生物技术通报

真菌漆酶的性质、生产、纯化及固定化研究进展

吴怡, 马鸿飞, 曹永佳, 司静, 崔宝凯

2019, 35(9): 1-10. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0614

摘要 ( 695 )

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真菌漆酶是一种性质优良的多酚氧化酶,由于在分子氧的协助下可将酚类、芳胺类化合物等多种底物氧化,最终得到水及其终产物,符合当代环保工业要求,因而在纸浆漂白、环境治理、生物检测、有机合成等领域有着巨大的应用潜力。就漆酶的生物学性质、生产、纯化、固定化等研究进展和现状进行了介绍和总结,同时对其今后的发展方向进行了展望。

表面活性剂对纤维素酶解的影响及机理

张家顺, 高丽莉, 马江山, 刘高强

2019, 35(9): 11-20. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0158

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随着能源危机和环境问题的日益紧张,寻求一种环境友好、可持续和充足的替代能源变得越来越重要。以木质纤维素生物质为原料,发酵生产生物燃料和其他生物材料的研究得到了越来越广泛的关注,而生物酶法高效降解木质纤维素是生物质转化利用的研究热点。添加表面活性剂（SF）可显著提高纤维素的酶解效率和转化率,但仍受到诸多因素的影响。综述了表面活性剂提升纤维素酶水解能力的研究现状,归纳了其种类与浓度、纤维素酶的来源与组成以及底物结构和水解条件对表面活性剂作用效果产生的影响,并从其对酶的吸附性质、酶的稳定性与活性、底物表面结构的影响等方面分析了表面活性剂提高纤维素的酶水解率和转化率的作用机制。并针对目前的研究现状,对今后应重点研究的方向进行了展望,即深入探究SF、纤维素酶与底物三者之间的分子作用力在稳定纤维素酶活性、改变酶吸附性质以及底物表面性质等方面发挥的作用,旨在为木质纤维素生物质的酶解转化研究提供理论借鉴。

施肥影响土壤性状和微生物组的研究进展

刘纪爱, 束爱萍, 刘光荣, 李祖章, 刘增兵, 高峥

2019, 35(9): 21-28. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0579

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主要介绍了土壤微生物组的研究方法,综述了施肥对土壤性状（物理性状、养分、酶活性）和土壤微生物组的影响,总结了土壤微生物丰度、多样性以及群落结构和组成对施肥的响应规律,简单概述了现阶段施肥影响土壤微生物组研究的不足,并且展望了未来的研究趋势,旨为农业生产的合理施肥提供一定依据。

昆虫共生菌介导的抗药性研究进展

段入心, 孟雷, 王宁新

2019, 35(9): 29-30. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0488

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我国是世界上最早使用农药防治农作物有害生物的国家之一,也是农药生产和使用的大国。随着化学农药在农林业生产中的广泛应用,昆虫对农药的抗性不断增加,并且已成为农业持续发展和环境保护中的重要制约因素。昆虫抗药性是指昆虫具有耐受杀死正常种群中大多数个体药量的能力,并在其种群中发展起来的现象。目前,已有600多种害虫对不同种类农药产生抗药性且抗药性增长速度呈上升趋势,研究发现昆虫共生菌与昆虫抗药性有关。这些昆虫中以双翅目和鳞翅目昆虫产生抗药性虫种数量最多。综述了昆虫抗药性机制、与昆虫抗药性相关的共生菌类群和相关研究进展,这为昆虫抗药性治理以及农药降解提供了新方向,同时也为当前植保工作奠定理论基础和提供新策略。随着分子生物学技术的快速发展,昆虫共生菌的功能研究将会有明显突破。昆虫共生菌介导的抗药性治理对于环境保护具有重要意义,也为生物防治提供新思路,同时为研究昆虫-微生物的互作奠定研究基础。

水环境微生物溯源技术的研究和应用进展

许又分, 李宗, 刘如铟, 余志晟, 张洪勋, 何炜, 李烨

2019, 35(9): 35-44. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0343

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地表水体的粪便污染是畜禽养殖业导致的主要环境污染问题之一,准确鉴别污染来源并从源头上控制畜禽动物粪便排放对于水体粪便污染治理具有重要意义。微生物溯源（Microbial source tracking,MST）是依据源指示微生物与宿主之间所具有的特异性关系来定位污染源的一类溯源技术。根据报道,多种肠道微生物可作为源指示微生物用于地表水环境的粪便污染溯源分析,并基于其表型或者基因型特征开发出多样化的检测方法,包括依赖培养的检测和不依赖培养的分子检测。从不同类型的源指示微生物入手,围绕两类主要的MST方法,即单源指示物法和多源指示物法,具体包括细菌指示物法、病毒指示物法、DNA微阵列法及高通量测序法等,重点综述了不同类型的源指示微生物及其常用的检测方法,包括其原理及优缺点,并讨论了目前MST技术所面临的问题与挑战。此外,还对现有的MST技术在美国环境保护署（U.S. Environmental protection agency,EPA）推行的最大日负荷总量（Total maximum daily load,TMDL）方案制定过程中的应用做了简要概述,并对MST技术的发展趋势进行展望,以期促进MST技术在我国环境水质监测领域中的应用。

低成本合成聚羟基脂肪酸酯（PHAs）的研究进展

邱石正, 李佳益, 杨景辰, 刘长莉

2019, 35(9): 45-52. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0398

摘要 ( 528 )

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聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates,PHAs）是微生物体内合成的一种天然的高分子生物材料,在碳源过量氮磷等其他营养条件不足的情况下可以作为微生物碳源的储备物质。因PHA同时具有良好的生物相容性、生物可降解性和热加工性能等特性逐渐成为传统石化塑料的最佳替代品。随着PHA产业化发展的不断推进,先后有四代商业化生产的PHA产品（PHB、PHBV、PHBHHx和P3HB4HB）被应用于医药、工业、农业及化工等领域,成为生物材料领域最为活跃的研究热点之一。但因其发酵底物和灭菌成本过高、生产效率和产品性能较低的问题始终没有得到有效解决,很难对石油基塑料保持较大的竞争力,使得探索出低成本合成PHA的方法尤为重要。介绍了目前PHA的主要种类及其特性、开始步入产业化的热门领域,综述了近年来在低成本合成PHA研发中,世界各国科研人员采用的构建低成本代谢途径、改造生产菌株、使用廉价发酵底物及改进发酵流程等策略的研究进展,旨为PHA早日低成本规模化代替石化塑料奠定理论基础。

气体作为电子供体的硫酸盐还原菌研究进展

祝传静, 李柳青, 黄建洪, 田森林, 胡学伟

2019, 35(9): 53-60. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0592

摘要 ( 356 )

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硫酸盐还原菌（Sulfate-reducing bacteria,SRB）在处理含硫酸盐废水具有显著优势,但其代谢过程需要电子供体的支撑。常用的有机电子供体（如乳酸盐、乙醇等）,SRB短时间内不可将其完全转化,导致出水残存COD高等问题,需后续深度处理。气体（H₂、CO₂和CO）作为SRB代谢过程的电子供体,具有单位质量电子供量大、出水残余有机物浓度低等优点而受到持续关注。主要围绕SRB利用气体作为电子供体的反应机理、影响因素（环境因子、气体传质、涉硫组分和供体竞争）、气体特性及代谢转化开展综述,并提出生化处理工程应用中亟待解决的难题,如难溶性气体传质效率、毒性气体（CO）的抑制解除、生物高效增殖及代谢活性保持等,以期为后续研究奠定相应的基础。

土建场地和建材的生物改良技术研究进展

郝大程, 鲁兰兰

2019, 35(9): 61-69. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0512

摘要 ( 577 )

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近年来,建造生物技术,尤其是建材和土建场地的生物改良技术的各个方面开始形成一个新的跨学科领域,涉及环境和工业微生物学、生物地球化学,以及生物技术在岩土工程和土木/环境工程中的多方面应用。概述土建场地和建材的微生物技术改良研究和应用进展,讨论建造相关的生物地球化学过程：生物聚集可用于控制风土侵蚀和粉尘排放;生物结壳、生物堵塞和土壤生物黏固各自具有不同的机理和使用方式;其他新颖的土地改良方式,如水饱和无黏性土壤的生物去饱和,软土的生物胶囊化和土壤污染物的生物固定化等各自具有独特的机制和优点。目前绝大多数微生物岩土工程研究仍停留在实验室阶段,需要更多努力将科学理念转化为可行的技术。因此,撰写本文目的是概述土建场地和建材的微生物技术改良研究和应用进展,讨论相关研究者和工程师需要了解的建造相关微生物过程,简要讨论各种现场应用的设计原则和注意事项。

包埋法固定钩状木霉孢子还原水体中六价铬的研究

王文婧, 卢松霖, 刘雪, 李司宇, 郝雪萌, 李媛媛, 张杰

2019, 35(9): 70-74. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0331

摘要 ( 304 )

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旨在探索固定化微生物还原六价铬的新方法,给后期固定化微生物还原六价铬提供新的研究思路。利用包埋法制备两种钩状木霉BSL01孢子包埋小球PVA-SA和PVA-SA-PDA,进一步研究两种小球的性能差异,如对水体中六价铬的还原效率以循环利用次数。结果表明,PVA-SA包埋小球对六价铬的还原效率为93.4%,可重复利用18次;PVA-SA-PDA固定小球还原六价铬效率为97.2%,可重复利用23次。两种固定化小球从第8个循环开始,3 d可以完全还原浓度为50 mg/L的六价铬,接近游离菌体还原六价铬效率的2倍。该研究首次将PDA培养基和真菌孢子制备成核壳小球,小球循环利用次数增多,且效果良好。

固定化海洋脲酶制备及其在尿素废水处理中的应用

刘长荣, 张风丽, 李志勇

2019, 35(9): 75-82. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0254

摘要 ( 357 )

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为确定合适的海洋碱性脲酶固定化方案,并对固定化脲酶的尿素废水处理效果进行评估。分别用3种材料对脲酶进行包埋,测定其固定化效果及酶学性质,并筛选出最佳方案装柱运行。结果表明：采用海藻酸钠-CaCl₂包埋效果最佳,其固定化率达61.47%,酶的最适温度从55℃提高至70℃,最适pH从8.5提升至9.5,在35-85℃保存30 min或在pH 7-10.5保持6 h后酶活仍能保持在90%以上,在4℃保存半衰期超过3个月。处理装置在70℃时,尿素废水流量达19 mL/min,且初始尿素降解率为90.25%,连续运转35 d效率不变。游离脲酶经海藻酸钠固定化后最适温度、pH及耐热性、耐碱性提升最显著;运用该固定化海洋脲酶进行尿素废水处理是除化学法外一条有效途径。

菌藻混合体系去除Cr（VI）的条件优化及Cr（VI）还原酶活性的测定

杨胜男, 刘娜, 宋东辉

2019, 35(9): 83-92. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0322

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为了高效去除废水中的Cr（Ⅵ）,从天津某印染场印染废水中筛选出两株高效除Cr（Ⅵ）细菌,探究了菌藻混合体系去除Cr（Ⅵ）的效果及优化条件,并测定了Cr（Ⅵ）还原酶活性。基于16S rRNA序列比对进行菌种鉴定。通过Placket-Burman、最陡爬坡试验、Box-Behnken实验设计及响应面法分析各因素交互作用。此外,对两株细菌Cr（Ⅵ）还原酶进行了活性测定。两株细菌属于沙雷氏菌属（Serratia）和代尔夫特菌属（Delftia）。最终确定菌藻混合体系去除Cr（Ⅵ）的最优条件为：温度29.74℃,Cu²⁺27.65 mg/L,葡萄糖含量2.41%（W/V）,丙酮酸钠2%（W/V）,接菌量7%,pH7.0,NaCl浓度为0,优化后菌藻混合体系24 h对Cr（Ⅵ）去除率达到97.89%。细菌S-3和D-7的Cr（Ⅵ）还原酶的最适温度为30℃,菌株S-3的Cr（Ⅵ）还原酶的最适pH值为6.0,酶促反应动力学常数K_m=86.94 µmol/L,V_max=2.71 µmol/（L·min）。菌株D-7中Cr（Ⅵ）还原酶最适pH值为7.0,酶促反应动力学常数K_m=103.18 µmol/L,V_max=3.38 µmol/（L·min）。菌藻混合体系通过响应面法优化后不但能提高Cr（Ⅵ）的去除率,也能缩短处理时间,在含铬废水处理方面具有良好的应用前景。

一株高效降解羽毛废弃物菌株的筛选及表达条件优化

张钰文, 袁航, 于江悦, 马晓晓, 史超硕, 李玉

2019, 35(9): 93-98. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0370

摘要 ( 359 )

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筛选和构建高效降解羽毛角蛋白的菌株,以提高角蛋白酶分泌表达量。从全国5个不同地方的猪、羊圈土壤中取样,在牛奶平板上进行初筛,以羽毛为唯一碳氮源对产角蛋白酶菌株进行复筛。通过形态学观察、16S rDNA序列分析,对菌株进行分类鉴定。为进一步提高菌株的发酵活力,筛选和优化了5个不同来源的信号肽序列（KerK、YoaW、DacB、NprE和SacB）,选用pWB980作为表达载体,构建重组质粒并转化到Bacillus subtilis WB600进行表达。获得一株高效降解羽毛的菌株M,经鉴定为芽孢杆菌（Bacillus sp.）。37℃发酵培养48 h后,菌株M角蛋白酶酶活力为21.98 U/mL。通过筛选和优化信号肽,获得含有信号肽DacB的重组菌株R3-DacB,该菌株分泌表达角蛋白酶活力最高,达到了226.34 U/mL,是初始菌株M的10倍。获得了一株降解羽毛废弃物效果较好的重组菌株R3-DacB,对角蛋白酶实现工业化生产具有重要意义。

麻山药不同生长时期根际土壤微生物多样性及群落结构特征

康捷, 章淑艳, 韩韬, 孙志梅

2019, 35(9): 99-106. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-1041

摘要 ( 343 )

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旨在研究麻山药不同生长时期根际土壤微生物动态变化规律。采用高通量测序的方法,研究了麻山药在苗期、花期和收获期根际土壤微生物群落结构的变化。结果表明细菌多样性和丰富度在不同生长时期内没有显著变化,而真菌变化趋势更为明显,从开始生长期到收获期逐渐增多,在收获期时多样性指数和丰度达到最高。变形菌门和酸杆菌门是麻山药根际细菌群落的最优菌群,两者在不同时期所占比例均超过了50%,放射毛霉属和被孢霉属是真菌群落的最优菌群,两者在不同时期所占的比例约15%,结合其他优势菌群在不同生长时期的明显变化,可以看出,这些菌群跟麻山药生长发育密切相关。

黄芪根腐病生防芽孢杆菌的筛选鉴定与盆栽防效试验

赵晓霞, 牛世全, 文娜, 苏锋锋

2019, 35(9): 107-111. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0329

摘要 ( 351 )

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黄芪根腐病是严重影响黄芪产量的病害之一,为得到对黄芪根腐病病原菌具有较强拮抗作用的芽孢杆菌,以病原菌Fusarium solaniun KR997532为靶标菌株,对本实验室筛选保存的植物病原菌的拮抗芽孢杆菌进行初筛和复筛,得到了1株具有较强拮抗作用的菌种7-2-1-6,根据菌株7-2-1-6的16S rDNA序列分析结果,结合其培养形态特征和生理生化特性,将其鉴定为枯草芽孢杆菌亚种（Bacillus subtilis subsp. Spizizenii）。菌株7-2-1-6在盆栽试验中防治效果约为68.80%,对黄芪根腐病有较好的生防效果。

蒽对3株灵芝菌株漆酶活性及其转录表达水平的影响

胡楚霄, 雷善钰, 秦艳平, 赵奕锦, 向泉桔

2019, 35(9): 112-117. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0260

摘要 ( 294 )

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探索多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs）蒽对不同灵芝菌株漆酶活性及其转录表达的影响。以3株灵芝菌株（美芝、荣保1号和川芝）为实验材料,避光静置培养5 d后,加入终浓度为1.0 mg/L的蒽,避光处理1 h、3 h、6 h、9 h和24 h,收集上清液测定漆酶活性,菌丝体样品提取RNA,分析多环芳烃蒽对漆酶活性和转录表达水平的影响。结果显示,蒽对3株菌株的漆酶活性及转录表达水平的影响均存在差异。3株灵芝菌株中,川芝的漆酶活性最高,美芝次之,荣保1号酶活最低。荣保1号漆酶活性随着处理时间的延长而上升,培养前期活性被为抑制,后期则被促进;美芝漆酶活性变化趋势类似于荣保1号,变化幅度较小;川芝漆酶活性受到强烈抑制,且随着时间的变化差异不明显。蒽处理下,美芝漆酶基因转录表达水平差异较小,大部分基因在处理9 h后出现转录表达水平峰值;荣保1号漆酶基因的表达水平类似于美芝;川芝漆酶在短期处理下,转录表达水平大幅上调,随着处理时间的延长,转录表达水平下调。3株灵芝菌株漆酶活性和漆酶基因转录表达水平对蒽的响应各不相同,其中川芝较敏感,荣保1号次之,美芝变化幅度最小,耐受力最强。

基于转录组测序的冈田绕眼果蝇aoattacin基因筛选及在昆虫细胞中表达、抑菌活性检测

蔡娟, 刘流, 王灵军, 曹建平, 郑明辉, 刘晖

2019, 35(9): 118-124. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0157

摘要 ( 347 )

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通过分析冈田绕眼果蝇转录组数据得到抗菌肽aoattacin基因,在昆虫细胞Sf9中表达并检测其抑菌活性。通过转录组分析得到抗菌肽aoattacin基因,全基因合成其序列,构建重组pFast-bac1-aoattacin载体,通过转染DH10Bac细胞获得重组杆状病毒,转染昆虫Sf9细胞,以获得P1代病毒和通过扩增获得P2代病毒,并检测基因在Sf9细胞里的表达。通过SDS-PAGE和Western Blot检测蛋白表达情况,通过最小抑菌浓度测定表达产物的抑菌活性。结果表明通过筛选转录组数据得到一个高表达aoattacin基因,在昆虫细胞Sf9中成功表达,抑菌实验显示抗菌肽Aoattacin 对受试革兰氏阳性及阴性菌等多种细菌具有抑制作用,或为一种新型广谱抗菌肽。

苏云金芽孢杆菌对PAHs的降解研究

雒晓芳, 陈丽华, 夏苗苗, 许淑娟, 熊梅

2019, 35(9): 125-133. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0879

摘要 ( 339 )

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为研究苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）在不同温度、pH、多环芳烃（PAHs）质量下对蒽芘芴的降解性能,采用单因素实验和响应面分析结合的方法,以PAHs为唯一碳源,活性炭为吸附载体,利用索氏提取法测定降解吸光度值。根据Design Expert 8.0.6.1软件中Box-Behnken design对实验结果进行分析。结果表明,温度与pH交互项对蒽、芘的降解影响显著,温度与PAHs质量交互对芴的降解影响显著。在优化实验中,蒽芘芴3物质在各自的优化条件下的降解率预期值分别为92.13%、87.08%、83.56%,与实际试验值91.60%、86.62%、82.95%相比,相对误差为±0.58%、±0.53%、±0.73%之间。3个优化模型相对误差均在2%以内,表明3个实验模型均可用于分析及预测苏云金芽孢杆菌对蒽芘芴的降解效果。

解淀粉芽孢杆菌淀粉酶催化活力改良及其在枯草芽孢杆菌中的高效表达

邱锦, 黄火清, 姚斌, 罗会颖

2019, 35(9): 134-143. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0234

摘要 ( 401 )

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α-淀粉酶（α-amylase）是一类作用于淀粉内部水解其α-1,4糖苷键从而将淀粉水解为糊精、低聚糖和单糖的酶。该类酶已被广泛应用于面包生产及洗涤等工艺中。从分子水平上改造淀粉酶,以提高水解活力及催化效率,已经成为多年的目标,也具有重要的研究意义。以目前广泛应用的来源于解淀粉芽孢杆菌的中温中性淀粉酶BAMYA出发,通过理性设计在该淀粉酶的C端结构域设计突变位点,利用定点突变提高其水解活力,并在枯草芽孢杆菌中实现高效表达。野生型酶BAMYA的最适作用温度和pH分别为55℃和6.0,比活为6 835 U/mg。突变体BAMYA-L473K/K474H/N475K最适作用温度为60℃,较野生型提高了5℃,作用的最适pH没有发生变化。突变体比活为10 148 U/mg,比野生型提高48%。野生型BAMYA和突变体BAMYA-L473K/K474H/N475K的Km值、催化效率分别为3.58 mg/mL和2.21 mg/mL,以及1 577 mL/（s·mg）和4 760 mL/（s·mg）。催化效率较野生型相比提高了2倍以上。该突变体应用于工业生产可有效提高其水解效率,降低应用成本。

马西利亚菌B260的分离鉴定及促进育苗的效果

郭宇泽, 丁雪敏, 姚岚, 许德敏, 赵雨洁, 冯福应, 孟建宇

2019, 35(9): 144-149. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0683

摘要 ( 590 )

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马西利亚菌广泛分布于植物根际,但目前仍缺乏其促进育苗效果的研究。分析马西利亚菌株 B260促进育苗效果,以期为该菌株的实践应用提供理论依据。以涂布划线分离培养根际细菌;基于16S rRNA 基因序列同源性分析,对菌株进行初步分类鉴定;基于选择性培养基分析菌株的固氮、解植酸磷、解无机磷、产ACC脱氨酶、产铁载体和产IAA等植物促生性状和能力;设置 2 组处理（含基质中添加菌株 B260的处理,pB260;不添加 B260 的空白处理,CK）;采用穴盘育苗比较分析不同处理下番茄、黄瓜、甘草及黄芪的幼苗生长性状。菌株 B260 的 16S rRNA 与 Massilia plicata 76^T的相似性最高（99.85%）,初步确定其为马西利亚菌;B260 具有含固氮、解磷、产激素、产铁载体和 ACC 脱氨酶在内的植物促生性状,其中固氮和解无机磷的能力较强;相比 CK,pB260 提高了番茄、黄瓜、甘草和黄芪的发芽率、株高、根长、干重和鲜重,特别是根长分别提高了 6.71%、5.41%、12.28%和 15.79%。菌株 B260 为马西利亚菌（Massilia）,具有多种植物促生性状,可促进育苗并作为育苗基质用菌种。

孔雀石绿降解菌群多样性及高效降解菌的降解特性分析

王亚妮, 宋金龙, 韩刚, 穆迎春, 江旭, 王金耀, 阮志勇, 李乐

2019, 35(9): 150-155. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0135

摘要 ( 384 )

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以三苯甲烷类染料孔雀石绿为唯一碳源,通过连续传代驯化,拟获得能够降解孔雀石绿的富集培养物。运用高通量测序对富集培养物进行了微生物群落区系变化分析,获得了与降解相关的微生物信息,进一步分离纯化到了1株孔雀石绿高效降解菌株。该菌7 d内对50 mg/L孔雀石绿降解效率达91.2%。经初步鉴定,该菌为Pseudomonas菌属菌株,并命名为Pseudomonas veronii JW3-6。对该菌进行了降解条件优化,结果表明菌株最适降解温度为30℃,pH为7,接种浓度为1×10⁷ CFU/mL。

石油烃降解菌对邻苯二酚、苯甲酸钠降解特性的研究

刘娜, 刘志敏, 宋东辉

2019, 35(9): 156-164. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0578

摘要 ( 511 )

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邻苯二酚和苯甲酸是苯类化合物代谢过程中两种常见的中间产物,也是工业废水中常见的环境污染物。为了高效去除苯类污染物,考察了高效降解石油中芳香烃组分的菌株Acinetobacter sp. Tust-DM21对邻苯二酚和苯甲酸钠的降解,并通过邻苯二酚1,2-双加氧酶（C12O）的粗酶特性和苯甲酸1,2-双加氧酶的酶活初步研究其代谢过程。在不含碳源无机盐培养基中,菌株Tust-DM21能够分别以邻苯二酚和苯甲酸钠为唯一碳源进行生长。通过改变接菌量、底物浓度、pH、温度等方面对该菌降解这两类苯类物质的特性进行研究,对C12O的最适pH、温度和动力学参数以及苯甲酸1,2-双加氧酶的酶活进行分析。菌株对邻苯二酚的最大耐受浓度为700 mg/L,菌株降解600 mg/L邻苯二酚的最佳条件为：接菌量5%、pH6.0、温度35℃,降解率达92%以上。菌株可耐受4 500 mg/L苯甲酸钠,降解浓度为1 500 mg/L苯甲酸钠的最佳条件为：接菌量3%、pH8.0、温度35℃,降解率达95%以上。C12O的最适pH为8.0,温度35℃,其动力学参数为K_m=25.68 μmol/L,V_max=0.131 mol/（mL·min）;苯甲酸1,2-双加氧酶的酶活为3.53 U。该菌对邻苯二酚、苯甲酸钠有良好的降解效果,具有潜在的应用前景。

堆肥过程中纤维素降解菌的分离与鉴定

李林超, 张超, 董庆, 郭成, 周波, 高峥

2019, 35(9): 165-171. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0581

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为了解决好氧堆肥中秸秆降解缓慢的问题,从玉米秸秆堆肥中筛选高效降解纤维素的菌株。采用平板稀释法并结合刚果红染色法对玉米秸秆堆肥中的纤维素降解菌进行初筛,通过滤纸条崩解实验进行复筛,筛得滤纸崩解能力较高的2株放线菌C31和C37,经鉴定分别为放线菌（Streptomyces drozdowiczii）和黄麻链霉菌（Streptomyces corchorusii）;1株细菌GD16,经鉴定为类芽孢杆菌（Paenibacillus pabuli）。对3株菌株进行了酶活的定量测量,其中菌株C31具有的纤维素酶活性和滤纸酶活性最高,分别为4.8 U/mL、3 U/mL,菌株GD16具有的木聚糖酶活性最高可达到23 U/mL。结果显示菌株C31、C37和GD16均具有纤维素酶活性、滤纸酶活性和木聚糖酶活性。

一株木质素降解菌的鉴定及其降解特性

胡笑峰, 张朵朵, 周云横, 卫亚红, 陈少林

2019, 35(9): 172-177. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0207

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为丰富木质素降解优良菌株种质资源,以碱木质素为唯一生长碳源并采用苯胺蓝和考马斯亮蓝脱色法从落叶覆盖的土壤中分离和筛选具有木质素降解能力的细菌。通过16S rRNA基因序列分析对菌株进行鉴定。使用紫外分光光度法测定其木质素过氧化物酶（LiP）、锰过氧化物酶（MnP）及漆酶（Lac）活力以及变化趋势。使用扫描电镜观察木质素样品在降解过程中的形貌变化。筛选得到1株木质素降解细菌QL-Z3,经鉴定命名为Erwinia sp. QL-Z3。在以碱木质素为唯一碳源的液体碱木质素培养基中发酵48 h,菌体生长达到稳定期,OD₆₀₀达到0.31,发酵72 h,木质素降解率为14.23%。木质素降解相关酶活力在发酵48 h和60 h达到峰值：发酵60 h Mnp达到263.83 U/L;发酵48 h Lip和Lac分别达到104.11 U/L和77 U/L。扫描电镜观察到菌株能够对木质素样品进行解聚,破坏木质素结构,使其裂解成细小的碎片。较为系统地揭示了菌株Erwinia sp. QL-Z3的木质素降解性能,该菌株可作为木质素降解的优良备选菌株。

一株聚丙烯酰胺降解菌的筛选及降解特性研究

刘宇程, 邱恋, 梁晶晶, 李玲丽, 马丽丽

2019, 35(9): 178-183. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0292

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从含聚丙烯酰胺（Polyacrylamide,PAM）污泥中筛分出一株聚丙烯酰胺降解菌,该菌能同时以PAM为唯一碳源和唯一氮源生长。在PAM起始浓度为1.2 g/L、温度为35℃、pH为7.0时,PCX菌株（接菌量5%）在48 h内对PAM的降解率可达43%。经生理生化和16S rDNA序列分析,确定该菌株为克雷伯氏菌属（Klebsiella sp.）,命名为PCX。聚丙烯酰胺（分子量：3×10³ kD）降解后其产物分子量为0.619 kD。结合红外光谱结果,推断其分子链上的酰胺基水解成羧基,侧链降解。生物急性毒性分析结果表明,其EC₅₀为106 mg/L,说明降解产物对水生生物无毒害作用。

一株耐盐对硝基苯酚降解菌的分离及其降解机理研究

任磊, 刘斌, 蔺中, 甄珍, 刘月廉, 胡汉桥, 闫艳春

2019, 35(9): 184-193. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0286

摘要 ( 398 )

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旨在分离获得可高效降解对硝基苯酚的海洋细菌,并系统阐明菌株对对硝基苯酚的降解机理。通过唯一碳源法进行富集、驯化和分离获得可降解对硝基苯酚的海洋微生物,通过单因素试验对菌株的环境适应性进行研究,基于代谢中间产物的质谱分析推测菌株降解对硝基苯酚的代谢途径,通过基因克隆获得参与对硝基苯酚降解的基因。分离获得一株可高效降解对硝基苯酚的海洋细菌RL-JY1,该菌72 h内对100 mg/L对硝基苯酚的降解率为100%。基于形态学、生理生化特征与16S rRNA基因序列分析,确定菌株RL-JY1为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）。菌株RL-JY1在温度为20、30和40℃时,72 h内对100 mg/L对硝基苯酚降解率分别为97.2%、100%和100%;在初始pH为6.0、7.0、8.0和9.0时,72 h内对100 mg/L对硝基苯酚降解率分别为64.7%、100%、97.2%和84.2%;在NaCl浓度为0-8%（W/V）之间,72 h内对100 mg/L对硝基苯酚的降解率均为100%,在NaCl浓度为10%和12%时,72 h内对100 mg/L对硝基苯酚的降解率分别为81.3%和50.6%。通过代谢中间产物的质谱分析与鉴定,推测了菌株RL-JY1对对硝基苯酚的代谢途径为典型的偏苯三酚途径。基于已有报道对硝基苯酚降解相关基因设计引物,从菌株RL-JY1基因组中克隆获得参与对硝基苯酚向马来酰乙酸转化的基因pnpABC,序列比对结果表明所获得的pnpABC基因与P. putida DLL-E4所报道的序列相似性在99%以上。对硝基苯酚降解菌RL-JY1为恶臭假单胞菌（P. putida）,该菌对环境温度、pH及盐离子浓度具有较好的耐受能力,且通过偏苯三酚途径对对硝基苯酚进行降解,菌株基因组中含有参与对硝基苯酚降解的pnpABC基因。

一株耐高温亚硝酸盐型反硝化细菌的鉴定及脱氮特性

李誉琦, 马佩钰, 刘涵, 王灵芝, 高仁玲, 李慧娟

2019, 35(9): 194-201. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0130

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亚硝酸盐具有一定的生理毒害作用,适于高浓度亚硝酸盐氮脱除的反硝化细菌的筛选及其性能研究对于废水处理具有重要意义。通过富集培养、平板初筛、摇瓶复筛从水产养殖厂废水中筛选反硝化细菌,经生理生化和16S rRNA分子生物学鉴定,确定菌株的种属;对碳源种类、亚硝酸盐浓度、pH、装液量、接种量、种龄、温度等因素对菌株降解亚硝酸盐的影响进行研究,提高菌株脱除亚硝酸盐氮的效率。鉴定结果所筛选菌株Y7隶属于芽孢杆菌属,将其命名为Bacillus subtilis Y7。单因素优化的结果为：以甘油为最适碳源、起始pH 7.0、250 mL三角瓶中装液量100 mL、种龄24 h且菌液（OD₆₀₀=1.5）的接种量为10%、在30℃条件下170 r/min发酵培养24 h后,菌株Y7对1 100 mg/L亚硝酸盐的降解率达到100%。菌株Y7不仅耐受高达1 100 mg/L的亚硝酸盐,而且50℃的高温也不影响其降解亚硝酸盐的效率。菌株Y7适合处理含高浓度亚硝酸盐的高温工业废水及夏季的水产养殖废水。

一株高效好氧反硝化细菌的分离鉴定及脱氮性能研究

李文甫, 杜柳冰, 刘思莹, 翁美遂, 舒琥, 陈琼华

2019, 35(9): 202-209. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0339

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从广州市西朗珠江水产研究所养殖池中分离新型好氧反硝化细菌,旨为开发新型生物脱氮工艺奠定基础。利用3种不同筛选培养基分离好氧反硝化细菌,测定在单一氮源培养基中发酵的生长曲线和脱氮性能,通过形态和16S rRNA基因序列分析对菌株进行鉴定并构建系统发育树。分离得到一株高性能好氧反硝化菌株BB-17,该菌株在单一氮源培养基中以28℃,180 r/min振荡培养时,其对数期出现在6-24 h,氨氮去除率在18 h达93.92%,硝态氮去除率在48 h达66.11%,亚硝态氮去除率在48 h达99.10%。BB-17为革兰氏阴性短杆菌,16S rDNA序列分析结果与Pseudomonas vancouverensis（AJ011507）比对具有98.41%同源性,确定BB-17为假单胞菌属并命名为Pseudomonas sp. BB17。

基于LAMP的好氧反硝化菌筛选及其反硝化性能

李秋芬, 刘启臣, 徐爱玲, 张艳, 宋志文

2019, 35(9): 210-217. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0555

摘要 ( 277 )

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为了快捷、精确的筛选海水好氧反硝化菌株,应用专用软件设计了nirS基因、nirK基因和nosZ基因的环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）引物,利用特异性的LAMP反应体系,对候选好氧反硝化菌株进行初筛,再用PCR法、产气检测法进行复筛,并对筛选出的反硝化菌株进行了反硝化性能测试。结果显示,通过LAMP体系在60℃下反应60 min、GeneFinder^TM核酸染料直接染色法对扩增产物进行观察,从好氧培养条件下分离的候选菌株中筛选出KFDX1、KFDX2、KFDX3、KFDX4、KWDX1、FJ3-1和FJ3-2等7株同时含nirS基因或nirK基因和nosZ基因的好氧反硝化菌株初选菌株;PCR的筛选结果与LAMP体系筛选结果一致,经产气检测,其中有6株产气,最终筛选出KFDX1、KFDX2、KFDX3、KWDX1、FJ3-2 5株可产N₂的好氧反硝化菌。反硝化性能测试结果表明,24 h后,这5株菌对NO₂-N和NO₃-N的去除率分别达到99%和90%以上,最大去除速率分别可高达4.9 mg/（L·h）和4.03 mg/（L·h）。这对改进反硝化菌株的筛选方法和推动其在废水处理中的应用具有重要意义。

伊犁野核桃内抑菌抗氧化内生真菌的分离、筛选和鉴定

让凤菊, 任艳利, 张维, 欧阳艳

2019, 35(9): 218-223. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0443

摘要 ( 345 )

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旨在从伊犁野核桃中分离抑菌活性、抗氧化性较强的内生真菌,并鉴定其种属。采用组织块分离野核桃内生真菌,通过平板对峙法进行抑菌活性实验,同时检验其DPPH自由基清除能力,并对其进行菌种鉴定。结果显示,（1）从野核桃中分离出49株内生真菌,茎部数量最多;根部次之,果仁未分离到;（2）菌株YHT-6和YHT-4抑菌效果显著,对4种供试菌株抑菌指数都大于10,YHT-4对4种供试菌株的抑菌直径均超过1.4 cm;（3）菌株YHT-4清除DPPH自由基能力较强,与Vc相当;（4）经形态学和分子学初步鉴定菌株YHT-4为三线镰刀属（Fusarium tricinctum）。分离得到的菌株YHT-4具有较强的抑菌、抗氧化活性,可作为药物开发的潜在来源进行进一步研究。

内蒙古呼伦贝尔地区的可培养黏细菌及其抗菌活性

王雪寒, 马强, 田媛, 胡靖, 刘惠荣

2019, 35(9): 224-233. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0210

摘要 ( 328 )

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从内蒙古呼伦贝尔地区采集土壤样品,测定其环境参数,采用大肠杆菌划线、兔粪诱导及滤纸诱导3种方法对20份土壤样品进行黏细菌的分离纯化及鉴定,再通过平板对峙法确定其抗菌活性,最后用统计学方法进行分析。结果表明,呼伦贝尔地区土样整体呈酸性,含水量较低,且土壤养分含量不均衡。共得到了41株黏细菌,分属于4个属,包括Myxococcus、Corallococcus、Cystobacter和Archangium,优势菌属为Myxococcus。在土壤类型为黑土以及利用方式为草地的样品中黏细菌表现出较丰富的多样性。黏细菌分布与环境因子之间未表现出显著的相关性。所有黏细菌均抑制马铃薯晚疫病菌生长且溶解大肠杆菌,对枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、核盘菌、立枯丝菌和尖孢镰刀菌均无抑制作用,有3株抑制金黄色葡萄球菌的生长。这些研究结果说明内蒙古呼伦贝尔地区的可培养黏细菌资源比较丰富且具有显著的抗马铃薯晚疫病菌活性,为该地区黏细菌资源的深入研究及开发提供了基础数据。

嗜水气单胞菌孔蛋白OmpF重组表达及其免疫原性分析

高云山, 刘丹丹, 徐俊林, 桑雨浓, 梁夏夏, 刘建欣, 王文彬

2019, 35(9): 234-243. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0628

摘要 ( 421 )

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气单胞菌外膜蛋白OmpF是β-桶状结构的孔蛋白,参与渗透压环境适应调控,在人鱼共患病原气单胞菌属中保守性较高,作为免疫检测靶点具有较高的研究价值。通过人工合成得到了GenBank已发表的嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）OmpF基因片段,将其插入质粒pET-28a（+）后转入大肠杆菌BL21（DE3）,经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后表达出分子量为40 kD左右的重组蛋白。经过优化表达温度和IPTG诱导浓度等后,重组蛋白主要以包涵体的形式表达。采用纯化的包涵体免疫BALB / c小鼠,ELISA结果表明小鼠血清与煮沸灭活的11株气单胞菌中的10株（10/11）均有特异性交叉反应,效价在1∶81 000,与副溶血性弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌及地衣芽孢杆菌无交叉反应。上述结果表明重组蛋白OmpF具有较好的免疫原性和气单胞菌保守性,可以用于制备气单胞菌交叉型抗体。

嗜水气单胞菌OprM蛋白的克隆表达与免疫保护作用评价

毛然然, 李小艳, 武瑶, 张丽珊, 林镇平, 林向民

2019, 35(9): 244-248. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0319

摘要 ( 359 )

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嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是一种常见的条件致病菌,控制该菌在水产养殖业中的危害是当前亟待解决的问题。利用克隆表达等分子生物学手段,获得嗜水气单胞菌 ATCC 7966 OprM 纯化蛋白,肌肉注射斑马鱼后对其免疫相关基因的转录水平进行检测,探索其免疫应答效果。结果显示大多数免疫相关基因表达上调,表明OprM蛋白在斑马鱼体内能够产生较好的免疫应答。进一步利用嗜水气单胞菌强毒株LP-2对免疫后斑马鱼进行攻毒实验,发现注射OprM蛋白后相对免疫保护率达89.47%,以上结果表明嗜水气单胞菌外膜蛋白OprM对斑马鱼具有较高的免疫保护性,是一种潜在的嗜水气单胞菌候选疫苗。

酸性矿业废水对土壤剖面中氮代谢功能基因丰度的影响

李慧, 查建军, 孙庆业

2019, 35(9): 249-256. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-1094

摘要 ( 334 )

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土壤中微生物介导的氮转化过程一直是环境土壤学和土壤微生物学研究的热点,土壤污染能显著影响土壤中氮的转化过程。强酸、高盐和富含重金属的酸性矿业废水（Acid mine drainage,AMD）的排放导致农田土壤污染严重,但目前AMD对土壤中氮代谢的影响还鲜有报道。以安徽铜陵一处受AMD污染的稻田土壤为对象,基于分子生物学技术,测定AMD污染稻田土壤剖面中微生物量及参与N转化的功能基因丰度,探讨了受AMD污染的稻田土壤中影响功能基因丰度的主要因素。结果表明：AMD污染的稻田土壤中,细菌和古菌的生物量随剖面深度的增加而降低,表层土壤（0-10 cm）中参与N转化的功能基因丰度最高;土壤剖面中amoA-AOA基因的丰度大于amoA-AOB,nirK基因丰度大于nirS,amoA-AOA和nirK是AMD污染土壤剖面中氨氧化和反硝化作用的主要功能基因;与未污染土壤相比,AMD污染的稻田土壤剖面中nifH基因丰度显著降低,而nirS基因丰度显著升高;pH与nirS、amoA-AOA及HZO呈极显著负相关,铁的含量与细菌和古菌数量,以及功能基因nosZ、amoA-AOA和HZO丰度呈极显著负相关。酸性矿业废水污染农田土壤中功能基因丰度与剖面深度和土壤理化性质关系密切。

2019, 35(9): 257-257.

摘要 ( 139 )

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