生物技术通报

植物细胞叶绿体的低温反应

李先文, 李玲, 林阳阳, 周棋赢, 李先维, 姚天泽, 陈宏敏

2016, 32(9): 1-6. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.001

摘要 ( 321 )

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低温冷冻是亚热带至寒带地区植物要经受的一种主要环境胁迫,而生活于这些地区的越冬植物经过长期进化已经产生了适应低温环境的策略。近年来人们从生理到分子的多个水平对植物适应低温环境的策略进行了研究,对低温的信号转导、冷诱导基因的类别和功能机制都有了一定的认识。但是,对越冬植物细胞中叶绿体这一重要结构在低温下的生理活动特点和生存策略的认识还不多。搜集整理了近年来的研究文献中对叶绿体的低温损伤、低温信号转导和低温适应策略的资料,以期助力于该领域的研究。

植物谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）研究进展

乔新荣, 张继英

2016, 32(9): 7-13. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.002

摘要 ( 535 )

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逆境胁迫会诱导植物产生过多的活性氧（ROS）,引起氧化胁迫,严重影响其生长发育。相应地,植物为适应诸多不良环境会产生多种抗氧化剂、抗氧化酶等协调氧化还原平衡,其中谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GPX）是植物体内重要的抗氧化酶之一。对近年来植物中GPX的结构、亚细胞定位、酶催化底物特点及作用研究进展进行综述,并对未来可能的研究方向进行展望。

TCP家族基因研究进展

刘丽娟, 高辉

2016, 32(9): 14-22. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.003

摘要 ( 931 )

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TCP 基因编码植物特异性的转录因子,含有一个bHLH motif,能够与DNA结合或者产生蛋白质与蛋白质的互作。TCP基因家族在单子叶植物中有5个成员,在双子叶植物中有超过20个成员。基因的复制和多样化进化出了两类有轻微不同TCP domain 的TCP基因家族。越来越多关于TCP基因功能的研究使得将TCP基因作为工具,调整植物生长模式,产生新的农业学性状成为可能。简要概括这一家族当前的进化、调控、蛋白的生化特性,以及部分成员的生化功能,特别是在控制发育组织的细胞增殖方面。旨在为更好的调节植物的生长模式和调控植物的生理特性的研究提供思路。

长链非编码RAN的研究进展

宋娜娜, 柴志欣, 钟金城

2016, 32(9): 23-31. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.004

摘要 ( 265 )

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人类基因组计划完成证实,人类共有3-3.5万个编码基因,这些基因所涵盖的编码信息仅占人类30亿个碱基对中携带遗传信息的1.5%,其余超过98%的遗传信息并不直接编码蛋白质。近些年来由于测序技术的飞速发展,人们发现这部分遗传信息与调控、剪切、转录等生物过程密切相关,其中长链非编码RNA具有表观遗传学调控、转录调控、疾病调控、细胞分化和个体发育等重要的生命过程的调控等过程,因此如何寻找RAN的功能单元和预测新的长链非编码RNA成为很重要的问题。就非编码RNA的起源与进化进行阐述,综述了长链非编码RNA在癌症上的功能,综合了长链非编码RNA一些常见的数据库及使用最新的生物信息学手段和相关技术预测长链非编码RNA,并进行进一步的功能研究。

二硫键及其连接方式对防御素抗菌功能的影响研究进展

陈惠娴, 毛若雨, 滕达, 王秀敏, 冯兴军, 王建华

2016, 32(9): 32-37. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.005

摘要 ( 362 )

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防御素是一类内源性、高度稳定、富含半胱氨酸的抗菌肽,对抗感染和宿主免疫调控具有重要作用。其序列内一般有6-8个保守半胱氨酸形成3-4对二硫键。二硫键对数和连接方式在维持防御素结构和抗菌功能方面具有重要作用,此外,高活性线型及低二硫键含量突变体在减少生产成本,简化生产流程方面具有重要作用。综述了防御素分子特征、结构和功能,在此基础上报道二硫键氧化还原状态、数量及其连接方式影响防御素抗菌活性的最新研究进展。

氨基酸缺乏诱导细胞自噬及miRNA调控机制

王琪, 齐仁立, 王敬, 黄金秀

2016, 32(9): 38-43. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.006

摘要 ( 321 )

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氨基酸是生物体内不可缺少的营养成分和生命活动最基本的物质之一,并对动物体的新陈代谢起到至关重要的作用。自噬是细胞内通过降解和回收细胞内生物大分子和受损细胞器,以完成本身代谢和某些细胞器更新的过程。研究证实氨基酸缺乏能诱导细胞自噬,而这种反应大部分是依赖于mTORC1信号通路的方式实现的,但总氨基酸或单体氨基酸调节细胞自噬的分子作用机制和自噬水平有很大差别,且相关方面的分子调节机制尚未完全清楚,需要进一步阐明。miRNA是一类长度为18-24 nt的非编码核苷酸,参与细胞增殖、分化、自噬与凋亡等多种生命活动。研究表明miRNA在氨基酸缺乏诱导细胞自噬过程中的也发挥重要调控机制。就不同氨基酸缺乏调控自噬相关机制加以综述,并探讨miRNA在其中起到的关键作用。旨在为治疗自噬相关代谢提供思路。

组蛋白去乙酰化酶（HDACs）及其在植物中的作用

董亚茹, 杜建勋, 陈传杰, 赵东晓, 王照红

2016, 32(9): 44-49. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.007

摘要 ( 606 )

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组蛋白去乙酰化酶（HDACs）是一个在真核生物（包括酵母、哺乳动物和植物）中广泛存在的超基因家族。HDACs与组蛋白乙酰基转移酶（HATs）共同作用来调节组蛋白乙酰化的状态,从而影响染色体的结构和功能,调节基因的转录和细胞的多种功能。目前,人们对植物HDACs的研究逐渐增多,很多HDAC基因在不同植物中得到鉴定和研究。综述了HDACs的分类以及在植物生长发育和胁迫反应中的作用,旨在为进一步研究HDAC在植物中的表观遗传调控机理以及培育抗逆新品种奠定理论基础。

5-羟甲基糠醛的生物催化氧化研究进展

吴树丽, 刘启顺, 谭海东, 张付云, 尹恒

2016, 32(9): 50-58. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.008

摘要 ( 406 )

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5-羟甲基糠醛HMF是重要的生物基平台化合物,将HMF氧化成呋喃类化合物是生物质转化的重要发展方向。生物催化具有选择性高、反应条件温和,环境友好等优势。近年来生物催化氧化HMF广受关注。从HMF生物转化过程的发现、HMF在微生物的代谢过程以及全细胞转化和酶法催化HMF氧化3个方面对该领域的研究进行综述,并对HMF的生物催化氧化过程发展方向进行展望,以期为绿色高效催化5-羟甲基糠醛制备呋喃类大宗化学品奠定理论基础。

基于高通量测序技术分析糖尿病与肠道菌群相关性究进展

刘冬恋, 廖梦玲, 周欢

2016, 32(9): 59-64. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.009

摘要 ( 303 )

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肠道菌群与糖尿病的发生发展密切相关,随着高通量测序技术的发展,越来越多的研究表明,糖尿病状态下,宿主肠道菌群的群落结构发生了变化。综述了国际上利用高通量技术研究的糖尿病状态下肠道菌群的差异的最新进展,同时从食物、药物、益生元和粪便菌群移植等方面阐述肠道菌群对糖尿病的调节机制,旨在为预防和治疗糖尿病提供新的思路。

云生毛茛ISSR-PCR体系优化与引物筛选

石琳, 胡延萍, 王建科, 王钧, 许小宁, 李毅, 王莉

2016, 32(9): 65-71. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.010

摘要 ( 236 )

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旨在建立稳定可靠的云生毛茛ISSR-PCR反应体系。采用正交试验设计方法,对影响云生毛茛ISSR-PCR扩增结果的Mg²⁺、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA五个因素进行优化筛选,对反应程序进行优化,建立适用于云生毛茛的最佳反应体系和扩增程序,并对反应体系和扩增程序进行验证;在此基础上筛选多态性好的ISSR引物,采用梯度法筛选各个引物的最适退火温度。结果表明,云生毛茛20 µL ISSR-PCR的最佳反应体系为：模板DNA 30 ng,Mg²⁺ 1.95 mmol/L,Taq DNA聚合酶0.04 U/µL,dNTP 0.150 mmol/L,引物 0.5 µmol/L;最佳反应程序为：94℃预变性5 min;94℃变性20 s,49.6-60.6℃复性1 min,72℃延伸100 s,38个循环;72℃下延伸6 min。在优化的反应体系和反应程序条件下,从100条ISSR引物中筛选获得16条ISSR扩增引物,并确定了引物各自的最适退火温度。经过不同居群云生毛茛的验证,证明优化后体系扩增条带清晰且重复性好,可用于后续云生毛茛遗传多样性的研究。

茅苍术质膜蛋白的制备及其双向电泳蛋白质组学平台的构建

陈飞, 周彤, 魏宇佳, 杨晶, 戴传超

2016, 32(9): 72-82. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.011

摘要 ( 266 )

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探讨濒危药用植物茅苍术的质膜蛋白质组方法,旨在达到了解其次级代谢物的代谢途径,并对相关药用活性成分进行代谢调控的目的。以茅苍术的根、茎、叶为实验材料,确定了超速离心结合双水相法作为提取、纯化其质膜蛋白的方法;进而对这些质膜蛋白的双向电泳分离条件进行了系统的优化和后期的部分蛋白质鉴定。结果表明,分别采用质量分数为6.4%、6.3%和6.1%的聚合物葡聚糖T-500和聚乙二醇PEG 3350（W/W）的双水相体系对超速离心后的茅苍术根、茎、叶粗膜组分进行处理可获得对应纯度高达92.1%、91.5%和90.8%的质膜蛋白;以2% CHAPS和2% Triton X-100作为组合变性剂裂解膜蛋白,等电聚焦总量为80 000 Vhs,浓度为12.5%-15% 的梯度SDS-PAGE分离胶对100 μg质膜蛋白进行双向电泳,通过Image Master 2D Platinum 7.0分析软件分别在根、茎、叶的质膜蛋白凝胶图谱上识别出了267、297和248个蛋白斑点;进一步比较分析了这3种组织质膜蛋白的异同之处,并选取其中的5个蛋白质利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪成功进行了鉴定。一套完整的同时适用于茅苍术根、茎、叶各个组织的从高纯度质膜蛋白的制备到膜蛋白的质谱鉴定的蛋白质组学技术平台被成功构建。

渤海N油田油藏内源微生物群落结构分析

王大威, 张健, 何春百, 马挺, 吕鑫, 李强

2016, 32(9): 83-92. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.012

摘要 ( 251 )

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利用变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE）技术分析渤海N油田注水和未注水油藏中细菌和古菌群落结构组成及分布特征,试分析注水过程对油藏微生物群落丰度和种群的影响,为开展目标油田本源微生物采油试验提供技术支持。结果显示,注水采油井中细菌丰度和种类明显高于未注水采油井,其中注水采油井中的细菌主要为固氮螺菌属（Azospira sp.）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas sp.）、陶厄氏菌属（Thauera sp.）;注水井古菌的丰度和种类与未注水井也存在一定差异,主要为热自养甲烷热杆菌（Methanothermobacter thermautotrophicus）、甲烷鬃毛菌属（Methanosaeta）、嗜泉古菌（Crenarchaeote）。注水井和未注水井中的细菌、古菌种类分布有限,但丰度较高,主要为提高原油采收率有益的采油菌种,显示该区块具备开展本源微生物微生物采油技术实施的条件。

沙冬青AmCIP基因结构及其内含子生物信息学分析

雷晨, 刘胜利, 于婷乔, 陈玉珍, 卢存福

2016, 32(9): 93-99. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.013

摘要 ( 275 )

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旨在分析沙冬青AmCIP基因DNA序列结构特性及功能。以沙冬青AmCIP基因的cDNA序列设计引物,采用PCR扩增其DNA序列,并利用生物信息学方法分析基因的结构。序列分析表明,沙冬青AmCIP基因DNA序列长1 548 bp,包含2个外显子和1个内含子,GenBank登录号KU744005。在该基因的ORF内存在一个78 bp的内含子序列,同时内含子序列中含有参与厌氧诱导的类增强子元件（GC-motif）和光响应元件（TCCC-motif）,3'-UTR区域含有多个参与光响应、胁迫响应和激素响应等相关的顺式作用元件,而5'-UTR区域只含有赤霉素响应元件（GARE-motif）,这些元件可能对AmCIP基因转录表达起调控作用。此外,该基因具有较高的A+T碱基含量（64.7%）,AmCIP的内含子不具有GT-AG规则的保守序列,即内含子5'碱基是GT,3'碱基是TG,推测AmCIP的mRNA具有独特的剪切机制。

ABA对低温胁迫下小桐子幼苗耐冷性及甜菜碱积累的影响

杨双龙, 邓凤飞, 杜朝昆, 成蕴秀, 龚明

2016, 32(9): 100-106. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.014

摘要 ( 269 )

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旨在探讨外源脱落酸（ABA）对低温胁迫下小桐子幼苗耐冷性及甜菜碱积累的影响。用150 μmol/L ABA处理低温胁迫下的小桐子幼苗,研究其对小桐子幼苗存活率,根系活力,电解质渗漏率,MDA含量,甜菜碱含量及其代谢关键酶BADH活性和JcBADH基因表达水平的影响。结果表明,外源150 μmol/L ABA处理可显著提高低温胁迫下小桐子幼苗的存活率和根系活力,降低电解质渗漏率和MDA含量;ABA也提高了低温胁迫下小桐子幼苗的甜菜碱含量,上调了BADH的活性和JcBADH的表达水平。因此,ABA可提高低温胁迫下小桐子幼苗的耐冷性,并且在ABA诱发的小桐子幼苗耐冷性的提高过程中,甜菜碱发挥着重要作用。

西瓜枯萎病拮抗链霉菌分离鉴定及盆栽抗病试验

任迁琪, 吴洪生, 李季, 陈素云, 徐亚, 姚东良, 赵月陈健李美颖宋星林

2016, 32(9): 107-113. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.015

摘要 ( 280 )

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旨在筛选出能高效抑制西瓜枯萎病病原菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）的天然拮抗菌。采用梯度稀释法分离连作辣椒根际土中的放线菌,纯化后用平板对峙法筛选出有拮抗作用的菌株,采用盆钵育苗基质拌菌法接种,进行盆栽抗病试验,并对拮抗效果最佳的菌株进行鉴定。结果显示,从连作辣椒根际土中,分离筛选出10株对西瓜枯萎病有拮抗作用的放线菌,其中菌株F22、F23、F32的拮抗作用显著。96 h抑菌圈直径分别达到1.70、1.17和1.47 cm。盆栽试验结果表明,拮抗菌株F32对西瓜枯萎病30 d的防治效果最佳,防效率达到66.7%,且抗菌谱性广。根据表型特征、生理生化特性和16S rDNA分子鉴定结果可知,菌株F32为链霉菌属（Streptomyces sp.）,且对西瓜枯萎病有良好的防治作用,是一株具有应用价值的生防菌株。

氟氯氰菊酯降解菌的筛选与降解特性的研究

卫正, 冯为民, 史延华, 任磊, 闫艳春

2016, 32(9): 114-122. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.016

摘要 ( 222 )

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从生产氟氯氰菊酯的农药厂排污口周围的泥土中,筛选分离出一株能高效降解氟氯氰菊酯的细菌YC-WZ5。采用富集培养法筛选菌株,利用其生理生化特征及16S rDNA基因序列分析鉴定菌株种类,利用气相色谱法测定培养液中氟氯氰菊酯浓度,研究菌株在不同条件下的降解能力,并用响应面法优化降解条件。菌株YC-WZ5经鉴定属于中间苍白杆菌（Ochrobactrum intermedium）。菌株YC-WZ5能在5 d内将50 mg/L氟氯氰菊酯完全降解。采用响应面法对菌株降解氟氯氰菊酯的条件进行了优化,得出最佳条件为30.9℃,pH为7.16和接菌量10.9%。菌株YC-WZ5在5 d内对初始浓度为100、200、300和400 mg/L的氟氯氰菊酯的降解率分别为84.5%、54.7%、40%和30.5%;对50 mg/L的氯氰菊酯、功夫菊酯,溴氰菊酯和联苯菊酯的降解率分别为99.83%、91.16%、84.98%和55.76%。菌株YC-WZ5具有高效降解氟氯氰菊酯的能力及良好的环境适应性。

三株假单胞菌低温噬菌体生物学特性比较研究

李明源, 王继莲, 任羽, 季秀玲, 古丽巴哈尔·萨吾提

2016, 32(9): 123-130. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.017

摘要 ( 243 )

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对分离自东帕米尔高原喀拉库勒湖和云南明永冰川的3株假单胞菌（Pseudomonas）低温噬菌体MuztagBP1、MuztagBP2和MYBP2A-15的生物学特征开展研究。以双层平板法培养噬菌体,观察噬菌斑特征,采用透射电镜观察经磷钨酸负染的噬菌体颗粒形态,比较分析了3株噬菌体的增殖温度、热稳定性、pH稳定性、化学试剂敏感性及一步生长曲线等特性。结果表明,3株噬菌体宿主虽然同属假单胞菌,但形态及生物学特征明显不同。3株噬菌体均属头尾型结构,其中MuztagBP1、MYBP2A-15头部呈正多面体对称,直径约68 nm和74 nm,具收缩尾,长度分别约130 nm、160 nm,初步鉴定为肌尾噬菌体科（Myoviridae）;MuztagBP2头部直径约82 nm,尾管细长,约640 nm,归属为长尾噬菌体科（Siphoviridae）;3株噬菌体均具热不稳定性,对紫外有一定耐受性;MuztagBP1对氯仿、异丙醇和乙醚极其敏感,推断其核衣壳外含有脂膜包被,MuztagBP2和MYBP2A-15对氯仿、异丙醇和乙醚不敏感,其核衣壳外无脂质成分;一步生长曲线显示3株噬菌体的潜伏期、裂解期和裂解量各异。

新疆艾比湖湿地博乐河入湖口古菌多样性分析

莫超, 胡文革, 郭飏, 王翠华, 武菲

2016, 32(9): 131-139. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.018

摘要 ( 269 )

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旨为了解艾比湖湿地土壤中古菌的多样性及其群落结构组成。以艾比湖湿地博乐河入口土壤为样本,首次利用古菌特异性16S rDNA引物构建克隆文库。使用限制性内切酶AfaⅠ和MspⅠ对目的片段进行酶切分型（amplified rDNA restraction analysis,ARDRA）,每种谱型随机选取若干阳性克隆子进行测序,序列比对构建古菌16S rDNA系统进化树。结果显示,测序得到的117条序列划分为61个OTUs,通过序列比对及系统发育分析归类为广古菌门（Euryarchaeota）和奇古菌门（Thaumarchaeota）两大门类。广古菌门的盐杆菌科（Halobacteriaceae）为第一优势菌群,包括盐微菌属（Halomicrobium）、盐碱球菌属（Natronococcus）、盐碱团菌属（Halalkalicoccus）等10个属,共48个OTU（78.7%）,阳性克隆子77个（63.6%）。艾比湖湿地博乐河入口土壤古菌多样性丰富并存在大量的潜在新种。

锦带花纤孔菌液体培养过程中的抗氧化活性

孟歌, 郑飞, 刘红霞, 司静, 崔宝凯

2016, 32(9): 140-148. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.019

摘要 ( 302 )

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为更好地研究和开发药用真菌锦带花纤孔菌（Inonotus weigelae）的药理作用,以菌丝体生物量、pH、还原糖含量、漆酶活性、多酚含量、丙二醛（Malonaldehyde,MDA）含量、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活性、总抗氧化能力（Total antioxidant capacity,T-AOC）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基清除能力为检测目标,对锦带花纤孔菌在液体培养过程中的抗氧化活性进行了评价。结果显示,抗氧化活性与菌株生长状况、胞外酶活性及次级代谢产物分泌密切相关。菌丝体生物量增长呈“S”型,6-12 d迅速增长,第12天达到最大值,在此过程中还原糖含量、漆酶活性及多酚含量均出现高峰,且菌丝体生物量的变化趋势与漆酶活性和多酚含量基本一致,说明菌株的营养利用与生理代谢相互依存。SOD活性与T-AOC在培养过程中均呈上升趋势,说明菌株在氧化胁迫的压力下可启动自身的抗氧化系统以抵御外界的损伤。此外,锦带花纤孔菌对DPPH自由基的清除能力也较强,第2天时清除率为78.56%,第14天时仍能达到50%以上。结果证明药用真菌锦带花纤孔菌具有较强的抗氧化活性。

雷州黑鸭胚胎期骨骼肌发育表达与功能分析

许冲, 陈琦, 苏瑛, 黄汉光, 崔红艳, 黄骏腾, 常羽

2016, 32(9): 149-155. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.020

摘要 ( 264 )

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为保护雷州黑鸭优异的肉用性能,并开发利用这一珍贵的种质资源,研究选取雷州黑鸭为实验素材,对其胚胎期胸腿肌进行组织切片观察,并采用qRT-PCR与Western blot试验方法检测了Pax3、DCN和MSTN等基因在8、13、18、23和28胚龄胸腿肌中的发育性表达规律。同时用qRT-PCR法检测了雷州黑鸭28胚龄时Pax3、DCN和MSTN基因在各组织中mRNA的差异性表达量。胸腿肌组织切片观察雷州黑鸭胚胎期腿肌的发育明显早于胸肌;荧光定量PCR结果显示,雷州黑鸭Pax3、DCN和MSTN基因在各阶段胸腿肌中的相对表达量在23和28胚龄期最高,显著高于其它胚龄（P<0.05）;雷州黑鸭28胚龄时各组织中Pax3、DCN和MSTN基因在胸肌和腿肌中的表达显著高于其他组织（P<0.05）;Western blot结果表明,在胸腿肌中Pax3、DCN和MSTN蛋白的表达量在8胚龄期最低,在23胚龄时表达量显著高于其它胚龄（P<0.05）,达到高峰。结合切片图对比表达模式的分析表明在肌纤维的形成以及生长发育过程中,Pax3、DCN和MSTN基因对骨骼肌的生理特性起到决定性作用,在雷州黑鸭胚胎期骨骼肌发育过程中的不同阶段调控着早期胚胎中前体肌细胞的分化、增殖、促进肌纤维的形成。

中华大蟾蜍γ-肌动蛋白基因Bbgγ-Actin的克隆与生物信息学分析

刘彦芳, 王秋爽, 凌鸿, 刘东春, 代英辉, 王东

2016, 32(9): 156-164. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.021

摘要 ( 259 )

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旨在获得中华大蟾蜍肌动蛋白序列全长。以中华大蟾蜍（Bufo bufo gargarizans）耳后腺为材料,提取总RNA,通过转录组高通量测序快速得到中华大蟾蜍肌动蛋白基因（BbgActin）cDNA全长2 055 bp,通过RT-PCR技术对其ORF序列进行验证,并对BbgActin基因进行分析。序列分析表明,BbgActin基因开放阅读框长1 131 bp,编码376个氨基酸。通过BLAST P程序分析,所得序列与GenBank数据库中肌动蛋白基因序列相似度均在89%以上,氨基酸序列的相似性达90%以上。系统进化分析表明,BbgActin与γ-Actin聚为一类,所得中华大蟾蜍肌动蛋白属于γ-Actin。首次获得了中华大蟾蜍γ-Actin cDNA全长序列。

大鼠sFcγRIIb基因原核表达及活性鉴定

张艳芬, 刘利鹏, 陈瑶, 崔哲, 毕克维, 王南南, 刘中成

2016, 32(9): 165-171. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.022

摘要 ( 214 )

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旨在克隆大鼠FcγRIIb基因,构建sFcγRIIb原核表达体系,制备重组大鼠sFcγRIIb蛋白。采用RT-PCR技术从RBL-2H3细胞中克隆FcγRIIb胞外区基因,构建重组表达质粒转化大肠杆菌诱导表达,镍柱亲和层析纯化重组蛋白,复性后利用Western blotting、ELISA进行鉴定。结果显示,成功克隆大鼠sFcγRIIb基因,构建原核表达载体sFcγRIIb-pET17b,转化大肠杆菌BL21（DE3）。通过对表达体系进行优化,确定IPTG浓度为1.0 mmol/L,诱导时间为4 h时蛋白表达效率最高,重组蛋白主要以包涵体形式存在。包涵体经8 mol/L尿素溶解,利用Ni-NTA柱亲和层析获得了较高纯度的重组蛋白。采用梯度透析复性法对sFcγRIIb进行复性后,经Western blotting、ELISA与竞争性ELISA鉴定,重组蛋白sFcγRIIb可被特异性抗体所识别且与IgG具有结合能力。成功建立了大鼠FcγRIIb基因原核表达体系,制备了具有生物学功能的重组蛋白。

少棘蜈蚣抗菌肽scolopin 2的克隆、表达与抗癌机制研究

侯欢欢, 卢佳, 章纬菁, 黄芳任文华

2016, 32(9): 172-178. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.023

摘要 ( 279 )

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旨在研究AMP-scolopin 2的抗菌活性和抗癌机理。利用SUMO融合技术对AMP-scolopin 2进行了体外表达;采用抑菌圈、MTT、流式细胞术和Western blotting等技术分析了其抗菌活性、溶血活性和对肿瘤细胞的促凋亡作用。结果表明,成功表达并纯化了AMP-scolopin 2;AMP-scolopin 2对白血病细胞（K562）和肝细胞癌（HepG2）具有抑制增殖和促凋亡作用,但对红细胞和正常细胞HEK293的影响很小;AMP-scolopin 2（40 μmol/L）可以诱导K562（21.4%）和HepG2（18.5%）细胞凋亡;此外,AMP-scolopin 2下调了与线粒体相关的凋亡蛋白pro-caspase-3、pro-caspase-9和pro-PARP的表达,且呈浓度依赖性。AMP-scolopin 2可以通过线粒体caspase依赖性途径促进肿瘤细胞凋亡。

指状青霉cyt b₅和cyt b₅r基因克隆及与cyp51A表达

秦婷婷, 耿辉, 王胜强, 牛玉慧, 伍志刘德立

2016, 32(9): 179-188. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.024

摘要 ( 280 )

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为探究指状青霉细胞色素b₅（Cyt b₅）与细胞色素b₅还原酶（Cyt b₅r）在细胞色素P450 CYP51A电子传递方面的功用,研究了指状青霉CYP51A与Cyt b₅-Cyt b₅r共表达机制;并检测了其对于cyp51A基因表达水平的影响。通过转录组分析筛选并PCR克隆获得了cyt b₅与 cyt b₅r基因,分别命名为HS-Pdcyt b₅和HS-Pdcyt b₅r。以多基因串联克隆载体pPICZαA为骨架构建了指状青霉共表达质粒ppbrA（pPIC-Pdcyp51A-cyt b₅-cyt b₅r）;电转化法将重组质粒ppbrA导入毕赤酵母X-33中。qRT-PCR分析结果显示,CYP51A与Cyt b₅-Cyt b₅r共表达后,其基因表达水平升高54%-97%,并维持较长时间（48-72 h）。表明Cyt b₅-Cyt b₅r系统可将电子高效转移给CYP51A,从而增强cyp51A基因的转录表达。从指状青霉中克隆表达HS-PdCyt b₅和HS-PdCyt b₅r蛋白,并通过共表达的方式研究cyp51A基因的功能尚为首次报道。

绿色木霉耐热β-葡萄糖苷酶分离纯化及酶学性质研究

彭利沙, 张永祥, 闫青, 王翔, 李军

2016, 32(9): 189-196. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.025

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旨在对绿色木霉-葡萄糖苷酶进行分离纯化并研究其酶学性质。对绿色木霉GIM3.139进行摇瓶发酵,经离心超滤和Sephadex G-200凝胶层析,得到纯化后的β-葡萄糖苷酶,并研究其酶学性质。结果显示,分离纯化组分经PAGE电泳检测达到电泳纯,研究发现,该酶最适反应温度为80℃,热稳定性好,在70-95℃时能长时间保持较高活力,最适pH值为6.5,耐酸碱稳定性好。金属离子中,Fe³⁺、Mg²⁺、K⁺对β-葡萄糖苷酶的活性起抑制作用,其中Fe³⁺对该酶的抑制作用最为明显,Fe²⁺、Mn²⁺对β-葡萄糖苷酶的活性起激活作用,其中Mn²⁺对β-葡萄糖苷酶的激活作用最为明显。有机溶剂中,甲醇、丙酮对该酶起到激活作用,其中甲醇的激活作用最明显,而乙酸乙酯对该酶具有明显的抑制作用。分离纯化得到了电泳纯的β-葡萄糖苷酶,并掌握了其基本的酶学性质。

生防链霉菌SSD49的绿色荧光蛋白标记及其在毛白杨组培苗中的定殖

刘晓瑜, 马玉超

2016, 32(9): 197-202. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.026

摘要 ( 296 )

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杨树溃疡病是中国杨树人工林重大生物灾害之一,采用生物防治的方法控制杨树溃疡病是持续有效的手段。为了获取能够高效定殖并对杨树溃疡病菌有良好生防效果的拮抗菌株,通过引入强启动子（ermEp）构建了高表达绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）的重组质粒,进而通过接合实验将该质粒导入到链霉菌生防菌株SSD49,构建了绿色荧光蛋白标记菌株SSD49-pIJ8660Ep,利用荧光显微镜研究该生防菌在毛白杨组培苗中的定殖情况。结果表明,SSD49标记绿色荧光蛋白后没有影响其对杨树溃疡病病原菌的抑菌活性,标记菌株能够定殖于毛白杨组培苗的茎和叶中。成功将杨树溃疡病生防菌株SSD49进行了绿色荧光蛋白标记,并且该菌株在毛白杨组培苗中有一定的定殖能力。

fat-1转基因牛血浆差异蛋白的研究

刘新峰, 丁向彬, 王轶敏, 李新, 郭宏, 李光鹏

2016, 32(9): 203-209. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.027

摘要 ( 246 )

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以fat-1转基因牛血浆蛋白为材料,利用2D-双向电泳、生物信息学及血脂生化检测技术对fat-1基因调控牛脂类代谢的潜在机制进行了研究。结果表明,8个相关差异蛋白（AHSG、KNG1、Serpin A3-1、ENSBTAG00000021729、Serpin A3-5、FAM208A、CTAGE5、LOC511240）被鉴定;经生物信息学预测,发现有63个蛋白与这8个差异蛋白存在互作关系,而且发现差异蛋白和互作蛋白富集了11个与脂类代谢密切相关的生物学通路,其中互作蛋白APOA1在11个通路中富集的频率最高;经血浆APOA1检测发现,转基因牛显著高于野生型牛;相关性分析发现APOA1与低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）高度负相关（r=-0.90）,与高密度脂蛋白胆固醇/总胆固醇（HDL-C/TC）的比值存在显著正相关（r=0.69）。综合结果显示了fat-1基因可能通过介导APOA1的表达调控转基因牛的脂类代谢。

差示扫描量热法分析光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP914 TXT基序对抗冻活性的影响

杜荣俸, 刘忠渊, 毛新芳

2016, 32(9): 210-217. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.028

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研究光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP914及其突变体的原核表达及活性,推测TXT基序的突变对昆虫抗冻蛋白抗冻活性的影响。通过定点突变新疆荒漠昆虫光滑鳖甲抗冻蛋白apafp914基因TXT基序的规则位点个数,并亚克隆至pET32a原核表达载体,转化大肠杆菌,Ni-NTA纯化得到融合蛋白TrxA-ApAFP914及3种突变体蛋白;利用SwisS-Model服务器预测分析了ApAFP914蛋白的三维结构;通过差示扫描量热法测定TrxA-ApAFP914及其突变体的热滞活性。结果显示,4种融合蛋白分子量均在30 kD左右;且突变蛋白TrxA-A19T具有最高的热滞活性,而突变体TrxA-T33F和TrxA-T33&45F的热滞活性显著低于未突变的TrxA-914。研究结果表明昆虫抗冻蛋白的TXT基序越规则其具有的热滞活性越高。

拟南芥黑芥子酶TGG1对抗旱性的作用

毛明宇, 张文宇, 夏洪宇, 王洋, 李晶

2016, 32(9): 218-224. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.029

摘要 ( 299 )

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为阐明拟南芥中黑芥子酶TGG1对抗旱性的影响,构建了35S启动子驱动的TGG1过表达载体,并将其转入拟南芥获得了转基因植株。以野生型和过量表达TGG1的转基因植株为材料,进行干旱胁迫实验,结果显示,在甘露醇模拟的干旱胁迫下35S∶TGG1种子平均发芽率显著高于野生型,平均相对电导率则显著低于野生型;自然干旱胁迫下,35S∶TGG1的相对失水速率显著慢于野生型,而干旱复水后的平均存活率则显著高于野生型。对气孔的观察结果表明,过表达TGG1的转基因植株气孔对ABA处理具有更高的敏感性,气孔关闭程度显著高于野生型植株。以上研究结果表明,过量表达TGG1基因可显著提高拟南芥的抗旱能力,而且其抗性机制很可能与气孔在逆境下的关闭程度有关。

纤维素酶高产菌株Trichoderma atroviride HP35-3原生质体制备及转化

林艳梅, 李瑞杰, 张慧杰, 秦秀林, 冯家勋

2016, 32(9): 225-231. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.030

摘要 ( 302 )

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旨在优化深绿木霉（Trichoderma atroviride）菌株HP35-3原生质体制备和转化条件,便于对该菌株进行遗传操作以提高其纤维素酶产量。分别对制备深绿木霉原生质体的菌龄、酶解时间、酶组分及比例和转化条件进行优化。结果显示,利用3 mg/mL蜗牛酶、3 mg/mL溶菌酶和3 mg/mL裂解酶酶组分酶解菌龄10 h的菌丝2 h,获得的原生质浓度达到3.5×10⁷个/mL以上,原生质体再生率为61%。利用原生质体进行PEG介导转化,当原生质体浓度为1×10⁸个/mL、外源DNA为5 μg时,转化率达到35个转化子/μg DNA。建立的高效原生质体制备及转化体系可用于深绿木霉的遗传转化及菌株改造。

金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶Ply187的CHAP结构域的表达及抗菌活性分析

吴蒙, 陆海荣, 黄青山

2016, 32(9): 232-238. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.031

摘要 ( 342 )

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噬菌体裂解酶是一种高效的抗菌蛋白,系统地分析噬菌体裂解酶催化域的活性,有助于设计高效杂合裂解酶。合成噬菌体裂解酶Ply187的CHAP催化结构域（CHAP_Ply187）基因,并构建表达载体pET28a-CHAP_Ply187转化至大肠埃希菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达和两步纯化,获得高纯度的CHAP_Ply187,再与溶葡萄球菌酶催化域（CAT_Lysn）进行活性比较。比浊法检测显示CHAP_Ply187和CAT_Lysn对金黄色葡萄球菌都具有较强的抗菌活性;CHAP_Ply187具有更宽的抗菌谱,最适作用pH范围更大,对离子强度的耐受能力更好,易受EDTA的影响。低浓度的二价金属离子Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺对两种催化域都有明显的促进作用,低浓度的Zn²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺对它们有很强的抑制作用。

斑马鱼嗜水气单胞菌的鉴定和人工感染组织病理学研究

林金杏, 杨迟, 冯丽萍, 胡建华

2016, 32(9): 239-245. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.032

摘要 ( 250 )

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从患病斑马鱼体内分离致病菌株并进行鉴定,观察人工感染分离菌株后组织病理学变化。通过对分离菌株ZF4形态特征、生理生化特性、保守基因和系统发育树建立等综合分析进行鉴定。结果显示,ZF4为β溶血的革兰氏阴性短杆菌,吲哚试验为阳性,发酵葡萄糖、蔗糖等糖类,AHA_0438、ASP、gyrB和16S rRNA等基因均为阳性,基于gyrB、16S rRNA基因系统发育分析结果显示ZF4为嗜水气单胞菌。人工感染后斑马鱼临床症状明显,发生肝脏组织变性、肠道内膜脱落、脾脏充血、胰腺间质纤维组织增生等组织病理学变化。斑马鱼体内分离的ZF4鉴定为致病性嗜水气单胞菌,且斑马鱼对该菌敏感,因此斑马鱼可作为研究嗜水气单胞菌的动物模型。

DSPAα1缺失突变体在毕赤酵母中的表达及活性研究

陈韵, 牛纯青, 宋小双, 苏畅, 华子春, 刘堰

2016, 32(9): 246-252. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.033

摘要 ( 270 )

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吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂（Desmodus salivary plasminogen activators,DSPAs）共有4种：DSPAα1、α2、β及γ。其中,DSPAα含有指形区（F）、表皮生长因子区（E）、kringle区（K）和丝氨酸蛋白酶区（P）,DSPAβ含E、K、P区,DSPAγ含K和P区。以DSPAα1为基础,研究其结构对纤溶活性的影响。采用重叠延伸PCR技术（splicing overlap extension PCR,SOE-PCR）获得缺失E区的DSPAα1突变体（mDSPAα1）,分别构建mDSPAα1/pPIC9K、DSPAβ/pPIC9K和DSPAγ/pPIC9K重组质粒并转化到巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）菌株GS115中表达,纤维平板法测活。结果显示未检测到DSPAγ的表达,DSPAα1活性为2.64×10⁵U/mg,DSPAβ的活性为1.32×10⁴U/mg,mDSPAα1活性为151.52 U/mg;同时使用DSPAα1、mDSPAα1、DSPAβ时,总活性几乎不受影响,单独使用任意两者时,发现活性均降低2-3倍。mDSPAα1纤溶活性几乎没有,同时DSPAβ与野生型DSPAα1相比保留了相当的催化活性。DSPAα1的N端区域可以影响其溶栓活性,而缺失E区后几乎丧失活性,说明E区在DSPAα1溶栓过程中起着至关重要的作用。

以MIF为靶标的抑制剂药物高通量筛选模型的建立和应用

张晶, 孙瑞秋, 唐延婷, 刘祥

2016, 32(9): 253-259. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.034

摘要 ( 274 )

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旨在以巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）为靶标,采用紫外-分光光度法建立高通量药物筛选体系。对目的基因进行分子克隆,利用大肠杆菌原核表达系统进行纯化得到高纯度的目的蛋白,利用紫外-分光光度法构建酶活体系,并优化体系条件,建立合适的高通量药物筛选模型,最终从384种小分子中筛选出潜在的酶抑制剂。筛选模型构建成功,并筛选出酶活抑制率较高的小分子2种,测得半数抑制浓度IC₅₀分别为59.07 μmol/L、44.12 μmol/L。针对MIF蛋白,建立了较理想的高通量药物筛选模型,适用于MIF蛋白酶活抑制剂的筛选,有利于后期的药物研发。

NADP（H）相关的体外合成乳酸途径构建以及性究

茅佳灵, 许琳, 严明

2016, 32(9): 260-266. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.035

摘要 ( 328 )

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活体细胞体内代谢途径调控机制复杂,若能将目的代谢途径移到胞外,则能进行直观研究。选用嗜热酶来源的10条基因,构建一个能实现自我能量ATP和辅酶NADP（H）循环平衡,葡萄糖代谢生成乳酸的体外合成途径。对该途径初步研究表明,最适反应pH7.0,最适反应温度50℃,该条件下添加少量的辅酶NADP⁺,8 h内能将12.4 g的葡萄糖转化生成9.5 g的乳酸。

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2016, 32(9): 300-300.

摘要 ( 150 )

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