生物技术通报

梁雪莲,谢振文

2014, 30(11): 1-6.

摘要 ( 267 )

PDF (986KB) ( 591 )

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甘薯分子遗传图谱的建立对甘薯分子育种技术体系的拓展和应用具有重要意义。当前,对甘薯分子遗传图谱的研究虽然取得一定的进展,但存在着很多技术瓶颈,如作图策略应用和优化等。总结了甘薯经典和分子遗传研究进展,剖析了甘薯分子遗传图谱作图的3种方法与策略；探讨和提出了提高甘薯作图效率和质量的途径主要是：优化作图群体质量、克服偏分离、整合多群体间遗传连锁图谱和选择合适的分子标记类型；并指出染色体关联在遗传作图中的重要性,提出甘薯分子育种领域亟待加强的方面,以期为今后甘薯精密分子图谱的建立及基于分子图谱的甘薯分子育种提供新的思路。

拟南芥乙烯合成酶ACS基因家族研究进展

吕淑芳,江静

2014, 30(11): 7-13.

摘要 ( 549 )

PDF (1331KB) ( 889 )

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1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid,ACC）合酶（ACC synthase,ACS）是乙烯生物合成的限速酶。ACS酶活性是ACC和乙烯调控植物生长发育的基础,其酶活性调节主要涉及转录启动、翻译后修饰、酶高级结构形成、生化特性等方面。简要总结拟南芥ACS酶活性研究进展。

植物多肽信号分子CLE家族

高丽

2014, 30(11): 14-23.

摘要 ( 595 )

PDF (1280KB) ( 1301 )

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动物中存在众多多肽信号分子,它们在信号转导方面发挥重要作用。近几年,对植物中多肽信号分子的研究取得了重大突破,它们积极参与调控植物生长发育的众多过程,同时也表明多肽信号分子在细胞之间的“交流”过程中发挥作用在进化上是保守的。CLE（CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION）家族是目前植物领域研究较热的多肽信号分子家族,通过对拟南芥CLV3和百日草TDIF等CLE多肽信号分子的研究发现,CLE蛋白在成为有功能活性的信号分子之前,存在翻译后蛋白剪切和修饰的过程,这方面与动物中多肽信使的成熟过程相似。对CLE家族成员的分子特征、生物学功能、翻译后的加工修饰和研究中出现的问题进行综述,并对本领域未来的发展方向作出展望。

哺乳动物中RNA干扰沉默基因表达的研究进展

曹腾威,谷凌云,黄和,高振,郦明芳

2014, 30(11): 24-31.

摘要 ( 328 )

PDF (1347KB) ( 868 )

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RNA干扰及相关基因沉默导致的代谢通路变化已经彻底改变了人们对基因调控的理解。基因沉默技术已经被用来作为一种研究工具来控制某些细胞基因的表达,特异的siRNA导入不同的细胞需要不同的转染载体才能达到最大的转染效率,并且不会产生较大的细胞毒性。近年来尤其是碳纳米管等新型纳米材料载体的应用拓展了人们对传统脂质体和病毒载体的认识。首先介绍RNA干扰技术及其发展历程,随后对利用几种不同的载体来设计和进行RNA干扰试验进行了比较,最后对最初的脂质体到生物病毒再到高分子纳米材料介导的RNA干扰在疾病的治疗和临床诊断进行了展望。

罗非鱼免疫学研究进展

甘桢,王蓓,鲁义善,汤菊芬,简纪常,吴灶和

2014, 30(11): 32-39.

摘要 ( 362 )

PDF (1026KB) ( 1288 )

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罗非鱼是我国主要的养殖鱼类之一,近年来频繁爆发的罗非鱼病害给罗非鱼产业造成了巨大的经济损失。鉴于免疫防治技术在水环境保护、食品安全等方面的优势,探讨鱼体免疫系统特性和免疫应答机制逐渐成为学术界的热点。就罗非鱼的非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫等方面的研究成果作一综述,旨在为今后深入研究罗非鱼病害的免疫防治技术提供一些可行的思路和有效的依据。

昆虫包涵体衍生型病毒经口感染相关蛋白的研究进展

|相兴伟,周宇芳

2014, 30(11): 40-47.

摘要 ( 321 )

PDF (1189KB) ( 638 )

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了解昆虫杆状病毒包涵体衍生型病毒（Occlusion-derived virus,ODV）的经口感染相关蛋白对揭示杆状病毒建立原发感染的机制、明确昆虫的先天免疫系统,以及研究控制昆虫新策略等方面具有重要意义。目前已鉴定的经口感染因子（Per os infectivity factors,PIF）包括P74、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5（ODV-E56）和PIF6。此外,与ODV病毒粒子经口感染有关的蛋白有ODV-E66、VP91、Ac108、ORF 145和ORF 150。综述近年来关于上述经口感染相关蛋白的结构和功能等研究成果,分析了这些蛋白的分子生物学特征。

毒素蛋白基因mazF在基因修饰系统中的应用进展

石杨,董会娜,张大伟

2014, 30(11): 48-54.

摘要 ( 376 )

PDF (1667KB) ( 1436 )

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毒素-抗毒素系统（Toxin-antitoxin system,TA系统）存在于大部分细菌中。mazEF是大肠杆菌中一种毒素-抗毒素系统。毒素基因mazF编码的MazF毒素蛋白可以特异性地剪切自由mRNA的ACA序列,从而抑制蛋白合成、引起细胞生长停滞；近些年,许多学者利用mazF基因作为反向筛选标记对不同种微生物建立了无标记或无痕的基因修饰系统,并实现了不同菌株的基因组修饰。主要综述了大肠杆菌mazF基因作为反向筛选基因的应用原理及其在不同种类微生物的基因修饰系统中的应用进展,然后对mazF基因及其他毒素基因在基因修饰系统中的应用进行了展望。

低温秸秆降解微生物菌剂的研究进展

赵旭,王文丽,李娟,呼和

2014, 30(11): 55-61.

摘要 ( 354 )

PDF (1019KB) ( 810 )

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秸秆的成分主要有纤维素、半纤维素和木质素等,降解秸秆的微生物包括细菌、放线菌和真菌。低温秸秆降解微生物的选育方法有直接从自然界中筛选、诱变育种、原生质体融合育种、基因工程育种等。目前,筛选获得的低温秸秆降解菌株的数量有限,降解秸秆的能力不高,低温条件下菌株的降解机理都需要进一步的研究。综述了低温条件下秸秆降解微生物菌剂的研究进展。

木质素降解酶及相关基因研究进展

董秀芹,袁红莉,高同国

2014, 30(11): 62-72.

摘要 ( 376 )

PDF (1022KB) ( 1212 )

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生物质的高效综合利用已成为全球关注的热点问题。生物质的主要成分是木质素、纤维素和半纤维素,其利用的关键是如何去除木质素,从而提高纤维素和半纤维素的得率。其中利用真菌的生物预处理方法因条件温和、无二次污染等优点符合全球经济可持续发展需要,受到研究者的普遍关注。综述了近年国内外真菌分泌的主要木质素降解酶,包括木质素过氧化物酶（LiP）、锰过氧化物酶（MnP）、漆酶（laccase）和多功能过氧化物酶（VP）的主要特点,总结了木质素降解相关酶的基因工程、基因组学的研究成果,并对其发展前景进行了展望。

MicroRNAs在棕色脂肪细胞分化过程中的作用

郝美林,黄英,黄丽梅,杨明华,李琦华,贾俊静,赵素梅

2014, 30(11): 73-78.

摘要 ( 296 )

PDF (1202KB) ( 641 )

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MicroRNA（miRNA）是一种非编码的小分子RNA,负性调控转录后基因表达。miRNA 在个体时序性发育、细胞增殖分化和凋亡、器官发育、脂肪代谢等许多生物发育过程中起着重要作用。近年来对miRNA 的研究证实,miRNA 直接或间接影响棕色脂肪组织发育过程中重要转录因子的表达。综述了miRNA 调节棕色脂肪细胞分化的最新研究进展。

非编码小RNA的多样性

黄俊骏,王华华,梁卫红

2014, 30(11): 79-83.

摘要 ( 353 )

PDF (997KB) ( 1432 )

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RNA是一类广泛存在的极其重要的生物大分子,它不仅种类繁多,而且不同种类的RNA在结构方面有着显著的差异。RNA种类和结构的多样性决定了RNA具有很多重要的生物学功能。随着对非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）研究的不断深入,ncRNAs同样呈现出前所未有的复杂性和多样性。主要介绍了tRNA、snRNA、scRNA、rRNA、siRNA、miRNA、piRNA和nat-siRNA等两大类持家ncRNA和调控ncRNA的结构和功能,为便于了解生物体内小的非编码RNA的多样性,进一步挖掘和利用ncRNAs提供一定的参考,促使人们对RNA 的认识和地位作出新的思考。

基因组编辑技术研究进展

吴璐,王磊,任远,原辉

2014, 30(11): 84-90.

摘要 ( 351 )

PDF (1448KB) ( 1811 )

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利用基因组编辑技术可以对生物基因组特定位点进行人工修饰,研究相关基因的功能,进而应用于基础研究和临床治疗方面。序列特异性的DNA结合结构域与非特异性的DNA修饰结构域组合而成的人工酶是基因组编辑工具的重要组成部分。主要介绍了锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）、归巢核酸内切酶（Meganucleases）和成簇间隔短回文重复（CRISPR）4种基因组编辑技术的特点、原理、构建方法及应用,为相关的研究和应用提供参考。

甘蔗健康种苗繁育技术研究进展

梁永检,张小秋,杨柳,杨丽涛,李杨瑞

2014, 30(11): 91-96.

摘要 ( 329 )

PDF (1031KB) ( 1069 )

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甘蔗健康种苗系指通过种茎温汤处理或腋芽茎尖培养等方法脱去甘蔗体内病菌的腋芽试管苗或种茎及其无性繁殖种茎苗,以及在不同隔离条件下逐代繁育并符合标准的原原种、原种和生产用甘蔗种苗。在生产甘蔗健康种苗过程中,利用间歇浸没式生物反应器（TIBs）进行甘蔗健康种苗的快繁,提高了增殖系数,降低了工作量。“甘蔗健康种子”的新技术,大大减少了甘蔗种植的用种量,并有利于机械化操作,降低了甘蔗种植成本。

利用SRAP标记分析海南旱稻地方品种的遗传多样性及其分子身份证的构建

姚宇飞,王英,庄南生,高和琼

2014, 30(11): 97-106.

摘要 ( 288 )

PDF (1766KB) ( 676 )

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利用SRAP标记对来自海南省的28份旱稻种质进行了亲缘关系分析。从255对引物组合中筛选出46对扩增条带清晰、多态性高的引物组合,并选用其中的18对引物组合对28份材料进行SRAP扩增,共扩增出180个条带,其中多态性条带160条,多态性比率为87.75%,平均每对引物组合产生10个条带和8.9个多态性条带。并且,运用UPMGA方法进行的聚类分析结果表明,供试旱稻种质的遗传相似系数范围为0.687 0-0.921 2,在遗传相似系数0.687 0处分为两大类群,第I类群全部为海南山栏稻种质,第Ⅱ类群为海南地方旱稻坡压和本研究组自育旱稻品种。对海南旱稻地方品种的划分表明,山栏稻种质间亲缘关系较近,海南地方旱稻坡压可能与籼型水稻种质具有一定的遗传相似性。此外,还构建了28份海南省旱稻种质的SRAP标记分子身份证,可为山栏稻种质的遗传亲缘关系,种质鉴定及新品种选育等方面提供依据。

OsPHGPx 基因的过量表达增强水稻抗氧化能力

宋建辉,李甜,吴秀云,吴赴清,刘进元

2014, 30(11): 107-113.

摘要 ( 293 )

PDF (2013KB) ( 617 )

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植物在生物或非生物胁迫下会通过表达磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶（PHGPx）来抵御胁迫引起的氧化损伤,但是PHGPx在植物体内抗氧化途径中所扮演的生理角色目前尚不完全清楚。利用农杆菌遗传转化技术,构建了过表达OsPHGPx基因的转基因水稻,并对转基因水稻进行了PCR、实时定量PCR以及Western blot等检测分析,结果表明OsPHGPx基因已成功转入水稻并正常表达。与野生型水稻相比,这些过量表达OsPHGPx的转基因水稻抵御百草枯氧化伤害的能力提高。

普通野生稻miR160f的克隆和功能分析

杨松楠,王姣,陈宗祥,田新杰,张静文,龙艳,裴新梧,袁潜华

2014, 30(11): 114-118.

摘要 ( 358 )

PDF (1780KB) ( 2952 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

MicroRNAs是一类在调节基因转录后表达中起重要作用的非编码RNA。miR160通过调节生长素响应因子（ARF）参与根细胞的分裂和分化,从而影响根的发育。克隆了普通野生稻miR160f基因,并将其转入拟南芥中鉴定功能。结果表明,过表达miR160f的拟南芥莲座叶的数量减少,抽薹时间缩短,开花的时间提前。qPCR检测显示miR160f的靶基因ARF10、ARF16及ARF17在过表达拟南芥植株中的表达下调,而ARF10和ARF16蛋白的缺失或减少会导致根冠细胞分化受阻、分裂失控,并导致根尖干细胞群的异位扩大,因此可以表明miR160不仅影响根的发育,还可能与水稻的开花时间相关。

马铃薯块茎形成相关基因STI-LIKE在拟南芥植株发育中的功能验证

平海涛,王玉萍,王东霞,周晓洁

2014, 30(11): 119-124.

摘要 ( 321 )

PDF (2458KB) ( 629 )

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马铃薯块茎的形成涉及一系列基因的表达和关闭。以马铃薯普通栽培品种“大西洋”为试验材料,采用RT-PCR扩增获得马铃薯STI-LIKE基因全长片段。RT-PCR定量分析表明,该基因在马铃薯营养器官中均有表达。生物信息学分析表明STI-LIKE蛋白具有3个TPR结构域,在高等植物中具有高同源性,是一个普遍存在的蛋白质。为验证STI-LIKE蛋白在拟南芥植株发育中功能,分别构建该基因强启动子表达载体（pBI121）和干扰载体（pHANNIBAL和pART27）,转化拟南芥获得了两种载体的拟南芥转基因植株,同时制备STI-LIKE蛋白抗体验证转基因植株蛋白表达。研究结果表明STI-LIKE基因可能参与拟南芥株型发育过程。

马铃薯AGPase活力反馈调控光合速率定量分析

白桦,崔雪琼,白少星,姚新灵

2014, 30(11): 125-129.

摘要 ( 279 )

PDF (2036KB) ( 488 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

为了揭示ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）改变对叶片光合作用的反馈调控,以改变AGPase活力的马铃薯转化株系为材料,测定了其AGPase活力（AA）、块茎淀粉积累量（SC）、叶片光合速率（PR）、叶绿素（CC）和蔗糖含量（SUC）等；测定结果分析显示,各株系的AGPase活力（AA）、块茎淀粉积累量（SC）和叶片光合速率（PR）间存在显著差异,且均显著高于对照；株系间AGPase活力、块茎淀粉含量和叶片光合速率呈显著正相关性；每单位AGPase活力上升可贡献贮藏器官淀粉积累增加2.5%,且是影响叶片光合速率的重要因素；结果表明,AGPase不仅是下游淀粉积累的限速酶,而且可向上游反馈调控光合速率。

甘蔗类异黄酮还原酶（IRL）基因的克隆与表达分析

谢晓娜,张小秋,邵敏,朱惠,杨丽涛,李杨瑞

2014, 30(11): 130-137.

摘要 ( 391 )

PDF (2206KB) ( 644 )

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采用 RT-PCR 技术从甘蔗中克隆 SoIRL基因,用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析,利用荧光定量 PCR 技术研究SoIRL基因在甘蔗不同组织和不同胁迫条件下的表达特性。结果表明,克隆获得甘蔗 SoIRL,GenBank 登录号为 KF808324。该 cDNA 全长 1 169 bp,含有 1 个 927 bp 的完整开放阅读框（ORF）,编码 309个氨基酸。系统进化树分析显示,甘蔗 SoIRL 与玉米的 IRL 蛋白亲缘关系较近。qRT-PCR 分析表明 SoIRL 在甘蔗根、茎、叶中均有表达；在RSD病菌及低温（4℃）、聚乙二醇（PEG）、NaCl 和脱落酸（ABA）4种非生物胁迫下均被诱导表达,但表达模式不同。说明该基因可能参与甘蔗应答RSD过程,并可能在非生物胁迫中也发挥了作用。

抗虫转基因银河杨的生长特性和抗虫性

陈虞超,张丽,巩檑,甘晓燕,石磊,宋玉霞

2014, 30(11): 138-141.

摘要 ( 267 )

PDF (1491KB) ( 608 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

以非转基因银河杨（Populus alba×Populus hopeiensis）为对照,对抗虫转基因银河杨抗虫基因Cry3A的稳定性,转基因银河杨的物候期、生长状况和抗虫性进行研究。结果发现,Cry3A基因整合稳定,在根、茎、叶中RNA和蛋白水平均有表达,不同组织中Bt蛋白水平差异显著,茎中Bt蛋白水平最高。抗虫转基因银河杨的物候期、生长状况未发生显著变化,但表现出显著的抗虫性。

绿头鸭IFN-α的可溶性表达及其活性分析

刘澜澜,庄艳娜,于晓红,曾祥伟

2014, 30(11): 142-146.

摘要 ( 293 )

PDF (1612KB) ( 431 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

为了利用原核表达系统研制有生物活性的鸭IFN-α。以pMD18T-MaIFN-α为模板扩增绿头鸭IFN-α成熟肽基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a中,在大肠杆菌BL21中进行变温诱导表达。SDS-PAGE分析表达结果,并用Western blotting进行验证。Ni²⁺树脂柱纯化目的蛋白后,测定其生物活性。结果表明,重组pET-32a（+）-MaIFN-α在大肠杆菌BL21成功表达,主要以可溶性形式存在,Western blotting分析显示目的蛋白具有良好的抗原性。细胞病变抑制法测定重组鸭IFN-α的抗病毒活性约为8×10⁴U/mL；荧光定量PCR方法检测显示表达的重组鸭IFN-α使NDV在DEF上的复制受到了明显的抑制,48 h时间点相对抑制率高达91%。这些都表明表达的重组鸭IFN-α具有良好抗病毒活性。

红罗非鱼MyoD基因克隆及序列分析

郭奕惠,范嗣刚,黄桂菊,朱克诚,喻达辉

2014, 30(11): 147-151.

摘要 ( 330 )

PDF (1504KB) ( 840 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

MyoD基因是MRFs家族中的一员,能调控肌肉细胞活性和增殖,在肌肉形成过程中起正调控作用。采用同源基因克隆和RACE方法获得红罗非鱼MyoD基因的cDNA序列。开放阅读框长903 bp,编码300个氨基酸,其中第1-114个氨基酸为碱性结构（Basic domain）,第109-165个氨基酸为螺旋-环-螺旋结构（Helix-Loop-Helix domain）,第199-213个氨基酸为周期蛋白依赖性蛋白激酶4（CDK4）结合区域,第233-249为Helix III结构,无信号肽序列。MyoD蛋白的二级结构为螺旋-环-螺旋二聚体。基于MyoD构建的鱼类系统进化树显示红罗非鱼,尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼聚为一支。

草鱼PAX7基因的克隆、序列分析及组织表达

甘甜,冷向军,郭婷,胡静,魏静,李小勤

2014, 30(11): 152-158.

摘要 ( 306 )

PDF (1931KB) ( 721 )

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配对盒基因7（Paired box 7 gene,PAX7）在神经嵴发育及原肠胚形成、肌肉自主更新与再生中扮演着重要角色,对细胞更新、分化、凋亡等起着十分重要的调控作用。参照GenBank中斑马鱼、线鳍电鳗和虹鳟等物种PAX7序列的保守区域设计简并引物,进行反转录PCR扩增,获得草鱼PAX7基因的部分序列,长645 bp,编码214个氨基酸,包含编码128个氨基酸的PAX7蛋白配对框（PD）。氨基酸序列比对结果发现,草鱼PAX7基因与其他物种具有高度的相似性,与斑马鱼、线鳍电鳗、日本青鳉、金头鲷、虹鳟、大西洋鲑、北极嘉鱼、人、野牦牛、褐家鼠和小鼠的PAX7氨基酸序列同源性可达90%-97%；各物种PAX7部分氨基酸序列的系统进化树结果显示,草鱼与斑马鱼、日本青鳉、北极嘉鱼、大西洋鲑、虹鳟、线鳍电鳗和金头鲷聚为一大支,小鼠、褐家鼠,野牦牛与人类另聚一支,所得结果符合物种传统分类进化地位。运用实时荧光定量PCR检测草鱼PAX7基因在各组织中的差异表达,结果显示PAX7基因在肌肉中表达量最高；其次是前肠和皮肤,在心、脑、肾和肝中仅少量表达,所得结果与该基因的功能相一致。

日本囊对虾Cathepsin B基因在不同卵巢发育时期的表达

程成,林鹏

2014, 30(11): 159-163.

摘要 ( 304 )

PDF (1645KB) ( 535 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

采用实时定量PCR技术,以18S rRNA为内标基因,检测日本囊对虾Cathepsin B基因在mRNA水平不同卵巢发育时期的表达。结果显示,Cathepsin B在卵黄合成前期表达最高,内源性卵黄合成期和外源性卵黄合成期表达水平基本一致,而在成熟期表达水平急剧下降。其中卵黄合成前期与其它3期相比具有显著性差异（P<0.05）,内源性卵黄合成期和外源性卵黄合成期Cathepsin B不具有显著性差异（P>0.05）,而成熟期与前边三期相比具有显著性差异（P<0.05）。推测Cathepsin B可能在日本囊对虾卵巢发育中发挥了作用。

海水小球藻磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（Chpepc2）克隆和生物信息学分析

黄希文,施定基,贾晓会,田琪琳,贾睿,何培民

2014, 30(11): 164-173.

摘要 ( 349 )

PDF (2378KB) ( 758 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

为了进一步了解藻类PEPC酶的特征,对海水小球藻pepc2基因进行了克隆并通过生物信息学方法分析了海水小球藻PEPCase2的结构和功能特征。结果表明,海水小球藻pepc2基因与莱茵衣藻pepc2基因相似度为90%,且其对应的氨基酸序列的特征与莱茵衣藻PEPCase2特征相同,可见该基因编码的是海水小球藻细菌型PEPC酶。海水小球藻PEPCase2二级结构主要包括α螺旋、β转角、无规则卷曲和伸展链,其三级结构外部为α螺旋结构,中心为平行β桶结构。海水小球藻PEPCase2具有多种重要的生理功能,主要与多种重要的物质合成有关。

重组大肠杆菌表达水稻白叶枯病菌FtsZ蛋白

陈洋,黄运红,李素珍,龙中儿

2014, 30(11): 174-178.

摘要 ( 351 )

PDF (2103KB) ( 519 )

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旨在通过现代分子生物学技术制备水稻白叶枯病菌FtsZ蛋白。以水稻白叶枯病菌总DNA为模板,采用巢式PCR方法扩增获得水稻白叶枯病菌ftsZ基因,构建ftsZ基因的表达载体pET-22b-ftsZ,转化表达宿主E. coli BL21后,经PCR、Nde I/Xho I双酶切及测序鉴定、阳性克隆子经IPTG诱导表达,融合蛋白经镍柱纯化后,通过SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定。结果显示,水稻白叶枯病菌ftsZ基因的重组表达载体构建成功,且阳性克隆子在IPTG的诱导下表达了FtsZ-6×His融合蛋白,并通过镍柱纯化获得了电泳纯的FtsZ-6×His融合蛋白。

戊糖乳杆菌发酵产乳酸及高产菌株诱变选育

王义强,王启业,马国辉,林丽云

2014, 30(11): 179-186.

摘要 ( 314 )

PDF (2135KB) ( 778 )

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戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）是能利用木质纤维素水解液发酵产乳酸的潜力菌株,发酵条件优化与高产菌株的选育是提高乳酸产量的重要手段。通过单因素试验、Plackett-Burman设计与响应面试验,对戊糖乳杆菌ATCC 8041产乳酸的发酵培养基及发酵条件进行了优化。结果表明,该菌株发酵培养基的最佳组合为葡萄糖93.11 g/L、酵母浸粉5.19 g/L、碳酸钙29.43 g/L、蛋白胨10.00 g/L、Na₂HPO₄?12H₂O 5.00 g/L、MgSO₄0.20 g/L、MnSO₄50 mg/L；最佳发酵条件为37℃、pH6.5、接种量6%、装液量80%。在此优化条件下,该菌株发酵产乳酸为54.12 g/L。进一步以戊糖乳杆菌ATCC 8041为出发菌株,通过原生质体进行紫外诱变,经多重筛选,最终获得一株遗传稳定性好的高产乳酸突变株,命名为戊糖乳杆菌Lactic UVC-02,由中国典型培养物保藏中心保存,注册号为CCTCC M 2013209。该突变株Lactic UVC-02经葡萄糖发酵,乳酸产量达64.17 g/L,比出发菌株ATCC 8041（54.12 g/L）提高18.6%。

一株产纤维素酶细菌的分离鉴定及酶学特性研究

贾博涵,周伟,赵罗迪,杨埔,苟敏

2014, 30(11): 187-192.

摘要 ( 293 )

PDF (1626KB) ( 652 )

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从采集的含腐烂树叶的土壤中,筛选到1株产纤维素酶能力较高的菌株JJ-3,经16S rRNA基因序列分析,鉴定该菌株为产酸克雷伯氏杆菌（Klebsiella oxytoca）。产酶条件及酶学特性研究表明：以滤纸为碳源、蛋白胨为氮源、初始pH为8.0的培养基中发酵3 d更利于纤维素酶的合成；菌株发酵液在中性和碱性条件下均有较高的滤纸酶活力,分别可达118.7 U/mL（pH7.0）,167.8 U/mL（pH8.0）和120 U/mL（pH9.0）；所产纤维素酶的最适酶反应pH为7.0,最适酶反应温度为40℃,对温度比较敏感,在pH7.0-8.0的范围内具有较好的稳定性,能满足中性和碱性纤维素酶的要求。

人组蛋白α-氨基乙酰基转移酶Nat11表达纯化、晶体生长及底物结合研究

黄嘉欣,李海涛

2014, 30(11): 193-200.

摘要 ( 351 )

PDF (1695KB) ( 752 )

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α-氨基乙酰基转移酶11（Nat11）催化组蛋白H4和H2A氨基端乙酰化修饰,发挥着重要的表观遗传调控功能。将人Nat11基因构建到原核表达载体pSUMO中,转化入大肠杆菌BL21（DE3）进行重组表达。通过镍柱亲和层析等一系列体外纯化步骤,获得高纯度Nat11。利用等温滴定量热法（ITC）,测得Nat11与底物多肽微摩尔量级结合常数。利用质谱技术,发现纯化后的Nat11结合有大肠杆菌内源产生的乙酰辅酶A或辅酶A,在ITC滴定过程中可以产生对多肽底物的乙酰化修饰,表明纯化获得的Nat11在溶液中具有酶活力。随后,对Nat11进行晶体生长研究,通过初筛优化获得蛋白截短体及底物-酶融合蛋白单晶。

细胞衰老相关基因MTMR2功能初探及相互作用蛋白的鉴定

李超群,陈亚丽,肖冬光,裴华东

2014, 30(11): 201-205.

摘要 ( 310 )

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过氧化氢（H₂O₂）诱导的细胞衰老在肿瘤形成中有重要作用,为进一步研究其内在机制,通过全基因组shRNA文库筛选出与之相关的MTMR2（Myotubularin-related protein 2）基因,并通过β-半乳糖苷酶染色试验证实其在H₂O₂诱导的细胞衰老中发挥重要作用。通过克隆质粒、表达纯化并结合质谱分析,发现了MTMR2的一个可能的重要相互作用蛋白14-3-3,并通过生化方法对两者的相互作用进行确认。

人LL-37与干扰素α2a密码子的优化及其在毕赤酵母中的融合表达

张明杰

2014, 30(11): 206-213.

摘要 ( 316 )

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通过密码子优化,在毕赤酵母中高效表达人LL-37与IFN-α2a融合蛋白。先按P. pastoris密码子偏好性对LL-37与IFN-α2a的原始密码子进行了改造,并在二者之间加上GlyGlyGlyGlySer的柔性连接接头,人工合成设计的新序列,最后通过pPIC9K载体将其整合入P. pastoris GS115的基因组,构建出重组菌株GS115LI。利用遗传霉素浓度梯度筛选出两株高拷贝的GS115LI1和GS115LI2菌株。对这两株菌经发酵诱导后的发酵液进行SDS-PAGE检测、抗病毒活性检测和抗菌活性检测,证明重组株既能够成功表达出LL-37与IFN-α2a的融合蛋白,而且该融合蛋白成功保留了抗菌肽与干扰素的功能活性。诱导发酵后,融合蛋白的产量可达到819.1 mg/L,经盐析、疏水层析和离子交换层析分离,可得到纯度达97%的融合蛋白产物,回收率可达到46.2%,纯化后产品的效价可达2.6×10⁸ IU/mg。经过密码子优化后,成功实现在毕赤酵母中高效表达出既有LL-37抗菌活性又具有干扰素α2a活性的融合蛋白。

重组酵母产人IFN-α2a与LL-37融合蛋白的工艺优化

张明杰

2014, 30(11): 214-218.

摘要 ( 314 )

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通过单因素试验探索重组酵母P. pastoris GS115LI产人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的最佳条件。结果显示,重组酵母菌产蛋白酶的最佳表达条件是利用BMMY为诱导培养基,以接种量OD₆₀₀=5.5、温度26℃、pH6.0、诱导剂（甲醇）为每隔24 h添加1.0%、振荡速度为200 r/min条件下连续诱导144 h。在最佳培养条件下,发酵液中的LL-37最高抗菌活性达27.9 mm。与初始的发酵条件相比,人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的产量提高了32.29%。

人D-二聚体的制备及其冻干性质的分析

武建伟,才蕾,王继华,唐时幸

2014, 30(11): 219-224.

摘要 ( 361 )

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以人源纤维蛋白原为原材料制备D-二聚体,将其制成冻干品并分析其冻干性质。使用凝血酶、Factor XIIIa酶解纤维蛋白原,获得交联纤维蛋白。经纤溶酶降解交联纤维蛋白,生成纤维蛋白降解产物。超滤除去纤维蛋白降解产物中的小分子物质,可获得较高纯度的D-二聚体。通过筛选和优化冻干方案,将D-二聚体制备成冻干品。经检测可知,D-二聚体冻干品可在37℃稳定保存12 d；复溶后在25℃稳定保存8 d；复溶后在4℃稳定保存30 d；复溶时,常用复溶溶剂对其复溶后的活性检测无明显影响。

自诱导系统在酶促合成2’-脱氧胞苷中的应用

王玺,段胜林,熊舒莉,郑桂兰,张贵友,王洪钟

2014, 30(11): 225-232.

摘要 ( 359 )

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旨在高效合成2’-脱氧胞苷（dCyd）。DCyd作为一类重要的药物中间体,能够用于合成吉西他滨（dFdC）、扎西他滨（ddC）等多种抗病毒或抗肿瘤的药物。采用ZYM-Fe-5052自诱导培养基对含有N-脱氧核糖转移酶II（NDT）的大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导,所得完整菌体直接用于催化合成dCyd。结果表明,自诱导系统不仅无需额外添加诱导剂,还能够达到较高的菌体密度,且与LB诱导系统所得菌体在合成dCyd方面具有同样高效的催化活性。2’-脱氧胸苷（dThd）和胞嘧啶的浓度比为1∶3时,产物转化率可高达86.5%。合成dCyd的最适反应条件为：2’-脱氧胸苷（dThd）和胞嘧啶的浓度比为1∶1.5,pH6.5的磷酸缓冲液,1 mg/mL的菌体量,终体系10 mL,30℃条件下反应1 h,产物转化率可达71.9%。此方法还可用于制备其他核苷类似物,具有广泛的适用性和应用前景。

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