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2021年 第37卷 第10期    刊出日期：2021-10-26

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研究报告

超表达马尾松PmPT3基因提高拟南芥耐低磷能力

方丹丹, 张婷, 文晓鹏

2021, 37(10):  1-8.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0072

摘要 ( 489 )   HTML ( 36)   PDF (3972KB) ( 718 )  

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旨在探讨马尾松PmPT3基因在低磷胁迫条件下对拟南芥磷吸收利用的影响,实现林木优良基因的利用。通过构建马尾松PmPT3基因超表达载体pBWA（V）HS-PmPT3,采用花序浸染法遗传转化拟南芥。经筛选和检测,共获得4株T3代纯合株系;磷处理结果表明:超表达马尾松PmPT3基因显著提高了转基因拟南芥超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）的活性,分别是野生型植株的2.17倍、1.59倍、1.81倍;丙二醛（MDA）含量较野生型植株降低了47.58%。转基因拟南芥的地上部分和根部总磷含量及无机磷含量较野生型相比,分别提高了1.26倍和1.74倍及1.38倍和1.89倍。转基因植株较野生型地上部干重提高了45.46%,根干重提高了55.56%,总干重提高了46.15%。与正常供磷条件相比,处于低磷胁迫下的拟南芥转基因植株,其根部和地上部分中的PmPT3基因表达量显著上调,且在根部达到极显著水平。结果表明,超表达马尾松PmPT3基因可以提高低磷胁迫下拟南芥中保护酶活性、降低丙二醛产生,促进拟南芥对磷元素的吸收,从而提高拟南芥耐低磷胁迫的能力,为通过基因工程创制耐低磷新种质提供了科学依据。

蒙古沙冬青外向钾离子通道AmGORK启动子克隆及表达分析

李俊林, 张焕朝, 聂文婧, 张海洋, 王向誉, 郭洪恩, 韩蕾

2021, 37(10):  9-16.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0192

摘要 ( 381 )   HTML ( 12)   PDF (3145KB) ( 277 )  

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克隆蒙古沙冬青钾离子通道AmGORK的启动子区域,探明在干旱胁迫下它对保卫细胞运动的调控机制,为深入研究该基因在水分及养分利用、光合作用、抗旱等过程的功能奠定基础。以蒙古沙冬青保卫细胞外向钾离子通道基因AmGORK编码序列为基础,通过染色体步移技术克隆该基因的启动子序列,并对其进行生物信息学分析,构建pCambia1301-AmGORK∷GUS双元载体转化野生型拟南芥,对T₃转基因拟南芥各组织进行GUS活性染色,转基因植株经PEG或ABA处理后,分析AmGORK启动子的表达情况。结果表明,获得AmGORK上游1 723 bp序列,该区域含有多个响应干旱、ABA、光照等的顺式调控元件,说明AmGORK可能参与干旱响应过程。经GUS活性染色,发现AmGORK在根中柱、叶柄、叶脉、叶片保卫细胞、花萼均有表达,表明AmGORK的表达具有组织特异性。定量分析发现PEG或ABA处理后的转基因植株中GUS分别上调3.2倍和4.1倍。AmGORK表达可能受干旱诱导。

非洲菊GjMnSOD基因的克隆及表达分析

武欢, 卢珍红, 郝向阳, 王斌, 焦元辰, 杨春梅, 程春振

2021, 37(10):  17-25.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0077

摘要 ( 407 )   HTML ( 15)   PDF (7722KB) ( 161 )  

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以非洲菊品种‘玲珑’为材料,利用RT-PCR技术克隆获得一条CDS长为519 bp的SOD基因（GenBank ID:MH708534.1）。利用生物信息学手段分析了该基因及其编码蛋白的序列特征,并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术分析了该基因在3种激素（100 µmol/L IAA、SA和GA₃）和3种非生物胁迫（200 mmol/L NaCl盐胁迫、30% PEG模拟干旱和4℃低温处理）下的表达模式。结果显示:该基因可编码分子量为19 203.85、等电点（pI）为7.93、无信号肽及跨膜结构的稳定亲水蛋白。该蛋白含有典型Sod-Fe-C保守结构域,在141-148位氨基酸之间含有一个MnSOD特征序列（DVWEHAYY）,因此命名为GjMnSOD。Wolf Psort预测结果显示GjMnSOD定位于线粒体。GjMnSOD与刺苞菜蓟MnSOD相似性最高（为93.86%）且在进化上亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示:GjMnSOD的表达受IAA、GA₃、SA、盐胁迫和低温显著抑制;在干旱胁迫下,GjMnSOD的表达呈“先降后升”的表达趋势,于处理4 h后显著高于对照。研究结果表明GjMnSOD参与非洲菊对多种逆境胁迫的响应,尤其在非洲菊应答干旱胁迫过程中发挥重要作用。

盐胁迫条件下‘巴麻火麻’内生真菌的分离鉴定与多样性分析

李娥, 黄勇, 孟园园, 李璇, 杜光辉, 刘飞虎

2021, 37(10):  26-33.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0588

摘要 ( 365 )   HTML ( 15)   PDF (2629KB) ( 405 )  

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旨在研究‘巴麻火麻’不同浓度盐处理下植物内生真菌动态变化规律,并筛选到与缓解盐胁迫密切相关的内生真菌。以前期筛选的耐盐工业大麻品种‘巴麻火麻’为研究材料,通过不同浓度（0、100、200和300 mmol/L）NaCl盐处理,利用传统方法对大麻内生真菌进行分离纯化,结合形态学和rDNA-ITS序列分析对菌种进行鉴定。1 400个大麻组织片中共分离到543株真菌,隶属于14个科18个属44个种。研究发现,盐胁迫处理影响大麻内生真菌群落组成,不同浓度NaCl处理下分离到的内生真菌不同,各处理间相似性系数均小于0.5。随着NaCl处理浓度的增加,内生真菌的丰富度、多样性指数、分离率均呈先降后升的趋势。其中,在200 mmol/L NaCl处理下,丰富度和多样性指数最低,而100 mmol/L NaCl处理下,分离率达到最低。在所有的处理中,均分离得到与抗逆性密切相关的毛壳菌（Chaetomium globosum）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、炭垫菌（Nemania diffusa）、枝孢霉（Cladosporium）、炭团菌（Annulohypoxylon stygium）等。

不同氮源及氮浓度对海水驯化藻株Asterarcys sp.生长及生化组成的影响

卫华宁, 王灵, 李涛, 王娜, 吴华莲, 向文洲

2021, 37(10):  34-44.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0139

摘要 ( 389 )   HTML ( 6)   PDF (3570KB) ( 488 )  

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以经海水驯化后的藻株Asterarcys sp. SCSIO-44020为材料,以30‰海水改良ZSNT为基础培养基,在柱式光生物反应器中分别加入3种不同类型氮源（硝酸钠、尿素及碳酸氢铵）和3组氮浓度（3 mmol/L、6 mmol/L及18 mmol/L）,研究不同氮源及氮浓度对Asterarcys sp.生长及生化组成的影响。结果显示,Asterarcys sp.生物质浓度均随着氮浓度的升高而增加,在氮浓度18 mmol/L条件下,硝酸钠组获得最大生物质浓度（7.78 g/L）,其次为尿素（6.61 g/L）,最低为碳酸氢铵（5.33 g/L）。低氮胁迫有利于藻细胞油脂和总糖的积累,最大油脂含量和多糖含量分别达到46.78% DW（碳酸氢铵,3.0 mmol/L）和29.70% DW（尿素,3.0 mmol/L）。该藻中性脂比例大于82.58%,在3种氮源随着氮浓度的降低而升高;脂肪酸主要包括C16:0（棕榈酸）、C16:1（棕榈油酸）、C18:0（硬脂酸）、C18:1（油酸）、C18:2（亚油酸）和C18:3（亚麻酸）,其中油酸含量最高（占总脂含量38.75%）;高氮有利藻细胞蛋白质积累,在尿素为氮源18 mmol/L条件下的蛋白质含量最高（17.61% DW）;在以硝酸钠为氮源18 mmol/L条件下,该藻总脂、总糖、总蛋白质及总类胡萝卜素均获得最大产量,分别为2.79 g/L、1.71 g/L、1.22 g/L和30.29 mg/L。总之,本研究显示Asterarcys sp. SCSIO-44020在海水中生长良好,初步确定高浓度（18 mmol/L）硝酸钠为其小型柱式光生物反应器培养较佳的氮源条件。

低温异养硝化菌的筛选、鉴定及降解特性研究

李珍阳, 姜润, 刘琳, 李思琦, 王晓慧

2021, 37(10):  45-56.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1315

摘要 ( 403 )   HTML ( 6)   PDF (5889KB) ( 351 )  

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从冬季北京化工大学污水处理站活性污泥、江苏省某污水处理厂生物转盘污泥和实验室的好氧颗粒污泥中筛选出3株较好的低温异养硝化的菌株制成混合菌剂,解决低温条件下异养硝化菌硝化能力差的问题。应用传统分离纯化培养技术筛选菌株,纳氏试剂分光光度法评价菌株的异养硝化能力,通过形态观察、生理生化特性和16S rDNA测序对菌株进行种属鉴定,设计正交试验和单因素试验,确定菌剂复配比并进行固定化,探究低温异养硝化的最优条件。在13℃下共筛选出3株脱氮效果好的菌株,经鉴定均属于不动杆菌（Acinetobacter sp.）,复合菌剂最佳复配比为1:1:1,进行固定化后在碳源为柠檬酸钠、pH为8、NH₄⁺-N浓度为50 mg/L、NaCl浓度为10 g/L-20 g/L时,其氨氮去除效率可达95.86%,对高氨氮,高盐度废水具有较高耐受性,在低温废水处理方面具有潜在的应用价值。

酿酒酵母TAP42基因在细胞壁应激反应中的作用

崔新刚, 孙雅欣, 崔晓静, 邓雁文, 孙恩浩, 王俊芳, 崔红晶

2021, 37(10):  57-62.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0036

摘要 ( 400 )   HTML ( 7)   PDF (2669KB) ( 247 )  

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研究蛋白质磷酸酶2A调节亚单位Tap42p（type 2A associated protein-42kD）在酵母细胞壁应激反应中的作用。采用一步基因置换法构建TAP42基因缺失（tap42Δ）酵母菌株;观察在细胞壁应激反应条件下tap42Δ菌株的克隆形成能力;通过全自动生长曲线分析仪检测细胞分裂增殖活力;RT-PCR检测细胞壁应激反应通路中转录因子Swi4p、Swi6p、Ssd1p和Mpt5p的表达水平。在正常培养条件下,与野生型酵母细胞（BY4743）比较,tap42Δ菌株形成较小克隆,细胞增殖活力较差;在细胞壁应激反应条件下,tap42Δ菌株的克隆大小和增殖活力都与BY4743菌株相似,菌株对应激反应诱导剂有一定的抗性;且缺失TAP42基因上调SWI4、SWI6、SSD1和MPT5等基因的转录表达水平。因此,缺失TAP42基因影响酵母细胞的分裂增殖能力,增强对细胞壁应激反应的抵抗性,上调细胞壁应激反应通路中转录因子的表达水平。

两株微生物的Cr（VI）还原特性研究

黄玉喜, 程顺利, 赫玲玲, 肖进彬, 任秋鹤, 彭子涵, 周振, 方玉美

2021, 37(10):  63-71.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0136

摘要 ( 397 )   HTML ( 12)   PDF (4377KB) ( 332 )  

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旨为研究2株微生物对Cr（VI）的还原能力及特性。在实验室条件下,通过连续培养,探究2株微生物的还原特性及pH、电子供体对其还原Cr（VI）影响,并结合表征手段研究寡养单胞菌对Cr（VI）的解毒机理。结果显示,寡养单胞菌和胶冻样芽孢杆菌对Cr（VI）的耐受性达400和200 mg/L,中性条件下,72 h内对45.5和18.5 mg/L的Cr（VI）去除率为100%;2株微生物在弱碱性条件下活性较强,在pH=8时,寡养单胞菌和胶冻样芽孢杆菌72 h内对50 mg/L的Cr（VI）去除率达98.1%和49.2%;寡养单胞菌在乙酸钠和乳酸钠的作用下,对50 mg/L的Cr（VI）的去除率可在60 h内达到100%,乳酸钠和葡萄糖可使胶冻样芽孢杆菌72 h内对50 mg/L的Cr（VI）去除率从49.2%提升至61.9%和73.2%;还原产物表征分析表明,寡养单胞菌表面在还原Cr（VI）的过程中吸附Cr（VI）于机体表面,并将Cr（VI）高效还原为Cr（III）。寡养单胞菌和胶冻样芽孢杆菌可作为修复重金属Cr（VI）污染的优质菌种。

一种苯酚降解菌Pseudoxanthomonas sp. BF-6的分离鉴定及其降解特性及途径研究

卫晓博, 侯颖, 程豪杰, 秦翠丽, 牛明福, 徐建强

2021, 37(10):  72-80.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0124

摘要 ( 471 )   HTML ( 11)   PDF (4476KB) ( 403 )  

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苯酚是最常见的有机污染物,为了获得降解苯酚的细菌,并探究其降解苯酚的特性和途径,采用连续富集和稀释平板分离,从农药厂活性污泥中得到一株能以苯酚作为唯一碳源生长的菌株BF-6,通过 16S rRNA 序列分析和生理生化试验将该菌株鉴定为假黄单胞菌（Pseudoxanthomonas sp.）。单因素试验结果表明,菌株BF-6在温度为20-37℃和pH5.0-10.0范围内均可很好的降解苯酚;在此条件下,5%接种量的菌株BF-6在36 h内可将100 mg/L苯酚降解97.79%,96 h可将200 mg/L苯酚降解97.58%。经苯酚诱导后,菌株BF-6细胞粗酶液表现出苯酚羟化酶和邻苯二酚1,2-双加氧酶活性,表明菌株BF-6降解苯酚的途径为邻位途径。本研究为低浓度苯酚的微生物降解提供了新的菌种资源。

Microbacterium sp. BD6在Cr（VI）污染农田土壤修复中的应用研究

杨宗政, 赵晓宇, 刘丹, 许文帅, 吴志国

2021, 37(10):  81-90.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0194

摘要 ( 334 )   HTML ( 4)   PDF (3088KB) ( 242 )  

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旨在探究Cr（VI）还原菌在Cr（VI）污染土壤中的修复条件及效果,为实际Cr（VI）污染农田土壤的修复提供借鉴。采用单因素实验、盆栽实验、高通量测序及qPCR等方法研究了菌株Microbacterium sp. BD6修复Cr（VI）污染土壤的最佳条件、修复前后对于植物的毒性以及对土壤中微生物群落的影响。实验表明菌株BD6在土壤含水率为30%及以上,温度为25-40℃的条件下,96 h对土壤中100 mg Cr（VI）/kg土壤的Cr（VI）还原率可达90%以上。菌株BD6在其它重金属离子存在的条件下仍然可以对Cr（VI）进行还原,但还原效果会受到影响。Cr（VI）会对黄豆植株高度、发芽率等指标产生负面作用;经菌株BD6修复后的土壤,降低了Cr（VI）的毒性,明显改善植株的生长状况,且植株体内铬含量显著降低。Cr（VI）污染土壤中微生物丰度和多样性 明显低于未污染的土壤;经菌株BD6修复后的Cr（VI）污染土壤,微生物多样性随着修复时间的增长呈恢复趋势。因此,菌株BD6可作为修复Cr（VI）污染土壤潜在候选菌株,在今后的实际污染土壤修复中具有一定的应用价值。

一株微杆菌CBA01对球形棕囊藻的溶藻特性与生理响应研究

王灵, 向文洲, 卫华宁, 吕金亭, 吴华莲, 吴后波

2021, 37(10):  91-99.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0161

摘要 ( 342 )   HTML ( 8)   PDF (3224KB) ( 308 )  

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赤潮给海洋生态环境和海水养殖业造成了严重危害,溶藻细菌是目前生物防治赤潮的有效手段之一。旨在探究从蓝细菌Cyanobacterium sp SCSIO-45682分离的4株共附生细菌中得到的一株对球形棕囊藻具有明显溶藻效应的微杆菌属菌株Microbacterium sp. CBA01的溶藻特性和初步的作用机理。采用细菌发酵液与棕囊藻共培养模式测定菌株CBA01的溶藻效应,并分别研究去除菌体、不同温度、不同pH条件下的溶藻特性,进一步测定藻细胞丙二醛（MDA）和抗氧化相关酶系统的响应规律。结果显示,菌株CBA01发酵菌液和无菌上清液对棕囊藻有明显的溶藻作用,而菌体本身不具有溶藻活性;其溶藻效应随着菌液发酵时间延长、菌液添加量增多以及藻液初始浓度降低而增强。经CBA01无菌上清液处理,棕囊藻生长初期的细胞丙二醛（MDA）含量大幅度上升,超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（POD）活性显著提高。菌株CBA01通过胞外分泌溶藻物质经间接溶藻作用而导致球形棕囊藻的裂解,其分泌的溶藻活性物质具有一定耐高温性、耐酸不耐强碱性;而该菌株产生的溶藻物质,可能具有较强烈的氧化活性,或产生诱导藻细胞产生过量氧自由基的活性,这可能是其形成溶藻效应的重要机制。

地衣芽孢杆菌KD-1β-甘露聚糖酶定点突变提高酶活性及稳定性

田庚, 高伟强, 陈晓波, 张春晓

2021, 37(10):  100-109.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0106

摘要 ( 346 )   HTML ( 4)   PDF (3372KB) ( 349 )  

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对地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶进行定向突变获得酶活性和稳定性提高的酶。应用PCR方法对Bacillus licheniformis KD-1 β-甘露聚糖酶基因manBl进行基因克隆和定点突变,在枯草芽孢杆菌B. subtilis DB104中进行分泌表达,采用二硝基水杨酸（DNS）法进行酶活性测定。β-甘露聚糖酶ManBl及6个突变体最适pH 6.0,最适温度60℃,6个突变体比活力和pH 6.0-10.0 之间的pH稳定性均高于野生型,突变体ManBl（T112R/K291E）比活力是野生型的2.6倍,为（9 742±370.0）U/mg,K_m值为2.67 mg/mL,70℃的半衰期为80 min;C-末端带有His标签后,ManBl和ManBl（T112R/K291E）的酶活性和热稳定性降低。β-甘露聚糖突变体ManBl（T112R/K291E）酶活性和稳定性高,适合在养殖业、食品加工和洗涤业等多种工业领域中应用。

融合超嗜热菌Pyrococcus furiosus红素氧还蛋白可提高靶蛋白的热稳定性

吴娇, 余桂珍, 袁航, 刘娴, 高艳秀, 龚明, 邹竹荣

2021, 37(10):  110-119.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0060

摘要 ( 341 )   HTML ( 8)   PDF (4093KB) ( 463 )  

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热稳定性是功能蛋白（特别是酶蛋白）储存和使用的重要限制因子。许多商业酶因耐热性不能达到工业生产的热处理条件而无法被采用;另外,植物中与光合作用有关的关键酶也受高温抑制,从而导致农作物产量下降。因此,对酶蛋白进行分子改良以提高其热稳定性,进而提升其功效和扩大其应用范围,具有重要的现实意义。选取3种典型的热稳定性差、易聚集但具有重要功能的酶蛋白（小桐子抗坏血酸过氧化物酶1即JcAPX1、大肠杆菌高丝氨酸-O-转琥珀酰酶即EcMetA、假单胞菌亚磷酸盐脱氢酶即PsPtxD）作为靶蛋白,鉴定出超嗜热菌Pyrococcus furiosus的小分子红素氧还蛋白（rubredoxin）能够作为热稳定融合标签,提高大肠杆菌重组表达靶蛋白的可溶性、热稳定性及其活性的耐热能力,为通过融合表达策略提高目标蛋白的热稳定性并强化其应用提供了一个新的技术选择。

分枝杆菌转化甾醇过程的中心代谢关键基因转录差异分析

熊亮斌, 孙吉, 刘显舟, 屈占国, 计雨情, 徐一新, 王风清

2021, 37(10):  120-127.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1497

摘要 ( 359 )   HTML ( 6)   PDF (3074KB) ( 321 )  

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为探究新金色分枝杆菌代谢甾醇积累甾体药物中间体过程的中心代谢调节机制,采用转录组测序结合qRT-PCR技术,对比分析甾药中间体生产菌株中心代谢的关键基因转录水平,测定转化过程的葡萄糖消耗速率。结果显示,糖酵解途径的pfkB、pyk转录下调1.96倍及1.49倍;磷酸戊糖途径的zwf、gntZ转录下调3.57倍及2.43倍;三羧酸循环的citA、icd2和kdg转录分别下调2.5倍、1.78倍及1.92倍。对葡萄糖消耗速率的测定显示,中间体生产菌株的初始代谢速率显著低于野生型菌株。研究结果表明在转化甾醇积累甾药中间体过程中,分枝杆菌的中心代谢途径受到一定程度的抑制性调节。

醌氧化还原酶的异源表达及其在偶氮染料脱色方面的研究

刘谦谦, 唐梓静, 李天真, 李宝库, 朱蕾蕾

2021, 37(10):  128-136.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1454

摘要 ( 308 )   HTML ( 5)   PDF (6506KB) ( 241 )  

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为研究NAD（P）H:醌氧化还原酶在染料处理方面的潜力,选用大肠杆菌异源表达人来源的NAD（P）H:醌氧化还原酶（hNQO1）,对6种介体小分子（1,4-萘醌、蒽醌-2-磺酸钠盐、甲基对苯醌、1,4-二羟基蒽醌、蒽醌、甲萘醌）进行筛选,选择适合浓度的介体小分子辅助hNQO1全细胞对偶氮染料进行脱色。结果表明,利用1,4-二羟基蒽醌作为介体小分子,hNQO1全细胞对刚果红的脱色效果较好,菌体能够重复利用3次,脱色率（反应6 h）依次为94.0%,79.7%和20.3%。与刚果红相比,hNQO1全细胞对苋菜红、活性黑5的脱色率（6 h）分别为18.8%,16.4%。综上所述,该重组hNQO1在染料废水处理方面具有较好的潜力和前景。

牛病毒性腹泻病毒离子孔道蛋白p7多肽多克隆抗体的制备和鉴定

付强, 郭妍婷, 陈俊贞, 王金泉, 史慧君

2021, 37(10):  137-142.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1509

摘要 ( 381 )   HTML ( 8)   PDF (3222KB) ( 251 )  

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牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）非结构蛋白p7因其离子通道活性被称为病毒孔蛋白,参与病毒进入、释放和复制的过程。为了深入研究p7蛋白形成离子通道的机理,使用人工合成的多肽制备p7特异性多克隆抗体。根据GenBank中BVDV毒株NADL p7氨基酸序列信息,进行生物信息学分析,合成表面抗原多肽并偶联血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin,KLH）作为载体蛋白,经反相高效液相色谱（reversed-phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC）纯化、纯度分析,用质谱进行定性鉴定;使用弗氏佐剂进行乳化后,对新西兰大白兔进行皮下多点注射免疫,免疫剂量为400 μg/只,连续5次免疫,免疫后10 d时采用多肽亲和柱纯化血清,获得多肽多克隆抗体,使用间接ELISA和SDS-PAGE进行抗体效价和纯度检测;BVDV NADL感染牛肾细胞MDBK后使用免疫荧光染色检测多肽多克隆抗体的反应性和特异性。生物信息学分析p7蛋白的主要抗原表位分布在氨基端,偶联KLH后合成多肽MSQYGAGEIVM MGN-Cys-KLH,经RP-HPLC纯化后多肽纯度可达80.19%,分子量为794.2 Da;经过5次免疫并使用多肽亲和柱纯化血清后,间接ELISA检测多肽多克隆抗体效价为1:100 000,Western blot检测抗体的纯度为90.2%;使用免疫荧光染色检测发现该抗体在BVDV NADL感染的MDBK细胞的细胞膜上呈现阳性染色,与p7离子孔道定位相符。成功制备兔抗BVDV p7多肽多克隆抗体,具有较好的反应性和特异性,为进一步研究p7形成离子孔道的机理提供了有利工具。

烟台黑猪SLA-2基因真核表达载体的构建及表达

胡晓, 王宝宝, 窦少华, 姜南, 付常振, 金行, 高凤山

2021, 37(10):  143-151.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1401

摘要 ( 464 )   HTML ( 10)   PDF (4793KB) ( 321 )  

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为构建烟台黑猪SLA-2基因（SLA-2-YT）的真核表达载体SLA-2-YT/pCDH并将其在真核细胞中表达,根据SLA-2-YT编码区基因序列设计1对引物,以SLA-2-YT/pMD18-T全基因克隆表达载体为模板进行PCR扩增获得SLA-2-YT编码区基因片段,在上下游引物的5'端分别添加限制性内切酶Xba I和Not I的酶切位点,将目的基因经pMD 19-T Simple Vector TA克隆后与pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro真核表达载体连接,获得的重组质粒转化至大肠杆菌Stbl 3感受态细胞,对扩大培养的单克隆菌株抽提质粒,使用双酶切和测序验证插入序列。对真核表达载体构建正确的菌株抽提无内毒素质粒,通过慢病毒包装和感染将质粒转染至sT2细胞,通过Western Blotting检测sT2细胞中SLA-2-YT基因的表达情况。结果显示,成功构建了SLA-2-YT/pCDH重组真核表达载体。重组质粒进行慢病毒包装和感染sT2细胞,经嘌呤霉素筛选后,成功获得阳性细胞克隆。Western Blotting检测显示SLA-2-YT/pCDH在sT2细胞中得到了优势表达,其融合蛋白的分子量大小为45 kD,与理论设计值相符。该实验成功构建了SLA-2-YT编码区基因的真核表达载体,并证实了SLA-2-YT编码区基因能够在sT2细胞中优势表达,为下一步开展SLA-2-YT递呈CTL表位的研究提供了材料。

叉角厉蝽2个章鱼胺受体的基因克隆及化学农药对其表达的影响

姚琼, 全林发, 徐淑, 董易之, 李文景, 池艳艳, 陈炳旭

2021, 37(10):  152-152.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0064

摘要 ( 381 )   HTML ( 6)   PDF (4221KB) ( 313 )  

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章鱼胺（OA）是无脊椎动物中一种非常重要的生物单体胺,作为神经递质与其受体结合共同参与调节昆虫的嗅觉、产卵、运动、学习、记忆和免疫反应等多种生理功能。为了探究叉角厉蝽章鱼胺受体功能,为捕食性天敌昆虫叉角厉蝽应对逆境胁迫响应机制的研究提供参考,利用转录组测序结果和RACE技术获得2个OctβRs基因,在对其序列特征进行生物信息学分析之后,通过RT-qPCR 技术分析2个OctβRs基因的发育模式以及在亚致死剂量的高效氯氟氢菊酯和毒死蜱处理后的表达变化。结果表明扩增得到EfOctβ1R和EfOctβ2R的基因开放阅读框长度为1 245和1 230 bp,分别编码414和409个氨基酸,均属于疏水性蛋白,蛋白序列包含有7个跨膜结构域,序列中存在半胱氨酸残基位点、蛋白激酶C、配体结合位点和糖基化位点等高度保守结构域,属于典型的G蛋白偶联受体超家族成员。同源性分析结果显示,2个EfOctβRs基因分属于 Octβ1R和Octβ2R两个明显分支。在叉角厉蝽整个发育周期的不同发育阶段中,均可检测到2个EfOctβRs基因,但二者在不同发育阶段的表达水平有所差异,在叉角厉蝽成虫期均有较高量表达,其中EfOctβ2R在卵期表达要高于若虫期,而EfOctβ1R则相反。亚致死剂量高效氯氟氢菊酯和毒死蜱处理后,2个EfOctβRs基因响应强烈,均呈现不同程度的表达上升变化,分别在2种药剂处理后24 h和36 h时,EfOctβ1R和EfOctβ2R表达上升高达12倍以上。本研究结果表明,EfOctβRs可能参与叉角厉蝽在杀虫剂肋迫下的应激过程。

重组鱼精蛋白的制备及抑菌活性分析

李招发, 邱丹丹

2021, 37(10):  162-168.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0076

摘要 ( 343 )   HTML ( 8)   PDF (3438KB) ( 402 )  

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旨在利用原核表达系统实现重组鱼精蛋白的表达,并检测其生物学活性。利用基因工程手段将CYGB中甲硫氨酸位点ATG（除起始密码子）全部突变为ATC获得CYGBm。采用CYGBm与鱼精蛋白融合方法表达重组鱼精蛋白,CNBr裂解CYGBm与鱼精蛋白中的甲硫氨酸位点,并得以纯化。采用试管培养法分析重组鱼精蛋白抑菌活性,鲜虾检测其应用效果。CYGBm与鱼精蛋白融合可以在原核表达系统中大量以包涵体形式表达,经分离与CNBr裂解制备了纯化的重组鱼精蛋白,经验证重组鱼精蛋白具有很好的抑菌活性。采用基因工程方法可以实现具有抑菌活性重组鱼精蛋白的制备,为工业化生产重组鱼精蛋白提供理论基础。

与SARS-CoV有交叉免疫反应的SARS-CoV-2 S蛋白B细胞抗原表位预测

高竞溪, 高珂星, 鲁非, 纪锋, 郭志刚

2021, 37(10):  169-178.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1474

摘要 ( 382 )   HTML ( 6)   PDF (5584KB) ( 318 )  

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综合预测可与SARS-CoV发生交叉免疫反应的SARS-CoV-2 棘突蛋白（S蛋白）优势B细胞抗原表位,为开发SARS-CoV-2和SARS-CoV S蛋白通用表位疫苗和相关单抗奠定基础。采用MEGA5.05中的Neighbor-joining法构建基于SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列的系统发生树;参考SARS-CoV-2毒株与SARS-CoV毒株S蛋白氨基酸序列比对及跨膜分析结果,筛选出二者可能存在的共同抗原表位区段（944-1 213aa）。以SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1株为研究对象,其目标区段的亲水性指数、柔性区段、蛋白质表面可能性和抗原指数等参数由DNAStar软件中的Protean模块进行分析预测;结合Phyre2在线工具模拟的空间结构,综合预测可与SARS-CoV发生交叉免疫反应的SARS-CoV-2 S蛋白B细胞优势抗原表位。SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列与SARS-CoV S蛋白具有最高相似性（77.5%）,与其它可感染人类的冠状病毒（MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、HCoV-229E）S蛋白存在显著差异,相似性均低于30.3%。Wuhan-Hu-1株S蛋白具有3个疏水核心,可能存在较强的可变性。目标B细胞抗原表位大概率分布于959-966、973-979、1 003-1 011、1 030-1 037、1 057-1 070、1 079-1 085、1 123-1 132、1 174-1 179位氨基酸区段。预测的SARS-CoV-2和SARS-CoV S蛋白共同抗原表位可为通用表位疫苗的设计、单抗的制备、相关药物的快速筛选等工作提供参考。

成纤维细胞生长因子20单克隆抗体的制备及鉴定

唐禄, 董丽平, 尹茉莉, 刘磊, 董媛, 王会岩

2021, 37(10):  179-185.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1525

摘要 ( 394 )   HTML ( 6)   PDF (4455KB) ( 380 )  

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构建表达重组人成纤维细胞生长因子20（fibroblast growth factor 20,FGF20）原核表达载体,并制备抗FGF20单克隆抗体,为开发新的药物奠定基础。构建pET24a-SUMO-hFGF20原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。经镍NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,SUMO酶酶切后,再次经镍NTA亲和层析柱纯化,SDS-PAGE法检测目的蛋白纯度。以重组FGF20蛋白免疫Balb/c小鼠,常规方法制备FGF20单克隆抗体,采用protein G柱分离纯化,SDS-PAGE法检测抗体纯度,ELISA法检测抗体效价和亚型,Western blot和SPR法测定抗体亲和力。成功构建pET24a-SUMO-hFGF20重组质粒。经分离纯化后获得FGF20蛋白相对分子质量为23 kD。得到1株ELISA检测强阳性杂交瘤细胞株,单克隆抗体纯化后,效价为1:25 600,亚型为IgG1,可以与商品化抗原结合,亲和力为1.07×10^-7mol/L。通过构建、表达和纯化重组蛋白,成功制备出抗FGF20蛋白高亲和力单克隆抗体。

Cry1B抗独特型单链抗体的定点突变及生物活性分析

仲建锋, 李兴奎, 徐重新, 张霄, 刘贤金

2021, 37(10):  186-195.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0197

摘要 ( 343 )   HTML ( 4)   PDF (6350KB) ( 389 )  

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Bt毒素的长期应用使其在害虫抗药性等方面存在生态风险,这一现状促使高特异活性和新功能Bt抗虫资源的积极开发。前期研究发现抗独特型单链抗体制备技术是开发新型杀虫蛋白的一个新途径。然而获得的Bt Cry1B抗独特型单链抗体C7与昆虫BBMV结合能力不高,需进一步改造提高。通过分子模拟技术对C7与稻纵卷叶螟BBMV上的受体氨肽酶N进行同源建模、分子对接,并预测C7与氨肽酶N结合区域的热点残基。利用C7的热点残基构建饱和突变抗体库,并采用固相筛选方法,得到突变体Y124G。BIAcore分析表明Y124G与BBMV的结合能力增加,生物测定发现对稻纵卷叶螟的杀虫活性提高。这为抗体分子改造技术的应用奠定了基础,也为新型生物农药创制提供了新的思路。

增殖诱导配体蛋白的核酸适配体筛选与特异性研究

郑芳芳, 林俊生

2021, 37(10):  196-202.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0069

摘要 ( 344 )   HTML ( 8)   PDF (3856KB) ( 250 )  

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获得TNF 家族增殖诱导配体（a proliferation inducing ligand,APRIL）的核酸适配体,并考察其亲和特异性。基于磁珠-SELEX技术筛选APRIL适配体,高通量测序获得特异性结合APRIL的序列,在线软件预测其二级结构,应用斑点印迹、酶联寡核苷酸吸附实验和qPCR法测定所获适配体的亲和力和特异性。经过7轮的筛选获得核酸适配体Apt10和Apt16,预测其二级结构均具有茎环结构,斑点印迹和酶联寡核苷酸吸附实验检测结果表明,2条核酸适配体均可特异性识别APRIL蛋白,酶联寡核苷酸吸附实验和qPCR检测Apt10和Apt16的解离常数均在nmol/L范围内。成功筛选获得能特异性结合APRIL的高亲和力DNA适配体。

综述与专论

WRKY转录因子在植物逆境响应中的作用

张桐, 李智强, 伍国强

2021, 37(10):  203-215.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1481

摘要 ( 753 )   HTML ( 41)   PDF (1136KB) ( 987 )  

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WRKY转录因子（transcription factors,TFs）是植物中最重要的转录因子家族之一。其含有由60个氨基酸组成的保守WRKY结构域,该结构域的核心序列WRKYGQK可以与启动子区W-box[（T）（T）TGAC（C/T）]特异结合,从而调节启动子中含W-box元件的调节基因或功能基因的表达。当植物遭受逆境胁迫时,WRKY转录因子参与相关的转录重编程的调控过程,在植物生长发育、物质代谢及环境适应中具有重要作用。本文就WRKY转录因子的发现、结构特点、分类、调控、表达模式及近年来在植物响应非生物（干旱、高温、低温、高盐碱、营养缺失等）和生物（病、虫）胁迫中的作用研究进展进行综述,并对未来研究方向加以展望。

RNAi与转Bt基因技术协同抗虫研究进展

邓普荣, 刘勇波

2021, 37(10):  216-224.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0244

摘要 ( 482 )   HTML ( 17)   PDF (1124KB) ( 499 )  

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转基因抗虫作物降低了昆虫的危害并减少了农药的使用,但是转Bt（Bacillus thuringiensis）基因抗虫作物的大面积连续种植使得靶标害虫对转Bt基因植物产生抗性进化,导致其长期抗虫效果受到挑战。为延缓靶标害虫对Bt蛋白的抗性进化,提高转基因作物的抗虫能力,RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术与转Bt基因技术协同应用于农业害虫防治。本文综述了RNAi技术应用于农业害虫防控的进展,以及与转基因抗虫技术联合防治农业害虫的研究进展,分析其面临的挑战和技术难题,以期支撑RNAi与转基因技术发展成一种绿色环保和可持续发展的害虫综合防控技术。

盐碱土壤微生物多样性与生物改良研究进展

迪力热巴·阿不都肉苏力, 穆耶赛尔·奥斯曼, 祖力胡玛尔·肉孜, 马勤, 雷瑞峰, 安登第

2021, 37(10):  225-233.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1344

摘要 ( 498 )   HTML ( 24)   PDF (1092KB) ( 567 )  

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

盐碱土壤是全球生态系统的重要组成部分,其环境健康与可利用性涉及生态安全和人类生存。土壤微生物在土壤形成、能量转移、养分动员与循环、植被重建和生态系统长期稳定中发挥着重要作用,地理环境、土壤组分和理化性质及立地植物等均强烈地影响着土壤微生物的多样性与分布,反过来微生物可被用于盐碱土壤的改良,其中输入有机质对改良效果具有决定性价值,而具有特殊适应性的被长期“驯化”的“本土”微生物成为盐碱土改良的首选。从盐碱土壤微生物多样性与功能、影响其多样性的主要因素及微生物应用于土壤改造等方面的研究进展进行了分析,总结出土壤特性造就微生物类群-微生物改变土壤微环境-微生物与土壤共同演化的生态循环模式,以期为盐碱土壤微生物的生态功能与应用提供参考。

超声波强化木质纤维素酶解的研究进展

胡芳, 董旭, 史长伟, 吴学栋

2021, 37(10):  234-244.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0116

摘要 ( 451 )   HTML ( 6)   PDF (1456KB) ( 518 )  

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超声波处理强化木质纤维素生物质酶解过程,可提高酶解速率和可发酵糖以及生物乙醇产量。综述了木质纤维素酶解过程和限制酶解的因素,以及超声波强化在酶-底物预处理、糖化、同步糖化发酵工艺、产酶过程中的应用进展。超声波以多种方式促进木质纤维素的生物转化,对酶促反应提供明显的强化效果。对超声波强化酶解的机理进行了分析,超声波促进非均相系统的扩散和传质,同时增大酶/底物的亲和力、提高酶/底物复合物转化为产物的速度,酶分子构象发生柔性变化,易于定位于底物,破坏酶分子聚集体,使得酶活性位点更易于进行反应;增加纤维素底物的可及性;改变酶蛋白空间结构,在不改变酶的结构完整性的情况下使蛋白质分子发生有利的构象变化,使酶的活性部位暴露得更加充分,提高酶活性。对超声波处理是否会导致纤维素酶活性下降,超声波反应器的类型、参数设置对研究结果的重要影响,以及超声波强化木质纤维素酶解的经济效益评价进行了讨论。在超声波强化与其他酶解改进措施的协同作用、机理的深入研究和操作参数的综合优化等方面提出了进一步深入研究的方向。

技术与方法

单细胞测序技术及其在毛囊发育中的应用

叶娜, 张晓兰, 包鹏甲, 王兴东, 阎萍, 潘和平

2021, 37(10):  245-256.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1491

摘要 ( 635 )   HTML ( 26)   PDF (1656KB) ( 748 )  

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毛囊是一种具有独特结构的、呈周期性生长的微型器官,其形态发生始于胚胎期,由表皮上皮、间质真皮及特殊衍生物经过一系列相互作用诱导形成。出生后个体的毛囊开始进行周期性循环,包括生长期、退行期和休止期。单细胞转录组测序（single-cell RNA sequence,scRNA-seq）是一种新的测序方法,通过制备单细胞悬液或细胞群,利用二代测序（next generation sequencing）来识别单个细胞的基因表达信息,主要用于分析细胞间遗传和基因表达水平的差异,更好地了解单个细胞在微环境中的具体作用。通过单细胞转录组测序可以揭示复杂和稀有细胞群体以及基因之间的调节关系,跟踪不同细胞谱系在发育过程中的轨迹。本文就单细胞转录组测序技术及其在毛囊发育调控研究中的应用展开叙述,以期为揭示毛囊发育的分子调控机制研究提供理论参考。

基于新型磁分离技术的高分辨率DNA片段筛选技术

刘莹, 程立, 张博

2021, 37(10):  257-265.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1478

摘要 ( 468 )   HTML ( 17)   PDF (4413KB) ( 589 )  

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游离DNA作为液体活检的目标检测物,能够用于疾病的检测,但游离DNA在样本中的含量低,且片段差异小,常规方法很难实现对特定片段长度游离DNA的筛选。这种基于新型磁分离技术对游离DNA进行高分辨率筛选的方法,使用自主合成的两种不同修饰的磁珠,在沉降剂的作用下,能够实现长短片段DNA的分别回收。通过对血浆样本中游离DNA进行富集,实现了150 bp以下DNA片段的富集,并经由临床样本验证,这一技术能够实现母体血浆样本中胎儿游离DNA的富集,可在无创产前诊断样本处理环节提前检测窗口、提高检测灵敏度等。DNA片段筛选在基因测序领域是不可或缺的环节,高分辨率筛选可降低下游测序深度、节约测序成本等,可应用于肿瘤的早期筛查、无创产前诊断和免疫缺陷型疾病筛查领域。

长茎葡萄蕨藻胁迫条件下RT-qPCR内参基因的筛选与验证

李恬静薇, 邹潇潇, 朱军, 鲍时翔

2021, 37(10):  266-276.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1585

摘要 ( 357 )   HTML ( 9)   PDF (3300KB) ( 225 )  

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为了筛选出长茎葡萄蕨藻中稳定表达的内参基因用于实时荧光定量PCR的分析,以不同胁迫条件下长茎葡萄蕨藻的匍匐茎和直立枝为材料,使用比较Ct值法、BestKeeper、geNorm、NormFinder软件综合比较了常用的5个候选内参基因的稳定性,并对筛选出的内参基因进行了验证。不同内参基因在长茎葡萄蕨藻中的表达稳定性差异较大,ClACT和ClGAPDH在长茎葡萄蕨藻不同组织、不同胁迫条件下的表达稳定性均较好,而ClTUB表达稳定性则较差。在使用RT-qPCR对胁迫条件下长茎葡萄蕨藻进行基因表达分析时,采用ClACT和ClGAPDH组合作为内参基因可得出较为准确的结果。

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2021, 37(10):  277. 

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2021, 37(10):  278. 

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2021, 37(10):  279. 

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