生物技术通报

生物防治棉花黄萎病的研究进展

梁宏, 黄静, 赵佳, 陈哲, 王长彪

2015, 31(5): 1-6. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.001

摘要 ( 484 )

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随着人们环境保护意识的增强，棉花黄萎病的生物防治成为目前研究的重要方向。评述了已取得的研究进展，包括生防菌类型、生防菌抗菌物质与拮抗基因的研究进展及微生态有机肥防治棉花黄萎病的应用，并指出了棉花黄萎病生物防治的发展趋势，为今后棉花黄萎病的生物防治提供借鉴。

植物WUSCHEL-related homeobox（WOX）家族研究进展

高丽, 孙祎敏, 邵铁梅, 孔卫娜, 崔润丽, 卢楠, 仵陶

2015, 31(5): 7-12. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.002

摘要 ( 490 )

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WUSCHEL相关的同源异型盒（WUSCHEL-related homeobox，WOX）转录因子家族，在植物发育的众多阶段（茎和根顶端分生区的建成、侧生器官的发育、花器官的形成和胚的发育），尤其是在细胞增殖和分化较为旺盛的区域发挥重要的调控作用，即促进细胞的增殖或抑制细胞的分化。就WOX同源异型盒转录因子家族的系统进化分析、WOX家族成员的分子特征、WOX基因的生物学功能及其作用机制进行综述，并对本领域未来的发展方向作出展望。

抗生素发酵废菌渣的无害化及资源再利用研究进展

陈立文, 方森海, 王明兹

2015, 31(5): 13-19. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.003

摘要 ( 563 )

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抗生素发酵每年产生大量有毒菌渣，处理不当将导致环境和健康问题。概述近来抗生素菌渣无害化处理及重新用作发酵培养基氮源，生产能源、饲料、可降解生物薄膜、石膏缓凝剂等资源化利用研究进展，提高抗生素危废菌渣的无害化处理及资源化利用效率。

纤维素酶降解秸秆特性及其基因工程研究进展

张森翔, 尹小燕, 龚志伟, 杨忠华, 侯亚利, 周卫

2015, 31(5): 20-26. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.004

摘要 ( 425 )

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能源短缺和环境污染问题是人们关注的焦点。秸秆类生物质以其资源丰富、无污染及可再生等特性使其在解决能源危机方面具有极大应用前景。对秸秆类生物质通过纤维素酶的水解转化为可发酵性的糖，再结合发酵技术可进一步生产乙醇、氢气等能源物质，是一条成熟的能源化技术路线。其关键是秸秆生物质的预处理与高效的糖苷水解酶获得。将从对秸秆类生物质的预处理、纤维素酶的作用机理研究和纤维素酶基因工程3个方面对当前的研究进展进行综述与分析。这对于促进秸秆类生物质能源化应用具有指导意义。

MicroRNA与NF-κB调控的细胞凋亡

齐仁立, 黄金秀, 龙定彪, 黄萍

2015, 31(5): 27-31. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.005

摘要 ( 381 )

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NF-κB是一种非常重要的核转录调控因子，激活后的NF-κB通过调节靶基因的转录表达参与细胞的各项生命活动，特别是炎症、免疫和凋亡。NF-κB在不同类型的细胞凋亡中可能发挥不同的调控作用。而microRNA这类非编码的RNA对于NF-κB的表达和功能又能够产生系统性或者特异性的调节。综述分析NF-κB对细胞凋亡的调控作用，并探讨microRNA在此过程中的作用。

利用元基因组学方法从瘤胃中筛选的功能酶及酶基因研究进展

张俊, 赵圣国, 王加启, 金迪, 卜登攀,

2015, 31(5): 32-40. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.006

摘要 ( 425 )

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瘤胃微生物群落是一个复杂、庞大的生物体系，其生物多样性极为丰富，蕴藏着巨大的基因和生态资源，是酶制剂开发的重要宝库。元基因组学方法避免了微生物培养条件的限制，通过直接对未培养微生物进行DNA提取、基因筛选与表达，从而不断扩大自然界中的基因数据库，为新型生物催化剂的开发及筛选提供了可能。对元基因组学技术及利用此技术从瘤胃中筛选的功能酶类及酶基因的研究进展进行了综述。

转基因植物中标记基因去除方法的研究进展

郎遥玲, 管晓燕, 白国辉, 刘建国

2015, 31(5): 41-47. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.007

摘要 ( 398 )

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随着越来越多的转基因植物品种的出现，转基因植物的环境安全及食用安全越来越受到人们的广泛关注。目前存在的问题之一是转基因植物中抗生素或除草剂抗性的选择标记基因的存留。为了提高转基因植物的安全性，将转基因植物中选择性标记基因去除，不仅利于同一转基因植物的多次操作，而且更容易被人们所接受。就目前转基因植物中选择性标记基因去除的方法及其优缺点进行了横纵向的比较，希望对相关研究领域方法的选择方向具有指导意义。

低温污水生物处理技术研究现状与展望

王硕, 时文歆, 王燕, 于水利, 李激

2015, 31(5): 48-53. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.008

摘要 ( 453 )

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我国绝大多数地区冬季污水处理能力降低，处理成本增加，进而影响周边环境，危害人类健康。总结了近年来国内外学者对低温污水生物处理技术的研究成果，以不同形态污泥（絮状污泥、厌氧颗粒污泥和好氧颗粒污泥）为出发点展开分析，通过对不同形态污泥的优缺点的对比，展望了低温污水生物处理技术的发展前景。

利用基因组改组技术选育阿维拉霉素高产菌

毛灵琪, 李存治, 陶兴无, 闫达中

2015, 31(5): 54-60. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.009

摘要 ( 447 )

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为选育阿维拉霉素高产菌株，对野生型绿色产色链霉菌（Streptomyces viridochromogenes）Tü57进行传统物理和化学诱变，并获得一系列以阿维拉霉素A的含量为指标的正向突变体，再采用基因组改组技术将不同的正向突变体进行融合杂交，获得融合子。在筛选融合子的过程中，采用传统薄层色谱（TLC）和管碟法（二剂量法）结合进行初筛、高效液相色谱法进行复筛的筛选策略。经过基因组改组，筛选得到一株高产菌株R708，其在摇瓶实验中阿维拉霉素A产量达到0.208 g/L，比野生菌株提高了20倍。基因组改组选育阿维拉霉素高产菌，能提高子代菌株的遗传多样性，比传统诱变选育更快速有效。

基于GC-MS的阿维链霉菌代谢物组学研究方法的建立

郭刚, 唐丹, 田萍萍, 石秀峰, 曹鹏, 高强

2015, 31(5): 61-67. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.010

摘要 ( 400 )

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基于GC-MS分析平台，建立了阿维链霉菌代谢物组样品制备过程中的菌体分离、细胞清洗、细胞淬灭及代谢物提取条件，并对阿维菌素高产菌株和野生菌株胞内代谢物组进行了初步分析。采用"冷冻离心-细胞清洗（3次）-液氮淬灭（5 min）-珠磨破壁（3个循环，每个循环48 s）-提取（氯仿:乙醇:水= 2:2:1）的方法，可以定性和定量检测阿维链霉菌胞内包括氨基酸、有机酸、脂肪酸、糖类等59种差异化合物。建立的方法能够有效地用于阿维链霉菌胞内代谢物的分析。

一种从非变性聚丙烯凝胶中回收小片段DNA的方法

向小华, 焦禹顺, 吴新儒, 程亚增, 侯烁, 刘贯山, 王元英

2015, 31(5): 68-72. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.011

摘要 ( 383 )

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利用高分辨率的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离、纯化特异性小片段DNA的首选方法，也是开展后续多种分子生物学试验的前提。本试验比较了改良煮沸法（液氮研磨+煮沸+低温浓缩）、煮沸法及直取法回收小片段DNA，以回收样品模板进行第二次PCR扩增，结果表明：改良方法回收的DNA 的纯度高，特异性好，回收率与经典煮沸法相当。在保证回收产物的特异性时，用低温浓缩法替代乙醇/醋酸钠共沉淀也具有可行性及一定的创新性。

适于双向电泳分析的酵母胞外蛋白提取方法

杜维, 朴永哲, 黄玮, 谷月, 赵长新

2015, 31(5): 73-77. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.012

摘要 ( 420 )

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采用了无蛋白酵母培养基培养FFC2144酵母细胞，用硫铵沉淀法、超滤法、冻干酚提等方法提取酵母胞外蛋白，计算3种方法的提取率并分别用双向电泳的方法对提取到的蛋白样品进行分离，同时运用质谱鉴定分离后蛋白。其中冻干-平衡酚法提取后得到114个蛋白点，提取率为73.67%，图谱识别的蛋白点最多图谱最清晰，是研究分泌类蛋白质组学理想的分离方法。

甲型H1N1流感病毒FAST-LAMP检测方法的建立

吕沁风, 罗鹏, 何蕾, 杨永耀, 郑伟, 李莉, 吴忠华,

2015, 31(5): 78-83. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.013

摘要 ( 381 )

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建立一种新型等温扩增检测方法，用于提高等温扩增反应的检测速度，应用于甲型H1N1流感病毒检测。根据HA基因设计一组引物，包括外引物、内引物、环引物及套内引物，套内引物的加入增加了引物与模板的接触位点，提高扩增效率，缩短检测时间。结果显示，FAST-LAMP检测法比普通LAMP检测法时间缩短45 min左右，比加入环引物的LAMP检测方法缩短20 min，大大缩短了反应的检测时间。检测灵敏度可达到1×10² 拷贝。FAST-LAMP是一种高效、更快的检测方法。

基于RNA-seq技术的楮头红转录组分析

金红, 焦根林, 陈刚

2015, 31(5): 84-92. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.014

摘要 ( 366 )

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利用RNA-seq技术对所构建的楮头红叶片的转录组进行测定，对原始reads进行过滤和组装，得到了51 305条质量较高的Unigenes，平均长度为921 nt，N50为1 490 nt。利用BLAST和BLAST2GO 软件对这些从头组装的Unigenes进行注释。用NCBI蛋白质数据库（Nr）、非冗余核苷酸数据库（Nt）、基因本体论（GO）、直系同源基因簇（COG）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库做参考，共注释了40 532条Unigenes。注释到Nr、Nt、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO库中的比例相对较高，分别为77.53%、56.18%、53.14%、46.58%、29.69%和60.72%。在蛋白质数据库中对所有的Unigenes进行blast以后，发现有39 302个CDS，用ESTscan预测了2 065个CDS。KEGG通路分析显示，参与次生代谢物生物合成的Unigenes有2 323条，占全部Unigenes的9.72%。其中有78条Unigenes编码了细胞色素P450家族蛋白，这些信息为药用植物次生代谢物生物合成关键基因的挖掘提供了理论参考。

高粱SbGABA-Ts基因的克隆、原核表达及纯化

杨泽伟, 王龙海, 朱莉, 汪海, 黄大昉, 郎志宏

2015, 31(5): 93-99. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.015

摘要 ( 370 )

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植物中GABA（γ-氨基丁酸）代谢与植物生长发育、信号传递及逆境响应等过程密切相关，而参与GABA代谢的关键酶GABA-T（γ-氨基丁酸转氨酶）在重要农艺作物中的研究相对滞后。利用同源性分析在高粱基因组数据库中获得两个γ-氨基丁酸转氨酶（SbGABA-T）基因，RT-PCR方法进行基因克隆，并连入原核表达载体pET28a（+），转化E. coli BL21（DE3）进行基因异源表达分析。结果表明，包含SbGABA-T编码区全长的融合蛋白主要在包涵体中表达，而去除了SbGABA-T N端信号肽的融合蛋白以部分可溶的形式存在。进一步优化表达条件，IPTG浓度为1 mmol/L时，16℃低温诱导18 h，即可获得大量可溶性融合蛋白。用带His标签的镍柱对融合蛋白进行了纯化。

沙冬青AmHsa32基因超表达提高转基因烟草抗热性

贺茜, 王艳萍, 陈玉珍, 卢存福

2015, 31(5): 100-105. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.016

摘要 ( 371 )

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Hsa32是一类新型的热激蛋白，主要发现于陆地植物中，对植物抗逆性的获得起关键作用。AmHsa32是Hsa32的同源蛋白之一，是从沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）克隆得到的耐热性相关基因。成功构建了Pcambia2300-35S-AmHsa32-OCS植物表达载体，经农杆菌介导转入到本生烟中。经PCR和Western boltting检测证明AmHsa32已经被转入到本生烟基因组中。对转基因和野生型本生烟在高温胁迫下种子的萌发率、幼苗生长耐热性进行检测发现，转基因植物的抗热得到了明显提高。研究结果表明，AmHsa32可作为植物耐热基因育种的重要基因资源。

沙冬青脯氨酸转运体基因的克隆及表达分析

岳光振, 金曼, 李俊林, 杨顺瑛, 郭满园, 苏彦华

2015, 31(5): 106-112. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.017

摘要 ( 346 )

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通过RACE技术从沙冬青中克隆获得了脯氨酸转运体基因AmProT（GenBank登录号为KJ873133）。序列分析表明，AmProT基因开放阅读框为1 329 bp，编码442个氨基酸，预测蛋白质分子量为48.07 kD，等电点为9.32，含有11个跨膜区域，具有典型的脯氨酸转运蛋白的特征。进化分析显示，AmProT与大豆ProT的相似性达到86%。荧光定量PCR分析表明，AmProT在地上部的表达量要显著高于地下部，在受到干旱、高盐、脱落酸胁迫后表达量呈上调趋势，推测AmProT可能在沙冬青响应干旱、盐等非生物胁迫过程中发挥作用。

烟草胞质6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的克隆及表达分析

林世锋, 付强, 余婧, 赵杰宏, 任学良, 王仁刚

2015, 31(5): 113-119. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.018

摘要 ( 388 )

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采用电子克隆的方法，结合RT-PCR和SMART RACE技术，首次从烟草（Nicotiana tabacum）中克隆到1个胞质6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGDH）基因的cDNA序列，命名为Nt6PGDH（GenBank登录号：KM211534）。该基因cDNA全长1 932 bp，开放阅读框1 455 bp，编码484个氨基酸，与番茄（Solanum lycopersicum）和马铃薯（Solanum tuberosum）的6PGDH氨基酸序列一致性最高，为95%。生物信息学分析表明，Nt6PGDH氨基酸序列不存在信号肽和转运肽，无跨膜结构域，定位于细胞质。对烟草不同发育时期Nt6PGDH基因的表达情况分析发现，Nt6PGDH基因在烟草旺长期根、茎、叶中的表达量均高于苗期，并且在同一发育时期，烟草根中表达量最强，茎次之，叶片最弱。

香樟Actin基因的克隆及表达分析

李勇鹏, 张力维, 姚瑶, 黄蕊, 杜丽

2015, 31(5): 120-127. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.019

摘要 ( 374 )

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Actin作为一个看家基因，经常在实时定量PCR中被用作内参对不同样品中的mRNA进行定量，因此在基因表达分析中扮演重要的角色。利用同源克隆的方法，根据GenBank中已经公布的其他植物的Actin基因的保守序列设计简并引物，采用RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）技术从香樟中获得了4个cDNA片段。分子生物学分析软件分析结果显示，4个片段大小为均为998 bp，编码332个氨基酸；同源性分析表明，所获得的片段属于Actin亚家族，分别命名为CcACTa、CcACTb、CcACTc 和CcACTd并提交GenBank（登录号：KM086736、KM086737、KM086738和KM086739）。实时定量PCR结果显示，CcACTc在根、茎、叶及低温处理的叶片中表达量相对稳定，可以作为候选内参基因。

FX-139发酵液及菌丝体提取物对人参愈伤组织生长及防御酶系的影响

郭双双, 史册, 韩梅, 杨利民

2015, 31(5): 128-133. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.020

摘要 ( 388 )

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以人参栽培土壤中分离纯化的生防菌株放线菌FX-139的发酵液和菌丝体提取物为供体，研究了其对人参愈伤组织生长的影响，及诱导受体防御酶的能力。结果表明：（1）FX-139发酵液和菌丝体提取物浓度为20 mg/L的处理条件对人参愈伤组织生长促进作用最强，比对照增加了68.96%、51.60%，差异显著。（2）发酵液水饱和正丁醇提取物处理下PAL、POD、PPO酶活峰值分别出现在第21天、第14天、第28天，比CK依次提高了1.29倍、2.5倍、2.12倍。菌丝体丙酮提取物处理下PAL、POD、PPO酶活峰值分别出现在第21天、第14天、第14天，比CK依次提高了1.9倍、2.6倍、1.4倍。（3）通过对人参愈伤组织防御酶活性研究表明，发酵液和菌丝体提取物处理下PAL、POD、PPO酶活性均有明显变化。总体来说，放线菌FX-139发酵液和菌丝体提取物可以诱导人参愈伤组织防御反应的表达，发酵液提取物对POD、PPO有良好的诱导作用，菌丝体提取物对PAL、POD和PPO均有较好的诱导效果。

小花棘豆Embellisia内生真菌原生质体的制备与再生研究

呼吉雅, 卢萍, 牛艳芳

2015, 31(5): 134-139. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.021

摘要 ( 394 )

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旨在获得数目多且活力高的小花棘豆Embellisia内生真菌的原生质体，分析和探讨该内生真菌原生质体制备与再生的最佳条件，为后续外源基因转化奠定基础。利用酶解法对制备小花棘豆Embellisia内生真菌菌丝的原生质体，研究酶解液成分、pH、温度、渗透压稳定剂、酶解时间及菌龄对原生质体制备和再生的影响；原生质体在TB3培养基上再生后，研究酶解时间对原生质体再生的影响。结果显示，2.5%（W/V）lysing enzymes、2%（W/V）纤维素酶和3%（W/V）蜗牛酶3种混合酶处理，菌龄为10 d，当酶解温度为30℃、pH5.8、1.2 mol/L MgSO₄为渗透压稳定剂，在80 r/min水平摇床酶解8 h时，原生质体浓度较高，达4.42×10⁵个/mL；酶解时间6 h时再生率最高，达46.7%。

农杆菌介导的蓖麻转化体系优化

李伟, 翟羽佳, 李鹏程, 王昌禄

2015, 31(5): 140-145. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.022

摘要 ( 373 )

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针对影响农杆菌侵染效率的主要因素进行条件优化，确立了以OD₆₀₀为0.8的菌液侵染、预培养5 d后的外植体为最佳侵染条件；侵染外植体经过5 d的共培养并除菌后，转到含有250 mg/L Kan的培养基中进行再生诱导，获得了多株具有Kan抗性的再生植株；通过在共培培养基中添加20 mg/L AS，124 mg/L Na₂S₂O₃和152.4 mg/L DTT，有效地抑制了侵染后外植体的褐化现象，提高了筛选阶段抗性芽的成活率；对具有Kan抗性的再生植株进行PCR和Southern blot验证，共获得18株包含外源基因的阳性转化株。

纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及发酵产酶条件优化

李争明, 张娟, 邓中洋, 卢凡, 秦文胜

2015, 31(5): 146-152. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.023

摘要 ( 403 )

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以腐烂木材、腐殖土等材料作为菌源，从中分离出180个菌株，以期得到具有纤维素酶活性的菌株。采用革兰氏碘液染色法进行定性初筛，获得了44个纤维素酶产生菌株。将此44个菌株发酵培养后，使用滤纸酶活性测定法进行定量复筛，滤纸酶活性最高的是菌株J1-3-1。通过对J1-3-1菌株的16S rRNA 的序列测定分析，将J1-3-1鉴定为鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.）。经对J1-3-1进行产酶发酵条件优化，分别确立了产生最高滤纸酶（FPase）活性、内切葡聚糖酶（CMCase）活性和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）活性的发酵条件。在最优发酵产酶条件下，菌株J1-3-1的滤纸酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的最高酶活性分别为8.76、28.04和7.02 U/mL。

杆菌肽产生菌的分离鉴定及其发酵条件初步研究

张玉明, 倪志华, 李宝库

2015, 31(5): 153-157. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.024

摘要 ( 440 )

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杆菌肽在畜牧养殖业中应用广泛，开展菌种筛选工作十分必要。以低浓度杆菌肽为筛选方法，分离得到一株杆菌肽产生菌，鉴定并命名为地衣芽孢杆菌Y822（Bacillus licheninformis Y822）。该菌株发酵生产杆菌肽时，最适pH为7.0，溶氧能够促进产物肽积累。将B. licheninformis Y822传代5次，分别进行发酵试验，可得到（783.51±7.34）U/mL杆菌肽，其中A组分占（75.04±0.83）%。B. licheniformis Y822杆菌肽产量较高，生产能力稳定，并且产物中杆菌肽A组分含量高，具有较高的工业应用价值。

Bacillus amyloliquefaciens C1菌株γ-PGA合成基因pgsBCAE的克隆与表达

王世锋, 何剑, 陈怡露, 郑涛, 沈其荣, 雍晓雨

2015, 31(5): 158-166. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.025

摘要 ( 423 )

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γ-PGA是微生物合成的一种新型高分子生物可降解材料，基因工程菌株的构建对于其合成机理及开发生产具有较高的研究价值。利用Self-Formed Adaptor PCR（SEFA-PCR）方法扩增出菌株B. amyloliqueficiens C1的γ-PGA合成酶基因簇pgsBCAE，将其克隆到表达载体pET29a（+）中并转化至表达宿主E.coli BL21（DE3）。结果表明，转化所得的工程菌株在IPTG诱导下通过摇瓶发酵生产0.14 g/L的γ-PGA。Mn²⁺和Zn²⁺能够显著促进重组子E.coli BL21（pET29α-pgsBCAE）发酵合成γ-PGA的产量，并且这种促进作用随着Mn²⁺和Zn²⁺浓度的提高而越加显著。Mg²⁺在低浓度（1 mmol/L）下也促进重组子合成γ-PGA，之后随着Mg²⁺浓度的升高，这种促进作用逐渐减弱，当Mg²⁺浓度达到4 mmol/L时，反而抑制重组子γ-PGA的合成。菌株B. amyloliqueficiens C1基因组内含有完整的γ-PGA合成酶基因簇pgsBCAE，该基因簇能够在表达宿主E. coli BL21中被诱导表达并合成γ-PGA，且其γ-PGA的合成受金属离子的影响。

新型脱氮菌Rhizobium radiobacter的分离鉴定及其硝化特征分析

罗小溪, 高建忠, 陈再忠, 于永亮

2015, 31(5): 167-172. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.026

摘要 ( 415 )

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旨在从污水处理厂中分离和鉴定具有硝化能力的脱氮菌。采用富集培养、平板划线分离菌株，命名为N312，并通过形态观察、16S rDNA基因序列分析及Biolog鉴定，利用正交试验法对该菌株的培养基配方进行优化。结果表明，分离获得具有硝化能力的自养脱氮菌，初步鉴定属于放射型根瘤菌（Rhizobium radiobacter），为革兰氏阴性杆菌，菌落圆形，乳白色，6 d内亚硝酸盐去除率达到100%，通过正交试验初步得到最佳培养基配方为NaNO₂ 1.5 g，Na₂CO₃ 1.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.25 g，FeSO₄·7H₂O 0.2 g，KH₂PO₄ 0.5 g。菌株N312是一株具有研究价值的自养脱氮菌。

蛋白核小球藻Fesod基因的克隆及表达分析

沈佳, 江灵芝, 孙雪

2015, 31(5): 173-178. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.027

摘要 ( 374 )

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利用RACE技术克隆了蛋白核小球藻Fesod全基因序列，得到1 215 bp序列，其5'非翻译区长52 bp，3'非翻译区长452 bp，共编码236个氨基酸。生物信息学分析结果表明，该Fesod基因编码蛋白的分子量为26.42 kD，等电点为6.98；位于线粒体中的概率是73.9%；该蛋白没有信号肽序列；蛋白质二级结构预测结果表明FeSOD中α-螺旋和无规卷曲分别占53.39%和39.41%。再利用实时荧光定量PCR技术检测了不同盐度和水杨酸浓度对蛋白核小球藻Fesod基因表达的影响，结果表明Fesod表达量随着盐度升高而增加，45‰盐度表达量为15‰盐度的3.61倍；而植物激素水杨酸的添加一定程度抑制了45‰盐度培养藻Fesod基因的表达，并且随其浓度增加呈现先升后降的趋势。表明蛋白核小球藻Fesod受盐度诱导，而水杨酸对其影响不明显。

红笛鲷（Lutjanus sanguineus）C型凝集素基因的克隆与组织表达分析

蔡佳, 张雪利, 吴灶和, 简纪常, 鲁义善, 冯东岳, 焦茂兴

2015, 31(5): 179-185. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.028

摘要 ( 379 )

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根据已知的海水鱼类C型凝集素基因的核苷酸保守区序列设计一对简并引物，先后通过RT-PCR 和RACE PCR法从红笛鲷脾脏中首次克隆获得红笛鲷C型凝集素（CTL）基因的cDNA全长（登录号：AGT37609）。该序列长828 bp，开放阅读框663 bp，编码220个氨基酸。氨基酸序列分析显示，红笛鲷CTL基因氨基酸序列与其他物种CTL的相似性在30%-68%之间。系统进化分析表明，红笛鲷C型凝集素与鳉鱼、条石鲷、斜带石斑鱼 CTL蛋白亲缘关系最近，聚成一支。通过荧光定量PCR 分析红笛鲷基因的组织差异表达，红笛鲷CTL基因在肝、脾以及皮肤中表达水平较高，其次是头肾、肾、胃、肠及肌肉，在心脏与脑中表达量较低。

来源于瘤胃厌氧真菌Neocallimastix frontalis木聚糖酶在毕赤酵母中的表达

汪艳, 李晓, 陈勇, 武运

2015, 31(5): 186-193. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.029

摘要 ( 386 )

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厌氧真菌Neocallimastix frontalis是瘤胃中降解木聚糖和纤维素的主要微生物之一，其木聚糖酶具有潜在的应用价值。对来源于Neocallimastix frontalis木聚糖酶基因Xyn11B进行密码子优化；通过全基因合成优化后的木聚糖酶基因Xyn11Bm，构建该基因的酵母表达载体pPIC9K-Xyn11Bm，并在毕赤酵母GS115中诱导表达。摇瓶水平时，重组Xyn11Bm酶活性最高为4 874.8 U/mL。在10 L发酵罐中诱导96 h后，重组Xyn11Bm的酶活性为5 139.7 U/mL，菌体湿重和干重达到216.7 g/L和117.3 g/L。酶学性质分析表明，重组Xyn11Bm的最适反应温度为50℃，最适反应pH为5.0。在pH5.0-8.0时该酶具有较好的稳定性，但温度稳定性较差。底物特异性分析表明，重组Xyn11Bm可水解燕麦木聚糖、桦木木聚糖和可溶性木聚糖4-O-Me-D-glucurono-D-xylan，但不降解地衣多糖和大麦β-葡聚糖。结果表明重组Xyn11Bm具有潜在的应用价值。

牦牛CAV-3基因的克隆及其在牦牛和黄牛组织的表达分析

赵娟花, 裴杰, 梁春年, 郭宪, 吴晓云, 张良斌, 阎萍

2015, 31(5): 194-199. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.030

摘要 ( 347 )

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旨在对牦牛CAV-3基因进行克隆、生物信息学分析，并对其在牦牛组织中的表达规律进行初步研究。根据GenBank数据库中已知的黄牛CAV-3基因的mRNA序列并设计特异性引物，应用RT-PCR技术克隆牦牛CAV-3基因的编码区。运用生物信息学方法，分析并预测牦牛Caveolin-3蛋白的理化性质、疏水性、蛋白结构域以及蛋白质二级结构。通过半定量PCR技术检测CAV-3基因mRNA在牦牛和黄牛各组织中的表达；利用实时荧光定量PCR技术检测牦牛和黄牛肌肉组织中CAV-3基因 mRNA表达水平。牦牛CAV-3的编码区全长631 bp，共编码151个氨基酸。CAV-3在牦牛肺、脾脏、肾脏、肝脏、卵巢组织中均不表达，仅在心脏和肌肉组织中表达，且在心脏组织的表达水平高于肌肉组织，CAV-3基因在黄牛各组织中的表达结果与牦牛一致。CAV-3基因在牦牛肌肉中的表达低于黄牛肌肉组织，但差异不显著（P>0.05）。

家蝇抗真菌肽-溶菌酶基因的克隆、表达及序列分析

彭传林, 魏川川, 吴建伟, 王宇, 修江帆, 尚小丽, 赵学军

2015, 31(5): 200-205. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.031

摘要 ( 377 )

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旨在对家蝇抗真菌肽MAF-1-溶菌酶（LZM）基因进行生物信息学分析，并进行融合基因MAF-1-LMZ的克隆和表达分析。从GenBank获得家蝇抗真菌肽MAF-1和溶菌酶LZM的编码序列，分析和预测这两种蛋白质的结构和功能。PCR扩增融合蛋白质抗真菌肽-溶菌酶的基因 MAF-1-LMZ，将其克隆到原核表达载体pET-28a中，重组质粒pET-28a-MAF-1-LMZ在大肠杆菌OrigmiB/DE3中经用IPTG诱导表达，表达产物MAF-1-LMZ通过SDS-PAGE电泳进行鉴定，采用小试管法倍比稀释法进行活性验证。结果显示，融合蛋白质MAF-1-LMZ序列的ORF为969 bp，编码322个氨基酸残基，理论分子量为35 468.6 Da，等电点为8.31，在大肠杆菌OrigmiB/DE3中得到成功表达。其纯化后的目的蛋白具有抗真菌活性。

乙酸对重组大肠杆菌BL21产酶的影响及作用机理研究

戴琨, 王腾飞, 郝昭程, 汤丹丹, 刘红娟, 王瑞明

2015, 31(5): 206-213. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.032

摘要 ( 447 )

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旨在研究发酵过程中产生的乙酸对重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET15b-TreS的生长以及重组海藻糖合酶基因表达的影响，并对其作用机理进行探讨。通过外源添加乙酸（钠）的方法，研究了乙酸钠对重组菌BL21（DE3）/pET15b-TreS生长曲线的影响；利用环境扫描电子显微镜，观察了重组菌形态的变化情况；通过测定菌液的电导率值变化、菌液上清中OD₂₆₀的变化，研究了乙酸（钠）对菌体细胞膜渗透性、完整性的影响；通过测定菌液上清中β-半乳糖苷酶的活性检测了乙酸钠对菌体细胞内膜的影响；利用荧光分析法检测了乙酸对菌体膜蛋白构象的影响；采用SDS-PAGE电泳研究了乙酸钠对菌体重组海藻糖合酶表达量的影响。结果表明，乙酸（钠）会对重组菌的生长产生一定的抑制作用，可以导致菌体细胞的表面出现凹陷、皱缩；并会影响细胞膜的渗透性、完整性，使得一些细胞内容物发生泄漏；影响细胞膜上的膜蛋白构象，对膜的结构造成一定程度的破坏；对重组海藻糖合酶的表达产生影响。乙酸（钠）对重组菌菌体的生长及重组海藻糖合酶基因的表达有影响，并且菌体细胞膜是其作用的一个靶点。

农药多抗性哈茨木霉的常压室温等离子体诱变

周文臣, 詹晓北, 朱莉, 郑志永, 吴剑荣

2015, 31(5): 214-223. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.033

摘要 ( 389 )

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旨在为提高生防木霉菌对田间除草剂、杀虫剂以及杀菌剂共存的复杂环境的适应性，以生防菌哈茨木霉（Trichoderma harzianum，GIM 3.442）为出发菌株，采用常压室温等离子体的方法对出发菌株进行诱变。结果显示，以杀菌剂代森锰锌和杀虫剂呋虫胺为筛子，选育出对复合农药有良好抗性的诱变菌株。从中挑选双抗性最好的菌株Th-36，以含有杀菌剂代森锰锌、杀虫剂呋虫胺和除草剂乙氧氟草醚的PDA为诱变筛选培养基，再次进行诱变筛选，获得两株具有三抗特性菌株（Th-3-36和Th-4-B）。毒力测试表明，抗性菌株Th-3-36和Th-4-B对代森锰锌、呋虫胺和乙氧氟草醚的EC₅₀分别达到5 089.2 μg a.i.·mL^-1和5 498.2 μg a.i.·mL^-1、758.5 μg a.i.·mL^-1和785.9 μg a.i.·mL^-1、198.2 μg a.i.·mL^-1和200.3 μg a.i.·mL^-1，均高于各农药的市售平均推荐使用浓度。筛选到的突变株对农药抗性明显增强、遗传了亲本的广谱抗菌性并具有良好的遗传稳定性，生长繁殖能力和酶学性质优于亲本菌株。

西藏藏猪遗传多样性研究

郭永博, 蔡原

2015, 31(5): 224-230. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.034

摘要 ( 431 )

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采用mtDNA D-loop作为分子标记，对西藏的4个藏猪群体（林芝、山南、昌都和日喀则）遗传多样性进行了研究。结果表明，西藏藏猪mtDNA D-loop高变区A+T含量（62.90%）明显高于 G+C 含量（37.1%），富含A和T，存在碱基偏倚性。在长度为435 bp的序列中，共检测到20个变异位点，界定了26个单倍型，单倍型多样度（Hd）为0.705±0.021，平均核苷酸差异数（k）为1.231，核苷酸多样度（Pi）为0.002 83。其中，Hd、k和Pi在昌都藏猪群体中最高，日喀则藏猪最低。此外，Hap1和Hap3单倍型是4个群体的共享单倍型，表明4个藏猪群体存在两个共同的母系祖先单倍型。

FUT8基因RNAi慢病毒载体的构建及对MCF-7细胞增殖的影响

温宪春, 韩翠翠, 赵月生, 于海涛, 李成冲, 岳丽玲

2015, 31(5): 231-236. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.035

摘要 ( 372 )

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旨在构建FUT8基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体并观察其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响。针对FUT8基因设计3组短发夹RNA序列，退火合成双链DNA，通过连接线性化的pGC-LV-GFP载体，构建miRNA慢病毒载体质粒，并将其转化至感受态细胞DH5α；测序验证正确后进行FUT8基因慢病毒载体的包装及病毒滴度测定，将获得的重组慢病毒pGC-shFUT8转染MCF-7细胞，利用Real time-PCR、Western blot分别验证转染后MCF-7细胞中FUT8 mRNA及蛋白的表达，MTT法及克隆形成实验检测shFUT8对MCF-7细胞增殖能力的影响。测序证实成功构建针对FUT8基因的RNAi慢病毒载体；慢病毒载体经293T细胞包装成功，测定病毒悬液滴度＞5×10⁸TU/mL；荧光显微镜下观察各转染组细胞GFP的表达，转染效率达90%以上；Real-time PCR、Western blot结果显示干扰组FUT8的mRNA及蛋白表达水平较对照组显著降低，其中pGC-shFUT8-2序列对FUT8基因的干扰效率可达80%，干扰效果最佳，FUT8沉默后MCF-7细胞增殖能力下降。

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