生物技术通报

基于CRISPR/Cas系统的DNA碱基编辑研究进展

赖昕彤, 王柯岚, 由雨欣, 谭俊杰

2022, 38(6): 1-12. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0311

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基于CRISPR/Cas的基因编辑是近年发展起来的一项变革性生物技术。其过程包括在目标DNA位点引入双链断裂（double strand break,DSB）以及其后续的细胞修复。细胞修复DSB主要有两种方式：非同源末端连接（non-homologous end joining,NHEJ）以及同源重组介导的修复（homology-directed repair,HDR）。前者是大多数细胞修复DSB的主要方式,其特点在于修复简单、效率高但极易出错,往往会引发难以预测的核苷酸插入或删除。点突变是自然界中最常见的遗传突变类型,引起了超过半数的人类遗传疾病以及许多重要农艺性状变异。碱基编辑能够实现单个碱基的替换,既不需要引入DSB,又无需修复模板参与,具有高效、编辑结果可控等优点,在基因治疗、作物育种及生物技术研究等方面具有重大的应用潜能。自首个碱基编辑工具开发以来,碱基编辑相关技术得到快速发展及广泛应用。本文综述了目前DNA碱基编辑研究进展,重点阐述了碱基编辑器及其在编辑效率、精度以及特异性提高和编辑范围扩展等方面的最新进展以及仍存在的瓶颈,并展望其研究和应用前景。

植物响应Cd胁迫研究进展

刘自然, 甄珍, 陈强, 李玥莹, 王泽, 逄洪波

2022, 38(6): 13-26. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1286

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镉（Cd）是一种毒性极强的重金属污染物,位于土壤无机污染物首位。Cd因具有强流动性和溶解性而容易被植物体吸收,不仅影响植物正常生理代谢并降低作物品质,还能通过食物链的传递和富集危害人体健康,因此植物对Cd胁迫的响应机制已成为研究的热点。本文综述了Cd胁迫对植物生理代谢和分子层次危害的同时,总结了植物在Cd胁迫下进化出的耐受性机制,以期为培育低积累作物和超积累Cd污染土壤修复植物提供理论依据。

植物黄烷酮-3-羟化酶基因研究进展

段玥彤, 王鹏年, 张春宝, 林春晶

2022, 38(6): 27-33. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1253

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黄烷酮3-羟化酶（flavanone 3-hydroxylase,F3H）作为植物进入不同类黄酮代谢物分支的一个中枢酶,可以催化生成花青素和黄酮醇合成的共同前体物质二氢黄酮醇,在类黄酮合成途径中起着十分重要的调控作用。本文从F3H基因的发现、结构功能和表达调控等方面,综述了F3H基因在调节植物花青素和黄酮醇合成中的研究进展及调控网络,并对未来研究方向进行了展望。期望为F3H基因在植物类黄酮代谢合成途径的调控机制研究提供参考,也有助于利用F3H开展基因工程研究,定向培育植物新种质。

AtRGS1胞吞动态调控G蛋白参与拟南芥生长发育和抗性反应

古盼, 齐学影, 李莉, 张曦, 单晓昳

2022, 38(6): 34-42. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0849

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异源三聚体G蛋白由Gα、Gβ和Gγ 3个亚基组成,是普遍存在于真核细胞中的跨膜信号转导因子。植物细胞通过定位于细胞质膜的G蛋白信号调节子RGS蛋白（regulator of G protein signaling）,调控异源三聚体G蛋白的活性,进而参与生长发育、激素和糖信号转导以及抗病反应等多个重要生物学过程。膜蛋白可通过胞吞循环调控其在细胞质膜上的数量,以响应外界环境因子和自身发育信号。近年来,研究表明多种外界信号诱导拟南芥AtRGS1蛋白的胞吞,进而促进其与Gα亚基的解离,游离的Gα-GTP、Gβγ亚基和定位于内含体的AtRGS1蛋白均可能调控下游信号转导,进而影响相应生物学过程。本文综述了AtRGS1通过胞吞作用调控G蛋白参与的生长发育和抗性反应的分子细胞学机制研究进展,以期为深入理解G蛋白信号调节子影响植物发育进程和抗性反应的作用机制提供理论参考,为植物膜蛋白胞吞调控信号转导提供新的视角。

ABC转运蛋白结构及其在细菌致病性中的研究进展

陈福暖, 黄瑜, 蔡佳, 王忠良, 简纪常, 王蓓

2022, 38(6): 43-52. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1175

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ABC转运蛋白,即腺苷三磷酸结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette transporter）是具有多种功能且分布极为广泛的膜蛋白质家族。它的主要功能是利用ATP水解产生的能量来实现对底物的跨膜转运,ABC超家族蛋白转运体普遍存在于细菌、真菌,线虫,果蝇、植物、哺乳动物等几乎所有生物体内。大多数ABC 转运蛋白最初是通过研究真核生物体耐药性（多效耐药和多药耐药）而被发现的。目前针对ABC转运蛋白在细菌致病性中所发挥作用也有广泛的研究。本文综述了ABC 转运蛋白的结构、转运机制和ABC转运蛋白在细菌致病性过程中的作用,讨论了深入研究ABC转运蛋白作用机制对细菌性疾病防治的意义及存在问题。ABC转运蛋白相关的细胞表面或分泌因子很可能是抗菌疗法或疫苗开发的作用靶点,为细菌性疾病的预防提供了新的思路。

联合用药对嗜水气单胞菌耐药性影响研究进展

赵海晴, 李耘, 梁严内, 刘哲, 任亚林, 李金娟

2022, 38(6): 53-65. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1004

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嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是威胁水产养殖业安全最严重的病原微生物之一,同时还存在人畜共患的典型特征。随着抗生素、抗菌药物的主动使用和被动暴露（医院生活废水、畜禽养殖污水排放至养殖水体环境）,嗜水气单胞菌多重耐药问题日益突出,给水产养殖和人体健康均带来潜在风险。而合理联合用药不仅可减缓和阻控细菌耐药性产生,还能减少药物残留。本文首先分析联合用药遵循的原则及应关注的方向,阐述耐药产生的原因及联合用药影响耐药性的作用机制,综述研究联合用药阻控嗜水气单胞菌耐药性的动态进展,最后提出如何推进的思考和展望,旨在为水产养殖业通过联合用药手段控制嗜水气单胞菌耐药性提供防控策略和解决手段。

抗生素佐剂与抗生素联用的抑菌作用研究进展

朱浩, 张严伟, 刘润, 梁艳, 杨奕, 徐天乐, 杨章平

2022, 38(6): 66-73. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0027

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细菌耐药性一直是一项全球性的卫生挑战,加剧人们控制和治疗危及生命的细菌感染难度。尽管人们正在努力开发新的抗生素或其替代品,但在过去的二十多年,几乎没有新的抗生素或其替代品被临床批准使用。抗生素佐剂与抗生素的组合可以抑制细菌耐药性或增强抗生素抑菌性,为对抗多重耐药细菌提供了一种可持续和有效的策略。本文综述了抗生素佐剂的分类和作用机制。最后讨论了抗生素佐剂和抗生素联合使用策略的发展趋势和面临的挑战。

一种用于PCR的番茄DNA快速粗提方法

申恒, 刘思慧, 李跃, 李敬涛, 梁文星

2022, 38(6): 74-80. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1123

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在对植物进行分子生物学研究时需要提取植物基因组DNA并对其进行PCR克隆,目前实验室常用CTAB法提取植物DNA,但其步骤相对繁琐,需要用有机溶剂反复抽提,在样本较多时,耗时较长。NaOH可以提取多种物种DNA,本研究优化了实验室条件下更加快速、经济、安全、高效的提取植物DNA的方式,主要包括以下步骤：利用液氮快速粉碎植物样品;采用碱裂解（0.5 mol/L NaOH）的方式一步提取DNA;提取的DNA利用TE缓冲液进行中和;以中和的粗提DNA作为模板进行PCR反应。本研究利用简单的DNA提取流程并结合PCR检测方式,完成了番茄转化子的快速初步鉴定。同时还证明了该NaOH法可用于番茄不同组织的DNA提取。本研究中整个操作过程步骤简单,耗时短,可在短时间内完成大量植物样品的DNA提取,无需使用氯仿、异丙醇等有毒物质,完成提取时间约为CTAB提取法的1/5,而且提取的不同组织DNA完整性较好,质量可观,满足常规的PCR检测,可用于基因克隆及转化子筛选鉴定,具有一定的利用价值和应用前景。

分析方法对细菌群落16S rRNA基因扩增测序分析结果的影响

钟辉, 刘亚军, 王滨花, 和梦洁, 吴兰

2022, 38(6): 81-92. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1102

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细菌16S rRNA基因扩增测序是当前环境微生物组学研究中应用最为广泛的方法之一。然而,测序序列最小分类单元的划分有多种方式,其对微生物多样性下游分析结果的影响还有待进一步探究。本研究通过提取5组环境样本（森林、农田、湿地土壤、湖泊沉积物和水体）的DNA进行16S rRNA基因扩增测序,对测序结果同时采用5种最小分类单元的划分方式（基于97%、98%、99%和100%序列相似性聚类的OTU以及基于DADA2算法得到的ASV）进行划分,比较分析最小分类单元划分方法对微生物群落多样性、组成、以及其与环境因子关联性分析造成的影响。结果表明,提高分类分辨率,能够获得更高的群落α多样性（Chao1和Shannon）和β多样性（P < 0.05）,而相对于按序列相似性聚类的OTU,ASV方法会在一定程度上降低Chao1和PD指数。对于群落组成,分类单元的划分方式主要影响微生物组一些低丰度属（< 0.2%）的占比,而对较高的分类学水平（门水平）组成的影响较小。此外,冗余分析的结果表明,提高分类分辨率水平,能够使得环境因子对微生物群落能够获得更高的解释度,同时也会影响各环境因子对群落组成的解释度排序。总之,本研究明晰了最小分类单元的不同划分方式会对微生物组多样性、组成以及与环境因子的关联性造成的影响,为后续环境微生物组学研究提供了理论指导。

途径工程改造谷氨酸棒杆菌产莽草酸

聂立斌, 易铃欣, 邓妍, 盛琦, 吴晓玉, 张斌

2022, 38(6): 93-102. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1058

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莽草酸是一种芳香族中间代谢产物,也是合成抗禽流感药物磷酸奥司他韦的前体。目前,国内外莽草酸的生产主要依靠成本较高,周期较长的植物提取法。微生物发酵法合成莽草酸具有生产成本低、周期短等优势成为研究的热点。为了构建产莽草酸的重组谷氨酸棒杆菌,此次研究从基因组水平上对谷氨酸棒杆菌体内的莽草酸代谢途径进行代谢工程改造。通过阻断莽草酸分解代谢途径、解除反馈抑制以及阻断竞争性代谢途径的策略,实现了莽草酸产量的大幅提升。结果显示,所构建的重组谷氨酸棒杆菌SKA06经72 h摇瓶发酵,莽草酸产量达到7.61 g/L,相较出发菌种提升了68倍。并且,基于染色体工程的遗传改造策略克服了引入质粒带来传代不稳定、需要添加抗生素等问题,可以为莽草酸工程菌种的选育提供重要参考。

大麦NRAMP全基因组鉴定及重金属胁迫下基因表达分析

李一涵, 于浪柳, 李春燕, 张蒙蒙, 张晓勤, 方云霞, 薛大伟

2022, 38(6): 103-111. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1006

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自然抗性相关巨噬细胞蛋白（natural resistance associated macrophage protein,NRAMP）是植物中一类重要的膜转运蛋白,在转运和重新利用重金属离子中起着重要作用。研究Mn²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺三种重金属离子与NRAMP家族基因表达调控之间的作用机制,为进一步明确NRAMP家族基因对大麦抗重金属胁迫的作用提供依据。利用生物信息学的方法从大麦（Hordeum vulgare L.）全基因组中筛选鉴定NRAMP家族基因序列,对该家族成员进行基因结构、保守基序、进化特征及表达谱分析,并利用qRT-PCR的方法检测不同重金属离子胁迫下大麦幼苗中NRAMP基因的表达情况。结果表明,从大麦基因组中共鉴定出10个NRAMP家族成员,且主要定位在细胞膜上;进化分析表明,亲缘关系近的家族成员保守基序、基因结构都更为相似,且大麦与水稻的NRAMP家族成员间亲缘关系更接近;定量检测结果显示,在Mn²⁺胁迫下,HvNramp1、HvNramp2表达水平显著上调;在Cd²⁺胁迫下,除HvNramp8表达量显著下调外,其余基因均上调;在Cu²⁺胁迫下,除HvNramp3外其余6个基因的表达量均显著上调。大麦NRAMP家族基因能够通过正向调控响应重金属离子的胁迫。

黄瓜AHP基因家族的鉴定及其非生物胁迫表达分析

周国彦, 银珊珊, 高佳鑫, 武春成, 闫立英, 谢洋

2022, 38(6): 112-119. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1338

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组氨酸磷酸转运蛋白（AHP）是细胞分裂素信号转导途径中重要蛋白之一,在植物生长发育和抵御系列非生物胁迫过程中发挥着重要作用。探讨黄瓜AHP的分子特征与表达模式,可为进一步探究黄瓜AHP基因功能和提高植物的非生物胁迫耐受性提供理论依据。通过对黄瓜AHP基因家族成员的数量、进化关系、顺式作用元件、基因结构、发育及非生物胁迫下基因表达模式进行分析。结果表明,黄瓜AHP基因家族有7个成员,不均匀分布在6条染色体上;系统进化分析发现黄瓜AHP基因家族成员与冬瓜和甜瓜亲缘关系较近;其启动子序列主要含有光响应、低温响应、干旱响应、激素响应和防御应激等顺式作用元件;基因表达谱分析发现CsAHP1、CsAHP3和CsAHP4在非生物胁迫下显著上调或下调,且CsAHP1在开花当天表达量最高;实时荧光定量PCR（qRT-PCR）结果显示,CsAHP1和CsAHP3均在干旱、高温胁迫下显著上调表达,CsAHP1、CsAHP2和CsAHP5在低温弱光胁迫下显著上调表达。黄瓜AHP基因家族可能与植物发育和非生物胁迫响应有着密切的关系。

氧化石墨烯对拟南芥生长的促进作用

高聪, 萧楚健, 鲁帅, 王苏蓉, 袁卉华, 曹云英

2022, 38(6): 120-128. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1188

摘要 ( 451 )

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明确氧化石墨烯（graphene oxide,GO）对拟南芥生长的促进作用,为纳米材料应用于农业生产提供理论依据。采用不同浓度GO的1/2 MS培养基点拟南芥种子,测定其主根长、侧根数、根系活力、超氧阴离子自由基的产生、超氧化物歧化酶活性、根系生长相关基因的表达情况。经20-200 μg/mL GO处理后,拟南芥主根长度比对照（不加GO）提高了4.6%-43.0%,在50-200 μg/mL内,与对照相比,差异达显著水平。50 μg/mL处理显著促进了侧根形成,侧根数比对照增加了约27.1%,高于或低于50 μg/mL则不利于侧根的形成。表明50 μg/mL GO对拟南芥的主根长和侧根数均存在促进作用,同时还发现该浓度可以增加拟南芥根尖的分生区和伸长区的长度,而对根尖直径和根冠长度无影响。氯化三苯基四氮唑（TTC）和四硝基氮蓝四唑（NBT）组织染色法结果表明50 μg/mL GO浓度处理提高了根系活力和超氧化物歧化酶活性及降低了超氧阴离子的产生。基因表达分析显示ADC1和DAR2表达量下调和IQM3表达量上调,从而促进了主根的伸长;ARF7、ARF19、ERFII-1和IQM3表达量上调,从而促进了侧根数量的增加。50 μg/mL GO处理可促进拟南芥根系的生长。根系活力的增加、超氧阴离子的减少及根相关基因的表达上调是GO促进根系生长的主要原因。

GRAS转录因子AtSCL4负调控拟南芥应答渗透胁迫

徐红云, 张明意

2022, 38(6): 129-135. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0963

摘要 ( 461 )

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探讨拟南芥GRAS转录因子AtSCL4（Arabidopsis thaliana SCL4）在渗透胁迫中发挥的生物学功能,为GRAS蛋白在非生物胁迫中的功能研究奠定基础。以野生型和AtSCL4突变体拟南芥为试验材料,通过生理指标测定和qRT-PCR方法研究渗透胁迫下AtSCL4调控植物抗逆的生物学机制。研究发现AtSCL4受渗透胁迫诱导后显著上调表达,且AtSCL4突变体的抗渗能力强于野生型。在渗透胁迫下,AtSCL4可以负调节ATMYB6的表达,减小气孔开放度,降低叶片水分流失;AtSCL4通过负调控P5SC1和BADH的转录来提高植物体内脯氨酸和甜菜碱的含量;AtSCL4通过负调节AtSOD1和PER4的表达来增加抗氧化酶活性而降低活性氧含量。AtSCL4可负向调控抗逆基因表达和生理变化应答渗透胁迫。

枯草芽孢杆菌K-268的分离鉴定及对水稻稻瘟病的防病效果

祖雪, 周瑚, 朱华珺, 任佐华, 刘二明

2022, 38(6): 136-146. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1124

摘要 ( 799 )

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生防细菌是绿色防控稻瘟病的有效措施。为了发掘高效拮抗稻瘟病菌的生防细菌,本研究采用平板对峙法从感病品种K020268的健康稻株叶片中筛选获得1株对稻瘟病菌抑制效果较好的拮抗细菌K-268,同时测定该菌的抑菌谱。通过形态学观察、生理生化鉴定16S rRNA 和gyrA序列分析对其进行菌种鉴定,并初步研究了该菌株的生物学特性和对稻叶瘟的防治效果。结果表明,菌株K-268对稻瘟病菌菌丝生长抑制率为86.30% ± 0.70%,同时对水稻纹枯病菌、玉米大斑病菌及柑橘沙皮病菌等供试的14株植物病原菌均有抑制作用;经鉴定菌株K-268为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,该菌株对数生长期为14-32 h,生长最适温度为30℃,生长最适pH值为6.0-7.0,并且其具有良好的耐盐性。离体接种实验结果表明,稀释10倍即菌液浓度6×10⁸CFU/mL时,预防组和治疗组的叶瘟发病率分别为14.81%和23.46%,效果与稀释750倍的75%三环唑稀释液（WP）效果相当。活体喷雾接种结果表明,在接种稻瘟病菌分生孢子悬浮液（1×10⁶个/mL）前 24 h 喷施稀释10 倍（6×10⁸CFU/mL）的发酵液和接种稻瘟病菌分生孢子悬浮液后 24 h 喷施稀释10倍的发酵液对稻叶瘟的防效分别为59.00%和60.23%,效果接近500稀释液的40%稻瘟灵（EC）。因此K-268在水稻稻瘟病生物防治中具有一定的开发和应用价值。

向日葵HaLACS1的克隆、表达及酵母功能互补鉴定

杨佳宝, 周至铭, 张展, 冯丽, 孙黎

2022, 38(6): 147-156. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1174

摘要 ( 429 )

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探究长链酰基辅酶A合成酶（long chain acyl-CoA synthetase,LACS）基因在向日葵（Helianthus annuus L.）油脂积累和逆境响应中的功能,为其在向日葵油脂合成和抗逆中的应用奠定基础。通过RT-PCR克隆得到向日葵HaLACS1的CDS序列,运用生物信息学方法分析HaLACS1的特点。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测HaLACS1的组织表达特性及对NaCl、PEG和ABA的响应情况。通过构建GFP和HaLACS1的融合表达载体,转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析。将HaLACS1转入酿酒酵母突变型菌株YB525中进行功能互补试验,并进行底物偏好性分析。结果显示,HaLACS1开放阅读框1 980 bp,编码659个氨基酸。蛋白进化树分析表明,HaLACS1与拟南芥AtLACS1和莴苣（Lactuca sativa）LsLACS1具有较高的相似性。拟南芥原生质体瞬时表达分析显示HaLACS1定位于内质网。实时荧光定量PCR结果显示,HaLACS1在所有组织中均有表达,但在种子发育的早期表达量较高,花次之。NaCl、PEG和ABA处理均能诱导HaLACS1在向日葵根、茎和叶中的表达。酵母功能互补试验证明HaLACS1蛋白具有LACS酶活性。底物偏好性分析表明HaLACS1偏好棕榈酸（C16：0）和油酸（C18：1）。表明HaLACS1与向日葵种子发育过程中的油脂积累和非生物胁迫响应相关。

油用牡丹根际解有机磷细菌的筛选及解磷功能研究

沈佳佳, 侯小改, 王二强, 王菲, 郭丽丽

2022, 38(6): 157-165. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0942

摘要 ( 397 )

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油用牡丹作为市场上新兴的木本油料作物,土壤有效磷缺乏严重制约油用牡丹生长发育以及产量和品质的提升。分离筛选油用牡丹高效解磷细菌,充分发挥其根际微生物的作用,是实现油用牡丹高产优质目标、保障农业绿色发展的有效途径。以不同生长年限油用牡丹‘凤丹’根际土壤为研究对象,选用以植酸钙为磷源的培养基,利用平板稀释法分离筛选具有解有机磷能力的细菌,并利用16S rDNA测序技术对菌株进行鉴定,结合溶磷圈法和钼锑抗比色法分析其解磷能力。从一、三、四年生油用牡丹根际土壤中共筛选出14株解有机磷菌株。其中隶属于芽孢杆菌属和假单胞菌属的各有5株,隶属于节杆菌属的有3株,还有1株隶属于新鞘氨醇杆菌属;14株解有机磷菌株溶磷指数和溶磷效率分别在1.6-9.0以及60%-800%之间,其中一年生油用牡丹根际筛选到的菌株FD1-15的溶磷指数和溶磷效率均最高;培养液中速效磷含量为2.88-5.30 mg/L,活化率在26.44%-62.13%之间,解磷能力和活化能力最强的是从三年生油用牡丹根际筛选获得的菌株FD3-13,隶属于芽孢杆菌属。这为提高油用牡丹的产油量和食用品质提供理论和技术支撑,同时也为微生物菌肥的研发和应用提供一定的参考。

宿根矮化病抗感甘蔗品种茎部内生真菌和细菌群落特征分析

高小宁, 刘睿, 吴自林, 吴嘉云

2022, 38(6): 166-173. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1197

摘要 ( 441 )

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通过分析宿根矮化病抗感甘蔗品种蔗茎内生真菌和细菌的群落特征,旨在了解内生真菌和细菌类群在寄主抗病中的作用,从而为构建生态防控宿根矮化病提供理论依据。利用Illumina MiSeq高通量测序技术,比较了宿根矮化病感病品种YT60和抗病品种HoCP95988蔗茎内生真菌及细菌的多样性指数、类群组成和物种差异。感病品种YT60蔗茎内生真菌和细菌的Alpha多样性指数高于抗病品种HoCP95988,具有更多的物种组成。蔗茎内生细菌主要分布在变形菌门（Proteobacteria）,子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）为内生真菌的优势菌门。抗感病甘蔗品种蔗茎内生真菌和细菌种群组成差异明显,其中内生细菌在浮霉菌门（Planctomycetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）和软壁菌门（Tenericutes）中包含的34个属的物种丰度存在显著差异,并且差异物种在感病品种YT60中呈现较高相对丰度。宿根矮化病抗感甘蔗品种茎部内生真菌和细菌多样性均较为丰富,种群组成存在较大差异,差异物种的分类信息为宿根矮化病生防微生物资源的挖掘提供了线索。

海甘蓝（Crambe abyssinica）叶绿体基因组特征及其系统发育研究

钱方, 高作敏, 胡利娟, 王洪程

2022, 38(6): 174-186. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1078

摘要 ( 597 )

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海甘蓝（Crambe abyssinica）为十字花科（Brassicaceae）海甘蓝属（Crambe）植物,其种子富含芥酸,被视为一种重要的可再生工业油用资源。本研究基于Illumina HiSeq 测序数据从头组装了（de novo）海甘蓝的叶绿体（chloroplast,cp）基因组,并分析其在十字花科植物中的系统发育位置。结果表明,海甘蓝叶绿体基因组大小为153 754 bp,呈典型的四分体结构;其包含111个基因,包括78个编码基因、29个tRNA基因以及4个rRNA基因。通过密码子偏好性分析,海甘蓝叶绿体基因组中末端为A/U的密码子使用存在偏倚。SSR及长重复片段分析检测到41个重复序列和59个SSR位点。与近缘种比较,发现其叶绿体基因组序列高度保守,尤其蛋白质编码序列相似度极高。同义与非同义核苷酸替代率分析表明,除ndhB和ycf2基因外,其余编码基因普遍存在纯化选择压力。此外,系统发育分析发现海甘蓝与芸薹属重要的经济作物亲缘关系密切,与白芥属植物形成姊妹类群。这为海甘蓝与芸薹属植物的种间杂交提供了遗传支撑,同时也为阐明海甘蓝的进化史提供了重要的分子信息。

马尾松MAPK级联途径应答信号物质基因的表达分析

陈虎, 杨章旗, 孙爽, 李鹏, 徐慧兰

2022, 38(6): 187-197. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1089

摘要 ( 325 )

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MAPK（mitogen-actived protein kinase）在响应和调控生物与非生物胁迫、激素调节等方面发挥重要作用。马尾松MAPK级联途径7个基因被鉴定,并进行分子特性和外源信号物质处理表达模式分析。结果表明,马尾松与火炬松、北美云杉等针叶裸子植物的关系较近,不同类型基因具有该类基因特有的MAPK结构域以及典型催化氨基酸基序,D（I/L/V）K是马尾松MAPK基因共有的活性基序,PmMAP4K与MAPK级联途径的3个成员未直接互作,MAPK级联途径基因可能通过磷酸化调控各种激素生物合成来响应非生物胁迫。7个基因均响应了MeJA、GA、SA、ABA、Ca²⁺处理,但模式不同。PmMAP4K基因对Ca²⁺处理响应明显,其次是PmMAP2K基因,其它基因对单独Ca²⁺处理响应不明显,4种激素和Ca²⁺共同处理均提高了基因表达量,MeJA+Ca²⁺处理MAPK基因表达量高于单独MeJA处理,而GA、SA、ABA单独处理基因的表达量高于其与Ca²⁺一起处理。以上结果为马尾松MAPK基因与信号物质途径互作应答非生物胁迫提供参考。

镉胁迫下梭鱼草叶片转录组测序及苯丙烷代谢途径相关基因挖掘

辛建攀, 李燕, 赵楚, 田如男

2022, 38(6): 198-210. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1151

摘要 ( 570 )

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为揭示苯丙烷代谢途径参与梭鱼草防御重金属胁迫的作用机制,分析镉（Cd）胁迫下梭鱼草叶片转录组序列,将其与NR、NT、PFAM、KOG、Swiss Prot、KEGG和GO公共数据库进行比对注释,并对差异表达基因进行趋势化分析,同时从中挖掘与苯丙烷代谢途径相关的差异表达基因。结果表明：（1）共获得221 392个unigenes,其中170 175个unigenes被注释到数据库,6 506个unigenes被注释到31条次生代谢通路;（2）将梭鱼草叶片unigenes与Swiss-Prot和Nr数据库进行比对,共得到168 355条CDS序列,Estscan软件预测得到84 673条序列;（3）对检测到的20 025个差异表达基因进行趋势分析,发现有3个显著的基因表达模式,包括2个下调表达模式（Cluster 0：2 631个基因,Cluster 1：3 153个基因）和1个上调表达模式（Cluster 5：3 733个基因）;（4）进一步挖掘转录组数据发现,在6_0 h和48_0 h组中,梭鱼草叶片中共有26个差异表达的基因被鉴定出来,分别编码3个苯丙烷代谢公共途径关键酶,5个木质素生物合成关键酶和7个黄酮类化合物生物合成关键酶。梭鱼草通过调控愈创木基木质素的生物合成和上调肉桂酸-4-羟化酶（C4H）、花青素合成酶（ANS）、花青素-3-O-葡糖基转移酶（3GT）、咖啡酰辅酶A-O甲基转移酶（CCoAOMT）、黄酮醇3-甲基转移酶（F3OMT）基因表达参与叶片Cd积累与解毒。通过转录组测序初步揭示了苯丙烷代谢途径参与梭鱼草叶片防御Cd胁迫的相关基因,为今后深入研究苯丙烷代谢途径在梭鱼草抵抗重金属胁迫中的功能及相关机制提供了理论基础。

二斑叶螨取食抗、感螨木薯品种对茉莉酸信号途径基因表达的影响

韩志玲, 陈青, 梁晓, 伍春玲, 刘迎, 伍牧锋, 徐雪莲

2022, 38(6): 211-220. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0993

摘要 ( 367 )

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明确二斑叶螨取食影响木薯茉莉酸信号途径基因表达的害螨密度和取食时间效应,为阐明茉莉酸信号途径在木薯抗虫性中的重要作用及抗螨种质资源鉴定评价提供理论依据及参考指标。以抗螨木薯品种C1115和感螨木薯品种面包为材料,分析与植物防御相关的茉莉酸号信号途径基因（DAD1、LOX2、OPR3和JAR1）在二斑叶螨以不同虫口密度（15、25、35、45、50和55头螨/叶）取食不同时间（1、2、4和8 d）后的表达量变化情况。结果表明,以45-50头螨/叶的害螨密度分别取食抗、感螨木薯品种2 d后,LOX2、OPR3和JAR1的表达量均较螨害前显著提高,并且上述3个基因在抗螨木薯品种中的表达量显著高于感螨木薯品种,而DAD1的表达量随害螨密度的提高和取食时间的增加波动较大。在较高的害螨密度和较短的为害时间处理时,茉莉酸信号途径基因LOX2、OPR3和JAR1在抗螨木薯品种中的表达量显著高于感螨木薯品种,LOX2、OPR3和JAR1可能与木薯对二斑叶螨的抗性有关。

土壤类型对花生根际土壤细菌群落多样性和产量的影响

徐扬, 张冠初, 丁红, 秦斐斐, 张智猛, 戴良香

2022, 38(6): 221-234. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0912

摘要 ( 470 )

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为了解不同土壤类型花生根际土壤细菌菌群多样性差异与产量的关系,明确不同土壤类型花生生产特性的区域优势,以6个花生主产区代表性土壤为研究对象,采用盆栽实验利用高通量测序技术研究不同土类花生根际土与非根际土细菌群落结构和变化特征。对6个土壤样品细菌菌群丰富度和多样性分析显示,湖南邵阳红壤细菌丰富度和多样性均较低,河北滦县褐土细菌丰富度和多样性均较高。放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）及芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）等为共有优势菌门,但在不同土壤类型样本中的菌群丰度存在明显差异,其中湖南邵阳红壤中绿弯菌门优势最明显,其他土壤类型放线菌门和变形菌门优势较明显。根际土与非根际土细菌门丰度间有差异,湖南邵阳红壤根际土与非根际土各细菌门（包括放线菌门、变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门以及厚壁菌门）丰度变化程度较其它地区大。冗余分析表明,土壤酸碱度（pH）、有机质（ORM）、碱解氮（N）,速效磷（P）和速效钾（K）等土壤理化因子对细菌菌群组成和物种丰度均有影响,但影响程度和正负相关性因土壤类型而异,河南焦作潮褐土细菌菌群与所有土壤理化因子均为锐角,呈显著正相关;而湖南邵阳红壤细菌菌群与所有因子间均为钝角,呈显著负相关。统计学分析显示,吉林公主岭黑土、新疆石河子棕钙土和山东沂南褐土荚果产量较高,湖南邵阳红壤荚果产量较低。优势菌门变形菌门在吉林公主岭黑土、新疆石河子棕钙土和山东沂南褐土中相对丰度高于湖南邵阳红壤,属水平鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）相对丰度在山东沂南褐土和吉林公主岭黑土也较高,推测变形菌门和鞘氨醇单胞菌属在花生生长发育和荚果产量提高方面是有利的。不同土壤类型花生根际细菌组成虽有一定的相似性,但差异性明显,个别菌群丰度呈现出特有性,其中变形菌门和鞘氨醇单胞菌属可能分别是与花生荚果产量提高相关的有益菌门和菌属。湖南邵阳红壤花生荚果产量最低,其花生生产的土壤禀赋优势较低。

超广谱β-内酰胺酶CTX-M-14中药抑制剂的筛选及芸香苷抑酶作用研究

赵子玉, 王春光, 吕建存, 李继开, 张铁

2022, 38(6): 235-244. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1105

摘要 ( 297 )

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β-内酰胺酶的产生是细菌产生耐药的常见机制,其主要代表为超广谱β-内酰胺酶,其中CTX-M-14在全世界呈现流行趋势,为寻找一种CTX-M-14抑制剂,使细菌恢复对β-内酰胺类抗生素的敏感性,本试验首先构建了CTX-M-14的原核表达载体,并以CTX-M-14为靶点借助虚拟筛选工具Autodock Vina进行筛选,得到结合作用较好的中药单体抑制剂芸香苷,通过DS Visualizer分析其相关作用力;通过联合抑菌试验验证芸香苷与抗生素的联合抑菌作用;通过酶动力学试验比较抑酶剂芸香苷与克拉维酸的抑酶作用与方式。结果表明,芸香苷与超广谱β-内酰胺酶CTX-M-14结合部位形成多个氢键和范德华力,其结合作用力为9.9 kcal/mol;芸香苷与头孢噻肟钠对大肠杆菌E320呈协同作用（FICI=0.236）;0.312 5 mg/mL的芸香苷与头孢噻肟钠对CTX-M-14蛋白阳性重组菌呈协同作用（FICI≤0.375）;1.25 mg/mL的芸香苷与头孢噻肟钠对导入空质粒pET-28a（+）的BL-21呈无关作用（FICI=1.5）;抑酶剂芸香苷与克拉维酸均为竞争性抑制剂,但克拉维酸抑酶作用优于芸香苷。本试验证明,芸香苷可以竞争性抑制CTX-M-14活性,具有β-内酰胺酶抑制剂潜质。

N端截短CBM41对枯草芽孢杆菌来源普鲁兰酶酶学性质的影响

付巧, 林啟兰, 薛强, 熊海容, 王亚伟

2022, 38(6): 245-251. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0927

摘要 ( 326 )

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采用N端截短方式对Bacillus subtilis 168来源普鲁兰酶进行蛋白结构改造,构建不同形式的截短突变体,考察N端结构对酶学特性的影响。利用基因工程的手段分别删去CBM41结构域N端前2、4和6个氨基酸,获得突变体M1（ΔN2）、M2（ΔN4）和M3（ΔN6）。3种突变体最适反应温度（40-45℃）和最适pH（6.0）均与WT一致,WT、M1、M2和M3的T_m值分别为48.57℃、50.03℃、48.43℃和49.50℃,M1、M2和M3的比活力均高于野生型,是WT的1.18、1.60和2.44倍,WT、M1、M2和M3的K_m值分别为23.89、29.01、17.29和19.08 mg/mL。上述结果表明,通过截短普鲁兰酶N端氨基酸可获得性质得到改良的突变体,为提高该酶的热稳定性、比活力和底物结合能力提供新的方法和思路。

端梗霉Z45产漆酶培养基的优化及其对染料的脱色

贾晨波, 苏一黄, 马秀梅, 王春利, 徐春燕

2022, 38(6): 252-260. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1221

摘要 ( 343 )

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菌株Acrophialophora sp. Z45是一株产漆酶的端梗霉属真菌,本文依据不同培养基中菌株Z45对愈创木酚的氧化圈大小探究了影响该菌株产漆酶的因素并设计正交试验优化其产漆酶培养基,进而比较了菌株Z45在土豆葡萄糖培养基和优化后的产漆酶培养基中的漆酶活力差异,最后基于漆酶与染料脱色的相关性评价了菌株Z45对8种合成染料的脱色能力。结果表明,单因素及正交试验确定了菌株Z45优化后的产漆酶培养基为：基础产酶培养基中以蔗糖为碳源、硝酸钠为氮源、C/N比为45∶1、pH为5.0;在优化后的产漆酶培养基中菌株Z45的漆酶活性显著提高;菌株Z45对溴酚蓝、中性红、亚甲基蓝、甲基蓝和结晶紫等5种染料均有一定的脱色能力,其中对三苯甲烷染料甲基蓝的脱色能力最强,菌株Z45的粗酶液能使甲基蓝快速脱色。在较低甲基蓝浓度的固体培养基上,甲基蓝完全脱色的时间不受染料浓度的影响;而较高甲基蓝浓度下,甲基蓝完全脱色的时间随染料浓度升高逐渐延长。

温度对真眼点藻生长、总脂及二十碳五烯酸（EPA）合成的影响

许瑾, 李涛, 李楚琳, 朱顺妮, 王忠铭, 向文洲

2022, 38(6): 261-271. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1293

摘要 ( 404 )

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真眼点藻可以积累二十碳五烯酸（EPA）而受到广泛关注,温度是影响多不饱和脂肪酸合成的重要因素。本研究以真眼点藻（Eustigmatos sp. JHsu-01）为材料,设置高温组（30℃）和低温组（15℃）两种培养条件,通过测定生长、脂类积累、脂肪酸组成和甘油酯合成关键基因表达量的变化,探究温度对EPA合成规律的影响。结果表明,低温培养促进了真眼点藻JHsu-01膜脂和EPA的合成,EPA含量最高达到2.78% DW,糖脂是EPA的主要载体,但温度可以改变EPA在糖脂和中性脂之间的分配比例。转录组结果显示,低温条件下,脂肪酸从头合成、三酰甘油（GPAT、plsC、PLPP和DGAT）、糖脂（MGD和DGD）、硫脂（SQD1和SQD2）和ω-3合成途径（Δ5 Des、Δ6 Des和Δ15 Des）中多个关键酶基因表达上调。综上所述,低温可以促进真眼点藻EPA的合成,同时也是一种获得高含量糖脂型EPA的理想培养方式,研究结果为提高真眼点藻EPA产量提供理论和技术依据。

利用CRISPR/Cas9技术建立OXTR基因敲除猪胎儿成纤维细胞系

刘静静, 刘晓蕊, 李琳, 王盈, 杨海元, 戴一凡

2022, 38(6): 272-278. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1432

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利用CRISPR/Cas9系统建立催产素受体（oxytocin receptor,OXTR）基因敲除的巴马猪胎儿成纤维细胞系（porcine fetal fibroblasts,PFFs）,为构建OXTR基因敲除巴马猪模型提供供体细胞。首先,对人和猪的OXTR基因进行了生物学信息分析。其次,利用在线设计工具设计了2个靶向猪OXTR外显子区的sgRNA,并克隆至pX330骨架质粒中,最后将打靶质粒和Neomycin抗性质粒共转染至PFFs中,用G418药物筛选出抗性单克隆细胞,测序鉴定其基因型。生物信息学分析显示人和猪OXTR基因进化距离较近,氨基酸序列一致性达到91%,相似性为93%,三维结构的RMSD值为0.009。成功构建OXTR基因的Cas9/sgRNA打靶载体,转染PFFs细胞后,药物筛选获得OXTR基因敲除的单克隆细胞并测序证实了基因突变型。人和猪OXTR基因具有高度同源性;构建的Cas9/sgRNA表达载体高效实现了OXTR基因编辑,成功获得基因敲除的单细胞克隆,为后续构建OXTR敲除的巴马猪模型奠定了前期基础。

牦牛TGF-β1基因克隆及在雌性生殖系统主要器官中的表达定位

王楠, 张瑞, 潘阳阳, 何翃宏, 王靖雷, 崔燕, 余四九

2022, 38(6): 279-290. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1152

摘要 ( 586 )

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转化生长因子β1（transforming growth factor beta1,TGF-β1）是一种多功能的生长与分化因子,广泛调控机体的多个生理病理过程,具有重要的生物学功能和广阔的应用前景。试验采集牦牛发情期和妊娠期卵巢、输卵管和子宫组织,克隆牦牛TGF-β1基因,利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）、蛋白质免疫印迹（Western blot,WB）等方法,对牦牛TGF-β1在基因和蛋白水平上进行定量分析。结果显示,牦牛TGF-β1基因（GenBank No.MZ004937）高度保守,牦牛TGF-β1核苷酸序列与普通牛（Bos taurus）序列相比,存在差异,所编码氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸。与普通牛（Bos taurus）、瘤牛×普通牛（Bos indicus×Bos taurus）亲缘关系最近,与犬（Canine）亲缘关系最远,其编码的蛋白为稳定的亲水性膜蛋白。牦牛TGF-β1在卵泡期、黄体期、妊娠期的卵巢、输卵管和子宫组织中均有表达,在卵巢中,妊娠期的表达量显著高于卵泡期和黄体期（P<0.05）;在输卵管中,TGF-β1基因妊娠期表达量极显著高于卵泡期和黄体期（P<0.01）;在子宫中,卵泡期和妊娠期表达显著高于黄体期（P<0.05）。IHC结果显示,牦牛TGF-β1主要在卵巢生殖上皮、卵泡膜、卵泡颗粒层、黄体细胞、输卵管黏膜上皮细胞、子宫腺（UG）和子宫内膜细胞中表达。研究结果为进一步探索TGF-β1参与牦牛生殖生理的分子机制提供基础数据,以期为探讨高原哺乳动物对高寒环境的适应性提供理论依据。

慢病毒介导Occludin过表达影响BVDV感染BALB/c小鼠的研究

王万顺, 付强, 魏玉荣, 胡新艳, 陈俊贞, 李泽宇, 史慧君

2022, 38(6): 291-298. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1156

摘要 ( 486 )

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为研究紧密连接蛋白（occludin,OCLN）是否影响牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）在BALB/c小鼠体内的复制。构建慢病毒表达载体pLVML-Myc-bOCLN-linker-GFP-IRES-Puro,连同辅助质粒pSPAX2和pMD2.G共同转染至HEK-293T细胞中,转染48 h后收集OCLN-GFP慢病毒悬液并测定其滴度,同时以pLVML-Myc-Mcs-linker-GFP-IRES-Puro载体包装的慢病毒作为阴性对照（GFP）;将4-5周龄BALB/c小鼠随机分为A（0 d）、B（4 d）、C（8 d）、D（10 d）、E（15 d）五组,每组6只,分别注射5×10⁷ IU OCLN-GFP和GFP慢病毒悬液,连续注射两次,间隔48 h,第二次注射后96 h时以1.68×10⁵ TCID₅₀/只BVDV攻毒BALB/c小鼠,分别于攻毒后0、4、8、10、15 d时,解剖小鼠并采集肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠等组织,使用实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR）和Western blot检测OCLN过表达情况,qRT-PCR检测不同组织中BVDV病毒载量;制作组织病理切片观察各组织病变情况。成功包装OCLN-GFP和GFP慢病毒;慢病毒感染BALB/c小鼠96 h后,OCLN-GFP慢病毒感染后OCLN mRNA和蛋白表达水平显著增加;与GFP慢病毒感染的对照组相比,OCLN-GFP慢病毒感染实验组各组织脏器中BVDV病毒载量从攻毒4 d后出现显著性增加;同时与对照组相比,BVDV攻毒后4 d,实验组小鼠肺脏及肝脏器官最早出现明显病变;BVDV攻毒8 d后,肝脏、脾脏、肺脏等器官病变程度较对照组更加严重。研究表明OCLN过表达能显著性增加BVDV在BALB/c小鼠体内的复制,BVDV感染造成的病理变化更为严重,为阐明OCLN介导BVDV复制等分子机制提供重要依据。

2022, 38(6): 299-299.

摘要 ( 129 )

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