生物技术通报

新一代精准基因编辑工具CRISPR/Cas9的技术优势与应用局限

吴言,郝雅荞,韦璇,沈琦,柳叶飞,王升厚,赵洪新

2018, 34(5): 1-8. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-1100

摘要 ( 1207 )

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CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ Cas9）是继锌指核酸酶（ZFNs）和类转录激活因子效应物核酸酶（TALENs）基因编辑技术之后的第三代基因编辑技术。CRISPR/Cas9 在细菌和古生菌中广泛存在,是细菌在长期进化过程中形成的一种“适应性免疫防御”,能够针对噬菌体感染、质粒接合和转化所造成的外源导入基因特异性识别、降解入侵的外源DNA,CRISPR/Cas9通过一段20 bp的短RNA来识别打靶位点的精准编辑技术。CRISPR/Cas9具有设计操作简便、编辑高效和通用性广等优点,是新一代具有革命意义的精准基因编辑技术。从CRISPR/Cas9的发现、作用机理、基因编辑以及应用局限等方面进行归纳总结,旨为理解其工作原理和精准基因编辑技术应用提供参考。

CRISPR技术的发展及应用研究进展

梁丽琴,阎婧,张鑫,郝泽婷,段江燕

2018, 34(5): 9-16. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0608

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CRISPR作为一种基于RNA的后天免疫防御系统,其间隔序列与噬菌体或质粒序列存在同源性,能利用靶位点特异性的RNA指导Cas蛋白靶向几乎所有生物和细胞中遗传错误的基因。与锌指核酶ZFN和转录激活因子样效应物核酶TALEN的基因编辑技术相比,更廉价高效,所以自2013年首次应用以来,迅速被广大中外研究人员接受并应用于研究,成为当今生命科学领域研究的新热点。鉴于CRISPR对今后的科学研究及现实应用具有重要意义,对 CRISPR研究的最新动态及在基因治疗等方面的应用进行综述,并在此基础上讨论了该技术存在的局限性及解决方法,最后对CRISPR的研究前景进行了展望,以期为相关科研人员了解CRISPR提供参考。

CRISPR/Cas9技术在表观基因组中应用的探讨

贺帅,王淑辉,孙秀柱

2018, 34(5): 17-21. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0358

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成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列关联蛋白9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins,CRISPR/Cas9）技术是近5年来在生物基因改造中应用最广泛的新型编辑工具,具有成本低、效率高、多位点打靶以及脱靶效应可预测等优点,正在成为不同生物体中设计基因组的有力工具。表观遗传的不断发展对分子生物学的中心法则提出挑战,包括DNA中碱基和组蛋白的修饰、非编码RNA对基因组和染色质结构的调节中都起到至关重要的作用。对CRISPR/Cas9系统的改造可以对表观基因组进行修饰。对CRISPR/Cas9系统在表观基因组中进行修饰的应用进行概述,讨论了定向修饰基因组存在的问题,以期为CRISPR/Cas9系统在基因组编辑领域的应用提供参考。

细菌多元基因编辑技术研究进展及其在合成生物学中的应用

郭明璋,刘海燕,杜若曦,许文涛

2018, 34(5): 22-31. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0089

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多元基因编辑技术是指通过一次实验操作在同一个细胞内完成多个靶位点基因编辑的技术。高通量化是基因编辑技术发展的重要方向,而多元基因编辑的出现与发展是实现高通量基因编辑的重要中间过程。目前,细菌中多元基因编辑技术主要有三种形式并行发展,分别是基于迭代编辑、基于CRISPR/Cas9等新基因编辑工具、基于大片段基因合成组装的多元基因编辑技术。综述了3种类型的多元基因编辑技术的原理和发展,以及多元基因编辑技术在微生物合成生物学中的广泛应用前景,讨论了目前多元基因编辑技术存在的问题,并展望了多元基因编辑技术进一步实现高通量化的发展方向。

CRISPR/Cas9基因组编辑技术及其在链霉菌中的应用

乔龙亮,庞建虎,党晨阳,黄海龙,朱鹏

2018, 34(5): 32-40. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0877

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链霉菌（Streptomyces）以产生多种抗生素而著称,长期以来都是生命科学与医学、药学及工业领域的研究热点。然而,链霉菌的遗传操作十分困难,传统的基因编辑手段因效率低、实验周期长及操作步骤繁琐等原因正逐渐被素有“魔剪”之称的CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas9（CRISPR-associated protein 9）系统所替代。该技术可以对基因组特定位点进行靶向编辑,包括缺失（Indel）、修复（Repair）和替换（Replacement）等。通过比较目前在链霉菌中基因编辑手段,总结出CRISPR/Cas9系统在链霉菌应用方面具有操作简单、效率高、成本低、实验周期短,以及能够同时敲除多个基因等优势,并综述了该系统在链霉菌中的应用,以及汇总了CRISPR/Cas9工具箱的靶向空间,最后针对该系统在链霉菌定向育种方面及合成新的抗生素方面进行展望,以期为相关领域的工作提供参考。

牛的基因编辑技术研究进展

汤波,孙照霖,戴蕴平

2018, 34(5): 41-47. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0413

摘要 ( 485 )

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基因编辑技术是对基因组进行定点修饰的一种新兴生物技术,主要包括锌指核酸酶（ZFNs）技术、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）技术以及最新的CRISPR/Cas9技术,正在动植物育种、生物制药、基因治疗等方面发挥前所未有的影响力。本文总结了基因打靶技术及各种基因编辑技术的发展简史,重点介绍了基因编辑技术在抗病、改善奶品质、提高瘦肉率和去角等牛新品种培育领域的研究进展。最后提出建立基因编辑农业动物监管体系的建议,以期加快我国基因工程动物产业化。

非人灵长类动物基因编辑技术的应用及挑战

毕延震,肖红卫,张立苹,任红艳,华再东,华文君,王正,牛敏杰,林郑云,任习东,孙理华,郑新民

2018, 34(5): 48-56. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0891

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建立有效的动物模型是研究人类疾病演进、开发新型治疗手段的重要方法。非人灵长类动物在进化发育、生理生化及病理方面和人类最接近,是研究人类疾病的理想动物模型。随着基因编辑技术的发展,研究者已经成功建立了多种模仿人类疾病的非人灵长类动物模型。但是CRISPR/Cas9的脱靶效应、嵌合突变以及基因敲入效率较低等突出问题也逐渐引起重视。本文综述了基因编辑技术在建立非人灵长类动物模型中的应用现状,提出了目前亟需解决的难点和应对策略,以期为高效、准确构建非人灵长类动物模型提供借鉴与参考。

CRISPR系统及其应用于小鼠的研究进展

董维鹏,王君实,张少华,燕炯

2018, 34(5): 57-63. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0530

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CRISPR系统作为一种基因编辑工具,自2013年首次应用于哺乳动物以来,凭借其设计简单,耗时短,效率高的优点,在短短四年间飞速发展,其应用已经远远超过了锌指核酸酶和转录激活因子样效应物核酸酶技术,并在分子生物学领域得到广泛应用。基于该系统发展而来的各项技术不断的被发掘,小鼠作为一种基本的实验动物,在CRISPR系统应用中扮演重要角色。目前基于CRISPR系统发展而来的应用工具已经成功的作用于各种体外培养的细胞,通过对胚胎细胞的编辑而产生动物模型的技术也在不断成熟,以及在疾病治疗特别是遗传病治疗中也展现出其独有的优势,并且其作用范围在不断的扩展,作用方式还在不断的创新。主要介绍CRISPR系统的结构与作用原理,讲述基因敲入、基因敲除、基因沉默、转录调控等作用于DNA的几种主要的CRISPR应用工具,针对目前主要的缺点即脱靶效应所研究出的几个改善措施,以及在小鼠疾病模型建立与疾病治疗中发挥的重要作用。

小鼠LSK及DN原代细胞中基因编辑方法的建立

王跃强,AvinashBhandoola

2018, 34(5): 64-70. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0903

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小鼠（Mus musculus）免疫系统包含种类众多、功能各异的细胞群体。为了研究小鼠免疫系统的发育机制,需要建立高效的遗传操作技术方法。首先选择Cas9敲入小鼠的DN细胞（CD4^-CD8^-double negative thymocytes）为研究对象,针对GFP和CD4表面抗原基因设计构建了sgRNA（single guide RNA）,使用小鼠逆转录病毒（Murine stem cell virus,MSCV）为载体实施了基因编辑。通过流式细胞仪分析,检测到GFP和CD4被成功敲除。在此基础上,选取Cas9敲入小鼠的LSK细胞（Lin^-Sca1⁺Kit⁺）为研究对象,使用同样的方法针对Tcf7基因设计构建了sgRNA并实施基因编辑。基因编辑后,LSK细胞不能正常分化为下游T细胞,但其分化为髓系细胞能力不受影响。这些结果表明,针对小鼠LSK和DN原代细胞实施的基因编辑取得成功。

利用CRISPR/Cas9系统在小鼠胚胎干细胞中进行miR-22的功能研究

张雪,陈亮亮,戴红霞,张文胜,任文燕

2018, 34(5): 71-79. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0964

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旨在构造neomycin筛选标记的sgRNA表达载体,并利用CRISPR/Cas9技术构建miR-22缺失的小鼠胚胎干细胞,探究miR-22在小鼠胚胎干细胞中的调控作用。首先通过点突变、搭桥PCR等手段,构造neomycin筛选标记的sgRNA表达载体,并获得靶向敲除miR-22的sgRNA表达载体,电转至稳转Cas9的小鼠胚胎干细胞中;其次经药物筛选、基因型鉴定等步骤筛选miR-22纯合缺失的小鼠胚胎干细胞。RT-qPCR手段证实miR-22在小鼠胚胎干细胞中被成功敲除,纯合突变体的比例约为6.67%。此外,miR-22缺失并未影响胚胎干细胞的细胞形态以及Oct4、Sox2和Nanog等干性基因的表达。因此,miR-22对小鼠胚胎干细胞的干性维持并非必需,而对胚胎干细胞谱系分化和命运决定的影响还有待进一步研究。

基于CRISPR/Cas9系统构建FOXA2表达示踪体系

程浩杰,张振旺,谭桂湘,刘昱翔,卜会铜,谭拥军

2018, 34(5): 80-86. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0111

摘要 ( 401 )

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利用CRISPR/Cas9系统在基因FOXA2蛋白质编码区后插入绿色荧光蛋白核酸序列,实现对FOXA2基因开启和关闭的示踪。通过靶向序列选择、Cas9靶向质粒及Donor片段的克隆、细胞转染并进行流式细胞荧光分选、阳性细胞有限稀释、富集培养及单克隆细胞的鉴定和转录翻译水平验证等5个方面,进行实验研究。在编辑的乳腺肿瘤细胞MCF-7中,绿色荧光蛋白有效表达;乳腺癌细胞内绿色荧光蛋白的表达水平同FOXA2蛋白的表达水平正相关,且经肿瘤细胞上皮间质转化进程诱导因子EGF的诱导,绿色荧光蛋白和FOXA2表达水平同步降低。方法学上CRISPR/Cas9靶向FOXA2并利用细胞内同源性定向修复插入绿色荧光蛋白序列成功;利用报告基因蛋白表达水平示踪目的基因的开启、关闭及表达量高低结果准确、方法简单,效果明显。

保加利亚乳杆菌CRISPR位点的序列分析

程娜,蔡针华,吕加平,贾震虎,逄晓阳

2018, 34(5): 87-93. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0952

摘要 ( 419 )

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乳酸菌基因组的CRISPR序列是乳酸菌识别并抵御噬菌体侵染的重要元件,其与cas蛋白共同构成了乳酸菌的获得性免疫系统。而目前对乳酸菌CRISPR序列信息研究较少。因此本文对8株不同来源的保加利亚乳杆菌的CRISPR序列进行了克隆测序,对其重复序列进行了遗传进化分析并预测了二级结构,同时进行了间隔序列的同源性分析。结果显示：8株保加利亚乳杆菌均含有长度不一的CRISPR区,最长的CRISPR序列片段长度为1 820 bp,含有30条间隔序列,最小的CRISPR片段仅有408 bp,含5个间隔序列。经分析发现CRISPR重复序列的二级结构预测有两类不同的结构,一类以“环”为主的典型RNA二级结构,一类以“茎”为主,前者剪切后具有典型crRNA结构,而后者的功能还有待进一步研究。通过分析保加利亚乳杆菌的CRISPR序列结构,可为保加利亚乳杆菌抗噬菌体的分子机制奠定基础,也对乳品工业筛选抗噬菌体的发酵剂菌株具有指导意义。

MRP8过表达促进重组酿酒酵母外切纤维素酶生产

万青青,李洁,曾钰,张明明,赵心清,白凤武

2018, 34(5): 94-100. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0380

摘要 ( 332 )

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增强酿酒酵母纤维素酶分泌能力,为提高利用联合生物加工生产纤维素乙醇的效率提供基础。采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,在分泌表达外切纤维素酶CBH1的酿酒酵母Y294中过表达线粒体核糖体蛋白基因MRP8。与对照菌株相比,过表达MRP8重组酵母的胞外CBH1酶活提高了约80%。实时定量PCR结果分析表明,在MRP8过表达突变体中,CBH1转录水平高于对照菌株,但是与蛋白折叠和分泌相关的关键基因转录水平没有明显变化。在刚果红平板和含有衣霉素或二硫苏糖醇的平板上生长没有受到影响。胞内ATP含量和活性氧积累未发现显著差别。本研究表明MRP8过表达促进外切纤维素酶的生产。

拟南芥中WRKY31转录因子的转录活性与互作蛋白分析

王艺桥,赵新杰,牛芳芳,郭小华,杨博,江元清

2018, 34(5): 101-109. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0918

摘要 ( 736 )

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为深化对AtWRKY基因家族中功能尚未被报道成员的认识,探究拟南芥中WRKY转录因子基因在非生物逆境响应中的作用与可能的机制,通过对AtWRKY31进行亚细胞定位以及转录活性分析,并利用qRT-PCR检测AtWRKY31在不同逆境处理1、3和12 h后的表达变化,通过酵母双杂交（Y2H）和双分子荧光互补（BiFC）对其互作蛋白进行了筛选与验证。发现AtWRKY31定位于细胞核,具有转录抑制作用,且表达受热害、低钾、低氮等处理显著的抑制。此外,发现WRKY31可以与WRKY31、WRKY6和WRKY42在体内发生互作。拟南芥WRKY31作为一个转录抑制子,可能通过与WRKY6和WRKY42转录因子互作来参与调控对一些非生物逆境的应答。

叶面肥对玉米籽粒中矿物元素的影响分析

李文宗,李卫华,徐妙云,王磊

2018, 34(5): 110-116. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0957

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Fe、Zn、Se等矿物元素在动植物以及人体的生长和发育过程中具有重要作用,为了提高玉米籽粒中Fe、Zn、Se的含量,对叶面喷施Fe、Zn、Se肥及其不同组合,探讨其对玉米成熟籽粒中的Fe、Zn、Se以及其它矿物元素含量的影响。使用不同浓度的硫酸亚铁（Fe肥）、硫酸锌（Zn肥）和亚硒酸钠（Se肥）及其不同组合对京科糯2010（JK2010）进行了叶面喷施处理。叶面喷施不同浓度的Fe肥、Zn肥和Se肥均能显著提高JK2010籽粒中Fe、Zn、Se元素的含量;Fe与Zn能够相互促进吸收,Se能够促进Zn的吸收,Fe与Zn对Se的积累有抑制作用;叶面喷施Fe、Zn、Se肥及其组合对玉米籽粒中Ca元素的积累有促进作用;不同的Fe、Zn、Se肥组合方式对籽粒中Cu的积累有不同的影响;总体上看叶面喷施Fe、Zn、Se肥及其组合对玉米籽粒中Mn、Mg、P等元素的积累影响不大。不同的叶面喷施组合处理中,Fe肥、Zn肥和Se肥三者配合使用能极显著的提高籽粒中Fe、Zn、Se元素的含量,为Fe、Zn、Se肥的生产应用提供新的策略,同时也发现Fe、Zn、Se肥的使用对籽粒中几种不同的矿物元素有不同的影响。

木薯不同发育期块根基因组DNA甲基化变化分析

薛晶晶,陈松笔

2018, 34(5): 117-123. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0893

摘要 ( 370 )

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DNA甲基化在植物的转座子沉默和基因表达调控中起着重要的作用。本研究以淀粉含量差异较大的两个木薯种质SC5和Cas36-12为研究材料,采用甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术,通过LabChip GX Touch微流控毛细管电泳系统分析其块根发育过程中的甲基化变化情况。结果表明：14对选择性扩增引物在SC5和Cas36-12中分别扩增出345和 339个甲基化条带,SC5三个发育期的甲基化率高于Cas36-12,且都超过50%。比较SC5和Cas36-12块根发育3个关键时期的甲基化变化情况,发现两份材料甲基化变化的整体趋势是一致的。形成期到膨大期主要以发生甲基化为主;而膨大期到成熟期主要以去甲基化为主。

四倍体海岛棉LTR反转录转座子的数量与分布

刘震,张树林,史莹慧,彭仁海

2018, 34(5): 124-130. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0940

摘要 ( 372 )

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棉花是重要的纤维作物,在四个栽培棉种中,海岛棉纤维品质最优,了解LTR反转录转座子的数量与分布,可以促进海岛棉基因组的研究。通过综合不同方法挖掘海岛棉基因组中的LTR反转录转座子序列,并进行家族归类和数据分析。结果表明海岛棉A亚组和D亚组共有的LTR反转录转座子家族占全部家族的95%,LTR反转录转座子的Copia超家族和Gypsy超家族的分布特征有明显的不同,但相同超家族在相同亚组染色体上则表现出相似的特征。LTR反转录转座子周边基因的GO注释主要富集在结合活性、催化活性和代谢过程等方面。研究结果揭示了LTR反转录转座子在海岛棉染色体上的分布特征及其周边基因的功能富集。

梨萜类合成酶基因家族生物信息学与表达模式分析

赵荣荣,刘斌,郭超,刘恒,张元湖

2018, 34(5): 131-141. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0804

摘要 ( 448 )

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萜类合成酶（Terpene synthases,TPS）是萜类化合物合成过程中的关键酶。基于梨（Pyrus bretschneideri）全基因组数据库,采用生物信息学和分子生物学方法,对梨TPS基因家族进行鉴定和亚家族分类,研究梨TPS基因的结构及编码蛋白质性质和表达模式。共鉴定获得33个萜类合成酶基因家族成员,聚类为5个亚家族,其中,TPS-a亚家族成员数量最多,包含4-7个外显子;主要定位于细胞质,少数分布在线粒体、叶绿体和内质网等;梨TPS蛋白均为亲水性蛋白,α-螺旋和无规卷曲是其二级结构主要组成元件,β-折叠和延伸链散布其中;TPS-a中保守基序个数相对较多,TPS-e/f相对较少;各亚族内蛋白质在三级结构上高度相似。除PbrTPS24外,其余9个TPS基因在根、茎、幼叶和幼芽中均有表达,并且不同的基因在不同部位高表达,PbrTPS存在组织特异性表达。

基于诺丽叶片愈伤组织的细胞悬浮系的建立

张正雪,蓝增全,吴田

2018, 34(5): 142-147. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0871

摘要 ( 316 )

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为通过诺丽叶片的细胞悬浮系来获得其次生代谢物。实验基于诱导的诺丽无菌苗叶片愈伤组织,改变液体培养基的激素组成、接种量以及在细胞悬浮培养过程中进行相关参数的测定以确定继代周期。液体培养基为MS+2.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT,最佳初始接种量为60 g/L;在14-22 d进入直线生长期,后缓慢增长,在第26 天细胞数量达到峰值11.8×10⁵个/mL后细胞数量下降;细胞活力最好出现在第21天,OD₄₈₅=1.8;初代细胞形态为不规则杆状细胞,在第6代呈规则小细胞团和圆球体;最佳继代周期22-26 d,诺丽叶片细胞悬浮培养液的细胞存活率为77.9%。实验建立了稳定的诺丽叶片细胞悬浮培养体系。

嗜水气单胞菌bamA、bamB、bamD突变株的构建及其对外膜蛋白转运的影响

黄放,林向民

2018, 34(5): 148-153. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0771

摘要 ( 429 )

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革兰氏阴性细菌的BAM（β-barrel assembly machinery）系统一般由BamA-E 等5个亚基组成,以β-桶状外膜蛋白的结构对细菌的转运和正确折叠中起重要作用。目前对于BAM系统的研究大多集中在大肠杆菌、脑膜炎双球菌等细菌中,而在其他细菌中的相关功能还有待进一步研究。以嗜水气单胞菌为研究对象,首先利用同源重组技术,分别构建完成bamA、bamB、bamD的缺失突变株。尔后,利用SDS-PAGE检测技术对相应突变株差异外膜蛋白进行比较,并对这些差异蛋白进行质谱分析,共鉴定到7个差异蛋白,其中5个为外膜蛋白,2个为位于内膜上的蛋白酶。此外,还通过Western blotting对部分突变株外膜蛋白的表达进行验证。研究结果发现,嗜水气单胞菌BAM系统的突变不仅改变了其外膜蛋白表达,还影响了微生物的蛋白转运进程;且在系统中不同亚基对不同外膜蛋白的转运和表达效果也有所不同,结果提示了嗜水气单胞菌BAM转运系统的不同亚基存在特定外膜蛋白转运的特性。

不同氮浓度对一株产油绿球藻生长、脂类积累及脂肪酸分布的影响

李涛,许瑾,吴华莲,王铭,向文洲

2018, 34(5): 154-162. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-1134

摘要 ( 441 )

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富含多不饱和脂肪酸的产油微藻是开发高值微藻油的理想原料,一株产油微藻是否具有高值油脂开发潜力需要评估其油脂产量、中性脂比例与多不饱和脂肪酸分布等指标。低氮胁迫是研究微藻油脂积累理想的方式之一,以一株产油绿球藻（Chlorococcum sp.）为实验材料,以硝酸钠（NaNO₃）为氮源,设置17.6 mmol/L、5.9 mmol/L和3.5 mmol/L三种氮浓度,跟踪测定产油绿球藻生长、脂类组成及多不饱和脂肪酸分布的时相变化。结果显示,3.5 mmol/L和5.9 mmol/L氮浓度条件下,产油绿球藻取得了2.55 g/L和2.51 g/L的总脂产量,远高于17.6 mmol/L氮浓度组的总脂产量（1.43 g/L）;降低氮浓度可以提高中性脂比例,3.5 mmol/L氮浓度组取得最高的中性脂比例,为88.6% 总脂质（Total lipid,TL）,高于5.9 mmol/L氮浓度组（86.3% TL）和17.6 mmol/L氮浓度组（80.5% TL）;降低氮浓度可以改变产油绿球藻的脂肪酸在不同脂类分子中的分布,促进脂肪酸更多分布于中性脂中,其中,3.5 m mol/L TL氮浓度组培养结束时,α-亚麻酸在中性脂的比例由接种时的33.9%提高到86.5%。适宜氮浓度对于提高产油绿球藻总脂产量、中性脂比例而多不饱和脂肪酸分布具有重要作用,产油绿球藻积累的α-亚麻酸在低氮条件下更倾向于分布在中性脂中,是一株具有高值化微藻油开发价值的藻株。

单增李斯特菌CdaA的抗原表位分析及抗体的制备

孙静娟,邱景璇,曾海娟,丁承超,王广彬,李杰,王淑娟,刘箐

2018, 34(5): 163-171. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0823

摘要 ( 331 )

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生物信息学分析结果显示单增李斯特菌腺苷酸环化酶CdaA具有良好的种内保守性、种间特异性和抗原表位结构,本研究对该蛋白的免疫原性进行验证并制备单克隆抗体,拟以CdaA为检测靶标检测单增李斯特菌。考虑到跨膜区可能会阻碍CdaA的表达,因而构建pET30a-Δ300cdaA并诱导表达Δ100CdaA。以纯化的Δ100CdaA制备的多克隆抗体效价可达1∶128 000。Western-blotting分析表明多抗能够识别从单增李斯特菌中提取的CdaA。另外,筛选得到一株单克隆抗体,3F8,单抗效价可达1∶512 000。Western blotting分析可知该单抗能够与9株单增李斯特菌和2株非致病李斯特菌的提取蛋白结合,并且与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等7株其他菌种的提取蛋白不结合,表明该单抗具有良好的特异性。利用生物信息学筛选检测靶标并分析抗原表位结构,最后成功制备多克隆抗体和单克隆抗体。

一株四环素高效降解菌的分离及降解特性

吴学玲,吴晓燕,李交昆,申丽,余润兰,曾伟民

2018, 34(5): 172-178. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0723

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四环素类抗生素在养殖业中广泛使用引起药物残留,给环境及人类健康带来了深远影响。从利用四环素类抗生素作为饲料添加剂的养猪厂底泥中,筛选获得一株能够高效降解四环素的细菌XY-1,经革兰氏染色、形态学观察、生理生化及16S rDNA序列分析等,确定该菌株属于拉乌尔菌属,命名为Raoultella sp.XY-1。采用高效液相色谱（HPLC）测定了菌株XY-1对四环素的降解能力,结果表明,该菌株最佳降解条件是温度为25℃,初始pH值为7.0,在此最佳条件下,XY-1在第8天时生长量最大且四环素降解率最高达到70.68%。对XY-1的四环素耐药基因进行了初步探究,首次在该菌株中检测到两种四环素耐药基因tet（D）和tet（E）。

极端嗜酸热古菌Acidianus manzaensis硫氧化模型构建

朱薇,马亚龙

2018, 34(5): 179-186. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0620

摘要 ( 312 )

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为了解极端嗜酸热古菌硫氧化代谢途径,基于Acidianus manzaensis YN-25全基因组信息,通过NCBI数据库比对初步筛选了20个可能与硫氧化相关的基因,并通过实时定量PCR（RT-qPCR）比较了所筛选基因在以单质硫（S⁰）和亚铁（Fe²⁺）两种不同能源底物培养下的表达差异。结果表明,A. manzaensis菌中存在至少15个与硫氧化相关的基因,经过比对分析,它们包括5个编码氧化单质硫（S⁰）及含硫中间产物的酶基因、4个编码末端氧化酶基因、1个编码硫酸根转运蛋白酶基因、1个编码电子传递蛋白基因,以及4个编码与硫氧化密切相关的硫还原蛋白家族（Sulfur reduction protein）的dsrE基因。基于上述实验分析结果,拟构建极端嗜酸热古菌A. manzaensis的硫氧化模型,即胞外的S⁰跨膜转运进入细胞内后,经硫氧化蛋白（SOR）氧化还原生成S₂O₃^2-,SO₃^2- 和 H₂S等含硫中间产物。接着,细胞内通过其他相关硫氧化酶的作用将这些中间产物进一步氧化,并将氧化得到的电子传递给细胞膜上的氧化型醌（Q²⁺）,使其形成还原型的醌（QH₂）,QH₂最终被末端氧化酶氧化形成NADH和ATP,从而为细胞生长提供能量。

多菌灵降解菌的生物学特性及降解能力研究

陈锐,孙晓宇,邓媛,路鹏鹏,赵玲侠,瞿佳,沈卫荣

2018, 34(5): 187-194. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0675

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农药污染已成为影响人身健康及环境的主要原因。在污染土壤中引入降解特定农药的微生物可有效降低该农药的浓度,并且该方法绿色环保、无二次污染。为降低棚室土壤中的残留农药多菌灵,通过唯一碳源平板筛选法,从长期使用多菌灵的棚室土壤中分离筛选出一株分解利用多菌灵的微生物菌株WNP-3,该菌株可在含200 mg/L的多菌灵LB培养基中正常生长。经形态学、理化、Biolog及16S rDNA鉴定,确定该菌为小麦苍白杆菌（Ochrobactrum tritici）。该菌表现出宽泛的生长范围：在pH4-9,盐含量1%-3%条件下正常生长,对多种农药具有耐受性。经紫外分光光度法及HPLC验证WNP-3在无机盐培养基、28℃、180r/min摇瓶培养120 h的条件下,对100 mg/L多菌灵的降解率为61%。

以抽油烟机废油为原料发酵产鼠李糖脂的研究

张婧波,吴剑荣,蒋芸,杨迪,詹晓北

2018, 34(5): 195-200. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0736

摘要 ( 398 )

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鼠李糖脂是一种具有巨大潜力的阴离子生物表面活性剂,可应用于石油、食品、农业、日化工业等领域。探讨以抽油烟机废油为碳源发酵产鼠李糖脂的可能性,以铜绿假单胞菌WB505为出发菌体,在7 L发酵罐中鼠李糖脂的产量达到12.3±0.52 g/L。利用基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析出所产鼠李糖脂的组成,结果显示其主要含Rha-C₁₀-C₁₀和Rha₂-C₁₀-C₁₀,其中单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的总相对丰度分别为49.7%和50.3%。所产鼠李糖脂的临界胶束浓度（CMC）为45.0 mg/L,能将表面张力从60.5±0.81 mN/m降至25.3±0.68 mN/m,乳化系数E24均>60%,并且对苯的乳化系数达到80.3±0.85%。以抽烟机废油为底物生产鼠李糖脂降低底物成本,为抽油烟机废油提供一种循环再利用处理方式。

HFSC标记在阿尔巴斯绒山羊毛囊及毛囊干细胞中的表达

乃门塔娜,张燕军,刘东军,李金泉

2018, 34(5): 201-205. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0885

摘要 ( 459 )

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旨在检测最广泛应用的毛囊干细胞标记在阿尔巴斯绒山羊毛囊组织中的表达情况,为今后内蒙古绒山羊毛囊组织学和细胞学领域相关研究提供依据。以阿尔巴斯绒山羊为研究对象,对其进行Krt15、Krt19、CD34和Sox9等的冰冻切片和细胞免疫组化实验。以上4个标记均在外根鞘中表达;Krt15、Krt19在隆突部表达,在隆突部下端不连续表达;CD34在隆突部和隆突部下端都有较强的表达;Sox9主要集中在隆突部表达。Krt15、Krt19、CD34和Sox9共同表达的部位为毛囊隆突部,因此可结合表达部位特征选用为阿尔巴斯绒山羊毛囊隆突部来源的毛囊干细胞鉴定标记。

“草甘膦安全之争”案例分析

袁子青,李菁仪,朱龙佼,罗云波,黄昆仑,许文涛

2018, 34(5): 206-218. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0375

摘要 ( 386 )

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自2015年IARC发布草甘膦可能致癌的评估报告以来,草甘膦的安全性一直受到各界人士的关注和热议。在各类案例中,“草甘膦安全之争”以其重要性、复杂性、曲折性成为农业投入品影响食品安全和生态健康的代表事件。该案例之所以如此重要,主要由于草甘膦在全球范围内的广泛使用和在除草剂市场上难以撼动的霸主地位,案例的复杂性体现在其涉及面广和影响深远,与生态、经济、政治、教育等领域存在千丝万缕的联系,而曲折性是指继IARC的致癌性评估后,各国际机构相继发布的无风险评估结果使得草甘膦的命运一波三折。本文首先回顾了整个案例的发展脉络,并陈述了事件的参与方,然后从发展历程、理化性质和检测方法三个方面展现了草甘膦的前世今生,并据此展开案例分析,揭示草甘膦与转基因作物的关系,接着将此案例与案例教学相结合,为案例融入课堂提供了思路,最后从多角度进行案例透视,探寻案例背后隐藏的社会真相,给出笔者从中获得的一些启示。

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2018, 34(5): 219.

摘要 ( 117 )

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