生物技术通报

玉米 ZmENA1 基因的克隆及其对金属离子的应答分析

张鑫, 周晓今, 逄森, 李素贞, 黄家兴, 陈茹梅

2020, 36(11): 1-8. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0192

摘要 ( 447 )

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烟酰胺（NA）是重要的植物铁载体麦根酸（MA）的前体物质,烟酰胺外排转运体 ENA 是植物体介导 NA 转运的重要蛋白。探究 ZmENA1 的基本功能可为阐明玉米中金属离子的转运及储存机制提供依据。本研究同源克隆了 ZmENA1 基因,并通过生物信息学方法分析了该蛋白的基本特征,同时运用实时荧光定量技术分析了该基因在籽粒发育过程及在不同金属离子浓度下的表达模式。结果表明,ZmENA1 的 ORF 长 1 356 bp,预测其编码蛋白等电点为 8.06,蛋白质大小为 48.998 kD,在蛋白质二级结构中 α 螺旋占比达 53.98%;该蛋白有 4 个磷酸化位点、10 个跨膜区且 N 端含有 1 个信号肽。表达分析发现,ZmENA1 在胚乳和种皮混合物中的表达量高于胚,并在 16 DAP达到高峰,然后随着发育进程逐渐降低。此外,ZmENA1 的表达可应答于 Zn²⁺、Mn²⁺ 和 Cu²⁺ 的缺乏以及过量的 Zn²⁺、Mn²⁺ 和 Cd²⁺,推测 ZmENA1 在调节金属离子的转运和储藏方面发挥作用。本研究为深入揭示 ZmENA1 的功能提供基础。

玉米铁还原酶基因ZmFRO2的功能分析

乔孟欣, 李素贞, 陈景堂

2020, 36(11): 9-20. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0281

摘要 ( 450 )

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Fe是植物生长发育过程中最重要的微量元素之一,植物缺铁会导致叶片黄化,进而影响产量。植物吸收转运铁共有两种机理,即机理I和机理II,相应的植物称为机理I植物和机理II植物,机理I植物主要包括双子叶植物和非禾本科单子叶植物,机理II植物主要包括禾本科植物。铁还原酶基因FRO（Ferric reduction oxidase）作为机理I植物中的关键基因已在多种植物中被发现与研究,包括禾本科植物水稻。为了解该基因在玉米中的功能,对玉米铁还原酶基因ZmFRO2进行了基因功能的分析,包括生物信息学分析、表达模式分析及亚细胞定位分析,证明了ZmFRO2具有铁还原酶的结构基础且与OsFRO1、MtFRO2、AtFRO6和AtFRO7具有较近的亲缘关系,ZmFRO2定位在质膜与胞质,该基因主要在叶片中大量表达,且该基因的表达受缺铁先诱导后抑制。另外,通过农杆菌介导的方法获得了过表达ZmFRO2玉米植株,对其进行铁还原酶活力及锌铁含量测定发现过表达ZmFRO2能够提高玉米根部铁还原酶活力,根部、叶片和籽粒的铁含量均有不同程度的升高。通过这些分析和测定为之后基因功能的深入研究奠定基础,进而为提高玉米铁含量提供新的功能基因和新途径。

水稻籽粒低镉蛋白LCD互作蛋白的筛选与鉴定

郝小花, 戴佳利, 暨文劲, 黄丹, 李东屏, 田连福

2020, 36(11): 21-29. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0510

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水稻低镉基因（Low cadmium,LCD）参与水稻籽粒镉（Cd）的积累,筛选与LCD互作的蛋白有利于揭示LCD介导的籽粒Cd积累调控的分子机制。以粳稻日本晴为试验材料构建酵母双杂交膜系统和核系统cDNA文库,以LCD为诱饵蛋白,分别进行膜系统和核系统筛选,获得29个与LCD互作的候选蛋白,并对这些基因进行gene ontology（GO）注释分析。进一步通过一对一互作验证,获得21个互作蛋白,包括膜系统蛋白16个,核系统蛋白5个,其中,6个蛋白与物质转运相关,5个蛋白与植物耐逆相关,4个蛋白与植物发育响应相关,6个蛋白与细胞生理代谢相关。

樟叶越桔嫩枝1株内生真菌的鉴定及抑菌活性测定

严冬, 曾为林, 罗旭璐, 陈肖学, 刘惠民, 赵平

2020, 36(11): 30-38. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0200

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从樟叶越桔嫩枝中分离得到1株内生真菌Z-78,通过形态鉴别和分子生物学方法,鉴定为木防己拟盘多毛孢（Pestalotiopsis cocculi（Guba）G.C. Zhao & N. Li）。采用平板对峙法测定了其对灰葡萄孢、腐皮镰孢、禾谷镰孢、尖孢镰孢、芸苔链格孢、密粘褶菌、绵腐卧孔菌和采绒革盖菌等8种植物病原菌的抑制活性,采用生长速率法对其发酵液抑制芸苔链格孢活性进行了酸碱稳定性试验。结果表明：内生真菌Z-78对8种供试病原菌均有较强的抑菌活性,其发酵液在不同pH条件下对芸苔链格孢保持活性稳定。

橡胶树HbCPA基因的克隆、表达及生物信息学分析

杨洪, 胡燕玲, 岳镒繁, 邓治, 代龙军, 李德军

2020, 36(11): 39-47. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0294

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N-氨甲酰基腐胺酰胺水解酶（N-carbamoylputreseine amidohydrolase,CPA）是高等植物通过精氨酸途径合成腐胺的终反应酶。利用RACE技术从橡胶树中克隆了一个CPA基因,命名为HbCPA。HbCPA序列全长1 342 bp,开放阅读框为906 bp,编码301个氨基酸。HbCPA理论分子量约为33.5 kD,理论等电点为6.01。进化分析表明,HbCPA与木薯MeCPA、蓖麻RcCPA和麻风树JcCPA聚为一枝。qRT-PCR结果显示,HbCPA在橡胶树各组织中均有表达,表达量从高到低依次为树皮、叶片、雌花、雄花、茎尖;HbCPA在叶片不同发育时期表达存在变化,淡绿期最高,古铜期和衰老期表达量相当且最低;同健康树树皮相比,HbCPA在死皮树树皮中表达量明显上调;HbCPA表达受乙烯利、茉莉酸甲酯、低温、干旱、高盐、过氧化氢等调控,表明HbCPA可能参与橡胶树产排胶调控及非生物逆境胁迫响应。

泰山黄精内生细菌的抗菌活性研究

郭晓平, 刘兴飞, 李晓楠, 吕雪茹, 郤少梅, 田园

2020, 36(11): 48-54. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0184

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分离及筛选泰山黄精中对常见植物病原菌有拮抗活性的内生细菌,为发掘生防微生物资源及泰山黄精的开发利用奠定基础。用常规组织分离法从健康黄精根茎中进行菌种分离,平板对峙法对菌株进行筛选,依据形态、生理生化指标及16S rDNA序列测定对活性最强的菌株进行鉴定。采用平板倒扣法测定菌株产生挥发性物质的抑菌效果,通过琼脂扩散法测定无细胞发酵液对病原真菌的抑制活性。获得1株具有广谱抗菌活性的内生细菌HJ-12,经鉴定为短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）,对6种病原菌的抑制率为（18.57±0.25）%-（48.33±0.15）%。该菌株所产的挥发性物质抑菌活性相较于菌体更强,抑制率为（21.05±0.17）%-（83.53±0.19）%,且该菌株经液体培养2 d后,其无细胞发酵液上清也具有明显的抑菌活性。该Brevibacillus brevis HJ-12菌株在植物真菌病害生物防控中具有潜在的应用价值。

一株溶藻菌CBA02的分离、鉴定及溶藻特性研究

杨冰洁, 向文洲, 金雪洁, 陈子硕, 王灵, 吴后波

2020, 36(11): 55-62. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0394

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微藻在大规模养殖中易受溶藻微生物污染,为了鉴定一株溶藻菌CBA02的物种分类,研究该溶藻菌溶藻效应和溶藻机制。利用2216E平板法分离纯化该株细菌;采用16S rDNA基因序列对法鉴定细菌种类;以盐生杜氏藻为实验对象,探究其溶藻特性和溶藻方式。经16S rDNA鉴定,菌株CBA02初步定名为Ponticoccus sp. CBA02;CBA02对盐生杜氏藻的溶藻率随菌液发酵时间和添加量的增加而提高,随藻初始浓度的提高而降低;菌液、无菌上清液及高温灭菌处理的无菌上清液均能显著性降低盐生杜氏藻叶绿素a浓度（P<0.05）,且经pH处理之后的无菌上清液的溶藻效率随pH的升高而提高。菌株Ponticoccus sp. CBA02对盐生杜氏藻具有的强烈的溶藻作用,其溶藻活性受菌液发酵时间、添加量、藻细胞初始浓度和pH等因素的影响,CBA02是通过分泌溶藻物质间接溶藻,溶藻物质具有热稳定、适宜较高pH的特性。

嗜水气单胞菌acrA缺失菌株的构建及其生理功能的测定

李小艳, 李泽琦, 汪玉倩, 于晶, 林镇平, 林向民

2020, 36(11): 63-69. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0380

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AcrA是革兰氏阴性菌中的一种膜融合蛋白,现今关于AcrA蛋白的研究,以AcrA蛋白在细菌中药物外排等膜转运过程中的调节作用为主。为了阐明细菌中acrA基因敲除后,该菌在溶血性、毒理性、压力胁迫性及抗生素敏感性等生理功能的变化,以嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）为研究对象,利用无痕敲除等分子生物学手段构建acrA（AHA_2911）的缺失菌株,并对野生菌株和缺失菌株的溶血性、胞外蛋白酶活、抗生素敏感性、高温胁迫、生长趋势以及生物膜形成能力等生理特性进行了测定。结果显示,敲除菌株的溶血性和胞外蛋白酶活并未受到影响,但acrA基因敲除后增加了该菌对卡那霉素、罗红霉素、巴罗沙星抗生素及吖啶黄素染料的敏感度并且显著提高了嗜水气单胞菌的生物膜形成能力。但是,∆acrA 在42℃下的生长趋势及其生物膜形成能力明显弱于野生株。以上研究证明嗜水气单胞菌acrA基因在药物外排泵中有一定的功能,并且提示该基因可能在细菌的高温耐受性及生物膜形成中起重要作用。

非洲猪瘟病毒K196R和A240L蛋白的可溶性表达及酶活力分析

李鹏昊, 梁严予, 王彦伟, 关洋, 逄文强, 田克恭

2020, 36(11): 70-75. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0216

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旨在提供可用候选抗原蛋白,用于非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）的诊断及免疫预防研究。将ASFV SY18株K196R和A240L蛋白的编码基因进行密码子优化,并在其N端添加促溶标签进行融合表达;TEV酶切后利用亲和层析纯化目的蛋白,并通过Western blot和酶活检测试剂盒对其反应性和体外酶活力进行鉴定。结果显示,K196R和A240L蛋白分别通过添加SUMO和MBP标签实现了可溶性表达,标签去除后蛋白大小分别为22 kD和27 kD左右;Western blot结果显示,K196R和A240L蛋白均能够与ASF阳性血清发生较好的特异性反应;酶活检测结果表明,二者均具有一定的体外酶催化活性。利用大肠杆菌表达的ASFV K196R和A240L可溶性蛋白,具有较好的反应性和一定的体外酶催化活性,可为ASFV的诊断及蛋白的相关功能研究提供一定的依据。

海鞘附着相关微生物膜中细菌原核群落结构解析

刘倩倩, 史宏伟, 郭长禄, 张治洲

2020, 36(11): 76-84. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0187

摘要 ( 348 )

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本研究利用环氧铁红防锈漆和丙烯酸脂成膜物作为涂层基质,添加4种纳米材料（0.1%,W/V）制备了2类防污涂层,发现两类涂层的防污性能打分接近,但是基于环氧铁红防锈漆的涂层其玻璃海鞘附着程度显著高于丙烯酸酯。通过实海挂板采集涂层表面生物膜,提取其宏基因组DNA并进行16S核糖体RNA全长基因的高通量测序,研究了第28天涂层表面原核菌群的组成差异。结果显示：（1）丙烯酸酯涂层生物膜原核菌群多样性高于铁红涂层;（2）纳米材料的添加没有明显改变涂层表面菌群结构组成;（3）两类涂层表面菌群结构差异明显,尤其是Neptuniibacter sp. CAR-SF和Cellvibrionales unclassified菌的含量在铁红涂层中含量均在4%左右,而在丙烯酸涂层中几乎为零,对应的OTU序列读数在两类涂层中相差100倍以上,差异性明显;而qPCR结果进一步证实Neptuniibacter属在两类涂层中含量相差很大。基于丙烯酸酯基质的涂层其海鞘附着量明显减少是否与上述细菌含量差异相关值得进一步研究。

家蝇抗菌肽MDC协同庆大霉素抗普通变形杆菌作用研究

陈晴汝, 桂水清, 卢雪梅

2020, 36(11): 85-93. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0245

摘要 ( 402 )

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以普通变形杆菌（Bacillus proteus vulgaris）为研究对象,探讨家蝇抗菌肽（Musca domestical cecropin,MDC）和庆大霉素（Gentamicin）的体外联合抗菌效果及协同抗菌机制。采用微量肉汤稀释法、棋盘法、结晶紫染色等方法研究两药的协同抗菌作用和抗生物膜作用;通过荧光染色、流式细胞术（FCM）、透射电子显微镜（TEM）观察两药联用的抗菌机制。家蝇抗菌肽MDC与庆大霉素的FIC为0.313,表明两者具有较好的协同抗菌作用;结晶紫染色结果显示两药对细菌初始生物膜、成熟生物膜和胞外蛋白质的影响也有一定的协同作用;荧光和流式细胞术结果显示药物可以有效杀伤细菌,使细菌死亡数目上升;透射电镜观察到给药后大部分细菌细胞壁破损,细胞膜不完整,胞质内容物坏死溶解导致细胞肿胀破裂。家蝇抗菌肽MDC和庆大霉素具有协同抗普通变形杆菌作用,且两药的作用机制相辅相成。

盖子区域氨基酸的定点突变对T1脂肪酶酶学性质的影响

朱彩林, 吕祥, 夏小乐

2020, 36(11): 94-102. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0220

摘要 ( 414 )

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T1脂肪酶来源于 Geobacillus zalihae 菌株,常作为生物催化剂广泛应用于各领域。为了综合改善T1脂肪酶的酶学性质,前期通过对该酶盖子结构进行理性设计得到3个效果较好的突变体L188M、A190L、A190Y,在此基础上,将单点突变体进行组合得到L188M/A190L和L188M/A190Y两个复合突变体。在该实验中对突变体脂肪酶酶学性质展开研究,同时将单点与组合突变效果进行比较。结果显示野生型及突变体最适pH均为9.0,复合突变体的最适温度提高5℃。单点突变及组合突变均使T1脂肪酶的酶学性质得到不同程度的改善,且复合突变体效果更显著。组合突变体使脂肪酶的温度、pH稳定性显著提高,L188M/A190L对于有机溶剂二甲基亚砜及正十六烷的耐受性为野生型的1.88倍和2.73倍,L188M/A190Y为野生型的1.96倍和2.58倍。此外,对C16和C18底物的选择性也明显增强,L188M/A190L为野生型的1.65和2.7倍,L188M/A190Y为野生型的1.5倍和2.25倍。该研究成果在一定程度上拓宽了T1脂肪酶的应用前景,同时为其他脂肪酶的改造提供了一定理论依据。

水稻耐碱性研究进展

冷春旭, 郑福余, 赵北平, 刘海英, 王玉杰

2020, 36(11): 103-111. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0263

摘要 ( 638 )

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我国土地盐碱化程度不断加剧,严重制约了粮食生产。水稻作为中度盐敏感作物,根系具有吸收盐分和分泌有机酸的作用,其生长的水环境能够淡化土壤表层盐碱度,是改良盐碱地的首选粮食作物。碱胁迫和盐胁迫均能对水稻造成渗透胁迫和离子毒害,而碱胁迫使水稻遭受高pH值和高盐分双重损伤,伤害作用和调控机制比盐胁迫更为严重和复杂。目前,研究多集中于盐胁迫,对碱胁迫下水稻响应和调控机制的研究较少。综述了碱胁迫对水稻生长发育和生理生化的影响、水稻耐碱机理及相关基因的研究,提出了强化水稻耐碱性的策略,以期通过分子生物技术培育耐碱水稻新品种,实现盐碱地改良,扩大水稻种植面积和总产量,保障粮食生产安全。

禾本科主要农作物叶绿体基因组研究进展

李裕华, 任永康, 赵兴华, 刘江, 韩斌, 王长彪, 唐朝晖

2020, 36(11): 112-121. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0285

摘要 ( 510 )

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叶绿体是植物细胞所特有的细胞器,是光合作用的主要场所。叶绿体拥有独立的核外基因组,编码与自身功能相关的部分基因,具有半自主性。叶绿体基因组（cpDNA）中含有大量功能基因,在物种鉴定及系统进化研究中的应用价值已经受到研究者们的广泛关注和逐步认可。禾本科是叶绿体基因组研究比较集中的一个科,就禾本科主要作物的叶绿体基因组特征、基因类型分布、RNA编辑以及禾本科主要作物叶绿体基因组在系统发育中的应用等方面进行了综合分析,旨为下一步解析禾本科叶绿体基因组在物种的进化、遗传、系统发育关系等方面的研究奠定基础。

非生物胁迫下植物DNA甲基化研究进展

刘治民, 杨芷怡, 冀凤丹, 梅志超, 于佳慧, 解莉楠

2020, 36(11): 122-132. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0330

摘要 ( 608 )

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非生物胁迫,包括高温、干旱、寒冷、洪涝和盐碱化等,通常不利于植物生长发育。在植物长期的自然选择和进化过程中,植物已经形成了一套完整的体系,以应对外界不断变化的环境。在真核细胞中,蛋白质编码基因的表达在很大程度上受到染色质状态的影响。表观遗传修饰,主要包括DNA甲基化,组蛋白修饰,组蛋白变体和一些非编码RNA（Non-coding RNA,ncRNA）的变化,会影响染色质的结构和可及性,进而改变基因表达的活性。近年来研究表明,表观遗传修饰广泛参与植物非生物胁迫响应,对植物适应不断变化的环境十分重要。作为最重要的表观遗传修饰之一,DNA甲基化在调控非生物胁迫响应中的作用引起了人们的广泛关注。主要综述植物DNA甲基化和非生物胁迫下DNA甲基化动态性研究的最新进展,以期为利用表观遗传变异提高植物的抗胁迫能力提供参考。

辣木抗逆相关研究现状及应用

普天磊, 韩学琴, 廖承飞, 邓红山, 罗会英, 金杰

2020, 36(11): 133-140. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0392

摘要 ( 388 )

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辣木（Moringa oleifera Lam）属于热带、亚热带速生树种,具有耐高温、耐贫瘠、耐旱等优良抗性,营养成分和功能性成分含量丰富,可应用于食品、保健品、饲料等多种领域。全球环境变化和人类活动使非生物胁迫加剧,辣木的非生物胁迫抗性越来越受关注,包括干旱胁迫、低温胁迫和盐胁迫抗性。同时,辣木提取物可作为安全有效的生长调节剂,缓解非生物胁迫对植物的损伤,促进植物生长,提高抗逆性,改善产量和品质。无论是辣木的抗逆性研究还是辣木生长调节剂的应用研究,主要通过植物的形态、产量/品质、渗透调节系统、酶保护系统、光合系统、分子水平等相关参数的变化来评价辣木植株或品种的抗性及对逆境损伤植物的改善程度。综述了近年来辣木抗逆研究现状及其提取物在植物抗逆上的应用进展,对其中存在的问题进行讨论,并提出展望,以期为辣木抗逆育种研究、抗逆机制研究及诱导植物抗逆性的应用研究提供参考。

微生物次级代谢产物生物合成的研究进展

赵江华, 房欢, 张大伟

2020, 36(11): 141-147. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0475

摘要 ( 1052 )

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微生物能够产生多种具有生物活性的天然次级代谢产物,这些次级代谢产物在医疗、农业和食品领域有着广阔的应用前景。分子生物学、生物信息学和测序技术的发展为次级代谢产物的挖掘奠定了理论基础,并提供了作工具。近年来,对微生物次级代谢产物的研究越来越多。传统的方法已经难以得到令人满意的结果,对微生物进行分子水平的操作将会是新的方向,如对次级代谢产物生物合成基因簇的调控。综述了新发现的次级代谢产物、提高次级代谢产物产量的策略,通过运用次级代谢产物生物合成基因簇异源表达、核糖体工程、表观遗传调控、代谢调控以及调控转录翻译水平等方法,挖掘新的次级代谢产物、提高次级代谢产物产量,旨在为新药的挖掘提供了突破点。

酿酒酵母关联多药耐受性转录因子Yrr1p的研究进展

曹文妍, 王心凝, 沈煜, 李在禄, 鲍晓明

2020, 36(11): 148-154. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0401

摘要 ( 389 )

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Yrr1p（for yeast Reveromycin A resistance）是含有锌指结构、关联多药耐受性的转录因子,在介导酿酒酵母耐药及抑制物抗性方面具有重要作用。本文回顾了Yrr1p的发现过程,综述了Yrr1p的结构与功能的关系及其介导酿酒酵母对4-硝基喹啉-N-氧化物、水杨酸、戴森锰锌及香草醛等抑制物的耐受机制。其中,Yrr1p介导香草醛耐受性机制与其他药物不同。并概括了Yrr1p与其同源转录因子Yrm1p、Pdr8p,以及上级调控因子Pdr1p、Pdr3p之间的调控关系。转录因子Yrr1p的研究对微生物耐药性研究以及构建高抗性微生物细胞工厂具指导意义。

代谢组学在水产品品质与安全中的研究进展

李锐, 孙祖莉, 杨贤庆, 李来好, 魏涯, 岑剑伟, 王晶, 赵永强

2020, 36(11): 155-163. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0448

摘要 ( 471 )

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代谢组学技术作为一门新兴起的技术,可对样本中小分子代谢物进行定性定量分析,在现代生命科学研究中得到广泛运用,同时也为水产品品质与质量安全变化分子作用机理的研究带来了新的方法。介绍了代谢组学技术及其在水产品质与质量安全控制中的应用,总结了近年来代谢组学技术在水产品养殖与营养、原料鉴定、贮运保鲜、加工产品品质安全领域的研究情况,探讨了组学技术之间的相互关系并对多组学技术联用在研究水产品安全影响因子、品质变化机理的进一步应用提出展望,以期为利用代谢组学技术以及多组学联用对水产品品质与质量安全方面的研究提供参考。

硝化酶的研究进展

赵璐瑶, 陈振娅, 霍毅欣

2020, 36(11): 164-172. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0065

摘要 ( 757 )

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有机化合物尤其是芳香族化合物的硝化反应在化工生产中具有重要作用,芳香族硝基化合物以其能量高、结构稳定的优势成为一种高附加值的化工中间体及工业产品。目前,化学合成法由于操作简便、投资小、生产条件可控成为最常用的硝化方法,但该生产方法转化效率低,废水、废酸产量大,造成环境污染,这些问题限制了硝基化合物的生产及应用。因此,需要寻找更加高效环保的合成方法。生物酶催化的应用日益广泛,且自然界中有许多微生物可通过转氨或氧化作用进行含氮基团的转化,为高能材料的酶促合成提供了资源库。本文总结了硝基化合物的种类和主要功能,归纳了当前已有硝基化合物合成方法以及存在的问题,综述了P450超家族、过氧化物酶和N-加氧酶中主要硝化酶的种类及特点,并对硝化酶的蛋白结构、催化机理及作用方式进行了深入分析,列举了硝化酶的定向进化研究,最后对利用硝化酶制备硝基化合物的研究方向进行了展望。

脂肪酶底物结合口袋的分子改造策略及进展

蔡玉贞, 白巧燕, 苏敏, 唐良华

2020, 36(11): 173-180. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0123

摘要 ( 782 )

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脂肪酶作为重要的酶制剂之一,因其对映选择性、立体选择性和广泛的底物特异性等特性被广泛地运用在工业生产中。为了提高脂肪酶的酶学特性和理化性质、迎合更高的工业需求,除了从酶反应的条件上进行优化,还可对脂肪酶进行分子改造,从根源上提高酶的催化效率。一般常采用半理性设计或理性设计的策略,在底物结合口袋或“盖子”结构附近进行酶分子的改造,以达到改变脂肪酶的底物特异性、立体选择性、对映选择性和区域选择性等目的。对近几十年来关于脂肪酶底物结合口袋的分子改造研究进行了综述,以期为今后的相关研究工作提供研究思路。

活性天然产物蛋白靶点的快速筛选策略

陈鹏

2020, 36(11): 180-187. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0400

摘要 ( 556 )

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来源于中药等自然资源的活性天然产物是药物的重要来源,筛选确定活性天然产物的蛋白靶点是明确其药理,毒理和成药的重要环节。目前传统的靶点筛选方法是基于分子标记示踪完成的,周期长且改变了天然产物本身的分子结构和药理作用,具有很大的弊端。新型冠状病毒引发的疫情（Coronavirus disease 2019,COVID-19）启示我们,快速的揭示药物的作用靶点对明确药物的药理和推广使用具有重要价值。近年来,结合蛋白质理化性质与蛋白质组学的非标记天然产物药理靶点的快速筛选技术日趋成熟。通过实例对目前主流的活性天然产物蛋白靶点的非标记筛选策略进行整理和总结,以期为该领域工作者提供前瞻性参考。

CRISPR系统转化医学研究进展

叶洲杰, 王心睿

2020, 36(11): 188-197. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0250

摘要 ( 430 )

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CRISPR系统作为在现今科学研究中对基因编辑运用广泛的一项技术,在后基因组学时代对于基因功能研究、疾病发生发展机制以及基因靶向药物等研究具有重要意义。目前人们运用CRISPR/Cas9编辑技术成功构建细胞和模式生物模型用于临床医学研究。CRISPR/Cas9作为一类强大的基因编辑技术不单只运用于基因功能缺失或外源基因敲入等研究中,CRISPR基因敲除文库筛选系统、CRISPR/dCas9基因激活系统、CRISPR干扰技术和CRISPR分子诊断技术等CRISPR转化医学研究将CRISPR应用于基因高通量筛选、基因沉默导致疾病发生、跨表观遗传修饰激活基因表达、可逆性干扰靶标基因表达以及运用CRISPR分子诊断检测病原微生物感染性疾病等临床研究中,推动生命科学和临床医学等多学科的发展。针对CRISPR系统在转化医学中的研究应用进行阐述。

类弹性蛋白作为功能纳米材料在生物工程领域研究及应用进展

周阳, 王桃桃, 闫丹丹, 王莹莹, 施沁璇, 孙丽慧, 林锋

2020, 36(11): 198-208. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0042

摘要 ( 868 )

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类弹性蛋白（Elastin-like polypeptide,ELP）是一种具有弹性功能且对温度敏感的人造蛋白质聚合物,主要由五肽重复序列单元Val-Pro-Gly-Xaa-Gly（VPGXG）_n构成。ELP对温度敏感的可逆相变特征体现在低于相变温度（Transition temperature,Tt）时呈可溶状态,在高于相变温度的溶液中呈凝聚状态,此过程可逆。基于ELP标签的可逆相变循环（Inverse transition cycle,ITC）是一种新型的分离纯化重组蛋白质的非色谱技术。利用ELP融合蛋白的可逆相变特性,经过多次ITC循环从可溶的蛋白上清溶液中特异性分离出含有ELP标签的融合蛋白。该技术仅需常规的离心机就能得到与色谱法的亲和层析纯度相当的目的蛋白,成本低、操作简便,适合大规模生产的需要。ELP和ELP衍生分子具有良好的弹性、自组装性、长期稳定性和生物活性等特性,精确控制ELP的设计有利于操纵它们对外界环境的刺激反应和其他物理功能特征,ELP可调的理化性质和良好生物相容性使ELP在生物学上也具有广泛的应用。重点阐述了ELP相变特性及机理,ELP融合蛋白的设计,ELP标签对融合蛋白的影响,ELP标签在蛋白质纯化、生物医药、生物工程、水凝胶及新兴领域方面的应用,ELP发展方向及亟待解决的关键问题和技术。

基因编辑技术在作物育种中的应用与展望

李树磊, 郑红艳, 王磊

2020, 36(11): 209-221. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0328

摘要 ( 1055 )

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基因编辑技术是指对目标基因进行“编辑”,实现对特定基因片段的删除、插入和替换的一项技术。如今该技术已经被广泛应用于细菌、真菌、动物和植物等领域,其中成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins,CRISPR/Cas system）作为第三代编辑技术,其效用远超于前两代并因此在近年来迅猛发展。简要介绍了锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases,ZFNs）、转录激活子样效应因子核酸酶（Transcription activator-like effectors nucleases,TALEN）和CRISPR/Cas共3种基因组编辑技术的作用机理,并总结CRISPR/Cas系统的功能、局限性以及其在作物育种上的应用,最后对基因编辑作物的未来进行展望。

基于代谢组学的转基因水稻生物安全评价方法研究

兰青阔, 赵新, 沈晓玲, 魏静娜, 刘双, 陈锐, 檀建新, 王永

2020, 36(11): 222-229. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0198

摘要 ( 439 )

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代谢组学因其全面无偏向性、非靶标轮廓分析的技术优势,成为目前转基因生物安全评价技术研究的热点。以转基因抗虫水稻及其非转基因受体为研究对象,采用基于超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱（UPLC-QTOF/MS）分析的转基因作物代谢组评价技术流程,对代谢组提取方法、数据处理方法、分析平台等进行了探索。结果表明,应用80%甲醇水能有效提取水稻苗期叶片中的代谢物;经UPLC分离、QTOF/MS分析、正交校正的偏最小二乘辨别分析（OPLS-DA）等计算方法,能够有效发现转基因水稻及其受体之间的差异代谢物。本研究建立的完整的转基因水稻代谢组分析方法具有分辨率高、易掌握的优点。本研究丰富了现有的转基因生物安全评价的内容和方法,为转基因生物安全管理提供技术支撑。

适合流式细胞仪分析的大豆细胞核解离液的筛选与应用

陈林, 潘贞志, 戴毅, 宋丽

2020, 36(11): 230-237. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0426

摘要 ( 537 )

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利用大豆Williams 82等多个品种为材料,比较6种不同细胞核解离液的核分离效果,以期制备适合流式细胞仪分析的大豆不同组织部位的高纯度细胞核悬液,并检测其在大豆细胞周期调控中的应用。将新鲜幼嫩的大豆叶和根组织在不同的细胞核解离液中进行机械切割后,细胞核从组织释放游离到核解离液,过400目滤网,离心富集及DAPI染色,流式细胞仪检测分析细胞核解离液中生物颗粒特性和DNA含量。结果表明：Galbraith’s和LB01 核解离液适用于大豆叶和根中细胞核的解离,其变异系数CV值较低,分别是2.78%和2.96%。其中LB01 核解离液可检测到显著的G2/M 期峰,在细胞周期及遗传倍性的研究中应用相对更好,且核解离液在不同大豆品种上具有一定的适用性,可成功检测PEG模拟的干旱胁迫对不同大豆根尖细胞周期的调控。

新型冠状病毒实时荧光双重逆转录RPA的建立及其在食品检测中的应用

吕继洲, 吴绍强, 张舟, 邓俊花, 袁向芬, 王彩霞, 冯春燕, 林祥梅

2020, 36(11): 238-244. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0432

摘要 ( 570 )

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旨在建立一种新型冠状病毒实时荧光逆转录重组酶聚合酶恒温快速的检测技术（RT-RPA）用于新型冠状病毒的检测与监测。根据新型冠状病毒保守的特异性S基因以及N基因序列,设计了两套RPA引物、探针;同时基于N基因等靶标序列构建重组载体,构建新型冠状病毒假病毒颗粒（VLPs）作为阳性质控品。经验证,筛选出一套基于S基因以及N基因的双重RPA引物、探针组合,其分析敏感度S基因引物探针可达10 copies/reaction,N基因引物探针分析敏感度可达10² copies/reaction;分析特异性良好,与H1N1流感病毒、PEDV、TGEV、FMDV、PPRV以及RV病毒无交叉反应。该方法建立后,应用于食品、动物组织器官及临床样本的检测。该方法可特异性从上述样本中检测到新型冠状病毒,表明其具有速度快（20 min）、双靶标、灵敏度高、操作简便,对仪器设备要求低等优点,可用于新型冠状病毒在食品、动物产品以及临床样本中的快速筛查。

基于核酸适配体传感器检测食品致病菌的研究进展

王琦, 颜春蕾, 高洪伟, 吴薇, 杨庆利

2020, 36(11): 245-258. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-1273

摘要 ( 625 )

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核酸适配体是可以识别并与靶标分子结合的单链DNA或RNA分子。由于适配体具有良好的特异性、稳定性、选择性、易于修饰和亲和力高等特点,在病原检测和其他小分子识别方面具有很大的潜力。综述了适配体的筛选技术以及适配体应用技术,包括比色法、可见光谱法、荧光法、电化学法、表面增强拉曼法和胶体金试纸条法等在食源性致病菌检测中的应用。目前适配体传感器在检测食品致病菌领域取得了显著进展。然而核酸适配体应用方面的挑战和缺陷仍需克服。

2020, 36(11): 259-262.

摘要 ( 103 )

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