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2019年 第35卷 第8期    刊出日期：2019-08-26

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研究报告

全基因组小麦PPR基因家族鉴定及表达分析

郭彩娟, 公杰, 刘永杰, 赵昌平, 高世庆, 吴华伟

2019, 35(8):  1-8.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0165

摘要 ( 445 )   HTML   PDF (5721KB) ( 773 )  

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旨在筛选对二系杂交小麦杂交种具有育性恢复功能的PPR（Pentatricopeptide repeats）基因,以期进一步研究PPR基因的功能及调控机制。通过对小麦全基因组数据进行生物信息学分析,获得了1 351个小麦PPR成员,并对该基因家族进行了染色体定位与分布分析及进化树构建。通过与已报道的水稻育性恢复基因进行同源比对分析,候选了23个育性恢复相关PPR基因。进一步对高、低2种不同类型恢复系、不育系及杂交种减数分裂期幼穗取样,对23个育性恢复相关PPR基因进行实时荧光定量PCR表达模式筛选鉴定。结合结实率等重要农艺性状表型分析发现,4个PPR基因在高恢复系杂交组合中表现出了明显的超亲表达模式,相应地,这4个基因在低恢复系杂交组合中基本呈现低亲的表达模式。初步确认了4个可能参与调控二系杂交小麦杂交种的育性恢复基因。

马铃薯黑痣病菌拮抗菌的筛选鉴定及生防因子分析

宋本超, 赵冬梅, 杨志辉, 张岱, 赵志, 朱杰华

2019, 35(8):  9-16.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0084

摘要 ( 342 )   HTML   PDF (2762KB) ( 344 )  

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应用平板对峙法从马铃薯根际土中筛选得到9株对马铃薯黑痣病抑菌效果较好的生防菌。采用形态学、生理生化特征及16S rDNA（Gen-bank MK271286）和gyrB（Gen-bank MK295695）序列分析对其中抑菌效果最好的菌株Z17-2鉴定为解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens。测定其抑菌谱的结果证明其对黑痣病菌、早疫病菌、枯萎病菌、干腐病菌、疮痂病菌有抑制作用,对黑胫病菌无抑制作用。通过测定其产脂肽、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、铁载体及解磷解钾能力,确定菌株Z17-2含有sfp、fenB、bacD、mycB等脂肽合成基因,能够产生蛋白酶、铁载体、纤维素酶,不能产生果胶酶,不具有解磷解钾能力。通过带毒培养基确定脂肽粗提物的抑菌能力达到70.38%。

生菜连作及生菜-菠菜轮作对土壤细菌群落结构的影响

洪洁, 康建依, 刘一倩, 高秀芝, 易欣欣

2019, 35(8):  17-26.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0182

摘要 ( 368 )   HTML   PDF (3624KB) ( 662 )  

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以生菜连作和生菜-菠菜轮作不同次数的土壤样品为材料,研究比较生菜不同种植方式下土壤细菌群落的差异。采集0-20 cm深度土壤样品,分别提取样品总DNA,采用高通量测序技术分析生菜种植前后土壤样品中细菌多样性。测序结果经过质控过滤,共获得有效序列46 865条,对相似水平为97%的OTU进行生物信息统计分析,共得到OTU 21 692个。Heatmap图和群落组成分析显示,样品共检测到细菌40个门,89个纲,190个目,371个科,693个属,其中变形菌门、厚壁菌门和放线菌门在连作过程中占比逐渐下降,而在轮作过程中较为稳定。另外,壤霉菌属、节细菌属、黄杆菌属、溶杆菌属及微细菌属等有益菌属逐渐成为轮作土壤样品中的优势菌属。主成分分析结果表明,轮作和连作土壤样品差异明显。生菜在连续种植第5次后,产量和过氧化氢酶活性分别下降了24.1%和20.7%,出现连作障碍,而轮作生菜产量和过氧化氢酶活性较连作分别提高了49.6%和10.5%。菠菜-生菜轮作土壤中细菌类群具有丰富的多样性,随着轮作的增加有上升的趋势,可在一定程度上缓解生菜连作过程中出现的问题。

一种耐盐促生菌筛选、鉴定及对玉米幼苗生长的影响

孙培, 王罡, 张亚楠, 李倩, 季静, 杨丹, 袁东, 王畅, 王昱蓉, 王萍

2019, 35(8):  27-33.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0145

摘要 ( 343 )   HTML   PDF (4906KB) ( 661 )  

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采用10%盐浓度的LB培养基从玉米根际筛选并分离出一株能够耐高盐的细菌菌株,利用形态特征和16S rDNA序列对该菌进行鉴定并分析其促生特性,通过盆栽试验研究在盐胁迫下,该菌株对玉米幼苗生长的影响。研究结果表明,该菌为嗜根考克氏菌Y1,具有溶磷性;在正常条件下,将嗜根考克氏菌Y1定殖在玉米幼苗根际上,株高和根长变化量分别增加了44.96%和49.45%左右,总叶绿素含量提高了74.44%左右,而MDA的含量降低了0.65倍左右;在盐胁迫下,株高和根长变化量分别提高了1.2倍和1.17倍左右,总叶绿素含量提高了56.24%左右,CAT活性提高了0.9倍左右,而MDA含量降低了0.34倍左右。结果表明,嗜根考克氏菌Y1可以作为生物肥料应用于盐渍化土壤中,缓解盐对玉米幼苗生长的抑制,促进玉米幼苗的生长。

与内生真菌共培养对葡萄果肉细胞生理生化影响的差异研究

禹满, 陈竞超, 瞿巾卓, 刘芳, 潘小霞, 杨明挚

2019, 35(8):  34-41.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0211

摘要 ( 291 )   HTML   PDF (1809KB) ( 230 )  

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根据与内生真菌共培养过程中对葡萄细胞生理生化的影响差异将内生真菌菌株归类,筛选出具有不同利用价值的内生真菌资源。以分离于玫瑰蜜、赤霞珠和夏黑葡萄叶片的18个属47株内生真菌和佳美葡萄（Vitis vinifera L. cultivar：Gamay）果肉愈伤组织为试验材料,构建内生真菌与葡萄细胞共培养体系,并探索这些内生真菌菌株对葡萄果肉细胞生长、花色苷含量、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性等的生理生化影响。结果表明,与不同内生真菌共培养对葡萄细胞生长、花色苷总量和PAL活性都有不同程度的影响。其中共筛选出20株对葡萄细胞伤害较小的内生真菌;6株显著促进葡萄细胞生长的内生真菌;11株显著促进葡萄细胞PAL活性的内生真菌;5株促进葡萄细胞花色苷总量的内生真菌。此次研究为发掘和利用内生真菌资源调控葡萄生化品质特征提供了技术参考和一定的物质基础。

一株产毒曲霉拮抗细菌的筛选、鉴定及抑菌活性研究

刘端木, 吴怿, 刘沄, 梁志宏

2019, 35(8):  42-50.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0074

摘要 ( 361 )   HTML   PDF (4526KB) ( 263 )  

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为获得同时抑制产毒赭曲霉（Aspergillus ochraceus）和黄曲霉（Aspergillus flavus）生长的拮抗菌株,充分开发利用有益微生物资源。从种植园土壤和赤豆（Vigna angularis）中分离筛选拮抗赭曲霉和黄曲霉的细菌,通过形态学、生理生化反应、16S rDNA序列同源性及特异PCR鉴定其种属;并研究菌株发酵上清液的抑菌稳定性等指标。结果显示,从种植园土壤中筛选出同时抑制赭曲霉和黄曲霉生长的拮抗细菌SC-B15,对赭曲霉和黄曲霉抑菌率分别达到47.30±13.17%和52.44±2.78%,鉴定结果为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。其上清液对赭曲霉和黄曲霉的抑菌圈直径分别为15.03±2.66 mm和13.95±2.62 mm。抑菌物质在20-40℃,pH 6-10条件下保持稳定,对胰蛋白酶和木瓜蛋白酶不敏感,显微检测赭曲霉和黄曲霉菌丝均出现异常。分离自土壤的B. amyloliquefaciens SC-B15菌株及其上清液可以有效抑制产毒赭曲霉和黄曲霉,对食品及饲料的防霉抑菌具有一定的开发应用价值。

Ensifer meliloti 1021烟酰胺酶的酶学特性及3-氰基吡啶调控机理的研究

郭静静, 郭磊磊, 赵云岫, 戴亦军

2019, 35(8):  51-58.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0027

摘要 ( 271 )   HTML   PDF (2405KB) ( 190 )  

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克隆和异源表达固氮菌Ensifer meliloti 1021烟酰胺酶（NAMase）,研究其酶学特性,并探究3-氰基吡啶（3-CP）对该酶的调控机制。PCR扩增获得E. meliloti 1021烟酰胺酶基因（nam）序列,构建含nam的重组质粒并导入 Escherichia coli Rosetta;（DE3）中异源表达,用Ni-NTA亲和层析纯化蛋白,探究温度、pH、有机溶剂及金属离子对NAMase活性的影响,并对烟酰胺酶进行了固定化研究。结果显示,克隆得到长636 bp的nam,编码的蛋白分子量为22.6 kD,等电点（PI）为5.5。NAMase的最适pH为7.0,在30-50℃温度范围内孵育2 h酶活维持在97.1%以上,最适温度在30-70℃。Ag²⁺和异戊醇对NAMase的活性抑制率最大。在E. meliloti 1021野生菌株及NAMase过表达菌株转化烟酰胺的过程中3-CP会抑制烟酸的产量,这种效应并非底物抑制作用。

粟酒裂殖酵母蛋白Atp4定位和功能的研究

李琴, 张琳琳, 黄鹰

2019, 35(8):  59-63.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0111

摘要 ( 299 )   HTML   PDF (3085KB) ( 376 )  

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研究粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中Atp4的定位和参与线粒体功能的机制。借助于基因敲除、荧光显微镜观察、线粒体提取、生化试剂处理和Western blotting等技术开展研究。在甘油培养基上,Δatp4突变菌株表现出生长缺陷,是线粒体呼吸缺陷菌;Fluorescence microscope观察到用GFP标记的Atp4和线粒体是共定位的;采用生化试剂TritonX-100和蛋白酶K处理以及碳酸钠处理Atp4-Flag和yHL6381线粒体,结果表明Atp4定位在线粒体内膜;Western blotting实验结果表明Atp4缺失导致Cob1、Cox1、Cox2和Atp6表达量剧烈下降,Cox3和Cox4蛋白表达量也有略微下降。综上所述,Atp4在线粒体内膜发挥功能,对于维持线粒体编码蛋白的正常表达至关重要,是线粒体呼吸链功能的发挥所必需的。

丁酸氧化菌群对抗生素及活性炭协同作用响应

冯高, 张昱晨, 苟敏, 陈娅婷

2019, 35(8):  64-76.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0271

摘要 ( 324 )   HTML   PDF (4111KB) ( 417 )  

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本研究构建了以丁酸为唯一碳源的厌氧消化反应器,利用16S rRNA基因测序技术分析氯四环素（Chlortetracycline,CTC）单独抑制及CTC与颗粒活性炭（Granular active carbon,GAC）协同作用下,互营丁酸氧化微生物群落结构的动态变化,探究环境胁迫下微生物之间的相互作用及其对CTC及CTC和GAC协同作用的响应。结果表明,原始反应器群落中,已知的互营丁酸氧化菌Syntrophomonas（11.6%）和乙酸营养型产甲烷古菌Methanosaeta（48.5%）分别在细菌和古菌群落中占主导优势。添加40 mg/L和50 mg/L CTC条件下,甲烷产量分别降低40.4%和49.3%。Syntrophomonas对CTC表现出耐受性,但与其呈正相关联系的细菌（如unclassified Firmicutes和unclassified Comamonadaceae）以及乙酸氧化菌Tepidanaerobacter活性被CTC明显抑制,从而影响丁酸降解率,同时造成代谢产物积累,导致产甲烷量降低。单独添加GAC以及在40 mg/L和50 mg/L CTC抑制下添加GAC,甲烷产量分别降低2.9%、48.5%和64.7%。共现网络分析结果显示,添加GAC明显增强了Geobacter以及与其呈正相关联系的细菌（Azonexus等）的活性。而产甲烷古菌Methanosaeta和Methanoculleus与Azonexus等大部分细菌呈负相关,因此,添加GAC可能间接影响了产甲烷古菌的活性。

基于三种碳源筛选低温纤维素降解菌及其复合系的降解能力分析

孟建宇, 冀锦华, 贾丽娟, 郭慧琴, 陶羽, 冯福应

2019, 35(8):  77-84.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0956

摘要 ( 335 )   HTML   PDF (3892KB) ( 264 )  

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分别以微晶纤维素、羧甲基纤维素（Carboxymethylcellulose,CMC）和D-水杨苷三种不同碳源在4℃下对呼伦贝尔森林土壤中的低温纤维素降解细菌进行筛选,将酶活性高的菌株分别混合构建低温降解复合系并测定其滤纸降解能力。结果共分离到172株低温纤维素降解细菌,以微晶纤维素、CMC为碳源分离到的细菌均分属于4个纲,以D-水杨苷为碳源分离到的细菌分属于6个纲,第一优势菌纲均为γ-Proteobacteria,比例分别为54%、48%和55%,其次为α-Proteobacteria,比例分别为28%、26%和34%;第一优势菌属均为Pseudomonas,比例分别为35%、26%和26%,以微晶纤维素为碳源分离到的细菌第二优势菌属为Rhizobium,比例为15%,以CMC为碳源筛到的细菌第二优势菌属为Rhizobium 和Oerskovia,比例为12%,以D-水杨苷为碳源分离到的细菌第二优势菌属为Lelliottia比例为19%。构建的27个低温降解复合系中滤纸酶活性最高的降解复合系为组合D13'1"和D13'2",酶活性可达158.02 U/mL,是其复合系中单菌株的5-10倍,为低温降解复合系最优菌群组合,具有较高的应用潜力。

抗氧化基因过表达提高运动发酵单胞菌糠醛耐受性

闻远, 夏娟, 戚良华, 刘小伟, 刘晨光, 白凤武

2019, 35(8):  85-94.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0040

摘要 ( 343 )   HTML   PDF (2539KB) ( 347 )  

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糠醛是木质纤维素水解液的主要抑制物,能诱发活性氧自由基（Reactive oxygen species,ROS）产生。探索抗氧化基因对于糠醛耐受性的影响有助于改善菌株表型。过表达运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis 自身的NADH氧化酶（ZMO1885）、NADP⁺还原酶（ZMO1753）和谷胱甘肽还原酶（ZMO1211）基因,检测胞内ROS、NADH/NAD⁺以及其耐受性能。结果表明,在2 g/L糠醛条件下,相比对照菌株,ZM4/ZMO1885的胞内ROS降低了52.1%,生物量提高了38.9%,且未引起胞内辅因子扰动。过表达ZMO1753和 ZMO1211没有显著提高菌株耐受性。在模拟木质纤维素水解液中,ZM4/ZMO1885的生物量较对照菌株提高了46.9%,糖耗速率提高了110.3%,乙醇生产力提高了195.2%。综上,过表达抗氧化酶基因能够影响糠醛胁迫耐受性,其中过表达ZMO1885不仅不影响细胞正常生长,还能降低ROS水平,提高糠醛去除率,改善了细胞的糠醛耐受性。

铜耐受定向驯化强化嗜酸喜温硫杆菌浸出贫黄铜矿

崔亚铨, 冯守帅, 黄兴, 陈金才, 杨海麟

2019, 35(8):  95-102.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0103

摘要 ( 292 )   HTML   PDF (4020KB) ( 210 )  

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生物浸出贫黄铜矿后期,累积的Cu²⁺会对微生物产生胁迫效应从而影响浸出效率,因此该类微生物的铜耐受性定向驯化变得非常关键。对嗜酸喜温硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）进行6个月铜耐受定向驯化,将出发菌株与驯化菌株在不同铜胁迫浓度下（0、1和3 g/L Cu²⁺）纯培养及浸出贫黄铜矿,并比较分析关键参数变化。在纯培养体系中,3 g/L Cu²⁺胁迫下最高比生长速率（μ_max）由驯化前0.21 d^-1（13 d）提升至0.54 d^-1（10 d）。在0、1和3 g/L Cu²⁺浸出体系中,菌株驯化后铜浸出率分别较出发菌株提高17.64%、70.93%及306.09%。扫描电镜（SEM）分析矿渣形貌差异表明伴随胁迫作用增强菌体对矿物腐蚀程度变弱,在相同铜胁迫水平下,驯化菌株浸出体系矿渣表面呈现更多潜在的吸附位点及明显腐蚀痕迹。采用傅里叶红外光谱（FTIR）分析矿渣表面关键官能团变化,驯化菌株浸出体系的矿渣呈现更多含硫基团。X射线衍射（XRD）分析矿渣成分表明驯化菌株浸出体系中呈现较为丰富的铁硫衍生物如Fe₃O₄、FeS。综上,驯化后A. caldus具备较强抵御铜胁迫能力,在浸出体系中保持了更活跃的生化浸出效应,有望在类似的工业生物浸出过程中发挥其潜在优势。

磷浓度对海水钝顶螺旋藻生长代谢的影响

陈浩, 杨冰洁, 李涛, 吴华莲, 吴后波, 向文洲

2019, 35(8):  103-110.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0181

摘要 ( 485 )   HTML   PDF (2791KB) ( 403 )  

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磷元素对微藻的生长代谢具有重要作用。为了探究磷源浓度调控海水螺旋藻主要代谢产物合成积累的可行性。以改良的Zarrouk海水培养基为基础,通过设置5种K₂HPO₃浓度（0.005-0.04 g/L）,分析不同磷浓度对海水螺旋藻的生长及生理生化指标的影响。结果显示,海水螺旋藻生物质浓度和蛋白质含量随着磷源浓度的升高而增加,0.04 g/L处理组达到最大值,分别为0.48±0.02 g/L和59.23±0.61%DW;总多糖含量随着磷源浓度增加先显著下降,0.005 g/L处理组含量最高（25.96±1.61%DW）;C-藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白和总藻胆蛋白含量随着磷源浓度增加,先升后降,0.03 g/L处理组含量最高,分别为14.56±0.99%DW、4.21±0.19%DW和18.77±0.39%DW;叶绿素a与类胡萝卜素含量随着磷源浓度的增加而升高,最高含量分别为1.01±0.01%DW和0.35±0.02%DW;而磷源浓度的变化对总脂含量和脂肪酸组成总体上无显著影响（P>0.05）。低磷源浓度有利于多糖积累,高磷源浓度则促进蛋白质和藻蓝蛋白、叶绿素和类胡萝卜素的合成,通过磷源调节可有效定向诱导海水螺旋藻主要高值化产物的合成积累。

甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶SeCDA7的表达与结合活性分析

张伟, 毕扬, 赵丹, 宗召莉, 郭巍

2019, 35(8):  111-117.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0137

摘要 ( 351 )   HTML   PDF (3386KB) ( 247 )  

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几丁质脱乙酰酶（Chitin deacetylase,CDA）是昆虫几丁质代谢酶系中的重要组分,是害虫防治的重要靶标。通过RT-PCR技术克隆得到编码甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶secda7基因（GenBank登录号为MG604929）,该基因长1 431 bp,包含开放阅读框长1 134 bp,SeCDA7蛋白的预测分子量分别为43.156 kD。结构域分析显示,SeCDA7具有一个多聚糖乙酰基转移酶催化区,属于第Ⅴ类CDA蛋白。分别构建了原核和真核重组表达载体,利用大肠杆菌和Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统转染Sf9昆虫细胞,成功表达了SeCDA7蛋白,纯化SeCDA7蛋白并分析几丁质结合活性,结果表明SeCDA7蛋白具有几丁质结合活性;荧光定量PCR结果显示secda7基因主要在中肠组织表达。本研究实现了甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶基因secda7的外源表达,并鉴定出SeCDA7蛋白具有几丁质结合活性,为深入探究甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶的生理功能提供了理论依据。

雷州黑鸭FSHR和ESR1与繁殖性状关联分析

邹坤, 崔红艳, 薛缘, 张少伟, 路丽丽, 赵志辉, 苏瑛

2019, 35(8):  118-126.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0094

摘要 ( 312 )   HTML   PDF (3558KB) ( 269 )  

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旨为探究产蛋基因FSHR和ESR1对雷州黑鸭的影响。采用荧光定量PCR对FSHR和ESR1在雷州黑鸭0-120 d的下丘脑-垂体-卵巢轴的表达规律进行研究,并通过PCR-SSCP对FSHR和ESR1的多态性与繁殖性状关联分析。结果表明,FSHR在0-90 d表达量总体呈稳定上升趋势,但在90-120 d下丘脑和垂体表达量略微下调,差异不显著（P>0.05）;ESR1表达量在0-120 d表达量总体呈上升趋势,但在90 d卵巢表达量出现波动,差异不显著（P>0.05）;FSHR的SNP（g.856937G>A,g.922947A>G）和ESR1的SNP（g.190744A>G）与雷州黑鸭产蛋量显著相关（P<0.05）,但与雷州黑鸭蛋品质关联不显著。以上结果提示：FSHR和ESR1对雷州黑鸭早期性腺发育起着重要作用,且3个SNP位点均可作为雷州黑鸭重要的产蛋标记基因。

围产前期添加山楂和黄芪混合物对奶牛血浆代谢组的影响

张萌, 刘国林, 李向龙, 陈永宏, 白玲荣, 罗芳, 李亚超, 陶金忠

2019, 35(8):  127-137.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0300

摘要 ( 387 )   HTML   PDF (7185KB) ( 194 )  

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旨为研究日粮中添加山楂、黄芪对产前奶牛血浆代谢物的影响。选取年龄、胎次和体况相近围产期健康高产荷斯坦奶牛20头。随机分为2组,对照组A组（n=10）：饲喂基础日粮;试验组B组（n=10）：饲喂基础日粮添加复方中草药山楂和黄芪（各150 g）。进入围产圈开始饲喂,连续饲喂14 d,晨饲前尾静脉采血10 mL,采用高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）技术,结合主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）对两组血浆代谢轮廓进行模式识别;以VIP>1、P<0.05和FC>1.3或FC<0.77作为标准筛选两组血浆差异代谢物;ROC曲线进一步确定这些差异代谢物对两组血浆分类的识别能力。结果显示：添加山楂和黄芪对D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、亚油酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成有显著的影响,经ROC曲线发现9个显著性上调差异代谢物：肌酐、5,2'-O-甲基胞苷、肉豆蔻酸、亮氨酸、烟酸、3-羟基苯甲酸、次黄嘌呤、γ-谷氨酰缬氨酸和马尿酸。综上表明：产前饲料添加山楂、黄芪影响奶牛的氨基酸代谢,脂肪代谢和糖代谢。

半乳糖流加对CHO细胞生长代谢及其表达的Fc融合蛋白糖基化的影响

肖政, 范里, 谭文松

2019, 35(8):  138-145.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0138

摘要 ( 824 )   HTML   PDF (4710KB) ( 744 )  

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旨在深入认识补料分批培养过程中,以半乳糖替代葡萄糖作为碳源,对CHO细胞生长、代谢和产物表达的影响。通过将补料培养基中的葡萄糖用等摩尔的半乳糖进行替换,综合考察了不同比例替换条件下CHO细胞的生长代谢和Fc融合蛋白的产物合成特性。结果显示：摇瓶的数据表明60%比例以上半乳糖的替代对细胞的生长造成了不利影响,培养后期的pH出现了大幅上升。同时随着半乳糖替代比例的增加,虽然代谢副产物乳酸的浓度有明显下降,但氨的生成却显著增多;此外,培养过程中谷氨酸和丙氨酸的浓度也随着替代比例的增加而增加。产物表达方面,在较低替代比例内（0%-40%）,Fc融合蛋白的表达量和总唾液酸含量都随着替代比例的增加而升高,而随着替代比例的进一步升高（60%-100%）,两者都逐渐降低。最后,在反应器内通过对培养pH的稳定控制,40%半乳糖替代过程的产物表达量和总唾液酸含量分别提高了43%和37%。补料培养基中以半乳糖替代葡萄糖进行补料的方式,有效地提高了最终Fc融合蛋白的表达量和总唾液酸含量,有助于建立高产高质的CHO细胞培养过程。

通过细胞穿膜肽和皂苷增强一种核糖体失活蛋白抗肿瘤活性

刘洋, 曹雪玮, 卢美雅, 王富军, 赵健

2019, 35(8):  146-154.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0198

摘要 ( 352 )   HTML   PDF (4145KB) ( 283 )  

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将核糖体失活蛋白类鼻疽伯克霍尔德菌致死因子1（BLF1）与细胞穿膜肽（CPP）HBP融合表达并与商陆皂苷甲（EsA）联合使用,提高BLF1重组蛋白抑制肿瘤细胞生长的活性。通过原核表达及NI-NTA亲和层析纯化BLF1、BLF1-HBP融合蛋白,以HepG2、MCF-7、A549和HeLa细胞为检测模型,MTT法检测BLF1重组蛋白对肿瘤细胞的毒性,激光共聚焦显微镜观察重组蛋白进入细胞效率,流式细胞术分析抗肿瘤效应。结果显示,穿膜肽HBP可有效提高BLF1对HepG2、MCF-7、A549和HeLa四种肿瘤细胞的生长抑制作用,其中对HeLa细胞的药效增强效果最显著,可达47.5倍;皂苷EsA的使用进一步显著提高了BLF1-HBP对上述4种肿瘤细胞生长抑制活性,且对MCF-7细胞的IC₅₀值从6 840 nmol/L降至0.57 nmol/L。激光共聚焦观察揭示EsA可有效促进BLF1重组蛋白进入肿瘤细胞效率,流式结果分析表明EsA可大大强化BLF1-HBP诱导肿瘤细胞凋亡的能力。将BLF1与穿膜肽HBP融合表达并在EsA存在下,可显著提升BLF1对肿瘤细胞的毒性,强化其诱导肿瘤细胞凋亡的能力。

炎症与肿瘤发生对造血祖细胞发育失衡的影响

李晓玉, 刘霖, 邢兵, 汤婧, 刘亚平, 周祖平, 蒲仕明

2019, 35(8):  155-161.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-1008

摘要 ( 362 )   HTML   PDF (3769KB) ( 199 )  

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主要研究炎症和肿瘤对小鼠造血免疫系统中造血祖细胞（Hematopoietic progenitor cells,HPCs）影响,探索炎症和肿瘤状态下造血-免疫系统间的相关性。利用偶氮甲烷（Azoxymethane,AOM）和右旋糖酐硫酸钠（Dextran sulfate sodium salt,DSS）共同诱导构建小鼠炎症性结肠癌模型,并采用流式细胞术分析正常、炎症和肿瘤小鼠造血祖细胞丰度以及细胞周期。炎症和肿瘤进程中,小鼠骨髓中较上游的多能祖细胞（Multi-potent progenitors,MPPs）占骨髓细胞的百分比显著升高,共髓系同祖细胞（Common myeloid progenitors,CMPs）、巨核细胞/ 红系祖细胞（Megakaryocyte/erythrocyte progenitors,MEPs）和粒细胞/巨噬细胞祖细胞（Granulocyte/macrophage progenitors,GMPs）也有类似变化,相反共同淋巴祖细胞（Common lymphoid progenitors,CLPs）则显著下降;并且,炎症和肿瘤状态下,髓系祖细胞分裂能力显著强于正常生理状态;肿瘤状态下,小鼠外周血CD4⁺/CD8⁺T细胞比值显著下降。炎症和肿瘤进程中,HSPCs偏向髓系分化;肿瘤状态下小鼠细胞免疫功能失衡且长期的炎症损害可能会引起免疫系统的失衡并最终导致肿瘤的形成。

神经节苷脂氟化寡糖在大肠杆菌中的生物合成

刘新平, 谭玉萌, 张雪, 冯雁, 杨广宇

2019, 35(8):  162-169.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0229

摘要 ( 341 )   HTML   PDF (3575KB) ( 293 )  

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神经节苷脂是一类存在于所有脊椎动物细胞中的糖脂分子,具有重要的生理功能和药用活性。合成生物学为构建神经节苷脂类的人工高效合成体系提供了契机,而其神经节苷脂氟化寡糖中间体的合成是至关重要的步骤。旨在实现神经节苷脂氟化寡糖在大肠杆菌中的人工生物合成途径：通过在大肠杆菌JM107中引入来源于脑膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitidis）的CMP-NeuAc合成酶（neuA）,空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）来源的α 2,3-NeuAc转移酶（cst）、β 1,4-GalNAc转移酶（cgtA）、β 1,3-Gal转移酶（cgtB）和UDP-GlcNAc异构酶（gne）,成功构建了以氟化乳糖和唾液酸为底物的3种神经节苷脂GM3、GM2、GM1氟化寡糖在大肠杆菌中的生物合成途径;开发了高灵敏度的氟化寡糖柱前衍生-HPLC定量检测方法;并通过对工程菌株进行透酶过表达和启动子优化,在摇瓶发酵中GM3、GM2及GM1氟化寡糖的产量分别达到81.5 mg/L、18.1 mg/L及12.3 mg/L,为进一步的代谢工程改造奠定了良好的基础。

综述与专论

植物细胞中蛋白脂酰化修饰的生物学功能

于明香, 宋水山

2019, 35(8):  170-177.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0095

摘要 ( 490 )   HTML   PDF (1150KB) ( 406 )  

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蛋白脂肪酰化修饰是蛋白翻译修饰的重要形式,在细胞信号转导、生长发育和代谢等过程中发挥着重要的作用。N-肉豆蔻酰化和S-酰化是脂肪酰化修饰的两种主要形式,长链的脂肪酸被共价结合到蛋白质上,使蛋白结构发生变化,从而影响细胞的一系列生理作用。近年来,相比于真菌和动物细胞中蛋白脂肪酰化修饰的功能研究而言,植物蛋白质脂酰化修饰及其生物学功能的研究相对较少,且两者并不完全相同,引起了研究人员的广泛关注。研究发现,植物蛋白质N-肉豆蔻酰化和S-酰化修饰过程中分别需要相对应的豆蔻酰基转移酶和S-酰基转移酶来催化,通过对两种转移酶缺失的突变体的研究发现,这两种酰基转移酶的活性与植物种子萌发、花期长短及表型正常化有关;N-肉豆蔻酰化和S-酰化蛋白通过疏水性的酰基键插入膜上相应的位置,进行膜锚定;参与调控植物生长、信号转导及免疫应答等过程。综述了近年来N-肉豆蔻酰化和S-酰化在植物细胞生物学功能中的研究进展,并对植物G蛋白偶联受体（GPCRs）脂质修饰在感知细菌信号分子N-酰基高丝氨酸内脂（AHLs）过程中的作用进行了讨论,旨在为采用遗传干预技术提高农作物生产、优质及抗逆提供理论指导。

药用植物microRNA研究现状与展望

严武平, 吴友根, 于靖, 杨东梅, 张军锋

2019, 35(8):  178-185.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0098

摘要 ( 370 )   HTML   PDF (1159KB) ( 279 )  

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microRNA（miRNA）是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,通过切割靶mRNA和抑制mRNA翻译,可在动植物中发挥重要的调控作用。自2002年首次出现植物miRNA的报道后,植物miRNA的研究迅速成为植物分子生物学领域的研究热点。综述了植物miRNA的生物形成途径和作用机制,重点概述了药用植物中miRNA的研究现状,并对该领域未来的研究方向进行展望,以期为今后药用植物中 miRNA的研究提供参考。

米曲霉功能基因组研究策略和进展

吴琴琴, 孙敏, 陈雨, 付雅琴, 曾斌, 贺斌

2019, 35(8):  186-192.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0226

摘要 ( 476 )   HTML   PDF (1095KB) ( 590 )  

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丝状真菌米曲霉是发酵工业中的重要菌种,常用于酱油、豆豉、次级代谢产物及酶类产品的生产。近年来,随着米曲霉全基因组序列的破译,米曲霉的功能基因组研究成为一个热点。由于米曲霉转化体系的不成熟和多核现象的存在,导致了米曲霉功能基因组研究的进展缓慢。综述了米曲霉目前所用的几种遗传转化策略,并比较了它们之间的优缺点;介绍了近几年米曲霉的功能基因组研究进展,重点阐述了米曲霉蛋白质分泌、分生孢子形成和次级代谢产物合成等重要的功能基因研究结果;最后对米曲霉在传统酿造和工业用酶及其次级代谢产物生产的应用上进行了展望。

乳酸菌在合成生物学中的研究现状及展望

刘洋儿, 郭明璋, 杜若曦, 贺晓云, 黄昆仑, 许文涛

2019, 35(8):  193-204.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0086

摘要 ( 608 )   HTML   PDF (1426KB) ( 1888 )  

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乳酸菌作为传统食品级微生物,长期应用于食品工业、生活保健、临床医学领域中。随着人们对乳酸菌特殊功能需求的提升,传统筛菌方法由于其技术繁复、周期长、成功率低等缺点,逐渐成为制约乳酸菌行业发展的瓶颈。合成生物学技术的出现,将具有特定功能的基因电路网络导入细胞基因组中,让细胞来完成设计者设想的各种任务,可为解决乳酸菌功能菌株开发难题提供新的机遇。探讨了乳酸菌的菌种特点及其作为合成生物学底盘的优势,综述了乳酸菌合成生物学中元件设计、载体选择、转化方法和基因编辑技术的发展现状,总结并展望了工程化乳酸菌在疾病诊断治疗、食品改善品质和生物能源等方面的应用,讨论了合成生物学在乳酸菌领域进一步应用所需实现的技术突破,旨为乳酸菌合成生物学的发展提供借鉴。

LncRNA在哺乳动物毛囊发育调控中的研究进展

常永芳, 包鹏甲, 褚敏, 吴晓云, 梁春年, 阎萍

2019, 35(8):  205-212.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0187

摘要 ( 384 )   HTML   PDF (1640KB) ( 315 )  

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长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类长度超过200 nt,本身不具编码能力的真核转录本,是基因编码蛋白的关键调节器,在转录水平和转录后水平调节基因的表达,广泛分布于动植物基因组中,作为一类重要的调节因子参与生命发育周期、细胞分化及疾病相关的一些生物学过程。目前,已有一些与皮肤生物学相关lncRNA的报道,但其在皮肤毛囊发育和毛发纤维中的功能及作用机制鲜有报道。近年来,新一代测序技术和芯片技术的结合为lncRNA的鉴定提供了更加有效和快速的途径。研究表明,部分lncRNA对皮肤毛囊细胞的增殖、分化及真皮乳头的形成具有一定影响,其相关靶基因参与调控毛囊的周期性生长。结合近期研究进展就lncRNA对毛囊生长发育的调控作用进行了综述,旨在为后续研究哺乳动物毛囊生长发育相关lncRNA的作用及调控机制奠定理论基础。

表观遗传药物研发的现状与挑战

江芮, 吕柯孬, 潘学峰, 崔新霞, 申世刚, 丁良

2019, 35(8):  213-225.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0099

摘要 ( 506 )   HTML   PDF (1909KB) ( 1218 )  

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表观遗传修饰不影响DNA序列,却可通过DNA甲基化/去甲基化、多种类型组蛋白可逆修饰以及非编码RNA分子影响染色质活性状态,影响DNA遗传信息的表达。基于表观遗传机制的药物旨在通过人为干预疾病状态下染色质表观遗传修饰状态,以矫正疾病关联基因的表达,实现疾病预防和治疗。围绕DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白修饰酶抑制剂和siRNA等在内的表观遗传药物的研发现状进行了系统的总结,并对相关研发和产业化过程中所遇到的问题进行了系统的梳理和较为深入的讨论,旨为促进国内表观遗传药物的研发和相关生物技术产业化发展。

技术与方法

猪圆环病毒2型Cap蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

欧云文, 代军飞, 马炳, 张杰, 邓辉祥, 李潇, 张欣明

2019, 35(8):  226-231.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0205

摘要 ( 362 )   HTML   PDF (3323KB) ( 389 )  

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旨在制备猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白的多克隆抗体。以PCV2毒株（CAU0673）DNA为模板进行PCR,扩增目的片段大小约为702 bp,构建pET30a-PCV2-Cap重组质粒,转入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达;对目的蛋白进行Ni-NTA树脂亲和层析纯化、复性,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定;将纯化后的重组Cap蛋白与弗氏佐剂混匀乳化,经背部皮下多点注射4次,免疫新西兰大耳白兔,制备成兔抗Cap蛋白多克隆抗体,采用Western blot和间接免疫荧光试验（IFA）验证兔抗血清特异性,并用间接ELISA测定抗血清抗体效价。PCR、双酶切和测序鉴定结果表明,重组质粒pET30a-PCV2-Cap构建正确;重组Cap蛋白以包涵体的形式表达,大小约为34 kD,复性后重组Cap蛋白可与PCV2阳性猪血清发生特异性反应;制备的多克隆抗体与PCV2重组Cap蛋白和全病毒抗原均可发生反应,ELISA抗体效价>1∶12 800,显著高于商品化疫苗组。

大肠杆菌代谢途径改造策略与应用研究进展

李冉, 黄玉清, 贾振华

2019, 35(8):  232-237.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0131

摘要 ( 532 )   HTML   PDF (1086KB) ( 605 )  

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大肠杆菌由于具有稳定性强和易于操作的特点成为基因改造常用的宿主微生物。利用基因工程手段改造大肠杆菌的代谢途径,可用于生物燃料、手性药物及其衍生物的合成。利用代谢组学和合成生物学能够高效地以大肠杆菌作为生物催化剂生产目标物。综述了大肠杆菌中丙酮酸、乙酰辅酶A、甲羟戊酸和莽草酸代谢途径的改造策略,以及大肠杆菌代谢途径的改造在合成生物燃料、砌块化合物中的应用,为研究者以大肠杆菌合成目标化合物的研究提供一个整体的思路和方法。

芽孢杆菌种间原生质体融合选育高产Surfactin新菌株

潘旭耀, 魏韬, 谭柱豪, 林龙镇, 郭丽琼, 林俊芳

2019, 35(8):  238-245.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0235

摘要 ( 330 )   HTML   PDF (4131KB) ( 418 )  

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旨在获得纳豆芽孢杆菌和暹罗芽孢杆菌种间融合高产Surfactin的新菌株。以纳豆芽孢杆菌和暹罗芽孢杆菌为亲本菌株,通过制备纳豆芽孢杆菌和暹罗芽孢杆菌的原生质体,采用PEG介导的双亲灭活标记法融合原生质体,拟融合子通过PCR鉴定、CPC-BTB法高通量筛选、HPLC复筛以及融合菌株的稳定性验证获得高产Surfactin的新菌株。研究结果表明纳豆芽孢杆菌和暹罗芽孢杆菌的原生质体制备最佳酶解浓度分别为0.25 mg/mL和0.2 mg/mL,最佳酶解时间分别为25 min和20 min,其原生质体得率分别为83.1%和84.3%。两者的原生质体融合条件为：纳豆芽孢杆菌紫外灭活80 min,暹罗芽孢杆菌85℃热灭活40 min,融合体系为50%的PEG6000在38℃下融合时间15 min。获得了遗传稳定的融合菌株F8,该菌株Surfactin产量相对于纳豆芽杆菌提高了33.3%,暹罗芽孢杆菌提高了60%。

酶解条浒苔蛋白制备抗肺癌活性多肽

段训威, 肖桂清, 王礼兴, 吴文林, 戴聪杰, 董乐

2019, 35(8):  246-252.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0338

摘要 ( 326 )   HTML   PDF (4798KB) ( 346 )  

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为了开发利用绿潮藻类条浒苔中含量丰富的蛋白质,采用木瓜蛋白酶酶解条浒苔蛋白,最佳酶解条件为：料液比1∶25、加酶量1 250 U/g pro、温度45.7℃、pH 7.2、震荡酶解时间120 min。在该条件下的酶解多肽经超滤分离获得不同分子量区间的多肽,并通过HUVEC、A549、H446、H460等细胞水平初步评价酶解条浒苔制备多肽抗肺癌的细胞生物学效果。结果表明,经上述条件获得的2-6 kD条浒苔多肽处理的HUVEC在抗氧化和小管形成等方面均受到抑制,其处理的NCI-H460、NCI-H446和A549的增殖、细胞周期、迁移也受到不同程度抑制,且能够促进细胞凋亡;2-6 kD浒苔多肽对H446、H460作用效果显著优于对A549的作用。这一细胞水平研究,不仅证实了酶解条浒苔获取新型天然抗肿瘤小肽的可行性,也为条浒苔蛋白质资源高值化利用探索提供了新的途径。

其他

目录

2019, 35(8):  253-253. 

摘要 ( 130 )   HTML   PDF (334KB) ( 228 )  

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封面

2019, 35(8):  254-254. 

摘要 ( 110 )   HTML   PDF (411KB) ( 138 )  

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