-77. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0769

摘要 ( 313 )

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近年来,基于高通量测序技术对植物根际土壤微生物菌群结构的测定结果表明,土壤中绝大多数微生物难以通过传统的富营养培养基实现培养和分离。为进一步探索分离土壤中寡营养微生物的方法,结合多种培养因素,以土壤浸出液为基础培养基设计寡营养培养基分离土壤细菌菌株。并通过菌株的细胞形态、生理生化特征、16S rRNA和gyrB基因序列等对其中一株菌进行鉴定,同时对其蛋白酶与铁载体的产生能力进行检测以评价其在植物根际促生方面的应用潜力。利用土壤浸出液做培养基是有效分离土壤寡营养细菌的方法;编号为S35的菌株鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）,具有蛋白酶和铁载体产生能力。采用的寡营养培养基可以分离获得在富营养培养基上不易分离的细菌,得到S. maltophilia S35菌株在植物促生方面具有一定的应用潜力。

农林生态区土壤中的可培养芽胞杆菌资源调查——以四川省和重庆市部分地区为例

刘国红, 刘琴英, 刘波, 车建美, 陈倩倩

2019, 35(3): 78-86. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0795

摘要 ( 239 )

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调查了四川和重庆农林生态区土壤中的芽胞杆菌资源种群分布,为芽胞杆菌功能资源挖掘和菌剂开发提供基础。采用可培养法从农林生态区土壤中分离获得芽胞杆菌,利用细菌16S rRNA基因初步确定其分类地位,并通过多样性指数分析芽胞杆菌种群结构。结果表明,共分离获得芽胞杆菌95株,经16S rRNA基因鉴定,7个属38个种,其中芽胞杆菌属（Bacillus）22个种、赖氨酸芽胞杆菌属（Lysinbacillus）4个种、类芽胞杆菌属（Paenibacillus）7个种、短芽胞杆菌属（Brevibacillus）2个种、嗜冷芽胞杆菌属（Psychrobacillus）1个种、鲁梅尔芽胞杆菌属（Rummeliibacillus）1个种和虚构芽胞杆菌属（Fictibacillus）1个种。其中,6株芽胞杆菌与其最相近模式菌株的16S rRNA相似性低于98.65%,为潜在新种。农林生态区土壤芽胞杆菌多样性指数香农指数大小依次为乐山林地>盐亭县农地>重庆林地>盐亭县林地。以芽胞杆菌种类为样本,含量为指标,当欧式距离λ=15时,芽胞杆菌种类可分为高含量分布广型和低含量分布不均匀型。综上所述,农林生态区土壤蕴藏着较丰富的芽胞杆菌种类,为芽胞杆菌资源开发和利用提供了资源保障。

过表达INO1基因提高酿酒酵母乙醇耐受性

黄贞杰, 陈由强, 薛婷

2019, 35(3): 87-92. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0784

摘要 ( 284 )

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为获得燃料乙醇生产菌株,通过基因工程改造,构建能够利用能源甘蔗汁发酵、乙醇产率高的酿酒酵母工程菌株。即过表达肌醇-3-磷酸合成酶基因ino1,敲除kanMX抗性基因,获得重组菌。对过表达菌株的乙醇耐受性进行分析。利用甘蔗汁进行发酵培养,采用气相色谱（GC）对发酵产物乙醇进行检测。结果显示过表达菌株YI2-1能够耐19%（V/V）的乙醇,利用20^oBx甘蔗汁厌氧发酵乙醇积累量为13.10%（V/V）,较出发菌提高了8.55%。而过表达菌株YI2-1△KP的最大乙醇积累量为13.17%（V/V）,较出发菌提高了9.16%。研究表明通过过表达酿酒酵母ino1基因能够有效提高菌株细胞活力、乙醇耐受性。构建的工程菌可利用甘蔗汁发酵,具有较高的乙醇产量。

氨浓度升高对CHO细胞维持期抗体融合蛋白的表达及N-糖基化的影响

陈欣宁, 赵亮, 范里, 刘旭平, 谭文松

2019, 35(3): 93-102. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0629

摘要 ( 558 )

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为了深入理解在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞流加培养过程中氨对抗体融合蛋白表达和N-糖基化的作用,认识氨影响N-糖基化加工的作用位点,考察了在细胞维持期（产物表达期）不同氨浓度条件与CHO细胞维持与代谢、抗体融合蛋白表达和N-糖链结构的关系。结果显示,氨浓度在5-12 mmol/L范围内对维持期的细胞生长曲线、葡萄糖和谷氨酰胺的消耗以及乳酸和氨的生成情况没有明显影响。但当氨浓度大于5 mmol/L时,随着氨浓度的升高,抗体融合蛋白的唾液酸化程度和半乳糖化程度均不断降低,而岩藻糖基化程度和高甘露糖糖型比例则没有变化。当氨浓度升高至大于9 mmol/L后,抗体融合蛋白的表达能力和最终表达量开始降低。因此,应在细胞培养工艺过程开发时控制氨的生成至小于5 mmol/L,以避免氨的累积导致产物的半乳糖化和唾液酸化程度降低以及产物表达量下降。

巴洛沙星胁迫下大肠杆菌的比较蛋白质组学研究

张良, 陈小青, 宋佳宇, 毛然然, 姜倩雯, 林向民

2019, 35(3): 103-109. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0848

摘要 ( 226 )

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随着全球细菌耐药形势的日益严峻,细菌耐药机制已成为热点内容。利用iTRAQ标记的定量蛋白质组学方法,比较大肠杆菌K12 BW25113菌株在1/4 MIC巴洛沙星浓度胁迫下蛋白表达的差异。结果表明,质谱分析法共鉴定到118个差异蛋白,其中52个蛋白表达上升,66个表达下降;经生物信息学分析发现,细菌可能通过降低TCA循环、丙酮酸循环以及碳代谢等能量代谢来调整细菌的耐药状态;并通过提高核酸代谢等相关蛋白表达,减少巴洛沙星的杀菌压力,促进细菌存活。同时,利用qPCR技术验证碳代谢和嘧啶代谢途径的相关基因在mRNA水平的表达变化,表明大部分基因转录水平表达变化与蛋白水平一致。以上结果为深入研究细菌的耐药过程提供了理论依据,也为更好地控制和防治耐药细菌提供了药物作用靶点。

单增李斯特菌核糖核酸酶Rnase III RncS氨基酸突变对其降解RNA活性的影响

王立霞, 孟庆玲, 乔军, 蔡扩军, 王登峰, 伍晔晖, 郭晶, 才学鹏

2019, 35(3): 110-116. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0861

摘要 ( 238 )

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为研究单增李斯特菌（LM）核糖核酸酶RnaseⅢ RncS氨基酸突变对RNA降解活性的影响。利用生物信息学软件分析单核细胞增生李斯特菌（LM）野毒株SB5中rncS基因编码的RnaseⅢ的结构域,并选择关键氨基酸利用基因重叠延伸PCR（SOE-PCR）技术对其进行了基因突变;然后将rncS突变基因片段D50A、E122A克隆至表达载体pET-32a（+）,在大肠杆菌中利用IPTG进行诱导表达;应用SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组蛋白的表达情况及其抗原特异性;通过体外酶活试验研究其对RNA降解活性的影响。结构域分析结果显示,LM-RnaseⅢ氨基酸序列含有1个双链RNA结合结构域（DSRM）和1个核酸酶结构域（RIBOc）,其中结构域RIBOc含有5个活性位点。SDS-PAGE检测结果显示,表达的重组突变型RnaseⅢ-D50A和RnaseⅢ-E122 A蛋白相对分子质量均为42.5 kD,与理论值相符;Western blot分析表明重组突变型RnaseⅢ-D50A和RnaseⅢ-E122A蛋白可与LM阳性血清发生免疫学反应。体外酶活实验表明,RnaseⅢ发挥降解活性依赖于Mn²⁺或Mg²⁺,将其第50位天冬氨酸突变后,RnaseⅢ RncS的降解活性有所降低（P<0.001）;第122位谷氨酸突变后,RnaseⅢ RncS 降解活性极显著下降（P<0.0001）,提示第122位谷氨酸是维持LM RnaseⅢ RncS酶活性的关键位点。

RNA干扰USE1基因慢病毒载体的构建及鉴定

王佳悦, 刘香男, 彭康莉, 赵博

2019, 35(3): 117-122. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0659

摘要 ( 272 )

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旨在构建泛素结合酶USE1基因的RNA干扰慢病毒载体,并在细胞中检测该基因的抑制表达水平,以期寻找Uba6-USE1特异性泛素化通路对应的下游底物并研究其功能。选取并合成靶向USE1基因的特异性shRNA序列,将其克隆至pLL3.7慢病毒抑制表达载体上,构建抑制USE1基因表达的重组慢病毒质粒并鉴定。将鉴定成功的重组质粒与psPAX2、VSVG慢病毒包装载体共转染至HEK-293细胞,收集病毒上清,测定病毒滴度并确定最佳感染稀释倍数,通过qPCR和Western Blot方法检测病毒感染HEK-293细胞后对USE1基因的抑制程度,获得能有效抑制USE1基因的慢病毒上清。结果显示,成功构建3种靶向USE1基因的RNA干扰慢病毒载体,获得滴度符合要求的3种慢病毒包装上清液,感染HEK-293细胞后发现,第2、3号shRNA序列均有明显抑制表达USE1基因效果,基因表达抑制率约50%（^*P<0.05）。利用RNA干扰技术成功构建了特异性抑制泛素结合酶USE1基因表达的慢病毒载体,并经mRNA和蛋白水平检验得到2种能够显著抑制USE1表达的慢病毒上清及其shRNA序列。

牦牛HYOU1基因克隆及组织表达分析

季文博, 王会, 柴志欣, 王吉坤, 信金伟, 钟金城

2019, 35(3): 123-131. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0852

摘要 ( 275 )

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为探究HYOU1基因在牦牛中的组织表达谱,通过对西藏牦牛HYOU1基因的CDS区进行克隆测序,分析该基因的结构和功能,采用RT-PCR技术检测黄牛和牦牛肺脏、心脏、肝脏、乳腺、大脑及肌肉中HYOU1基因的相对表达量。结果表明：（1）HYOU1基因CDS区长度为3 006 bp,其中A、G、C和T含量分别为25.0%、31.1%、26.7%和17.1%,存在一定碱基偏好性;发现1个（ACG→ACA）SNP位点,为同义突变。（2）生物信息学分析表明该蛋白呈中性,为较不稳定、亲水性分泌信号蛋白;存在一个跨膜螺旋（TMhelix）区位于13-35氨基酸位置;二、三级蛋白结构分析发现其主要的空间构象为：无规则卷曲及α-螺旋。（3）聚类分析显示,西藏牦牛与野牦牛的遗传距离最近,与瘤牛及普通牛的遗传距离次之,与水牛最远。（4）RT-PCR结果显示HYOU1基因在黄牛和牦牛肝脏、乳腺、肺脏、大脑、心脏、肌肉6个组织中均有表达,且相对表达量依次递减;在相同组织中,黄牛组织的表达量均显著高于牦牛组织中的表达量（P<0.05）,其中黄牛肝脏组织的表达量为牦牛表达量的4.4倍。

牦牛TSHB、DIO2和DIO3基因的克隆及其在繁殖轴的表达研究

王琴, 卢建远, 字向东

2019, 35(3): 132-137. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0793

摘要 ( 267 )

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为了解TSHB-DIO2/DIO3系统对牦牛季节性发情的调控机制,以牦牛为研究对象,运用RT-PCR方法克隆牦牛TSHB、DIO2、DIO3基因的cDNA序列,结合GenBank已公布的普通牛TSHB、DIO2、DIO3基因序列,构建遗传进化树,采用荧光定量 PCR 技术检测其在牦牛下丘脑、垂体、卵巢、输卵管、子宫中的表达水平。结果表明,牦牛TSHB、DIO2、DIO3基因均与普通牛有最近的分子进化关系;TSHB基因CDS区为417 bp,在垂体中的表达水平高于其他组织,差异极显著（P<0.01）;DIO2基因cDNA 为951 bp,在所检测的组织中均有表达,且在子宫中的表达水平高于其他组织,差异极显著（P<0.01）;DIO3基因cDNA为873 bp,在子宫组织中未检测到表达,在卵巢中的表达水平高于垂体、下丘脑和输卵管,差异极显著（P<0.01）。提示TSHB-DIO2/DIO3可能参与牦牛繁殖调控,旨为揭示牦牛季节性繁殖分子调控机制提供参考。

澳大利亚转基因生物安全监管概况及启示

吴刚, 李文龙, 石建新, 张丽, 武玉花, 宋贵文

2019, 35(3): 138-143. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0711

摘要 ( 313 )

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澳大利亚是世界上重要的农产品生产国和出口国,本文对澳大利亚转基因生物安全监管从基因工程安全管理立法历程、转基因监管体系及职责、转基因日常监管与执法、转基因标识管理、生物育种新技术研究和监管等方面进行了综述。以澳大利亚转基因生物安全管理经验为启示,结合我国转基因生物安全管理的现状,提出如下建议：对我国现有转基因管理体系、法规制度体系和技术支撑体系等进行完善,严格监管执法,落实相关责任,提高公众参与度、加大信息公开力度,并尽快明确基因编辑等生物育种新技术的监管原则。

成纤维细胞生长因子5研究进展

雷蕾, 包鹏甲, 梁春年, 褚敏, 阎萍

2019, 35(3): 144-150. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0622

摘要 ( 312 )

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成纤维细胞生长因子5（Fibroblasts growth factor 5,FGF5）是成纤维细胞生长因子家族（FGFs）的成员之一,具备多种生物学功能。目前的研究发现,FGF5在哺乳动物毛发周期性生长中起着重要作用,是生长期到退行期的关键信号分子,同时与动物肢体发育及人多形性胶质母细胞瘤、黑色素瘤、肝细胞癌、人类高血压的形成也有一定的联系。综述了近年来FGF5的相关生物学功能及其在疾病形成中的研究结果,以期为其在人类毛发生长、动物绒毛资源利用、肢体发育以及肿瘤诊治等领域中进一步的研究及合理开发利用提供理论依据。

铁皮石斛分子遗传学和多组学研究进展

乔宇琛, 周思静, 宋梅芳, 王平, 刘桂君

2019, 35(3): 151-163. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0759

摘要 ( 289 )

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铁皮石斛（Dendrobium officinale）又名黑节草,隶属被子植物门,单子叶植物纲,兰科石斛属,是一种集食药用与观赏性为一体,且极具经济价值的多年生草本植物。由于铁皮石斛种子在自然条件下萌发效率低、生境破坏及采摘无度,野生资源已面临灭绝,1991年被国家列为珍稀濒危植物。《中国药典》记载其有滋阴清热、益胃生津的功效,被誉为“药界大熊猫”,具有很高的药用价值。加上近些年大健康产业不断蓬勃发展,铁皮石斛的市场需求逐年增加,这一古老的药食两用植物已成为人们的研究热点。随着基因组测序以及生物信息学等技术的日趋成熟,铁皮石斛在分子生物学研究领域取得了一系列可喜的成绩。综述了近年来国内外有关铁皮石斛在分子遗传学、基因组、转录组、蛋白质组与代谢组方面的研究进展,讨论了这些工作对铁皮石斛研究的重要意义,并对亟待开展的工作进行了展望,旨为铁皮石斛分子育种、功能基因挖掘和活性成分生物合成机制提供理论依据,促进铁皮石斛产业的科学可持续发展。

交联酶聚集体的制备及在漆酶固定化中的应用进展

韩姝然, 卢磊

2019, 35(3): 164-170. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0935

摘要 ( 278 )

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漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,其催化效率高,作用底物范围广,在工业中具有广阔应用前景。交联酶聚集体（CLEAs）是一种无需载体、无需酶纯化、制备简单、成本低的新型固定化酶方法,通常具有较高的稳定性,可实现酶的重复利用。对交联酶聚体制备过程中影响酶活性的相关因素以及其改进策略进行了分析,并对交联漆酶聚集体在污染物降解等方面的应用进行了总结,旨在为进一步的研究和应用奠定基础。

乙烯生物合成及信号转导途径中介导花衰老相关基因的研究进展

刘畅宇, 陈勋, 龙雨青, 陈娅, 刘湘丹, 周日宝

2019, 35(3): 171-182. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0923

摘要 ( 329 )

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乙烯为植物重要内源激素,参与植物多项生命活动,在花发育及衰老进程中起重要调节作用。在花卉中,研究者可通过调控其乙烯生物合成及信号转导途径相关基因影响内源乙烯生成,继而影响其发育与衰老进程。目前,通过调控内源乙烯延长花期的研究主要应用于观赏花卉,对于药用等其他花类应用尚少。对乙烯生物合成和信号转导途径模型及其相关基因的互作模式、近年来乙烯反应中介导花发育与衰老相关基因克隆及调控的相关研究进行综述,以期将通过调控内源乙烯途径相关基因来延缓植物花期的研究应用于其他花期短的观赏切花、花类药材等,为从基因水平调控内源乙烯以获得花期延长的观赏、药用花类等优良育种提供参考。

基于碳基电极的电化学传感器检测铅离子的研究进展

林少华, 谢银侠, 罗红霞, 许文涛, 申慧杰

2019, 35(3): 183-193. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0599

摘要 ( 291 )

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重金属铅离子在空气、水、土壤和食物中普遍存在而且含量越来越高。铅离子具有较大的毒性,对人体的健康有很大的危害。近年来发展了很多检测铅离子的方法,其中以碳基为基底电极的电化学传感器由于具有简单、快速、灵敏等优点而备受青睐。从复合电极修饰材料的角度,综述了基于无机材料、有机材料和功能核酸等复合电极在检测铅离子的研究进展,重点介绍了碳基电极的发展历程、构建及铅离子的检测方法,对基于碳基电极的铅离子电化学传感器的发展前景进行了展望。

功能核酸荧光免标记型定量统一化检测技术的研究进展

肖冰, 刘榜, 罗云波, 黄昆仑, 张园, 李夏莹, 张秀杰, 许文涛, 周翔

2019, 35(3): 194-202. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0809

摘要 ( 205 )

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功能核酸是一类具有特定空间构象、执行特异生物功能的天然或者人工核酸序列,具有易于修饰、价格低廉、稳定性高、特异性强等优势,其搭载免标记荧光传感系统后,功能核酸可起到将多种靶物质统一转为较为稳定的核酸信号,以及通过核酸扩增对检测信号进行扩增等重要作用。而免标记荧光传感技术可以在检测中免去荧光标记时荧光、猝灭基团的筛选和标记过程的繁琐和成本,同时可保证与核酸的特异或非特异性结合后产生荧光信号变化。通过两种技术的优势结合,检测的灵敏度、实时性可进一步提高,逐渐被广泛应用于环境污染物检测、食品风险因子检测、疾病诊断等多个领域。首先明确功能核酸与荧光定量检测技术等相关概念,详细阐述了几种重要的荧光物质的特点以及其与功能核酸的分子识别、作用方式与发光机制,接着紧紧围绕该种传感技术的几个特点,从功能核酸荧光免标记型定量统一化检测技术与其实际应用角度进行分类介绍与评价对比,最后就功能核酸荧光免标记型定量统一化检测技术在多种领域的检测分析中的研究意义以及存在的问题进行讨论,并对未来的发展与应用作出展望。

公共场所水环境中活嗜肺军团菌的快速检测方法

郭沛, 赵龙, 胡翮

2019, 35(3): 203-209. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0791

摘要 ( 346 )

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旨在建立一种基于16S rRNA前体的分子学检测方法用于快速检测活嗜肺军团菌,应用该方法与ISO标准法调查公共场所水环境中嗜肺军团菌的水平及污染现状。此研究方法的理论基础在于营养刺激后可诱导嗜肺军团菌16S rRNA前体的合成,后者可作为检测细胞活性的指标。分别应用预刺激RT-qPCR法和ISO法对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌以及非军团菌进行检测,并验证两种方法的特异性、灵敏度。应用预刺激RT-qPCR法和ISO法检测公共场所水环境中的嗜肺军团菌,比较两者结果的一致性。结果显示,预刺激时间大于3 h时,嗜肺军团菌16S rRNA前体的增长缓慢,最佳预刺激时间设置为3 h。预刺激RT-qPCR法与ISO法均能较好地检出嗜肺军团菌,特异性均为100%,预刺激法的最低检测浓度（Limit of detection,LOD）为10²Cell/L,ISO标准法的LOD为10⁴ Cell/L。预刺激法及ISO法的总阳性率分别为43.5%（30/69）和40.6%（28/69）,两种方法的检出率差异无明显统计学意义（C²=0.119,P=0.730）。预刺激RT-qPCR法是一种快速有效的检测活嗜肺军团菌的方法,诊断灵敏度及特异性高,是ISO标准法潜在的替代方案。

一株具有噬菌体抗性的芽孢杆菌BS-2的鉴定及葡萄糖流加工艺优化

戚家明, 杨娜, 孙杉杉, 明艳超, 郭亮, 张东旭, 徐志文

2019, 35(3): 210-216. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0670

摘要 ( 290 )

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筛选噬菌体抗性菌株以解决枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）生产过程中噬菌体污染问题并提高抗性菌株的发酵水平。采用双层平板法从异常发酵液中分离并纯化以枯草芽孢杆菌为宿主的噬菌体,利用纯化得到的噬菌体筛选实验室芽孢杆菌库以得到抗性菌株,结合16S rDNA和gyrA基因序列进行系统发育分析确定其分类地位,以分批发酵的生长曲线及葡萄糖含量曲线作为基础,对发酵培养基的初糖浓度及葡萄糖的流加方式进行优化提高筛选到的噬菌体抗性菌株的发酵水平。从异常发酵液中分离到噬菌体S01及S02并在实验室芽孢杆菌库中筛选到一株噬菌体无法侵染的芽孢杆菌BS-2,结合16S rDNA及gyrA基因序列的系统发育分析将BS-2鉴定为枯草芽孢杆菌,按照葡萄糖初始浓度15 g/L,葡萄糖浓度低于5 g/L时以2 g/L·h的速度流加葡萄糖,补加量10 g/L的流加补料方法,可以将发酵水平提高至2.43×10¹⁰ CFU/mL。枯草芽孢杆菌BS-2具有较好的噬菌体抗性且经过工艺优化可以达到较高发酵水平,有较强工业化应用潜力。

运用全因子试验方法优化单抗生物类似药生产过程中的糖基化分布

张磊, 杨沐迪, 董顺, 刘明秋

2019, 35(3): 217-224. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0782

摘要 ( 341 )

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旨在调控单抗生物类似药的糖基化分布,使其与原研药一致。通过全因子设计试验考察不同浓度的半乳糖、尿苷、氯化锰和蛋白水解物对单抗糖基化修饰的影响。结果表明,半乳糖、尿苷及氯化锰均能提高单抗半乳糖基化,且对细胞生长和单抗产量无明显影响。此外尿苷和氯化锰还能降低五聚高甘露糖型（Man5）,但过量的尿苷会导致Man5增高。而蛋白水解物除了能降低Man5,提高单抗岩藻糖基化外,对细胞生长也有促进作用。选取模型预测的最优条件进行反应器培养验证,最终的单抗糖基化分布符合预期,成功建立CHO细胞单抗糖基化调控的生产策略。

2019, 35(3): 300-300.

摘要 ( 100 )

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