生物技术通报

WOX家族基因调控植物生长发育和非生物胁迫响应的研究进展

冯珊珊, 王璐, 周益, 王幼平, 方玉洁

2023, 39(5): 1-13. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1098

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WOX（WUSCHEL-related homeobox）家族是植物特有的一类转录因子家族，其含有由65-66个氨基酸残基组成的同源异型结构域（Homeodomain，HD）。植物WOX家族成员通过在转录水平上调控靶基因表达，从而参与植物的生长发育和对非生物胁迫的响应等重要生物过程。综述了植物WOX家族成员的分类、结构特征，重点介绍了其在植物生长发育（根、茎、叶、花、果实、种子、胚胎）的调控及植物响应非生物（干旱、盐、冷）胁迫方面的功能研究进展，并对研究WOX转录因子的意义及有待解决的问题进行了展望，旨在为进一步研究WOX家族基因的功能提供参考。

植物侧枝发育的调控研究进展

王兵, 赵会纳, 余婧, 余世洲, 雷波

2023, 39(5): 14-22. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1112

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植物侧枝的发育在植物形态建成中具有十分重要的地位，侧枝的形态直接影响植物的产量。侧枝的发育由生长点干细胞持续分裂和分化形成，包括侧生分生组织特化，侧生分生组织起始和侧生分生组织外生。侧枝的发育受到内部生长因子和外部环境信号的共同调节。文中总结了侧枝发育过程中侧生生长点干细胞起源、形成和休眠等过程的基本问题，综述了转录因子、激素、表观遗传、外界环境共同决定侧生分生组织形成和发育中的作用机制，为探讨植物侧枝的形成机理提供参考。

植物花瓣呈色机理及花色分子育种

张和臣, 袁欣, 高杰, 王校晨, 王慧娟, 李艳敏, 王利民, 符真珠, 李保印

2023, 39(5): 23-31. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1229

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植物花瓣呈色的主要化学物质包括类黄酮/花青素苷、类胡萝卜素和甜菜色素。其中类黄酮/花青素苷是分布最广泛的色素，决定大多数植物花瓣的呈色；类胡萝卜素在一些植物黄色至橙红色花瓣中起着作用；而甜菜色素主要存在于石竹目植物，包含甜菜红素和甜菜黄素。目前，关于色素生物合成的分子网络已被解析，主要由一系列结构基因控制；一些与色素合成相关的调控因子在很多植物中被鉴定发现。另外，基于外源基因表达或内源基因编辑的分子育种在一些观赏植物的花色改良中被成功应用。本文系统性总结了植物中3种类型色素合成的分子基础、调控机制及分子育种应用等方面的研究进展；将有助于提高我们对植物色素合成分子调控网络的认识，并以期为今后开展花色分子设计育种提供理论支持。

植物细胞外囊泡及其分析技术的进展

张雪萍, 鲁雨晴, 张月倩, 李晓娟

2023, 39(5): 32-43. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1106

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细胞外囊泡是细胞在生理和病理条件下通过胞吐作用释放的具有磷脂双分子层结构的纳米级囊泡。细胞外囊泡作为蛋白质、核酸、脂质和代谢物等物质的载体，能够在细胞与细胞之间穿梭，行使物质传递、信息交流的功能，是细胞间通讯的重要媒介。近年来，植物中细胞外囊泡的研究也不断深入，其研究和分析技术也取得了很大进展。本文介绍了细胞外囊泡的组成，综述了植物中细胞外囊泡的生物学功能，分析了细胞外囊泡分离与富集方法的优缺点，以及原位成像技术的应用，最后对植物细胞外囊泡研究技术发展的重点进行了展望。

甘草酸和甘草苷生物合成与调控的研究进展

周定定, 李辉虎, 汤兴涌, 余发新, 孔丹宇, 刘毅

2023, 39(5): 44-53. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1249

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甘草是一种被多个国家药典收录的常用中草药，由豆科甘草属特定物种的根和匍匐茎炮制而成。甘草含有丰富的次生代谢物和多种活性成分，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎和增强免疫等多方疗效。甘草酸和甘草苷是甘草最重要的活性物质。近年来甘草酸和甘草苷的生物合成和调控的研究进展突出。为此，本文综述了甘草中甘草酸和甘草苷的生物合成途径，以及非生物胁迫、生物因素对合成通路调控的研究进展；也对甘草酸和甘草苷的生物合成及调控的未来研究提出展望，以期对该领域的未来发展带来一定帮助。

组学技术在重离子辐射微生物诱变育种中的应用

雷彩荣, 郭晓鹏, 柴冉, 张苗苗, 任军乐, 陆栋

2023, 39(5): 54-62. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0958

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重离子辐射诱变具有诱变率高、诱变谱宽、突变体易稳定等优势，在微生物育种实践中已得到广泛应用。随着测序技术的发展，对重离子辐射诱变效应的研究可以实现较为全面地了解突变体在基因组、转录组、蛋白质组和代谢组等多个层面的生物学信息。本文综述了利用重离子辐射诱变技术进行微生物育种的研究进展，以及联合高通量测序技术探究重离子诱变产生的生物学效应机理。在此基础上，进一步探讨利用组学方法研究重离子诱变微生物的新思路，旨为重离子诱变微生物育种技术提供参考和建议。

强化细胞外排提高工程菌类黄酮产量的策略

马芳芳, 刘冠闻, 庞冰, 蒋春美, 师俊玲

2023, 39(5): 63-76. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1006

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类黄酮的抑菌谱广、抗氧化活性高，在食品和生物医药领域应用广泛，市场需求量大，依赖于从植物中提取的现有生产技术存在诸多弊端，微生物发酵法生产类黄酮成为国际竞相发展的前沿技术。通过代谢途径改造和基因优化构建高产菌株是现有研究的主要策略，较少考虑类黄酮对生产菌的抑菌作用。考虑到生产菌生长受到抑制会限制发酵中类黄酮积累，本文在总结分析动物、植物、微生物中类黄酮外排机制与关键基因的基础上，结合相关基因在工程菌中成功表达的案例，提出将类黄酮外排机制和关键基因引入工程菌构建的策略，以期为类黄酮高产菌株的构建提供借鉴。

乳腺生物反应器的表达优化策略

刘晓燕, 祝振亮, 史广宇, 华梓宇, 杨晨, 张涌, 刘军

2023, 39(5): 77-91. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1150

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乳腺生物反应器是指将外源基因导入动物基因组并在动物乳腺中特异性表达，利用动物乳腺合成、分泌蛋白的功能，在其乳汁中获得外源蛋白的技术。乳腺生物反应器凭借其高表达、低成本以及合成蛋白质的结构接近天然蛋白质等优势而被视为药用和营养蛋白生产的一次技术革新，然而由于外源基因随机整合以及重组蛋白表达不稳定等问题极大地限制了其应用。本文结合乳腺生物反应器的发展现状，从利用基因编辑技术、筛选合适的外源基因整合位点以及改进外源基因调控序列3个方面对乳腺生物反应器优化策略进行了综述，以期为提高乳腺生物反应器生产重组蛋白的表达提供理论借鉴。

火龙果溃疡病菌实时荧光定量PCR内参基因的筛选

姚姿婷, 曹雪颖, 肖雪, 李瑞芳, 韦小妹, 邹承武, 朱桂宁

2023, 39(5): 92-102. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1322

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火龙果溃疡病是由火龙果溃疡病菌引起的重要真菌病害，近年来在世界火龙果产区的爆发严重影响了火龙果产业的发展。为研究火龙果溃疡病菌响应逆境胁迫的基因表达和功能，需要筛选火龙果溃疡病菌在各种条件下表达稳定的内参基因。以火龙果溃疡病菌菌株LJ02为研究对象，以在马铃薯葡萄糖液体培养基（PDW）培养的菌丝体为对照组，以在LB培养基培养的菌丝体和分别在添加过氧化氢、吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑的PDW培养的菌丝体为处理组。利用实时荧光定量PCR技术以及内参基因稳定性评估软件（geNorm、NormFinder、Bestkeeper和RefFinder），评估18 个候选内参基因（CYT1、SDH2_1、TBCC、SUI1、RPL19、PPH、ATP5B、UBE2_16、RPL13、UBE2_2、PRS17、SUCLA2、ATP5A、TUB1_2、ACT1、EFTU、EF1A和GAPDH）的表达稳定性。结果显示，火龙果溃疡病菌的18个候选基因在上述培养条件下的Ct值介于14.80-24.66之间，表达水平适中；稳定性最高的内参基因是CYT1，其次为SUI1，GAPDH和ACT1的稳定性最差；最少使用2个内参基因组合可以提高定量PCR分析结果的准确性，此时SUCLA2和ATP5A是最稳定的内参基因组合。该结果可为研究火龙果溃疡病菌生物学过程中的基因表达提供理论依据。

多荧光标记引物增强甘蔗染色体寡聚核苷酸探针杂交信号

李心怡, 姜春秀, 薛丽, 蒋洪涛, 姚伟, 邓祖湖, 张木清, 余凡

2023, 39(5): 103-111. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1085

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荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization, FISH）是植物分子细胞遗传学研究最为重要的手段之一。近些年，基于参考基因组设计的低拷贝寡聚核苷酸探针在FISH中应用得越来越广泛。然而，由于植物基因组中分布大量的重复序列，这使得oligo-FISH的分辨率存在一定局限性。利用包含多个荧光基团的荧光PCR引物，扩增出甘蔗染色体特异oligo探针，并进一步优化甘蔗的荧光原位杂交体系，提高了甘蔗oligo探针识别近缘物种染色体的效率。通过开发多荧光标记的甘蔗oligo探针以及甘蔗荧光杂交体系的优化，有效拓宽荧光信号的最小分辨率，提高信噪比（signal-to-noise ratio, SNR），并成功基于甘蔗oligo探针对高粱1-10号染色体分型。多荧光标记引物增强oligo探针信号的新方法及FISH体系的优化为今后在其他物种中提高oligo-FISH鉴定染色体及捕捉微弱的荧光信号提供了参考。

大丽轮枝菌（Verticillim dahliae）突变体库的构建与分析

潘国强, 吴思源, 刘璐, 郭惠明, 程红梅, 苏晓峰

2023, 39(5): 112-119. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1247

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为了更加快捷地筛选大丽轮枝菌致病关键基因，利用聚乙二醇介导的原生质体转化法构建病原菌随机插入突变体库，对部分阳性转化子的生长表型指标和致病力进行分析，筛选生长发育与致病缺陷突变体并进行靶标基因定位。结果表明，本研究共获得13 030多个阳性转化子，随机挑选5个转化子与V991野生型菌株进行比较分析，发现其中一个突变体在PDA和不同碳源培养基上的菌落直径、产孢量以及致病力均显著降低。侧翼序列测序结果结合Blast比对分析表明，该缺陷突变体中的潮霉素抗性基因表达盒定位于大丽轮枝菌3号染色体1 528 782 bp处，属于内切葡聚糖酶1基因（VDAG_04017）。综上所述，本研究通过大丽轮枝菌插入突变体库构建、突变体生长表型指标和致病力鉴定及靶标基因定位等一系列分子生物学手段，可初步鉴定病原菌致病相关基因，为从全基因组层面深入研究大丽轮枝菌致病机制奠定了一定基础。

小反刍兽疫病毒H蛋白抗体化学发光免疫分析检测方法的建立

钱榜, 刘振东, 赵印, 李静, PRAJAPATI Meera, 李彦敏, 孙跃峰, 窦永喜

2023, 39(5): 120-129. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0999

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本研究旨在建立小反刍兽疫病毒H蛋白抗体的化学发光免疫分析检测方法。以H蛋白4个反应原性较好的B细胞表位串联后为检测抗原，在确定抗原包被量和血清稀释度，优化血清和酶标二抗反应时间的基础上，用ROC曲线分析确定检测临界值，建立了小反刍兽疫病毒H蛋白抗体化学发光免疫分析检测方法，然后对该方法进行敏感性、特异性和重复性评价。结果显示，建立的小反刍兽疫病毒H蛋白抗体化学发光免疫分析检测方法最佳抗原包被浓度为1.5×10^-6µg/孔，待检血清最佳稀释度为1∶100；血清及酶标二抗孵育时间均为10 min，检测方法的临界值为S/P=9.77%，批内及批间变异系数均小于10%；与口蹄疫、羊痘、蓝舌病及山羊传染性胸膜肺炎阳性血清不发生交叉反应；用建立的化学发光法和市售小反刍兽疫抗体cELISA试剂盒平行检测247份田间血清，两者相对符合率为94.33%，但化学发光法敏感性更高。研究结果表明，建立的小反刍兽疫病毒H蛋白抗体化学发光免疫分析方法灵敏、特异、稳定，可用于田间血清样品小反刍兽疫抗体检测。

牛诱导多能干细胞的建立及应用研究进展

曾虹, 曾睿琳, 付伟, 吉文汇, 兰道亮

2023, 39(5): 130-141. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1371

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诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为可以无限增殖更新并具有分化为三胚层多种细胞类型的一类干细胞系。目前对人与小鼠的iPSCs研究已经取得了很多重要成果，但其他动物，如牛等经济型有蹄类家畜iPSCs的研究始终没有突破性的进展。如何将外源转录因子通过重编程载体高效安全地导入体细胞中并持续表达是生产牛诱导多能干细胞（bovine induced pluripotent stem cells，biPSCs）的主要瓶颈。本文就biPSCs建立中重编程系统的选择、诱导因子的选择、小分子化合物的添加等方面进行综述，以期为进一步完善biPSCs及牛胚胎干细胞系的建立提供参考。

盐胁迫盐芥和拟南芥褪黑素含量及合成相关基因表达模式分析

李帜奇, 袁月, 苗荣庆, 庞秋颖, 张爱琴

2023, 39(5): 142-151. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0975

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盐生植物盐芥（Eutrema salsugineum）耐盐适应性强且具备模式植物特征，是研究植物逆境适应机理的理想材料。作为一种多功能的激素信号分子，褪黑素在盐芥耐盐性中的作用仍不清楚。本研究以盐芥为主要材料，以拟南芥做对比，主要通过褪黑素酶联免疫以及实时荧光定量PCR分析，比较了二者在不同组织中褪黑素的积累和在响应盐胁迫过程中褪黑素合成、相关基因的表达模式以及外源褪黑素处理对其盐应答表型的影响。结果显示，两种植物的褪黑素合成均在幼叶中最高，盐芥本底褪黑素合成水平显著高于拟南芥，且盐胁迫诱导了两种植物中的褪黑素含量，但不同于盐芥，拟南芥在处理7 d后褪黑素合成明显下降。通过序列比对发现在不同植物中，盐芥和拟南芥褪黑素合成相关基因的亲缘关系较近。盐应答表达分析显示，盐芥SNAT1、ASMT和COMT在盐处理3 d表达上调，而拟南芥中的相关基因在处理1 d和3 d后受盐诱导，7 d后拟南芥中表达下降而盐芥中则无明显变化，表明两种植物相关基因响应盐信号的表达变化存在差异。此外，外源褪黑素处理明显缓解了两种植物在盐逆境下的胁迫表型。综上，褪黑素有效贡献于盐芥抗盐性，参与调节盐芥和拟南芥的耐盐适应过程，但二者对褪黑素合成的诱导模式不同。

SP1调控碳水化合物分配对穗形态的影响

梁成刚, 汪燕, 李天, 大杉立, 青木直大

2023, 39(5): 152-159. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1301

摘要 ( 146 )

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探讨SP1在水稻“源-库”系统中的调控作用，为解析稻穗形成的机理和青贮饲料稻分子育种提供科学参考。以sp1与WT为材料，进行氮处理和生长分析，表型鉴定、碳水化合物测定和RT-qPCR检测。结果发现，氮处理10 d时，sp1与WT无表型差异，但在高、中氮条件下，sp1相对生长速率显著提高；24 d时sp1叶鞘、根、植株干重提高，叶鞘氮含量降低、碳/氮比值提高，说明充裕的氮能促进sp1生长，SP1可能影响叶鞘碳-氮平衡。抽穗期sp1株高显著降低，分蘖数显著提高，稻穗变小并伴随高位分蘖发生。孕穗期sp1茎、鞘中碳水化合物含量与WT差异较小，但抽穗期茎中淀粉、蔗糖和叶鞘中淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖含量明显提高。SP1在叶鞘基部高表达，推测突变SP1能抑制蔗糖由茎鞘向穗的运输，导致高位分蘖发生和稻穗变小。SP1可应用于青贮饲料稻分子育种。

高粱表皮蜡质缺失突变体sb1抗旱生理生化分析

王春语, 李政君, 王平, 张丽霞

2023, 39(5): 160-167. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0889

摘要 ( 163 )

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植物抗旱性与体表蜡质积累有关，高粱是抗旱性极强的作物，茎秆和叶片表面覆盖一层厚厚的蜡质，开展高粱体表蜡质层对高粱抗旱能力的研究，为高粱抗旱品种选育和抗旱分子机制提供理论依据。以高粱品种BTx623和表皮蜡质缺失突变体sb1为试验材料，统计农艺性状以及扫描电镜观察叶片表面蜡质形态结构；分析表皮蜡质的有无对离体叶片失水速率和叶绿素浸提率的影响；检测在干旱胁迫处理下植株的表型变化以及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）的活性变化。结果表明，与对照BTx623相比，表皮蜡质缺失突变体sb1株高明显降低、抽穗开花期延后1周、叶片远轴面片状蜡质缺失，其他农艺性状变化不明显。突变体sb1离体叶片失水速率和叶绿素浸提率显著高于对照。在干旱胁迫处理条件下，随着干旱胁迫时间的增长，对照BTx623和突变体sb1的SOD和POD活性均增强，但对照SOD和POD活性均显著高于突变体sb1，且干旱处理96 h和复水后突变体sb1都造成叶片大面积干枯。突变体sb1表皮蜡质缺失后叶片渗透性增强，清除活性氧的能力减弱，抗旱性降低。

陆地棉与拟似棉异源六倍体的合成与性状鉴定

王一帆, 候林慧, 常永春, 杨亚杰, 陈天, 赵祝跃, 荣二花, 吴玉香

2023, 39(5): 168-176. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1230

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远缘杂交及多倍化是棉花种质创新的重要途径，通过陆地棉与野生拟似棉远缘杂交并加倍获得可育的杂种后代，为利用拟似棉中的优良基因拓宽陆地棉的遗传多样性提供理论依据和新材料。本研究以陆地棉为母本、拟似棉为父本杂交合成F₁并采用秋水仙素进行染色体加倍，获得异源六倍体植株，对其进行形态学（叶片表型）、细胞学（气孔密度、气孔长度、保卫细胞对中叶绿体数、花粉粒直径）、生理生化指标（SOD、POD、CAT、可溶性蛋白及叶绿素荧光参数指标）鉴定。通过流式细胞鉴定筛选出了3株六倍体植株。六倍体与三倍体及亲本性状统计结果显示，六倍体叶形指数与陆地棉无显著差异，说明六倍体叶形整体偏向陆地棉，而三倍体远缘杂种更多偏向父本拟似棉，六倍体叶面积及气孔长度增大、保卫细胞中叶绿体数显著增多；六倍体花的表型性状介于双亲之间，花粉粒直径大于三倍体呈极显著差异，六倍体正常花粉粒比为73.25%，三倍体正常花粉粒比为51.13%，说明六倍体育性在恢复；六倍体叶片中SOD、POD、CAT及可溶性蛋白含量显著大于其他世代；六倍体较其他世代最大荧光产量Fm差异显著，初始荧光Fo、叶片可变荧光Fv、原初光能转化效率（Fv/Fm）、PS II潜在光化学效率（Fv/Fo）以及开放的PS II捕获的激发能的效率（Fm/Fo）均表现出极显著差异。综合结果证明通过杂交加倍成功合成了陆地棉与拟似棉异源六倍体新种质，同时发现六倍体在抗逆性及光合作用表现优于三倍体。

外源硫诱导苦荞镉胁迫响应的比较转录组学分析

刘辉, 卢扬, 叶夕苗, 周帅, 李俊, 唐健波, 陈恩发

2023, 39(5): 177-191. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0951

摘要 ( 198 )

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Cd（镉）含量超标是影响苦荞（Fagopyrum tararicum）安全生产的主要重金属污染。为揭示外源添加硫（S）对苦荞耐Cd胁迫影响的分子机理，通过比较转录组学分析手段，分析根施100 mg/kg（NH₄）₂SO₄（S）处理与5 mg/kg CdCl₂（Cd）处理后苦荞叶片的差异表达基因及其功能。结果显示，共获得393 983 500条干净序列，鉴定到19 875个基因，其中差异表达基因共有1 760个。通过GO注释和KEGG pathway对这些差异表达基因进行分析表明，外源S添加增强谷胱甘肽还原酶途径，抑制氧化还原途径，并诱导水杨酸响应、脱落酸响应以及生长素响应途径应对Cd毒害。转录组数据鉴定到苦荞FtbHLH68受Cd+S处理特异诱导表达，模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）同源基因突变体Atbhlh68表现出Cd+S处理缺陷表型，且Atbhlh68中叶绿素含量、净光合、GR活性和GSH活性变化均不响应Cd+S处理。研究结果揭示了苦荞响应Cd胁迫转录水平调控过程，阐明外源添加S增强植物抗Cd胁迫的分子机理，为外源S在苦荞抗Cd胁迫中的应用奠定理论基础并提供了作用靶点。

甜瓜PIN基因家族的鉴定及高温胁迫表达分析

李敬蕊, 王育博, 解紫薇, 李畅, 吴晓蕾, 宫彬彬, 高洪波

2023, 39(5): 192-204. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1196

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生长素输出载体蛋白PIN（PIN-formed）是调控植物生长素极性运输的重要载体，在植物生长发育过程中发挥重要作用，但PIN蛋白在甜瓜基因组中的成员、性质、染色体分布、系统进化、启动子，以及家族成员在高温胁迫中的表达特性尚不明确。本研究利用生物信息学方法在甜瓜（Cucumis melo）全基因组数据库中筛选鉴定到18个CmPIN成员，编码氨基酸数量在51-642之间，分子量介于5.19-70.30 kD之间，不稳定指数在24.33-48.87之间；主要定位于细胞质膜上，除CmPIN6和CmPIN8无跨膜结构外，其他16个PIN蛋白均具有2-11个跨膜结构域；分布在9条染色体上，均含有1-9个Motif，CmPIN家族成员基因含有1-10个外显子，二级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲结构。构建了CmPIN家族成员与拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、番茄（Solanum lycopersicum）、玉米（Zea mays）的PIN蛋白进化树，将18个CmPINs聚类为7个亚族，其中亚族Ⅵ中数量最多。启动子顺式作用元件分析显示，甜瓜CmPIN启动子中存在大量的顺式作用基本元件，还含有与激素、光信号和干旱诱导等相关的顺式作用元件。对不同温度处理的甜瓜胚根进行荧光定量分析，结果表明，高温胁迫下Yucasin+IAA处理的CmPIN13和CmPIN18基因表达量显著高于Yucasin处理；NPA+IAA处理的CmPIN2、CmPIN13和CmPIN18基因表达量显著高于NPA处理，推测CmPIN基因家族参与了甜瓜发芽过程高温胁迫的响应调控。

青杄转录共激活因子PwMBF1c的功能研究与验证

刘奎, 李兴芬, 杨沛欣, 仲昭晨, 曹一博, 张凌云

2023, 39(5): 205-216. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0812

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克隆通过青杄干旱转录组筛选到的差异候选基因PwMBF1c，对其生物学功能进行分析和验证，以期能够解析青杄的耐旱机理，并为培育优良抗逆林木品种提供基因资源。利用RT-qPCR技术分析PwMBF1c对干旱、高温、低温及激素处理的响应。瞬时转化烟草叶片和洋葱表皮细胞检测PwMBF1c的亚细胞定位。利用酵母单杂验证PwMBF1c的转录活性。在拟南芥和马铃薯体系中验证了PwMBF1c抗旱应答的功能。PwMBF1c主要在成熟叶中表达，其转录水平受干旱、高温、水杨酸（SA）诱导上调；PwMBF1c的C端具有转录激活活性，而N端和全长不具有转录活性；PwMBF1c定位于细胞膜、细胞质和细胞核；过表达PwMBF1c显著提高了拟南芥和马铃薯的耐旱性。干旱胁迫下，与对照组Col-0和VC相比，过表达拟南芥株系PwMBF1c-L1和PwMBF1c-L2存活率更高，叶绿素含量较高，MDA含量较低；在PEG处理后，与野生型马铃薯Y5相比，过表达PwMBF1c显著提高了苗高。PwMBF1c的表达水平受干旱等多种逆境和激素的诱导，PwMBF1c主要定位于细胞膜、细胞质和细胞核，且该蛋白的C端具有转录激活活性。PwMBF1c能够显著提高转基因拟南芥和马铃薯的耐旱性。

虎杖转录因子PcMYB2的表达特性和功能分析

姜晴春, 杜洁, 王嘉诚, 余知和, 王允, 柳忠玉

2023, 39(5): 217-223. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1231

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对虎杖R2R3-MYB转录因子PcMYB2进行转录活性鉴定和表达特性分析，并在转基因拟南芥和转基因毛状根中进行功能研究。利用酵母单杂交试验分析PcMYB2的转录活性；实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术检测虎杖中PcMYB2的表达模式；DMACA法检测PcMYB2转基因拟南芥和虎杖毛状根中的原花青素含量。酵母单杂试验表明，PcMYB2具有转录激活活性；RT-qPCR结果显示，PcMYB2在虎杖根、茎、叶中均有表达，在叶中表达量最高，并且ABA和H₂O₂外源处理可诱导叶片中PcMYB2的表达；与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥种皮颜色加深，原花青素含量为野生型的1.8倍；与野生型毛状根相比，转基因毛状根DMACA染色更深，原花青素含量为野生型的2.3倍。PcMYB2具有转录激活活性，且促进植物原花青素的生物合成。

异源表达大豆转录因子GmNF-YA19提高转基因烟草抗旱性

翟莹, 李铭杨, 张军, 赵旭, 于海伟, 李珊珊, 赵艳, 张梅娟, 孙天国

2023, 39(5): 224-232. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1285

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核因子（NF-Y）广泛存在于真核生物中，是一类能够在植物非生物胁迫反应中发挥重要调控作用的转录因子。探究大豆GmNF-YA19的抗旱性及作用机制，为GmNF-YA19在抗旱植物育种中的应用奠定基础。运用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）对GmNF-YA19在非生物胁迫下的表达量进行检测，克隆GmNF-YA19，构建GmNF-YA19植物表达载体并转化烟草，对转基因烟草的抗旱性进行鉴定。RT-qPCR结果显示GmNF-YA19在大豆中能够响应干旱、高盐、低温及外源ABA，且干旱胁迫下GmNF-YA19的表达量升高最显著。以大豆叶片cDNA为模板，通过PCR克隆GmNF-YA19。序列分析结果显示，GmNF-YA19编码一个含有213个氨基酸的蛋白质，预测分子量22.99 kD，预测等电点9.40。GmNF-YA19蛋白序列包含一个保守的CBF结构域。蛋白系统进化分析表明，GmNF-YA19蛋白与OsNF-YA7蛋白、AtNF-YA4蛋白和AtNF-YA7蛋白亲缘关系较近。共获得4棵转基因烟草植株。在干旱胁迫下，GmNF-YA19的异源表达增强了转基因烟草的抗旱性。与野生型烟草相比，GmNF-YA19转基因烟草中3个抗逆相关基因（NtABA2、NtNCED3-2和NtP5CS）的表达量显著升高。GmNF-YA19的异源表达增强了转基因烟草的抗旱性。

番茄青枯病抗性相关miRNA的鉴定与表达分析

史建磊, 宰文珊, 苏世闻, 付存念, 熊自立

2023, 39(5): 233-242. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1241

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为理解番茄（Solanum lycopersicum）青枯病抗性响应miRNA与靶基因间的调控关系，对抗、感番茄自交系接种青枯菌（Ralstonia solanacearum）前后进行小RNA测序。结果在8个样本中共获得112.76 M高质量数据，检测到336个miRNA，包括193个新miRNA。其中，31个差异表达miRNA靶向调节575个基因的表达。556个靶基因被注释到防御反应、植病互作、植物激素信号转导等代谢途径中。启动子除典型的转录起始TATA-box和CAAT-box，及与生物胁迫相关的W-box和TC-rich repeats，还存在激素、光、非生物胁迫、伤等响应元件。RT-qPCR验证发现6对miRNA-targets具有正-负、负-正和负-负3种番茄青枯病应答模式。这些结果初步揭示miRNA可以通过靶向基因表达响应番茄青枯病。

沙福芽孢杆菌GX-H6的分离鉴定及对水稻细菌性条斑病的防病效果

任沛东, 彭健玲, 刘圣航, 姚姿婷, 朱桂宁, 陆光涛, 李瑞芳

2023, 39(5): 243-253. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1153

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水稻细菌性条斑病（bacterial leaf streak, BLS）由稻黄单胞菌稻生致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc）侵染引起，已成为我国南方水稻种植区的一个重要病害。为了筛选防治BLS的生防菌，以Xoc 野生型菌株GX01为指示菌，采用含菌平板稀释法和牛津杯法，从花生根际土壤中筛选到一株对Xoc具有拮抗作用的细菌，编号为GX-H6。根据形态学观察、生理生化特征以及16S rDNA和进化树分析，鉴定该菌株属于沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis）。拮抗实验表明，B. safensis GX-H6菌株能够对多种黄单胞菌以及植物病原真菌具有较好的拮抗活性，尤其对引起水稻发生白叶枯病（bacterial blight, BB）的稻黄单胞菌稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）的拮抗效果最显著。温室和田间水稻植株试验表明，GX-H6菌株能较好地防治BLS和BB。对GX-H6菌株的基因组进行分析，发现该菌株的基因组中拥有与抗真菌、环境竞争相关的基因，同时也拥有地衣杆菌素（lichenysin）、植物阿唑霉素（plantazolicin）和溶杆菌素（bacilysin）合成相关基因。这为生产应用提供了新的微生物资源，以及为后续的抑菌机理研究提供了新材料。

基于LC-QTOF-MS代谢组学解析牛樟芝子实体和菌丝体中氨基酸代谢差异

郑焕, 林冬梅, 刘峻源, 张引莲, 林标声, 林占熺, 李晶

2023, 39(5): 254-266. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1080

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为分析氨基酸在牛樟芝子实体和菌丝体代谢中的差异，采用LC-QTOF-MS系统质谱技术对牛樟芝子实体和菌丝体等3组样品进行代谢组分析，运用SIMCA软件（V16.0.2）对差异氨基酸代谢物进行筛选，分析重要氨基酸及其代谢途径，挖掘潜在标记物用于牛樟芝品种多样性和差异性分析。样品间主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）表明样品间在负离子条件下具有显著差异，在t检验P < 0.05，VIP > 1的条件下，牛樟芝子实体（ACFB）与液体培养14 d菌丝体（ACM-14）中有288个显著差异代谢物，其中主要差异氨基酸有15种；在ACFB与液体培养28 d菌丝体（ACM-28）中有332个显著差异代谢物，其中主要差异氨基酸有11种；ACM-14与ACM-28间存在283个显著差异代谢物，其中主要差异氨基酸有14种。牛樟芝子实体与菌丝体间氨基酸代谢差异大于菌丝体间，其中以L-精氨酸差异尤为显著。本研究为挖掘牛樟芝子实体、菌丝体氨基酸标记性代谢物和开发产品等提供理论参考。

羊肚菌菌种生产车间气溶胶微生物群落研究

余洋, 刘天海, 刘理旭, 唐杰, 彭卫红, 陈阳, 谭昊

2023, 39(5): 267-275. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0702

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为研究羊肚菌菌种生产车间的气溶胶微生物群落动态变化，从菌种生产源头寻找影响羊肚菌安全生产的环境微生物因素。利用高通量扩增子测序对羊肚菌菌种大生产期间的接种室、原种室和栽培种室的气溶胶微生物群落进行监测。结果发现，随着菌种扩繁级别增加，扩繁车间空气中的真菌多样性显著升高，而细菌多样性无显著变化。车间的真菌群落以子囊菌门为主，细菌群落以变形菌门、厚壁菌门和放线菌门为主。假单胞菌属和乳杆菌属在3种扩繁车间的细菌群落均占主导地位，其比例随着菌种级别升高呈上升趋势；Phialemoniopsis sp.主导了3种扩繁车间的真菌群落，比例均超过96%。Phialemoniopsis sp.与羊肚菌不出菇的潜在风险因子——枝顶孢属具有极高的系统发育关系相关性，表明它可能影响羊肚菌生产的风险生态因子之一。研究为羊肚菌菌种安全生产的环境条件需求提供了理论补充。

菌株C8和B4的分离鉴定及其耐盐促生效果和机制

车永梅, 郭艳苹, 刘广超, 叶青, 李雅华, 赵方贵, 刘新

2023, 39(5): 276-285. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1292

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土壤盐渍化是影响农业生产的主要环境因素，合理使用根际促生菌是改良修复盐渍化土壤的有效途径。本研究从东营地区盐渍化土壤中分离筛选到两株耐盐促生菌株C8和B4，经形态学特征、生理生化特性、16S rDNA和gyrB基因序列分析，分别鉴定为氧化微杆菌（Microbacterium oxydans）和嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）。含盐LB培养基上检测结果显示，菌株C8耐6% NaCl，具有解钾、溶有机磷、溶无机磷和分泌生长素的功能；菌株B4耐8% NaCl，具有溶有机磷和分泌生长素的功能。C8和B4单独施用及配施对盐胁迫下番茄的促生作用及机制的试验结果表明，C8和B4单独施用及配施均显著促进盐胁迫下番茄种子萌发和幼苗生长，提高过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性，上调过氧化氢酶基因CAT1和CAT2表达量，增加植株K⁺含量，降低Na⁺含量和Na⁺/K⁺，上调液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因NHX1和NHX3的表达量。C8和B4配施具有增效作用。以上结果表明，C8和B4通过调节抗氧化酶及Na⁺转运蛋白基因表达，提高植株抗氧化能力，维持体内离子稳态，提高植株耐盐性。

一株耐铀菌株的鉴定及其促生特性研究

罗义, 张丽娟, 黄伟, 王宁, 吾尔丽卡·买提哈斯木, 施宠, 王玮

2023, 39(5): 286-296. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1031

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从退役铀矿区土壤中筛选获得耐铀促生菌株，为铀污染土壤的微生物-植物联合修复技术提供优良菌种资源，以解决退役铀矿区污染治理问题。梯度稀释某退役铀矿区污染土壤，涂布含铀培养基，分离筛选出一株具有耐铀性能菌株B2。通过形态学观察、生理生化实验及16S rDNA序列比较分析，对其进行初步鉴定。采用分光光度法测定菌株在铀胁迫下的生长曲线和培养基铀含量，分析其耐铀能力和铀吸附或吸收能力。通过平板法测定其固氮、解磷、产纤维素酶、合成铁载体能力。用Salkowski比色法测定其产吲哚乙酸（3-indole acetic acid, IAA）能力及产量。通过种子萌发和盆栽实验，验证该菌株的促生能力。综合形态观察结果、生理生化特征和基于16S rDNA序列的进化分析，确定菌株B2为微枝形杆菌属细菌（Microvirga makkahensis sp.），在铀浓度为0-400 mg/L时，其生长曲线符合S型生长曲线模型，当铀浓度达到600 mg/L后生长受抑制，其对培养基中的铀无吸附或吸收作用。菌株B2具有固氮、解磷、产纤维素酶、合成铁载体和产IAA的促生特性，培养48 h后IAA产量可达到24.39 μg/mL。菌株B2可显著提高上海青（Brassica chinensis L.）种子的发芽率，促进幼苗的生长发育，显著增加上海青生物量。菌株B2为一株具有产IAA等促生能力、耐铀的微枝形杆菌属细菌，能有效促进上海青种子萌发和幼苗生长，可作为微生物-植物联合修复铀污染土壤的候选菌株。

超临界CO₂与姜精油协同对副溶血弧菌杀菌效果的影响与机制研究

黄亚宁, 张海娇, 韩玉谦, 刘尊英

2023, 39(5): 297-305. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1207

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优化超临界CO₂低压、低温杀菌技术，降低细菌群体感应对杀菌效果的影响。采用液质联用法和苯酚硫酸法分别测定副溶血弧菌群体感应信号分子和胞外多糖的含量，采用微量扩散法测定所选群体感应抑制剂姜精油的群体感应抑制活性，优化联合超临界CO₂杀菌工艺。随着菌落总数的增加，群体感应信号分子和胞外多糖在菌悬液中积累，激活相关基因的表达从而增强菌体感应导致超临界CO₂杀菌效果下降。姜精油可作为群体感应抑制剂，其最小抑制浓度为200 μg/mL，且在亚抑菌浓度下可以显著抑制副溶血弧菌的泳动性、生物膜形成（抑制率为64.20%）及菌悬液中的胞外多糖产生（抑制率为45.1%）。联合杀菌的最优工艺为群体感应抑制剂浓度75 μg/mL，杀菌条件为15 MPa、40℃、20 min。姜精油可作为群体感应抑制剂应用于超临界CO₂杀菌可以大幅度提升其杀菌效果，为群体感应抑制剂的应用提供理论基础。

重组牛乳源金黄色葡萄球菌GapC蛋白优势B细胞抗原表位的预测和筛选

陈晓萌, 张雪静, 张欢, 张宝江, 苏艳

2023, 39(5): 306-313. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0962

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旨在表达牛乳源金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）GapC蛋白并对其B细胞抗原表位进行预测与鉴定，本研究利用实验室分离鉴定的S. aureus分离株15119 扩增GapC基因并构建重组表达质粒pET-28a-GapC，诱导纯化得到分子量为44 kD重组蛋白GapC，以此免疫新西兰大白兔，获得特异多克隆抗体。利用生物信息学方法，对GapC蛋白的二级及三级结构进行分析，预测其B细胞抗原表位，并利用特异性抗体对筛选的表位进行鉴定。结果表明，GapC蛋白具有良好的免疫原性，筛选出7个线性B细胞抗原表位，利用兔抗重组GapC蛋白多克隆抗体鉴定得到了PL 5（²²¹IPEIDGKLDGGAQRVP²³⁶）多肽和PL 7（²⁶⁴KNASNESFGYTEDEIVSSDVVGM²⁸⁶）2个优势B细胞表位。本研究成功制备了GapC蛋白，预测并鉴定了2个优势抗原表位，为其嵌合表位疫苗的开发提供了技术支持。

2023, 39(5): 314-314.

摘要 ( 56 )

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