生物技术通报

堆肥微生物：过去,现在和未来

李季, 王禄山

2022, 38(5): 1-3.

摘要 ( 373 )

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堆肥调控作物根际微生物组抑制植物病害的研究进展

王宁, 李蕙秀, 李季, 丁国春

2022, 38(5): 4-12. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0136

摘要 ( 815 )

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我国有机废弃物总量大、养分储量高,是提高农田生态系统服务功能的重要资源。好氧发酵能够较容易地实现有机废弃物处理与资源化转化,发酵产物堆肥常对多种植物病害具有抑制作用。回顾了近年来堆肥抑病方面的研究进展,重点关注堆肥对根际微生物组结构和功能的调控作用及潜在调控途径,探讨了堆肥微生物组与土壤和根际微生物组的差异,堆肥对土壤物理生物化学特性的影响及生物非生物环境因子对根际微生物组的影响,旨为“堆肥-土壤-植物根际微生物组”互作系统提供初步认识。

畜禽粪便堆肥过程中微生物群落演替

王孝芳, 万金鑫, 韦中, 徐阳春, 沈其荣

2022, 38(5): 13-21. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0138

摘要 ( 544 )

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为了满足日常肉蛋奶的需求,畜禽养殖业快速发展,与此同时产生的大量畜禽粪便亟需处理。堆肥作为一种高效、无害化、资源化的处理方式,被广泛应用于畜禽粪便的处理。畜禽粪便堆肥是通过微生物活动,将不稳定的有机物质分解转化合成为稳定的腐殖质的过程。了解微生物群落演替的基本规律,是发展堆肥新方法与理论的重要基础。论文梳理了畜禽粪便堆肥不同阶段中微生物群落结构和功能演替规律,总结了堆肥起始物料的特性（含水量、pH、C/N等）和人为活动（翻堆曝气、菌剂接种）对堆肥微生物群落演替的影响,比较了当前堆肥微生物群落的研究方法。提出了未来畜禽粪便堆肥研究值得重视的科学问题和研究方向,为指导未来的工作提供支持。

堆肥腐殖化过程及微生物驱动机制

王宇蕴, 赵兵, 马丽婷, 李兰, 邓亚琴, 徐智

2022, 38(5): 22-28. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0134

摘要 ( 991 )

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好氧堆肥是一种典型的有机固体废弃物稳定化无害化的生物化学过程,在这一过程中有机物通过微生物分解然后聚合形成腐殖质（HS）。木质素由于其复杂的网络结构,导致很难在堆肥高温阶段完全被微生物降解,此外,木质素作为HS形成的原料和骨架,它的深度降解对堆肥腐殖化过程具有重要的意义。堆肥冷却和腐熟阶段是HS形成的关键时期,其中真菌和木质素酶在深化木质素降解、强化腐殖化过程中扮演重要角色。温度和pH作为影响腐殖化进程的重要环境因子,它的调控是人为强化腐殖化进程的重要手段。综述了关键酶降解木质素的作用机制、前体物质与腐殖酸形成之间的作用机理,以及真菌对腐殖酸形成的驱动机制。提出探索堆肥过程中参与HS合成代谢途径的关键基因和酶是今后堆肥腐殖化过程研究的重要方向。

堆肥腐殖化：非生物学与生物学调控机制概述

解新宇, 史明子, 齐海石, 吴迪, 张旭, 张椿浩, 吴占海, 魏自民

2022, 38(5): 29-35. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0135

摘要 ( 593 )

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堆肥技术是有机固体废弃物处理处置与资源化利用最有效手段之一,涉及诸多复杂的非生物学与生物学反应。本文分别从非生物学及生物学层面阐述了腐殖化进程调控机制。非生物学腐殖酸合成机制涵盖了木质素-蛋白理论、多酚自缩合、多酚-蛋白途径以及美拉德反应。生物学途径包含堆肥进程碳组分的固定、木质纤维素的生物转化、反硝化进程等对腐殖化进程的响应。旨在为堆肥腐殖化进程中腐殖质的合成提供更为全面的技术参考和现状概述。

嗜酸硫杆菌在工农业中的应用

高雪彦, 陈林旭, 陈显轲, 庞昕, 潘登, 林建群

2022, 38(5): 36-46. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0139

摘要 ( 625 )

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嗜酸硫杆菌（属）（Acidithiobacillus spp.）能够氧化亚铁、硫或还原性无机硫化合物（reduced inorganic sulfur compounds,RISCs）获得能量,固定二氧化碳,是一类典型的嗜酸性化能自养微生物。嗜酸硫杆菌广泛分布于酸性矿水、热泉等酸性环境中,是地球生态系统硫和铁元素循环的主要推动者。嗜酸硫杆菌独特的生理代谢特征和极端环境适应性,使其广泛应用于生物浸出领域。本文综述了嗜酸硫杆菌的生理代谢特征和极端环境下的适应机制,阐述了嗜酸硫杆菌在工农业中的应用,讨论了面向国家重大需求,嗜酸硫杆菌在今后的主要研究方向和需要解决的关键科学问题,为嗜酸硫杆菌在生理代谢、环境适应和工农业应用的研究提供重要的线索和启示。

外接堆肥微生物在餐厨废弃物好氧堆肥中的应用

丁晓艳, 王越, 王宁, 李婉婷, 丁国春, 李季

2022, 38(5): 47-55. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0137

摘要 ( 471 )

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微生物是堆肥过程的主要驱动力,其群落在堆肥过程中不断演替,进而影响好氧发酵进程和堆肥的品质。大量研究表明：接种外源微生物可促进堆肥进程,加快有机物分解和堆肥腐熟,消解抗生素等有害物质等作用。餐厨废弃物油脂、盐、水含量高和易酸化等问题会影响好氧发酵过程中微生物的活动。通过特定样品的富集驯化、选择性培养,并结合先进的分子生物学技术,筛选具有不同降解功能的菌株,并以此为基础构建的微生物菌剂能够一定程度上克服餐厨废弃物用于好氧堆肥的限制性问题。主要阐述了餐厨废弃物好氧发酵过程中微生物菌群的演替规律,构建微生物菌剂的菌种类型及功能和不同菌剂对好氧发酵的作用及潜在影响机制,以期能够为相关微生物强化技术的研发提供一些参考。

不同基因型马铃薯对干旱胁迫的生理响应

于国红, 刘朋程, 李磊, 李明哲, 崔海英, 郝洪波, 郭安强

2022, 38(5): 56-63. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0305

摘要 ( 431 )

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通过对不同基因型马铃薯干旱胁迫下多种生理指标的综合分析,为马铃薯抗旱性研究提供理论依据,为马铃薯抗旱育种提供种质资源。采用12份不同基因型马铃薯为试验材料,测定不同处理条件下各品种整株内4种渗透调节物质和3种抗氧化酶指标,结合相关分析、隶属函数分析、聚类分析和灰色关联度分析对12份不同基因型马铃薯抗旱性进行综合评价。结果表明,干旱胁迫下,各品种叶绿素含量显著降低,渗透调节物质及抗氧化酶活性显著升高,但各种指标在不同品种中的变化幅度呈显著性差异。生理指标与综合抗旱指数的密切程度顺序为：叶绿素>CAT活性>丙二醛>SOD 活性>可溶性糖>POD 活性。通过综合评价得到抗旱性强的马铃薯品种为135、SOLARA、TACNA和克新23号,抗旱性中等的马铃薯品种为16、费乌瑞它、F8、P、VITESSE和ZORA,抗旱性差的马铃薯品种为SOSNA和冀张14号。

草棉同源多倍体后代筛选及性状鉴定

杨亚杰, 李昱樱, 申状状, 陈天, 荣二花, 吴玉香

2022, 38(5): 64-73. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1288

摘要 ( 406 )

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多倍化是物种形成及植物育种的重要途径。以实验室前期合成的草棉同源多倍体后代S₁为材料,对其进行流式细胞术、形态学、细胞学和SRAP分子标记鉴定。流式细胞倍性鉴定表明,以二倍体的荧光峰值作为参照,8株后代中有5株三倍体和3株四倍体。形态学鉴定表明,二倍体表现为株高、茎细、叶薄、叶片较小、叶色翠绿、花朵较小,三倍体和四倍体则表现为植株矮小、茎秆粗壮、叶片增厚和皱缩、叶片较大、叶色浓绿、花朵较大。细胞学鉴定表明,随着倍性的增加,气孔密度呈下降趋势,而气孔长度、叶绿体数和花粉粒直径均呈上升趋势;二、三和四倍体草棉在花粉母细胞减数分裂过程中均出现正常和异常行为,包括单分体（0.17%,2.50%和2.17%）、二分体（0.33%,0.67%和0）、三分体（4.17%,10.00%和2.33%）、正常四分体（94.83%,54.00%和73.67%）、异常四分体（0.17%,0.33%和0.83%）和多分体（0.33%,32.50%和21.00%）;异常多分体均不能形成正常花粉粒,所以三者的正常花粉粒所占比例分别为95.33%、58.83%和77.67%。SRAP分子标记鉴定表明,三倍体和四倍体不仅扩增出与二倍体完全一致的条带,还出现了条带的缺失与新的特异性条带,其中三倍体的遗传比例分别为80.81%、6.73%和12.46%,四倍体的遗传比例分别为76.59%、10.37%和13.04%,从分子水平证明了多倍体的真实性。

R2R3-MYB转录因子PnMYB1调控三七皂苷生物合成

雷君, 陈勤, 邓兵, 张金渝, 刘迪秋, 崔秀明, 葛锋

2022, 38(5): 74-83. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0981

摘要 ( 472 )

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旨在明确PnMYB1转录因子对三七皂苷生物合成具有调控作用。利用RACE技术获得PnMYB1基因全长,对PnMYB1进行系统发育树分析;构建PnMYB1植物过表达载体并侵染三七细胞,检测转基因三七细胞中人参皂苷R1、Rg1、Re、Rb1和Rd的含量;将PnMYB1与鲨烯合酶（PnSS）、鲨烯环氧化酶（PnSE）、达玛烯二醇合成酶（PnDS）和环阿屯醇合成酶（PnCAS）等参与三七皂苷生物合成途径的关键酶的基因启动子共转染烟草叶片,进行瞬时表达分析,利用GUS表达系统验证PnMYB1转录因子能否与三七皂苷生物合成关键酶基因的启动子相互作用。结果显示,PnMYB1转录因子属于R2R3-MYB家族;在过表达PnMYB1的三七细胞中,五种重要三萜皂苷在转基因细胞中均有不同程度的增加,进一步分析证明PnMYB1转录因子通过激活PnSE和PnDS的启动子,促使PnSE和PnDS的表达水平显著升高,进而实现对三七皂苷生物合成的调控。PnMYB1转录因子可以同时调控三七皂苷生物合成途径中两个关键酶基因的表达,从而影响三七皂苷的生物合成。

2-十三烷酮胁迫下棉铃虫FoxAl调控CYP6B6的表达

魏倩, 刘小宁, 赵洁

2022, 38(5): 84-92. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1305

摘要 ( 349 )

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旨在研究2-十三烷酮胁迫对棉铃虫Helicoverpa armigera叉头框A类似蛋白（forkhead box A-like protein,FoxAl）基因表达水平的影响,及FoxAl蛋白是如何调控解毒酶基因CYP6B6表达,为进一步明确FoxAl参与棉铃虫解毒代谢和生长发育过程提供依据。通过酵母自激活检测FoxAl蛋白的转录激活能力;通过凝胶阻滞检测FoxAl蛋白与CYP6B6启动子的结合能力;通过RNAi沉默棉铃虫5龄幼虫中肠内FoxAl基因,检测不同时间（24,48,72和 96 h）后FoxAl和CYP6B6的表达变化情况;最后通过qPCR检测不同浓度（5,10和20 mg/g）2-十三烷酮处理不同时间（6,12,20,30和48 h）后棉铃虫6龄幼虫中肠内FoxAl和CYP6B6的表达谱,并分析FoxAl和CYP6B6表达谱的相关性。FoxAl蛋白具有激活酵母MEL1报告基因转录的能力,且该蛋白能与CYP6B6启动子中响应植物次生物质应答的核心片段结合。利用dsFoxAl沉默棉铃虫5龄幼虫中肠内FoxAl的表达量后,CYP6B6的表达量也显著降低。2-十三烷酮处理棉铃虫6龄幼虫后,中肠内FoxAl和CYP6B6的表达量变化情况相似,基本都呈抛物线趋势,在短时间12 h内两者的表达量迅速上升后,随胁迫时间的延长两者的表达量逐渐降低;此外,FoxAl和CYP6B6的表达量变化基本呈正相关,甚至在20 mg/g的胁迫浓度以及12 h和48 h的胁迫时间下两者都是高度正相关（r=0.819,P=0.045;r=0.987,P=0.007;r=0.978,P=0.011）。棉铃虫FoxAl蛋白可能是CYP6B6的转录激活因子,在植物次生物质2-十三烷酮短期胁迫下,FoxAl的表达量增加,进一步上调CYP6B6的表达,从而参与棉铃虫对2-十三烷酮的解毒作用。

花生疮痂病菌蓝光受体EaWC 1基因克隆及生物信息学分析

李洋, 张晓天, 朴静子, 周如军, 李自博, 关海雯

2022, 38(5): 93-99. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0937

摘要 ( 429 )

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光是真菌感知和适应环境的重要信息载体,调控多种生理生化过程。痂囊腔菌素（Elsinochromes,ESC）是花生疮痂病菌重要的毒力因子,蓝光对其具有正调控作用,为了进一步揭示光调控ESC机制,开展了花生疮痂病菌蓝光受体基因EaWC 1克隆、生物信息学分析和表达模式研究。结果表明,蓝光受体基因EaWC 1全长为3 261bp,具有一个完整的开放阅读框,编码长度为1 086个氨基酸的蛋白质,相对分子质量11.95 kD,理论等电点为8.81,具有核定位信号,为稳定亲水性蛋白。qPCR定量分析表明,EaWC 1基因表达受到蓝光诱导,其表达模式与ESC毒素含量呈显著正相关。研究结果对于阐明花生疮痂病菌蓝光受体生物功能,揭示ESC毒素生物合成光调控机制和调控网络奠定了理论基础。

产IAA兼具溶磷解钾高效促生菌的筛选、鉴定及其广谱性应用

张昊鑫, 王中华, 牛兵, 郭慷, 刘璐, 姜瑛, 张仕祥

2022, 38(5): 100-111. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1557

摘要 ( 649 )

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从植株根际筛选出具有多种功能的促生菌种,对其促生功能进行探究,为实现农业“增产提效”提供优质菌肥种质资源。从根际土壤中分离出菌株,用Salkowski比色法测定产吲哚乙酸（IAA）能力,并用钼锑抗比色法和火焰光度法测定溶磷解钾能力,筛选出高效促生菌株并进行形态、生理生化及16S rDNA系统鉴定,探究其产IAA最适条件,进而通过盆栽和大田试验研究其实际应用效果。实验筛选出一株产IAA达61.71 mg/L、解钾能力达17.57 mg/L、解有机、无机磷能力分别达到98.25 mg/L和 0.64 mg/L的威兹曼芽胞杆菌（Bacillus wiedmannii）YC9;其产IAA能力在装液量为150/250 mL、pH为7-9、碳源为葡萄糖、氮源为蛋白胨时最优;盆栽试验中通过主成分分析（PCA）结合相关性分析发现YC9可以通过提高土壤中IAA以及速效磷钾含量,从而促进烟草根系及地上部的生长。在烟草和小麦的大田试验中,烤烟的产量和上等烟的比例分别增加了14.3%和9.6%,小麦增产了43.8%,表明YC9在烟草与小麦种植中均有良好的应用效果。YC9是一株兼具产IAA、解磷、解钾的多功能促生菌,能够在河南省潮土种植区提高经济作物的产量和品质,增加粮食作物的产量,具有广谱性应用前景。

过表达Spt7对黑曲霉生长及抗逆性影响

薛鲜丽, 王静然, 毕杭杭, 王德培

2022, 38(5): 112-122. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0946

摘要 ( 449 )

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SAGA复合体是一种多功能蛋白复合物,负责细胞内10%以上的基因转录。Spt7作为SAGA复合体的核心蛋白,维持SAGA复合体的稳定。除酵母之外的真菌中并未有Spt7相关的研究报道。本研究对不同黑曲霉、丝衣霉等丝状真菌来源的Spt7的氨基酸序列进行多序列比对及蛋白结构的分析,发现Spt7在不同物种一致性较低,但均存在保守型的Bromo结构域。以黑曲霉1062为出发菌株,通过农杆菌转化法将过表达spt7的质粒转入1062菌株中,获得黑曲霉OE spt7转化子。通过对OE spt7转化子及对照组在CM培养基生长形态进行观察分析发现,过表达Spt7有益于菌体的生长及分生孢子的生成,在72 h时OE spt7转化子和对照组的菌落直径分别达到2.9 cm和2.8 cm,且转化子的孢子数量达到（5.8-6.3）×10⁷/cm²,较对照组（2.3×10⁷/cm²）提高1.5-1.7倍,且转化子菌丝分支较对照组多。另外,与对照组相比,OE spt7转化子在15 mmol/L H₂O₂条件下孢子萌发更快,菌落直径是对照组4倍,且在15% NaCl高渗以及39℃高温的条件下较对照组生长更加鲜活。通过qRT-PCR分析参与菌体抗氧化胁迫的过氧化物酶及耐高温的热休克蛋白基因的转录水平,发现除了CatR转录水平下调3.56倍,其他的过氧化物酶SOD、CpeB、GPX分别上调了3.8、1.89、3.56倍,除Hsp40及Hsp70较对照组无显著差异,Hsp90的转录水平上调19倍。

开菲尔粒中微生物对苯并（α）芘的非靶向代谢组学分析

古丽加马力·艾萨, 邢军, 李安, 张瑞

2022, 38(5): 123-135. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1074

摘要 ( 382 )

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本文针对新疆传统发酵剂开菲尔粒中微生物对多环芳烃类化合物苯并（α）芘的作用机制这一问题,研究50 mg/L苯并（α）芘胁迫作用下,开菲尔粒微生物在发酵乳中代谢产物发生的特征性变化。采用非靶向代谢组学技术,结合主成分分析和偏小二乘判别分析方法,确认了苯乙酸、苯酚、原儿茶酸、邻苯二甲酸二异丙酯、邻苯二甲酸等为中间代谢特征产物,在KEGG数据库共注释到56条代谢途径,其中富集代谢产物较多、显著性高、与氨基酸代谢有关的关键通路有3条,中间代谢物质在脱氢酶、双加氧酶、脱氢异构酶等一系列酶的作用下将苯环裂解,因此推断开菲尔粒中存在微生物菌株可能通过“萘途径”“邻苯二甲酸途径”“苯丙氨酸途径”3条代谢途径对苯并（α）芘进行降解。研究可以为微生物对苯并（α）芘的作用机制提供一定的理论基础,可以为降低苯丙（a）芘对人体的危害提出可能的生物防治策略,为开菲尔发酵乳制品在食品工业中的合理开发应用提供研究依据。

绿色木霉Tv-1511组蛋白乙酰化酶编码基因TvGCN5的功能分析

张豪, 李哲, 郭凯, 黄艳华, 郝永任

2022, 38(5): 136-148. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0998

摘要 ( 422 )

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绿色木霉在植物促生抗逆、生物防治、纤维素酶生产和生物质利用等方面有着广泛用途。组蛋白乙酰化酶在基因表达调控中发挥着重要作用,GCN5是最具代表性的组蛋白乙酰化酶之一。本文针对绿色木霉TvGCN5基因的功能进行了分析研究。通过敲除绿色木霉组蛋白乙酰化酶TvGCN5基因建立绿色木霉Tv-1511-△GCN5缺失突变菌株,同时通过构建TvGCN5基因过表达载体获得绿色木霉GCN5基因过表达菌株Tv-1511-GCN5-OE,以研究绿色木霉Tv-1511组蛋白乙酰化酶编码基因TvGCN5在促生抗逆、产酶等方面的功能。结果表明,相比较野生型,TvGCN5过表达的Tv-1511-GCN5-OE菌株,在胁迫应答方面,具有更强的盐胁迫和高温胁迫耐受性;在对植物促生方面,具有更强的IAA生产能力,促生效果更好;在产酶方面,具有更更强的多种纤维素酶的生产和分泌能力。而缺失型菌株Tv-1511-△GCN5,相比较野生型,则在这些方面普遍降低,效果减弱。因此,TvGCN5基因在木霉促生抗逆、次级代谢以及产纤维素酶等方面可能起着重要作用。

Lon1蛋白酶参与耐辐射异常球菌高温胁迫及细胞分裂的功能研究

赵明明, 唐殷, 郭磊周, 韩佳慧, 葛佳茗, 孟勇, 平淑珍, 周正富, 王劲

2022, 38(5): 149-158. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1067

摘要 ( 365 )

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Lon是一类广泛存在于生物体内的蛋白水解酶,其通过水解受损及无用蛋白,防止蛋白聚集造成的细胞伤害,在胞内氨基酸周转再利用中发挥重要作用。极端微生物耐辐射异常球菌（Deinococcus radiodurans R1）的超强非生物胁迫耐受性与其拥有功能强大的胞内蛋白质稳态系统密切相关。而Lon作为蛋白水解系统的重要组成部分,在耐辐射异常球菌中的功能分析还未见具体报导。因此本研究以耐辐射异常球菌Lon1蛋白酶为研究对象,分析其逆境胁迫下的功能。结果显示 lon1基因的转录受高温诱导,48℃高温胁迫蛋白组学分析显示,lon1的缺失使多个分子伴侣蛋白、参与膜功能和转运蛋白以及与DNA修复、转录调控、能量代谢等相关的蛋白表达量发生显著上调;lon1的缺失使5个参与细胞形态建成的蛋白表达量显著下调,电镜结果证实lon1缺失使细菌分裂异常,形成巨型细胞,细胞膜发生严重的损伤;非生物胁迫冲击实验发现,lon1的缺失使耐辐射异常球菌对0.2 mol/L NaCl以及48℃高温敏感。研究表明Lon1蛋白酶主要参与耐辐射异常球菌的细胞形态建成,并在适应高温等胁迫中发挥功能。

miR-665在奶牛乳腺上皮细胞炎症中的表达及功能分析

李宇航, 王兴平, 杨箭, 罗仍卓么, 任倩倩, 魏大为, 马云

2022, 38(5): 159-168. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1071

摘要 ( 363 )

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为探究miR-665在奶牛乳腺上皮细胞炎症中的表达及功能,利用脂多糖（LPS）诱导奶牛乳腺上皮细胞产生炎症反应,在LPS诱导0、3、6和12 h采用qPCR技术检测了miR-665及其潜在靶mRNA的表达水平,并采用生物信息学方法进行了miR-665保守性分析、靶基因预测及其KEGG和GO功能富集分析。结果表明,miR-665在牛、人和小鼠等物种间高度保守;与0 h相比,miR-665在LPS诱导乳腺上皮细胞产生炎症的3、6和12 h的表达量均显著上调,且与促进炎症相关的潜在靶基因（MAPK14、MAP3K2、SMAD2、SP1）的表达量呈相反趋势;miR-665的靶基因预测及其KEGG和GO功能富集结果显示,miR-665可能通过参与MAPK、Th17细胞分化、肿瘤坏死因子等信号通路发挥作用。推测miR-665可能在LPS诱导的乳腺上皮细胞炎症中具有抑制作用。

调控猪ETV5基因miRNA的筛选鉴定

李虹仪, 彭国良, 肖正中, 张茂

2022, 38(5): 169-174. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1057

摘要 ( 362 )

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ETV5是在精原干细胞自我更新和维持中起到关键作用的转录因子。为筛选出调控猪ETV5基因的miRNA,利用在线分析软件TargetScan、miRanda预测调控ETV5基因的miRNA,采用双荧光素酶活性检测对筛选出来的保守miRNA进行验证,筛选出miR-19后采用 miR-19 模拟物 mimics 和抑制物 inhibitor 分别转染猪胎儿成纤维细胞和睾丸支持细胞,荧光定量检测ETV5的表达,同时在猪胎儿成纤维细胞中对ETV5基因进行敲除,检测miR-19的表达变化。结果表明,miR-19可通过与ETV5 3' UTR区结合显著降低细胞中荧光素酶的活性（P<0.01）;细胞转染结果显示miR-19 mimcs 可显著降低猪胎儿成纤维细胞和睾丸支持细胞中ETV5的表达,miR-19 inhibitor 则结果相反（P<0.01）;在胎儿成纤维细胞中对ETV5基因进行敲除后,miR-19的表达极显著提高（P<0.01）。miR-19对猪ETV5基因的表达具有调控作用,为进一步开展miRNA调控猪ETV5基因影响猪生殖方面的研究提供参考。

军曹鱼nanos1的克隆及其在胚胎和性腺发育过程中的表达分析

李豫, 陈刚, 马骞, 邝杰华, 陈有铭

2022, 38(5): 175-182. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1039

摘要 ( 317 )

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旨在探讨军曹鱼nanos1基因（Rcnanos1）的序列特征,及其在胚胎和性腺发育过程中的功能,利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）克隆获得Rcnanos1基因的cDNA序列,全长1 290 bp,其中5'非编码区139 bp,3'非编码区470 bp,开放阅读框（ORF）681 bp,共编码226个氨基酸。序列多重比对结果显示,RcNanos1氨基酸序列包含两个连续的锌指功能结构域,与尖吻鲈（Lates calcarifer）Nanos1的一致性最高（99.6%）。系统进化分析表明军曹鱼Nanos1与尖吻鲈（Lates calcarifer）和斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）的同源蛋白亲缘关系最近。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）结果显示,Rcnanos1在150 dph（days post hatching）军曹鱼的13种组织中均有表达,但在性腺中的表达量显著高于其它组织。胚胎发育过程中,Rcnanos1在早期卵裂阶段的表达水平较低,16细胞期时表达量开始显著升高,并在1 dph仔鱼中的表达量上升至最大值。Rcnanos1在精巢和卵巢首周年发育过程中的表达模式相似,在精巢中（Ⅱ-Ⅴ期）,Rcnanos1的表达水平呈逐渐升高趋势,360 dph（Ⅴ期）时的表达量最高;在卵巢中（Ⅰ-Ⅲ期）,Rcnanos1的表达量同样在360 dph（Ⅲ期）时达到峰值。由此推测,Rcnanos1基因可能在胚胎和性腺发育过程发挥一定的调控作用,可为揭示军曹鱼生殖细胞发生发育的分子机理提供理论基础。

Kod DNA聚合酶的制备及纯化研究

易芳, 来鹏程, 郑希鳌, 胡帅, 高燕丽

2022, 38(5): 183-190. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1210

摘要 ( 1058 )

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Kod DNA聚合酶作为常见的高保真DNA聚合酶,具有较强的DNA延伸能力以及3'-5'外切核酸酶校正活性。本研究通过对重组Kod DNA聚合酶分离纯化条件的优化,以期提高其表达和纯化效率以及片段扩增能力。利用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG）对pET-30a-Kod进行诱导表达后,利用酶溶法和超声波破碎法对细胞破碎并提取粗酶液,然后利用Ni-NTA柱洗脱纯化获得较纯Kod DNA酶,再经透析得到高纯度Kod DNA酶,利用PCR反应和Sanger测序手段来检测自提纯化的Kod DNA聚合酶活性及保真性。同时,本研究对IPTG浓度和洗脱液中咪唑浓度等重要参数进行优化。结果表明,在28℃条件下0.1 mmol/L IPTG诱导16-18 h后,Kod DNA聚合酶高效表达;当咪唑浓度为200 mmol/L时蛋白洗脱效果最佳。PCR反应体系中Mg²⁺浓度为1.5 mmol/L,Kod DNA聚合酶浓度为0.061 25 μg/µL时,Kod DNA聚合酶效率较高,能有效地扩增3 194 bp的目的条带;通过序列比对,PCR产物序列中未引入任何突变。经优化制备后的Kod DNA聚合酶在酶活性和扩增保真性上均能达到商用高保真DNA聚合酶水平。本研究为节省实验室PCR成本,进一步开发和利用Kod DNA聚合酶奠定一定的基础。

靶向模拟Bt Cry1C蛋白抗虫功能的人源化基因工程抗体筛选及鉴定

徐重新, 张霄, 刘媛, 仲建锋, 谢雅晶, 卢莉娜, 高美静, 刘贤金

2022, 38(5): 191-200. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0991

摘要 ( 340 )

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Bt蛋白制剂及其转基因作物长时间推广应用,害虫抗药性等问题日益凸显,探索新型安全抗虫材料已成为竞先研究的热点。基于抗体免疫网络学说的抗独特型抗体技术被证实可用于研发抗原生物活性类似物,有望成为靶向创制模拟Bt蛋白抗虫功能材料的新途径。以Bt Cry1C蛋白多克隆抗体为包被抗原,从人源化噬菌体单链抗体库中获得9个阳性单克隆,其中E8-Anti-Id scFv经鉴定为β型抗独特型基因工程单链抗体。Bt Cry1C蛋白多克隆抗体、小菜蛾（Plutella xylostella）刷状缘膜囊泡（brush border membrane vesicles,BBMV）蛋白和稻纵卷叶螟（Cnaphalocrocis medinalis）BBMV蛋白对E8-Anti-Id scFv的竞争抑制中浓度（IC₅₀）分别为2.625、3.638和4.605 μg/mL。室内生物测定显示,噬菌体展示形式的E8-Anti-Id scFv在滴度为1.2×10⁸ CFU/mL浓度条件下,对供试的小菜蛾和稻纵卷叶螟在72 h内的校正死亡率为58.69%和52.82%,其抗虫活性分别达到浓度为20 μg/mL的原Bt Cry1C蛋白的77.87%和73.21%。由此表明,获得的E8抗独特型基因工程单链抗体材料初步具备模拟Bt Cry1C蛋白抗虫功能的特性,为后期深入研究和推进应用奠定了技术和材料基础。

参与植物非生物逆境响应的DREB/CBF转录因子研究进展

刘坤, 李国婧, 杨杞

2022, 38(5): 201-214. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1219

摘要 ( 686 )

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DREB/CBF转录因子是植物AP2/ERF转录因子超家族的一个亚家族,具有AP2保守结构域,能特异性结合植物抗逆基因启动子区域DRE/CRT顺式作用元件。目前,越来越多研究表明,DREB/CBF转录因子参与调控植物响应干旱、盐、冷、热以及其他逆境胁迫的应答反应,是植物抗逆的关键调节因子。综述了近年来国内外DREB转录因子的研究进展,从DREB转录因子的结构、分类、家族及在非生物逆境胁迫中的功能等方面进行了总结,并结合当前研究的瓶颈,讨论了研究植物DREB/CBF转录因子的意义及存在的问题,并提出了今后的突破方向,以期为筛选优质抗逆植物资源,培育抗逆农林草新品种提供理论依据和指导。

植物内生菌在食用农产品质量安全与营养品质调控中的研究进展

徐重新, 仲建锋, 高美静, 卢莉娜, 刘贤金, 沈燕

2022, 38(5): 215-227. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1082

摘要 ( 391 )

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食用农产品是食品的基础原料,直接关乎人类日常生活和健康,对其质量安全和营养品质调控是农业和食品领域研究的重大课题。植物内生菌是健康植物体内的共生菌,菌体及其代谢产物能对调控植株生长发育以及环境胁迫适应等方面产生重要影响。目前对植物内生菌的研究已渗透到农业生产过程中的各个领域,其应用价值逐渐崭露头角,成为助推农业生产和提升农产品品质的潜在辅助手段,特别在食用农产品质量安全与营养品质调控上具有独特优势。本文就植物内生菌在食用农产品生产过程中产地环境危害物、农药投入品危害物、病虫害以及营养品质指标等调控方面的最新研究状况进行系统综述,并就植物内生菌在食用农产品质量安全与营养品质指标调控研究上的技术瓶颈以及未来可拓展的研究和应用展开探讨,为食用农产品质量安全与营养品质调控领域研究提供最新的有参考价值的文献资料和潜在技术创新思路。

介孔二氧化硅纳米粒在农业中的应用

孙德权, 陆新华, 李伟明, 胡玉林, 段雅婕, 庞振才, 胡会刚

2022, 38(5): 228-239. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0731

摘要 ( 628 )

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介孔二氧化硅纳米粒（mesoporous silica nanoparticles,MSNs）具有高容量介孔空间、比表面积大、稳定性强、内外表面易于修饰和生物相容性好等优点,其在农业上的应用已成为当前国内外研究的热点。综述近年来国内外MSNs在农业生产上的应用进展,详细阐述MSNs作为载运系统在农业投入品和转基因方面的优势,讨论MSNs在环境污染治理、农产品贮藏保鲜、探测传感器等方面应用的特点,解析植物吸收、运输和积累MSNs的过程以及其与植物互作的原理,综合评估MSNs的生物安全性。最后,针对目前存在的问题和发展前景进行展望,以期为更有效地利用MSNs解决农业生产中的实际问题提供参考与理论支撑。

发光核酸适配体的筛选及应用

周子琦, 张洋子, 兰欣悦, 刘洋儿, 朱龙佼, 许文涛

2022, 38(5): 240-247. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1183

摘要 ( 480 )

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发光核酸适配体（light-up nucleic acid aptamers,LNAs）是一类能够特异性结合目标分子并增强目标分子发光性能的功能核酸（functional nucleic acids,FNAs）。LNAs具有组成简单、结构稳定、表达时间短等优点,因此在细胞成像、物质检测等传感领域显示出巨大潜力。随着对细胞内基因原位分析的研究深入,现存胞内成像技术的不足逐渐显露,LNAs成像系统应运而生。本文梳理并概括了不同类型LNAs的筛选方法,并从胞内、体外两个方面对LNAs的前沿应用进行了分析,指出了当前LNAs研究以及传感系统存在的不足,展望了LNAs在无细胞传感中的巨大发展前景,以期能够促进LNAs系统成为胞内外传感研究的一件利器。

噬菌体抗体展示技术及其在抗新冠病毒抗体发现中的应用

王加利, 和似琦, 康子茜, 王建勋

2022, 38(5): 248-256. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0862

摘要 ( 618 )

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噬菌体抗体展示技术是第一个也是目前应用最广泛的体外抗体筛选技术,可用于发现治疗各种疾病的全人源抗体。虽然存在不同的抗体发现方法,但噬菌体抗体展示技术已成为发现和优化靶标特异性单克隆抗体不可或缺的工具。研究人员可通过在丝状噬菌体上创建组合抗体库,从而在几周内获得抗原特异性抗体。在当前冠状病毒病（COVID-19）大流行的情况下,对中和抗体的研究激励着研究人员寻找出抗SARS-CoV-2的候选治疗药物。通过对噬菌体抗体库的筛选,目前已有许多不同的SARS-CoV-2中和抗体被发现。因此,本文综述了噬菌体抗体展示技术的原理,抗体库的构建、分类及淘选流程,并对其优点及局限性进行了讨论。此外,还总结了利用该技术发现抗SARS-CoV-2中和抗体的最新进展。旨为今后该技术在抗体发现中的应用提供理论支持。

CRISPR/Cas基因编辑技术及其在微藻研究中的应用

陈映丹, 张扬, 夏嫱, 孙虹霞

2022, 38(5): 257-268. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0877

摘要 ( 698 )

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微藻由于在医药、食品、可再生燃料和化学原料等方面的潜力,受到了研究者越来越多的关注和青睐。然而,合适基因编辑方法和转化工具的缺乏,使得微藻基因工程的进展还相对比较缓慢。随着分子生物和基因编辑技术的发展,CRISPR 技术凭借简便、特异和高效的优势,逐渐成为探讨基因功能、提高植物育种和增加代谢物产物等研究的有力手段。基于此,本文综述了CRISPR/Cas 的2 种主要类型,重点论述了其在微藻领域中的应用进展,并总结了CRISPR 技术在微藻应用中所存在的问题,期望为以后的研究提供启发和参考。

L-天冬氨酸-α-脱羧酶的重组表达、定点突变及高通量检测方法的建立

朱秋雨, 段绪果

2022, 38(5): 269-278. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0892

摘要 ( 387 )

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将枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因进行了克隆和异源表达,并通过定点突变构建了2个突变体。针对该酶活力检测时存在的检测通量低、周期长和成本高等缺点,旨在建立一种简单高效的酶活力高通量检测方法。采用氯酚红（CPR）指示剂和4-吗啉乙磺酸（MES）缓冲液体系,并对检测条件进行优化,提高检测的准确性和灵敏性,建立了基于比色法的微孔板高通量检测方法,然后以L-天冬氨酸-α-脱羧酶及其突变体作为模型酶,对高通量检测方法进行了验证。优化后的酶活检测条件为MES缓冲液2 mmol/L,CPR指示剂75 μmol/L,L-天冬氨酸75 mmol/L,pH 6.5,温度37℃,反应时间10 min,检测波长为567 nm。采用3种模型酶对微孔板高通量检测方法进行了验证,结果显示该方法与HPLC法测得的结果一致。高通量检测方法具有操作简便易行、灵敏度高等优点,能够用于L-天冬氨酸-α-脱羧酶的快速检测。该方法的建立将为L-天冬氨酸-α-脱羧酶进行定向进化及突变体的高通量筛选奠定基础。

基于跨反向剪接位点引物特异性检测circRNA的PCR方法

孙宝箴, 全龙萍, 康慧, 姚玉新, 沈甜, 陈卫平, 杜远鹏, 高振

2022, 38(5): 279-285. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0746

摘要 ( 490 )

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为了特异扩增circRNA发生可变反向剪接环化事件时被包含的circRNA,准确分析目标circRNA的表达水平。首先通过生物信息学分析葡萄高可信度circRNA的可变反向剪接环化事件特征,提出一种适用于葡萄circRNA可变反向剪接环化事件的引物设计改良方法,即一端引物的3'端跨反向剪接位点3-4个碱基,并运用RT-PCR和qRT-PCR方法进行验证。结果表明,高可信度葡萄circRNA的来源基因中有21.7%存在可变反向剪接环化事件,可分为并列、交叉和包含关系。选取4组circRNA进行扩增,其中circRNA_4363、circRNA_6017、circRNA_6044和circRNA_7086分别被circRNA_4364、circRNA_6018、circRNA_6045和circRNA_7085包含,使用常规背向引物对被包含的4个circRNA进行RT-PCR可获得2条扩增条带,且qRT-PCR溶解曲线为双峰。通过应用改良引物对circRNA_4363、circRNA_6017和circRNA_7086进行RT-PCR和qRT-PCR可获得单一扩增产物。相较于常规背向引物,使用改良引物可以特异扩增发生可变反向剪接环化事件时被包含的circRNA,使其定量分析结果更加准确可靠。

2022, 38(5): 286-286.

摘要 ( 112 )

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