生物技术通报

植物bHLH基因家族研究进展及在药用植物中的应用前景

安昌, 陆琳, 沈梦千, 陈盛圳, 叶康卓, 秦源, 郑平

2023, 39(10): 1-16. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0243

摘要 ( 279 )

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碱性/螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子是植物中第二大转录因子家族，该家族广泛存在于各种植物的基因组中，并在植物生长发育、次生代谢、非生物逆境胁迫响应等方面发挥着重要的调控作用。本文全面综述了植物bHLH基因家族成员的结构特征、分类规则及其生物学功能的研究进展，重点梳理总结了bHLH在植物生长发育和非生物胁迫（干旱、低温、盐、重金属）中的应答和调控，以及在次生代谢产物生物合成及动态积累过程中的重要作用，可为深入研究bHLH在生长发育、植物抗逆及品质形成等方面的分子调控机制及种质资源的开发提供指导。同时，因bHLH广泛参与调控植物次生代谢产物的合成和积累，已成为分子生药学和中药生态农业研究的热点。为此，本文进一步总结了近年来研究较为透彻的两种药用植物（丹参Salvia Miltiorrhiza、黄花蒿Artemisia annua）中bHLH基因家族及其成员的研究进展，以期为药用植物bHLH基因家族的深入研究提供参考，并为药用植物的分子育种、拟境栽培等工作的开展以及中药生态农业的发展提供新思路。

观赏植物花斑形成调控机制的研究进展

齐方婷, 黄河

2023, 39(10): 17-28. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0242

摘要 ( 167 )

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花瓣上出现的独特色彩图案又称花瓣彩斑（花斑），花斑不仅是植物重要的观赏性状，还能起到吸引昆虫、抵御天敌和适应环境变化等多种作用，在生物进化上具有重要的意义。本文综述了近年来观赏植物花斑形成的相关进展，总结了花斑形成的遗传规律和影响因素。重点描述了色素合成途径结构基因和转录因子在花斑形成中的重要作用，即结构基因的时空特异性表达和竞争机制，促进了不同种类的色素在花瓣中差异积累；而转录因子通过直接或间接调控结构基因的定位表达参与花斑的形成。此外，本文还归纳了观赏植物花斑形成中的其他调控机制，如转录后调控、翻译后调控和甲基化等，汇总了花斑形成的分子调控网络，以期为观赏植物花斑形成的分子机理研究提供新视角。

几丁质酶在农作物病虫害生物防治中的研究进展

马赛买, 李同源, 马燕军, 韩富军, 彭海, 孔维宝

2023, 39(10): 29-40. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0520

摘要 ( 192 )

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病虫害严重影响农作物的品质、产量和安全。生物防治作为一种绿色、安全、有效防控病虫害的技术方法越来越受到人们关注。几丁质酶（EC 3.2.1.14）是一类广泛存在于微生物和植物中的糖苷水解酶，可有效降解病原真菌细胞壁、昆虫及线虫体壁中的几丁质，抑制病原真菌孢子萌发和菌丝生长，以及昆虫和线虫的发育，在农作物病虫害生物防治中具有重要作用和广泛的应用前景。本文综述了几丁质酶的种类和来源、生防机理，以及基于几丁质酶的转基因技术在作物病虫害防治中的应用等方面的进展，以期为几丁质酶的进一步研究和应用提供信息参考。

溶杆菌中活性天然产物的研究进展

周闪闪, 黄远龙, 黄建忠, 李善仁

2023, 39(10): 41-49. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0655

摘要 ( 122 )

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微生物次级代谢产物是天然药物的重要来源，广泛应用于医药和农业生产。放线菌和真菌是产生抗生素的主要微生物，但经过长期大量的筛选，从中发现新抗生素越来越困难。随着基因测序技术的进步，越来越多的微生物基因组被测序，许多以前被忽视的微生物发现也具有产生新抗生素的潜力。溶杆菌是新型生防细菌，对植物病原真菌、细菌、卵菌和线虫等具有拮抗作用，从溶杆菌中已经发现大量结构新颖和活性显著的次级代谢产物，在生防制剂和前体药物方面具有应用前景。本文对溶杆菌资源分布、次级代谢产物种类和应用进行综述，希望为进一步从环境中筛选分离溶杆菌和发现更多具有新颖活性的天然产物提供参考。

抗猪繁殖与呼吸障碍综合征基因编辑猪研究进展

李双喜, 华进联

2023, 39(10): 50-57. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0373

摘要 ( 128 )

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猪繁殖与呼吸障碍综合征是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种病毒性传染病。该病是影响我国生猪产业健康发展的最重要的三大疫病之一。目前对于该病的防控主要依赖于养殖场内外部生物安全体系，采取合理措施降低病毒的污染，切断病毒传播途径。从保护易感动物的角度而言，抗病育种也是疫病防控的重大策略之一。近年来，随着基因编辑技术的发展和成熟，分子育种作为猪抗病育种的核心技术，已显示出其独特的优势。国内外多个研究团队已利用分子育种技术在抗PRRS育种方面取得很多突破性进展。本文以PRRSV受体为切入点，综述当前猪抗PRRS育种的研究现状，以期为PRRS的防控和猪的抗病育种研究提供参考和线索。

球孢白僵菌真菌病毒BbPmV-4外壳蛋白多克隆抗体制备及应用

郭文博, 路杨, 隋丽, 赵宇, 邹晓威, 张正坤, 李启云

2023, 39(10): 58-67. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0383

摘要 ( 149 )

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真菌病毒Beauveria bassiana polymycovirus 4（BbPmV-4）的感染能够提高寄主球孢白僵菌的致病力，然而其在寄主中的复制、传播和与寄主互作机理尚不清楚。本研究构建了真菌病毒BbPmV-4外壳蛋白（coat protein, CP）的原核表达载体 pET-28a（+）∷BbPmV-4-CP，转化大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3），进行蛋白原核表达，免疫日本大耳兔制备了多克隆抗体，并利用间接ELISA，Western blot和免疫荧光等血清学方法进行病毒在寄主胞内定位和胞外复制的检测。结果表明，所表达BbPmV-4-CP为一种可溶性蛋白，相对分子质量约为28.56 kD；所制备的BbPmV-4-CP兔源多克隆抗体效价为1∶256 000；Western blot检测验证了所制备抗体能够识别对应抗原蛋白及寄主球孢白僵菌中的病毒BbPmV-4；利用所获取的多抗BbPmV-4-CP对含病毒BbPmV-4的球孢白僵菌培养上清液及沉淀中的病毒含量进行间接ELISA检测，结果显示，培养上清液中存在病毒，表明真菌病毒BbPmV-4可在寄主球孢白僵菌体内复制并游离到寄主体外；免疫荧光检测结果显示该病毒定位于真菌细胞核上。本研究制备了高效价和特异性的真菌病毒多克隆抗体，建立了球孢白僵菌真菌病毒的血清学检测技术体系，为研究真菌病毒在寄主体内的复制及其与寄主真菌的互作机理研究提供实验材料，并且可以利用病毒感染及其互作基因调控寄主毒力，创制高毒力球孢白僵菌菌株。

基于Csy4与MCP的新型迷你基因组编辑系统的构建

邓嘉辉, 雷建峰, 赵燚, 刘敏, 胡子曜, 尤扬子, 邵武奎, 柳建飞, 刘晓东

2023, 39(10): 68-79. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0248

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MCP是MS2噬菌体的外壳蛋白，Csy4是一种参与CRISPR 1-F系统crRNA生成的小型蛋白，能够以较高的特异性识别并结合RNA。目前CRISPR/Cas等基因组编辑技术存在靶向核酸酶分子量大、脱靶率高、受PAM位点限制等问题，为解决上述问题，构建基于上述两种小型蛋白的新型迷你基因组编辑系统。本研究采用AlphaFold2预测MCP-FokI、FokI-MCP、Csy4-FokI和FokI-Csy4融合蛋白的结构，通过浸花法将MCP-FokI和FokI-MCP编辑载体分别转化拟南芥，利用拟南芥叶片注射的方法投送CLCrV介导的Csy4-FokI与FokI-Csy4编辑系统，提取拟南芥基因组DNA，通过HI-TOM高通量测序检测新型迷你基因组编辑系统的编辑能力。结果显示，融合蛋白中MCP、FokI和Csy4都各自保持着自身原有的三维结构，预示它们都能正常发挥彼此的功能。构建靶向敲除拟南芥CLA1基因的4个不同中间间隔区的双靶位点MCP-FokI和MCP-FokI植物表达载体，初步证明MCP-FokI和FokI-MCP均不能实现对靶基因的靶向编辑。构建靶向敲除拟南芥CLA1基因的7个CLCrV介导的不同中间间隔区的双靶位点Csy4-FokI编辑载体，其中CLCrV介导的Csy4-FokI编辑系统能够实现对靶基因的靶向编辑，但是突变类型均为碱基置换类型且编辑效率很低，而FokI-Csy4基因组编辑体系并未检测到编辑的发生。成功构建了Csy4-FokI新型迷你基因组编辑系统，为克服CRISPR/Cas基因组编辑技术存在的问题提供了一种新的解决方案。

基于紫色杆菌素生物合成途径的L-色氨酸生物传感器的构建

李仁瀚, 张乐乐, 刘春立, 刘秀霞, 白仲虎, 杨艳坤, 李业

2023, 39(10): 80-92. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0271

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结合生物传感器进行高通量筛选是鉴定L-色氨酸高产菌株的有力工具，但现有的L-色氨酸生物传感器普遍存在工作范围和动态范围都较低的缺点。在大肠杆菌中表达紫色杆菌素生物合成途径，测试不同来源的VioA酶，结合RBS工程，开发了一种新型酶偶联L-色氨酸生物传感器。测试发现来自Chromobacterium violaceum的VioA酶可使该传感器的检测上限扩大至10 g/L外源添加的L-色氨酸；将其RBS的初始翻译速率降低到约2 000时，传感器的动态范围扩大到55倍；通过肉眼可直观地区分L-色氨酸产量不同的大肠杆菌菌株。这种新型的L-色氨酸生物传感器可结合高通量筛选等手段，在鉴定L-色氨酸及其高附加值衍生物高产菌株等方面发挥巨大作用。

FACS技术在酶定向进化中的应用

刘金升, 陈振娅, 霍毅欣, 郭淑元

2023, 39(10): 93-106. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0486

摘要 ( 186 )

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流式细胞术（flow cytometry，FCM）是一种在单细胞水平上对大量细胞进行快速、相对定量的多参数分析技术。基于FCM建立的荧光激活细胞分选术（fluorescence-activated cell sorting，FACS）可物理分离荧光标记的单细胞，目前已被广泛应用于酶定向进化领域。定向进化已被证明是获得高酶活、强热稳定性、耐溶剂性等优良性质工业酶的有效方法，其首先需通过随机突变和DNA重组等方法构建酶突变文库，随后需在人工选择压力下对突变文库进行筛选。传统筛选方法如平板法、微孔板法等，存在通量低、成本高、误差大、准确性差等局限，无法实现对大型文库的高通量筛选。相较于传统筛选方法，FACS具有高通量、耗费低、误差小、精度高等优势。本文首先总结了FCM及FACS的发展进程，以及由此衍生的相关仪器的组成和分类，随后讨论了FACS在酶定向进化中的应用现状及现阶段的应用局限性，最后总结并展望了FACS发展方向及其在酶定向进化领域的应用前景。

微流控技术在病原微生物检测中的研究进展

万其武, 包旭东, 丁柯, 牟华明, 罗阳

2023, 39(10): 107-114. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0479

摘要 ( 149 )

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快速、准确地检测病原微生物对于疫情防控和保障人民生命健康具有重大意义。近几年，研究者们通过合理地设计微流控芯片，将微流控技术与各种检测技术相结合，已经开发出了多种用于病原微生物检测的技术方法。相较于传统的病原微生物检测技术，微流控检测技术优势突出，具有操作人员技术要求不高、样本需求量少和自动化程度高等优点，适用于各种复杂环境下病原微生物的精准、快速检测。本文对微流控技术在病毒、细菌、真菌、衣原体及支原体等病原微生物的检测应用进行了综述，以期为病原微生物的检测提供研究思路，促进微流控技术在病原微生物检测中的发展，提高对疾病的预防和控制能力。

甘蓝型油菜酪氨酸代谢关键基因FAH的克隆、功能鉴定和表达分析

支添添, 周舟, 陈纪鹏, 韩成云

2023, 39(10): 115-127. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0270

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克隆甘蓝型油菜（Brassica napus L.）酪氨酸代谢关键基因FAH，对其进行功能验证和表达分析，为进一步解析FAH在甘蓝型油菜中的作用和功能提供理论依据。以甘蓝型油菜‘westar’为试材，克隆与拟南芥AtFAH同源性最高的甘蓝型油菜FAH基因BnaA06g38260D（BnaA06FAH）和BnaC05g49430D（BnaC05FAH），通过生物信息学分析其亲缘关系，构建过表达载体转化拟南芥突变体sscd1进行功能验证。克隆BnaA06FAH和BnaC05FAH启动子序列，利用PlantCare在线数据库分析启动子调控元件，构建启动子和GUS的融合载体，通过GUS组织化学染色分析其表达模式。结果显示，BnaA06FAH和BnaC05FAH与AtFAH的氨基酸序列相似性分别为93.11%和92.40%，2个基因过表达都可以完全抑制拟南芥突变体sscd1在短日照下模拟病斑的形成，暗示BnaA06FAH和BnaC05FAH都与AtFAH功能相似。BnaA06FAH和BnaC05FAH启动子除具有所必需的TATA-box和CAAT-box等基本顺式作用元件外，都含有多个与光诱导、激素响应和逆境胁迫响应元件以及多种与抗病相关的顺式作用元件，但与BnaA06FAH相比，BnaC05FAH与拟南芥AtFAH相同的顺式作用元件更多；GUS活性检测表明，BnaC05FAH启动子驱动的GUS基因的表达比BnaA06FAH强，并且两者驱动表达的组织部位不完全相同。因此，BnaA06FAH和BnaC05FAH启动子的作用部位和作用强度都存在明显差异。BnaA06FAH和BnaC05FAH都能够调控拟南芥sscd1模拟病斑的形成，但两者启动子驱动下游基因的强度和部位不同。

普通白菜PRR5的克隆、表达及功能验证

侯瑞泽, 鲍悦, 陈启亮, 毛桂玲, 韦博霖, 侯雷平, 李梅兰

2023, 39(10): 128-135. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0338

摘要 ( 151 )

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克隆BrcPRR5，并研究其在不同组织和不同发育时期的表达模式及功能，为了解PRR5对普通白菜成花转变的影响奠定基础。运用RT-PCR方法克隆PRR5的同源基因BrcPRR5，并对其进行生物信息学分析，利用荧光定量PCR测定该基因在不同组织部位和不同发育时期的相对表达量，构建过表达载体并转化拟南芥进行基因的功能验证。结果表明，BrcPRR5的CDS全长为1 701 bp，编码566个氨基酸，通过与其他物种的同源蛋白进行氨基酸序列多重比对，确定得到的序列属于普通白菜PRR5同源基因。BrcPRR5在茎和花中的表达量高于叶和果荚中的表达量；在S0茎尖中表达量最高，说明其在普通白菜成花转变过程中表达量上调可能促进成花转变。超表达转基因植株开花期提前，株高和茎粗明显优于野生型。BrcPRR5可以促进植株提早抽薹开花。

低磷胁迫下番茄转录因子WRKY6功能分析

陈浩婷, 张玉静, 刘洁, 代泽敏, 刘伟, 石玉, 张毅, 李天来

2023, 39(10): 136-147. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0339

摘要 ( 145 )

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本研究旨在分析番茄转录因子WRKY6在低磷胁迫应答中的作用，为研究番茄耐低磷分子机制及挖掘提高番茄低磷耐受性和磷素利用率的基因资源奠定理论基础。试验以野生型番茄Ailsa Craig为材料，以其cDNA为模板克隆基因SlWRKY6，利用根癌农杆菌介导转化法构建RNAi-SlWRKY6和OE-SlWRKY6转基因番茄株系，并对野生型、RNAi-SlWRKY6和OE-SlWRKY63种不同基因型的番茄植株进行低磷胁迫处理，在处理第18天对叶片与根系进行表型观察和生理生化指标测定。表型观察结果显示，与RNAi-SlWRKY6转基因番茄相比，OE-SlWRKY6转基因番茄植株较矮壮，叶片数量较多，受低磷胁迫影响较小，表现出较强的耐低磷性。生理生化指标分析结果表明，与野生型相比，OE-SlWRKY6转基因番茄根系与叶片的有机磷和总磷含量显著升高，根系酸性磷酸酶活性和部分有机酸含量显著增加，磷转运体表达量显著降低。而RNAi-SlWRKY6转基因番茄受到低磷胁迫后，这些指标的变化趋势与过表达株系相反。低磷胁迫后，LePT1的相对表达量在OE-SlWRKY6植株根系中呈下降趋势，与RNAi-SlWRKY6植株中变化相反。在野生型、RNAi-SlWRKY6和OE-SlWRKY6植株根系中LePT2的相对表达量均呈整体上升趋势，而LePT3则呈整体下降趋势。由上述可知，SlWRKY6能够响应低磷胁迫，其表达量高低与番茄植株的低磷耐受性呈正相关，且可能影响磷转运体基因对低磷的响应。该研究结果可为进一步揭示番茄WRKY转录因子家族的功能及其对低磷胁迫的响应机制提供理论依据。

激素和逆境胁迫对大豆维生素E和γ-TMT表达的影响

白苗, 田雯青, 武帅, 王敏, 王利祥, 岳爱琴, 牛景萍, 张永坡, 高春艳, 张武霞, 郭数进, 杜维俊, 赵晋忠

2023, 39(10): 148-162. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0183

摘要 ( 119 )

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明确大豆维生素组分含量及合成相关基因γ-TMT对激素和逆境胁迫的响应，为维生素E参与逆境胁迫研究开辟新思路。以山西省主栽品种晋大88为试验材料，在激素、逆境胁迫条件下对不同组织的维生素E组分含量、生理指标、γ-TMT表达模式进行分析。结果表明，维生素E主要存在于叶中，茎中有少量，根中不存在。在激素及盐等胁迫条件下，叶和茎的总维生素E含量小于对照，但γ-生育酚含量在NaCl、H₂O₂、ABA胁迫下含量高于对照。在激素和逆境胁迫环境下，大豆植株的生长被显著抑制，株高、鲜重、干重、SPAD值以及含水量皆小于对照。基因组数据挖掘到3个γ-TMT，启动子中均存在许多胁迫应答和激素响应元件，在激素和逆境胁迫下，γ-TMT1-γ-TMT3在根、叶中的表达均发生上调或下调。在NaCl胁迫条件下，大豆叶中γ-生育酚含量增加，而γ-TMT2、γ-TMT3的表达明显下调，推测γ-TMT2和γ-TMT3可能影响盐胁迫条件下维生素组分含量。激素和逆境胁迫显著抑制大豆茎和叶中维生素E的含量，进而抑制植株的生长，影响了大豆γ-TMT表达和维生素E组分。

甘蔗ShPR10基因的克隆及其编码蛋白与甘蔗线条花叶病毒P1蛋白的互作研究

黄佳艳, 冯小艳, 沈林波, 王文治, 胡海燕, 张树珍

2023, 39(10): 163-174. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0403

摘要 ( 109 )

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病程相关蛋白10（pathogenesis related protein 10, PR10）在植物抵抗病毒侵染中发挥重要作用。前期以甘蔗线条花叶病毒（Sugarcane streak mosaic virus, SCSMV）编码的RNA沉默抑制子P1为诱饵，筛选获得一个甘蔗ShPR10蛋白。为探究ShPR10在甘蔗应答SCSMV侵染过程中的功能，利用同源克隆技术克隆甘蔗ShPR10基因并对其编码蛋白进行生物信息学分析，利用绿色荧光蛋白融合表达法分析ShPR10蛋白的亚细胞定位，采用酵母双杂交和双分子荧光互补技术验证ShPR10与SCSMV P1的互作关系，采用农杆菌共浸润瞬时表达系统和Western blot技术分析ShPR10对P1沉默抑制子活性的影响。结果显示，甘蔗ShPR10基因开放阅读框全长570 bp，编码一个不稳定亲水蛋白，蛋白分子量为21.17 kD，等电点为4.77，含有一个P-loop基序，不含跨膜结构域和信号肽。ShPR10二级结构包含51.85%的无规则卷曲、35.98%的α-螺旋、7.41%的延伸链和4.76%的β-转角。ShPR10蛋白与玉米ZmPR10蛋白的氨基酸序列相似性高达91.53%，两者在进化树上聚为一个分支。ShPR10定位在细胞质和细胞核，与SCSMV P1在酵母细胞和烟草细胞中存在互作关系。ShPR10本身不具有沉默抑制子活性，其表达削弱了P1的沉默抑制子活性，但对P1蛋白的含量无明显影响。综上，ShPR10可能通过结合P1来削弱P1的沉默抑制子活性，从而提高甘蔗对SCSMV的抗性。

发根农杆菌介导的甘薯遗传转化体系优化

陶娜, 李茂兴, 郭华春

2023, 39(10): 175-183. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0369

摘要 ( 181 )

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遗传转化体系对植物基因功能的验证具有重要意义，为在甘薯（Ipomoea batatas L.）中建立发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导的遗传转化体系，本研究采用3×3×5三因素试验设计研究发根农杆菌侵染时间、外植体类型、发根农杆菌菌株对甘薯毛状根诱导率的影响。确定合适的外植体类型、侵染时间，在此基础上采用5×5双因子设计，研究5种发根农杆菌菌株和甘薯品种（系）对甘薯发根诱导率的影响。用PCR技术检测诱导出的毛状根，证实了发根农杆菌 Ri质粒的rolB 基因已经整合到甘薯细胞基因组中。结果表明，发根农杆菌侵染时间、外植体类型、发根农杆菌菌株、甘薯品种均影响发根诱导率，且各因子间存在交互作用。最适宜发根的外植体为茎段，最佳侵染时间是20 min，‘徐薯22’适宜菌株为MSU440，‘泰中6号’适宜菌株为K599，‘1610’适宜菌株为C58C1，‘YS’适宜菌株为K599，‘灰薯’适宜菌株为C58C1。采用发根农杆菌菌株MSU440，以‘徐薯22’茎段为外植体、农杆菌侵染20 min，最高获得了79.63%的毛状根诱导率。构建过表达载体进行毛状根遗传转化，通过目的基因的PCR 扩增发现甘薯毛状根的转基因效率为38.1%。建立了发根农杆菌介导的甘薯遗传转化体系，为甘薯进一步的转基因育种奠定基础。

烟草半胱氨酸蛋白酶家族和相应miRNAs的鉴定及其对PVY的响应

尹国英, 刘畅, 常永春, 羽王洁, 王兵, 张盼, 郭玉双

2023, 39(10): 184-196. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0297

摘要 ( 87 )

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植物半胱氨酸蛋白酶（cysteine proteases, CPs）广泛影响着植物的生理过程及抗病调控。为研究烟草半胱氨酸蛋白酶在调控马铃薯Y病毒（potato virus Y, PVY）中的功能机理，本研究在全基因组水平上鉴定栽培烟草CPs基因家族，使用生物信息学方法分析CPs基因家族的进化关系、Motif基序及启动子调控元件；筛选CPs对应的miRNAs，分析CPs基因及其对应的miRNAs在PVY感染后的表达特性。结果表明，栽培烟草中共鉴定到70个CPs基因家族成员，根据其系统发育特征和结构可分为5个亚家族，其中C1A 39个、C2A 2个、C12 5个，C13 8个，C14A 16个；Motif分析表明，同一亚家族CPs具有相似的motif分布；启动子顺式作用元件分析表明，CPs家族基因含有光应答元件、激素响应元件以及低温、干旱、高温、盐胁迫等响应元件。基于转录组和small RNA测序结果发现，PVY感染后有38个CPs基因上调表达，18个CPs基因下调表达。有28个CPs基因受51个miRNAs调控，PVY感染后，38个miRNAs表达上调，13个miRNAs表达下调，其中7个在PVY感染后与miRNAs负相关。RT-qPCR结果证明PVY感染后，有15个CPs基因表达量显著上调。研究结果有助于深入理解烟草CPs基因家族功能，及其与相应miRNAs通过互作调控烟草对PVY的响应，为研究茄科作物抗PVY分子机制提供理论依据。

利用CRISPR/Cas9系统研究REVOLUTA参与烟草叶芽发育的调控

王兵, 赵会纳, 余婧, 陈杰, 骆梅, 雷波

2023, 39(10): 197-208. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0364

摘要 ( 120 )

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作物叶芽受到分生组织调控，调控叶芽是作物增产的有效措施之一。目前关于烟草分生组织调控的分子机理研究偏少，可用于株型改良的种质资源缺乏。本研究通过CRISPR/Cas9编辑系统靶向突变烟草REVOLUTA（REV）基因，分别构建两个不同REV单靶点序列C15NtREV和C16NtREV，通过农杆菌介导的叶盘转化方法获得再生苗，利用PCR测序鉴定转基因阳性单株，测序结果表明Ko-C15Ntrev突变体在NtREV氨基酸第26位置之后发生移码突变，而Ko-C16Ntrev突变体在NtREV氨基酸第60位置之后发生移码突变。此外，借助扫描电镜分别观测两个单靶点纯合突变体顶芽表型，结果表明烟草Ko-C15Ntrev双拷贝同源突变体出现顶芽缺失和叶片畸形的表型，而Ko-C16Ntrev单拷贝同源突变体未表现出顶芽缺失，但顶芽发育迟缓。相较于野生型烟草，Ko-C16Ntrev突变体自然株高较野生型增加3.76%，Ko-C16Ntrev突变体叶片数和腋芽鲜重分别较野生型减少21.47%和23.41%，且均达到极显著差异，说明NtREV参与烟草顶端分生组织发育，进而调节叶和腋芽发育。这些突变体为后续研究烟草的叶芽发育分子机理提供了重要研究材料。

甘肃部分地区苹果褐腐病病原分离鉴定及拮抗细菌筛选

蒋晶晶, 周昭旭, 杜蕙, 吕昭龙, 王春明, 郭建国, 张新瑞, 李继平

2023, 39(10): 209-218. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0234

摘要 ( 93 )

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明确甘肃省静宁县及榆中县苹果褐腐病的病原种类，并筛选优质病原拮抗菌，为苹果采后病害的生物防治提供资源。采用常规组织分离法对苹果褐腐病病果进行病原菌分离纯化、柯赫氏法则验证、分子生物学方法结合形态学鉴定；采用平板对峙法筛选拮抗细菌，利用形态学、生理生化和分子生物学方法对拮抗菌进行鉴定，用离体果实测定拮抗菌防病效果。结果表明，引起甘肃静宁县及榆中县苹果褐腐病的病原菌为云南链核盘菌（Monilia yunnanensis），筛选获得的最优拮抗细菌X2-2为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），对M. yunnanensis的菌丝抑制率达（81.29±0.57）%，在离体果实上拮抗菌的防治效果达98.8%，能够显著抑制苹果褐腐病病斑在果实上的扩展速度。云南链核盘菌为甘肃部分地区苹果褐腐病主要病原菌，该研究筛选出的拮抗细菌X2-2抑菌效果显著，具有作为优质生防菌株的潜力。

菠萝不同品种对低温胁迫响应差异的生理代谢机制

刘传和, 贺涵, 何秀古, 陈鑫, 刘开, 邵雪花, 赖多, 秦健, 庄庆礼, 匡石滋, 肖维强

2023, 39(10): 219-230. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0071

摘要 ( 111 )

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为探明菠萝不同品种对低温胁迫响应差异的相关机理，本研究以耐寒性强的‘粤甜’和耐寒性弱的‘巴厘’品种为试材，对常温（25℃）及低温（5℃）处理48 h植株的叶片生理指标、基因相对表达量及差异代谢物等进行比较测定。结果表明，低温处理后‘粤甜’的可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸含量及POD、SOD、CAT酶活性均显著高于‘巴厘’，丙二醛含量显著低于‘巴厘’；POD、CAT基因相对表达量显著高于‘巴厘’，ProDH基因显著低于‘巴厘’；内源生长素、细胞分裂素、茉莉酸、水杨酸及独角金内酯含量高于‘巴厘’，赤霉素、脱落酸含量低于‘巴厘’。代谢组分析表明，低温处理后‘粤甜’与‘巴厘’间共检测出差异代谢物262个，其中黄酮类代谢物最多。KEGG分析表明‘粤甜’‘巴厘’间差异代谢物主要富集在次生代谢物生物合成、类黄酮生物合成、黄酮与黄酮醇生物合成等代谢通路中。筛选出110个低温诱导的‘粤甜’与‘巴厘’差异代谢物，其中41个在常温下差异显著、低温处理后差异倍数增大，69个在常温下无显著差异、低温处理后差异显著；差异代谢物在‘粤甜’中的含量积累均显著高于‘巴厘’。由此可见，渗透调节及抗氧化活性、内源激素及代谢物积累的差异是‘粤甜’与‘巴厘’低温响应差异的重要原因。

菊花根状茎发育的转录组分析

徐俊, 叶雨晴, 牛雅静, 黄河, 张蒙蒙

2023, 39(10): 231-245. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0315

摘要 ( 102 )

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为了探究菊花根状茎形成的分子机制，本研究选取了具有稳定根状茎的菊花株系‘2017XS’的根状茎尖、根状茎中部、根状茎下部、叶片、茎段、根系、茎尖、舌状花8 个部位进行了转录组测序，并利用生物信息学方法对根状茎尖和整个根状茎中高表达的基因进行筛选。转录组测序共得到159.51 GB 数据，组装后得到100 235个Unigene。其中，64 956（64.80%）个Unigene在7个公共蛋白质数据库中得到了注释。为了找到根状茎发育的关键基因，通过加权基因共表达网络分析（weighted correlation network analysis，WGCNA）、K-means和基于Venn筛选差异基因3种方式筛选在根状茎尖和根状茎中高表达基因。最终筛选到20个在根状茎尖中高表达的基因和36个在根状茎中高表达的基因。这些基因包括了和植物非生物胁迫相关的基因、脱落酸（abscisic acid, ABA）代谢基因、红光受体和紫外光受体以及光周期核心转录因子，选取6个差异表达较显著的基因进行 RT-qPCR 荧光定量分析，结果与转录组测序数据一致，验证了转录组的有效性。且这些差异表达基因在同样具根茎的菊花株系‘2005042’中亦表现为在根状茎中特异高表达。综上，菊花根状茎的形成和发育可能受到包括脱落酸在内的植物激素以及光周期等因素的影响，本研究对进一步探究菊花根状茎发育的分子机制提供了重要依据。

乌头内生细菌JY-3-1R的鉴定及其生防和促生能力研究

邹兰, 王茜, 李慕仪, 叶坤浩, 黄晶

2023, 39(10): 246-255. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0590

摘要 ( 111 )

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分离筛选具生防和促生潜力的乌头内生细菌，为乌头土传病害防治提供优质微生物菌种。采用纯培养法从健康乌头分离内生细菌，对峙试验检测菌株拮抗病原菌能力，多位点持家基因序列鉴定菌株分类地位，平板法检测菌株产酶和铁载体能力，比色法检测菌株产IAA能力，大田试验检测菌株对乌头生长的影响和白绢病的生防潜力。从111株乌头内生细菌中筛选到1株对白绢病和根腐病病原菌有显著抑制作用的内生细菌JY-3-1R，该菌鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。JY-3-1R无细胞发酵滤液对齐整小核菌（Sclerotium rolfsii）菌丝生长和菌核萌发抑制率达100%。该菌具产IAA、铁载体、蛋白酶、纤维素酶和葡聚糖酶的能力，同时包含合成伊枯草菌素、丰原素、表面活性素、芽孢菌霉素、杆菌溶素、杆菌烯和大环内酯的功能基因。大田条件下，JY-3-1R接种降低乌头白绢病发病率高达40%，生防效率为61.53%-84.61%，生防能力持续30 d，同时植株茎、主根和子根干重分别提高了34.34%、82.59%和56.08%。JY-3-1R兼具生防和促生能力，具有开发作为乌头生物肥料和生防材料的潜力。

灰毡毛忍冬UGTPg17、UGTPg36基因克隆及功能研究

杨敏, 龙雨青, 曾娟, 曾梅, 周新茹, 王玲, 付学森, 周日宝, 刘湘丹

2023, 39(10): 256-267. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0194

摘要 ( 83 )

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克隆灰毡毛忍冬糖基转移酶UGTPg17、UGTPg36基因，并进行其不同花期表达量与皂苷含量相关性分析。根据灰毡毛忍冬转录组Unigene序列设计特异性引物进行UGTPg17、UGTPg36克隆；使用生物信息学网站对克隆的UGTPg17、UGTPg36编码蛋白进行理化性质、蛋白结构和进化关系等分析；实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析基因在不同花期表达情况；HPLC法测定灰毡毛忍冬皂苷含量；利用SPSS分析基因表达量与皂苷含量相关性。UGTPg17、UGTPg36基因开放阅读框长度分别为1 410 bp、1 428 bp，分别编码469、475个氨基酸，分别包含4、7个糖基化位点，均属于不稳定、亲水性蛋白，不具跨膜区域；UGTPg36蛋白不存在信号肽序列，UGTPg17蛋白平均S值>0.5，推测其可能含有信号肽。UGTPg17、UGTPg36在不同花期中表达均为上升趋势，皂苷含量在不同花期中存在波动，两者相关性分析得出，2个UGT基因与皂苷含量呈极显著负相关。成功从灰毡毛忍冬中克隆了UGTPg17、UGTPg36基因，其在不同花期表达存在差异性，且相关性分析表明UGTPg17、UGTPg36基因与灰毡毛忍冬皂苷生物合成相关，为进一步探索其具体功能奠定了基础。

链霉菌Streptomyces sp. FXP04全基因组测序分析

唐碧瑶, 付学鹏

2023, 39(10): 268-280. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0178

摘要 ( 100 )

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链霉菌Streptomyces sp. FXP04是健康马铃薯根际土壤中分离的一株对致病疫霉（Phytophthora infestans）有显著拮抗作用的革兰氏阳性放线菌。解析菌株FXP04的全部基因组序列信息，深入探索该菌株拮抗作用机制，并挖掘其次级代谢产物基因资源。利用Illumina和PacBio平台相结合测序技术对FXP04进行全基因组测序，并进行了基因预测、功能注释、比较基因组学分析以及次级代谢产物合成基因簇预测。FXP04基因组大小为4 535 201 bp，共编码5 037个基因，GC含量为72.95%，其中含有3个5S rRNA、3个16S rRNA、3个23S rRNA，33个tRNA以及23个sRNA；含有1 699个串联重复序列，含1 284个小卫星 DNA，188个微卫星 DNA；在 GO、COG、KEGG、CAZy、VFDB和ARDB数据库分别注释到2 088、2 319、1 530、73、139和14个基因；同时预测到菌株FXP04中有10个次级代谢产物合成基因簇，分别编码杀粉蝶菌素、Youssoufene等抑菌物质。通过基因组测序初步揭示了菌株FXP04的内在作用机制，对后续开发利用菌株FXP04提供理论依据。

Loop B3对GH7内切纤维素酶功能的影响机制

杨俊钊, 张新蕊, 孙清扬, 郑菲

2023, 39(10): 281-291. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0307

摘要 ( 77 )

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糖苷水解酶第七家族（GH7）包含内切和外切两类纤维素酶，其中对外切纤维素酶的研究较为成熟，但对内切纤维素酶的研究相对较少。本研究从嗜热真菌Myceliophthora thermophila的基因组中鉴定出一个新型GH7内切纤维素酶MtCel7b，其在60℃，pH 5.0时表现出最佳酶活力。在90℃孵育1 h后，MtCel7b仍能保留40%以上的活性。经过序列统计分析发现，MtCel7b loop B3存在长链型和短链型的进化差异，为了探究loop B3对内切纤维素酶结构和功能的影响，将MtCel7b的长链型loop B3进行截短，构建了B3^cut突变体。结果显示，B3^cut突变体在高温下的稳定性较野生型提高了约9%-44%，而其对3种纤维素底物的比活性降低了34%-74%。借助分子动力学模拟进一步分析显示，在突变体B3^cut中，其loop B3的截短导致催化裂隙两端的loop A3和loop B1发生了显著位移，缩小了催化口袋的空间结构，加强了催化位点周围的氢键作用网络，从而导致酶在高温下更加稳定。本研究阐明了loop B3在GH7内切纤维素酶中的重要作用，为酶分子的改良工作提供了新的参考。

基于苯酚降解的粪产碱杆菌Alcaligenes faecalis JF101的全基因组分析

张傲洁, 李青云, 宋文红, 颜少慧, 唐爱星, 刘幽燕

2023, 39(10): 292-303. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0281

摘要 ( 106 )

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粪产碱杆菌属对芳香族类物质表现出广泛的降解能力，本研究对1株粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）JF101开展苯酚降解基因解析，并进一步挖掘其潜在功能。通过对菌株JF101全基因组测序、组装和功能注释，分析其降解苯酚的功能基因，并与5株近缘菌株开展比较基因组学研究。结果表明，JF101基因组大小为4 143 816 bp，GC含量为 57.44%，含有3 804个编码蛋白基因和55个tRNA、9个rRNA、5个sRNA，在COG、GO、KEGG数据库中分别注释到3 040、2 529、2 415个基因。鉴定了11个苯酚降解基因。比较基因组学表明，菌株JF101没有质粒，与同属的5株菌株有2 008个共有同源基因家族和5个特异基因家族。此外发现菌株JF101含有与相容性溶质转运相关的Trk、Kdp等基因，实验测定了其耐盐能力。通过对菌株JF101全基因组的解析，为进一步阐释其苯酚降解机制及发展实际工程应用奠定了基础。

胆固醇7α-羟化酶在毕赤酵母中的异源表达

赵昕, 杜玉瑶, 殷子扬, 毛淑红

2023, 39(10): 304-310. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0387

摘要 ( 94 )

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胆固醇7α-羟化酶（CYP7A1）是胆固醇分解为胆汁酸的限速酶，其催化胆固醇为7α-羟基胆固醇，7α-羟基胆固醇是重要的甾体药物及中间体。以人源CYP7A1作为研究对象，首先构建了重组毕赤酵母/pPIC3.5K-CYP7A1；然后对7α-羟化酶进行分子改造，之后将酶与不同来源NADPH细胞色素氧化还原酶（CPR）适配，以提高目的产物7α-羟基胆固醇的产量。其中突变体G485A将7α-羟基胆固醇的产量提高了8.70%；5种不同来源的CPR与CYP7A1共表达毕赤酵母菌株均可提高7α-羟基胆固醇的产量，并且罗汉果（Siraitia grosvenorii）来源的CPR（SgCPR）与CYP7A1适配性最好，使7α-羟基胆固醇的产率提高了82.26%；在以上研究的基础上，构建突变体G485A与SgCPR共表达毕赤酵母菌株，最终7α-羟基胆固醇的产量提高了133.79%，其产量为0.25 mg/L。实验在毕赤酵母中成功异源表达人源胆固醇7α-羟化酶，并通过分子改造及与不同来源CPR适配的方法提高了7α-羟基胆固醇的产量。

NH₃和H₂S除臭菌剂的制备及其对厨余垃圾堆肥除臭效果和机理探究

崔若琪, 张玲悦, 江海溶, 张毓羚, 张明露, 任连海

2023, 39(10): 311-322. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0277

摘要 ( 76 )

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为了缓解厨余垃圾因降解或腐烂产生的恶臭气体所造成的污染，本研究分别从污泥和厨余堆肥中分离筛选出8株对NH₃和H₂S具有除臭效果的菌株，混合制备成复合微生物除臭菌剂，研究其除臭效果、堆肥过程中的理化性质和微生物群落的变化。由响应面分析得出菌剂对于NH₄⁺-N降解率的最佳条件为温度27℃、pH 6.21、接种量14%时，NH₄⁺-N的降解率为92.55%；菌剂生成SO₄^2-的最佳条件是温度29℃、pH 6.61和接种量5%时，SO₄^2-的最大生成量为173.57 mg/L。厨余垃圾堆肥添加菌剂后NH₃的去除率为55.32%，H₂S的去除率为61.72%，同时含水率、C/N、pH均有降低，加速了堆体温度的上升，延长了高温持续时间。菌剂的添加有利于微生物群落结构的改变，增加了去除NH₃和H₂S的微生物丰度，加快了对NH₃和H₂S的代谢转化过程，抑制了NH₃和H₂S的释放，对于厨余垃圾恶臭气体的控制有着良好的应用潜力。

FLAG标签纳米抗体的筛选、表达及验证

王欣怡, 王晓倩, 王红军, 晁跃辉

2023, 39(10): 323-331. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0291

摘要 ( 201 )

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纳米抗体是一种新型的蛋白质工程抗体，其体积小、稳定性强、亲和力高等特性为科学研究提供了新的可能性。FLAG标签是一种广泛应用于生物学研究中的短肽标签，在生物学研究中具有重要的作用。为了制备FLAG标签的纳米抗体，利用酵母双杂交技术筛选出具有高亲和力的纳米抗体，并对制备的FLAG纳米抗体进行性能检验。通过DNA重组技术，构建包含FLAG的诱饵载体，利用酵母双杂交技术，在驼源纳米抗体酵母文库中，筛选针对FLAG标签纳米抗体。在酵母文库中筛选出5个单一的候选抗体DNA序列，为了排除载体本身表达蛋白序列对抗体筛选带来的干扰，通过“点对点”验证方法排除非特异性杂交的可能，通过该操作确认所筛选的5株纳米抗体均能与FLAG标签发生特异性亲和反应。为了制备纳米抗体，构建了5个纳米抗体原核表达载体，并利用大肠杆菌体系进行表达。通过SDS-PAGE和Western杂交（WB）分析，结果显示，成功获得2株可溶性表达的抗FLAG标签蛋白纳米抗体。对这2株纳米抗体与商品化的常规FLAG标签抗体进行效果比对，结果显示制备的2株纳米抗体与商品化抗体均能够识别FLAG多肽及含有FLAG标签的融合蛋白，且在特异性上没有明显区别，表明制备的FLAG纳米抗体具有较好的应用前景。基于酵母双杂交技术，成功筛选并制备了FLAG标签纳米抗体，这一成果不仅丰富了纳米抗体的类型，也为抗体开发及应用提供了新的途径。该研究为进一步研究FLAG标签在生物学研究中的应用，以及纳米抗体在生物工程中的应用提供有力支持。

2023, 39(10): 332.

摘要 ( 45 )

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