生物技术通报

水稻品质的遗传与育种改良研究进展

李然, 钱前, 高振宇

2022, 38(4): 4-19. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1598

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随着人民生活水平的提高,在追求水稻高产的同时,优质已成为育种家的育种目标和消费者的关注重点。水稻品质包含碾磨品质、外观品质、蒸煮食味品质和营养品质四类指标,本文从水稻品质的遗传与改良两方面展开论述,回顾了水稻品质的遗传与育种改良研究进展,介绍了已克隆的稻米品质相关基因或QTL的功能及其在稻米品质改良中的应用。最后,在此基础上分析了现阶段水稻品质的遗传与改良存在的问题并对未来研究方向作了展望。

高直链淀粉禾谷类作物种质创新与利用研究进展

徐妙云, 邢利娟, 杨明雨, 张凌萱, 王磊, 刘悦萍

2022, 38(4): 20-28. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1399

摘要 ( 456 )

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当前,营养过剩和营养不均衡导致的慢性病和糖尿病人数逐年增长,开发适合慢性病人的食物,开展功能型农业生物的品种设计和选育工作,越来越受到重视。高抗性淀粉水稻和小麦被认为是对慢性病很有效的功能型食品,而高直链淀粉玉米则用途更为广泛。综合近年来对禾谷类作物淀粉合成调控网络及关键基因的研究发现,籽粒中淀粉分支酶的表达对直链淀粉的积累、抗性淀粉的形成和脂肪酸、氨基酸等营养成分,以及甾体等代谢物的改变均具有重要作用。本文对参与禾谷类作物胚乳中淀粉合成代谢的酶类、提高直链淀粉含量的方法、高抗性淀粉水稻、小麦和高直链淀粉玉米种质的创新及利用等方面进行综述,并对今后的研究方向进行展望。

水稻锌吸收、转运、累积机理研究进展

薛欣月, 于雪然, 刘晓刚, 马嘉欣, 田蕾, 李培富

2022, 38(4): 29-43. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1484

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锌是水稻正常生长发育所必需的微量营养元素之一,是生长素、叶绿素合成等多种酶促反应的辅助因子。水稻缺锌时,植株矮小,叶片生长受到抑制且失绿变白,抽穗晚而少,严重影响产量;锌过量又容易对水稻产生毒害作用。因此研究水稻锌元素吸收、转运和累积机制,通过现代分子生物技术对水稻籽粒锌富集进行生物强化具有重要意义。基于近年来国内外研究报道,简要概述了锌在水稻体内的生理功能,水稻不同营养器官对锌的吸收途径以及影响锌元素吸收积累的因素,并对近年来水稻中鉴定出的锌转运蛋白及其家族成员的种类、结构以及功能进行了归纳总结,旨为进一步了解水稻体内的锌转运系统及其调控提供参考。

马铃薯块茎形成的生理生化基础和分子机制

雷春霞, 李灿辉, 陈永坤, 龚明

2022, 38(4): 44-57. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0065

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马铃薯（Solanum tuberosum L.）块茎诱导和形成是其生长发育和产量决定最重要的事件,涉及多重环境因素与植物激素及信号分子的互作以及这种互作对大量关键基因及多条信号转导与代谢途径的调控。概述了马铃薯块茎形成的生理生化基础,包括块茎形成的过程及影响块茎形成的内源因素和环境条件;讨论了块茎诱导形成过程中信号转导途径及相关基因、蛋白、miRNAs、激素和第二信使分子等对块茎形成的调节;构建了块茎诱导形成过程中可能的分子互作网络;展望了未来研究的方向和可能的突破点,旨在为将来通过精准分子育种手段来培育高产优质的马铃薯品种提供借鉴和新思路。

KASP标记技术在主要农作物中的应用及展望

杨青青, 唐家琪, 张昌泉, 高继平, 刘巧泉

2022, 38(4): 58-71. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1378

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随着基因测序技术的发展,植物基因组数据越来越丰富,其中的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）数据由于具有高密度、高通量和易于自动化分析等特点而被广泛用于分子标记的开发和应用。竞争性等位基因特异性PCR（kompetitive allele-specific PCR,KASP）技术是近些年来发展起来的一种主要基于SNP的高通量基因分型技术。该技术由于其高通量、低成本和可操作性强等优点而在农作物性状改良等领域具有很大的应用潜力。本文介绍了KASP技术的发展、原理和方法步骤,综述了该技术在主要农作物的种质资源鉴定、分子标记辅助育种、基因定位和种子纯度鉴定等遗传育种中的应用,并讨论了该技术的优缺点,以期为今后农作物育种研究提供参考依据。

甘蔗单糖转运蛋白基因ShSTP7序列分析及组织表达特征测定

赵婷婷, 王俊刚, 王文治, 冯翠莲, 冯小艳, 张树珍

2022, 38(4): 72-78. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1537

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糖转运蛋白基因在调控甘蔗产量形成、糖分积累过程中发挥重要作用,对其功能研究有助于揭示甘蔗糖分积累机制及其在甘蔗品种遗传改良上的应用。利用RT-PCR、Real-time PCR、原生质体亚细胞定位等技术,分离甘蔗中单糖转运蛋白基因ShSTP7,并对其编码蛋白生物学特性、亚细胞定位情况及ShSTP7基因表达模式进行分析。结果表明从甘蔗叶中克隆出1 619 bp ShSTP7 cDNA序列,其中包含1 557 bp完整阅读框,编码518个氨基酸;ShSTP7编码蛋白ShSTP7属于易化扩散超家族单糖转运蛋白家族成员,含有12个跨膜结构域及STP糖转运保守结构域,与割手密、高粱、玉米STP7高度同源;ShSTP7-GFP融合蛋白定位于细胞膜;ShSTP7主要在甘蔗叶片中表达,茎秆中表达量低,在高糖甘蔗茎尖未成熟1-3茎节中的表达量高于低糖甘蔗,在高糖甘蔗叶和第4-24茎节中的表达低于低糖甘蔗。这些研究结果表明甘蔗中ShSTP7是一种细胞膜单糖转运蛋白,可能负责质外体中单糖的吸收,在甘蔗叶片糖分运输过程中发挥重要作用,研究结果将为解析甘蔗中单糖转运蛋白基因功能及应用奠定基础。

玉米甲硫氨酸合酶基因METS的克隆及表达特性

任莹, 连通, 张春义, 姜凌

2022, 38(4): 79-85. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1226

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在植物中,5-甲基四氢叶酸和同型半胱氨酸在甲硫氨酸合酶（methionine synthase,METS）的作用下生成甲硫氨酸,甲硫氨酸合酶是连接甲基代谢和一碳代谢的枢纽,克隆玉米甲硫氨酸合酶基因METS并分析其表达特性可为解析玉米籽粒的甲硫氨酸和叶酸的积累机制奠定基础。通过逆转录聚合酶链反应克隆得到玉米METS的编码序列,通过生物信息学方法分析其蛋白的特点,同时运用实时荧光定量技术分析了基因的组织表达特性及在萌发过程中的表达模式。结果发现玉米包含3个编码甲硫氨酸合酶的同源基因ZmMETS1、ZmMETS2、ZmMETS3,基因长度分别为2 301、2 298和2 298 bp,编码蛋白的氨基酸数量分别为766、765和765个,蛋白质分子质量约为84.5 kD,3个蛋白均含有N端和C端2个结构域,每个结构域由α螺旋环绕平行的β片层构成立体结构。系统发育树分析3个蛋白与高粱SbMETS的相似程度最高。表达分析发现它们在玉米各组织中均表达,各组织中转录水平最高的是ZmMETS1;相对来说雌穗中3个基因的转录水平较其他组织高;另外,在萌发过程中,ZmMETS1和ZmMETS3的转录水平随着萌发的时间迅速增加,之后迅速下降。玉米中存在3个具有组成型表达特征的玉米甲硫氨酸合酶基因,ZmMETS1可能在雌穗发育和萌发过程中起主要作用。

大白菜KCS基因家族鉴定及在蜡粉近等基因系中表达分析

王荣花, 王树彬, 张志刚, 赵智中, 李巧云, 王立华, 刘栓桃

2022, 38(4): 86-96. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0185

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β-酮脂酰辅酶A合成酶（β-ketoacyl-CoA synthase,KCS）是超长链脂肪酸合成中的限速酶,通过对大白菜KCS基因家族鉴定分析,为揭示KCS在控制大白菜蜡质性状中的具体功能研究奠定了基础。利用生物信息学的分析方法鉴定大白菜KCS基因家族成员,分析其亲缘关系、蛋白质理化性质、染色体定位、共线性关系、基因结构、蛋白保守域结构和基因表达模式。从大白菜全基因组共鉴定到32个BrKCS基因成员分成4个亚组,不均匀地分布在10条染色体上。BrKCS氨基酸长度和分子量的范围分别为181-755 aa和20.54-84.83 kD。共线性分析表明BrKCS5、BrKCS8和BrKCS13等7个家族成员与拟南芥共线性的BrKCS基因发生两倍化,1个家族成员（BrKCS9）发生了三倍化。基因结构分析显示,不同成员编码的氨基酸序列外显子数目及位置存在差异。转录组分析表明,BrKCS5、BrKCS6b与BrKCS10b基因在大白菜不同器官/组织尤其在花器官中可能参与蜡粉的合成。qRT-PCR分析结果验证了转录组数据的可靠性。综上所述,从大白菜全基因组共鉴定到32个BrKCS,其中3个基因在蜡粉近等基因系中表达量高且差异显著,为解析BrKCS基因在控制大白菜蜡质性状中的分子机制奠定了基础。

利用基因编辑技术研究BRANCHED1参与油菜分枝过程的调控

Olalekan Amoo, 胡利民, 翟云孤, 范楚川, 周永明

2022, 38(4): 97-105. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1344

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植物的株型决定于其分枝方式,而改良分枝方式是提高作物产量的有效方式之一。目前关于油菜分枝调控的分子机理研究较少,缺乏用于株型改良的种质资源。本研究以油菜BRANCHED1（BRC1）为目的基因,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向突变油菜BRC1基因,通过农杆菌介导的遗传转化获得再生苗,PCR技术筛选出转基因阳性单株,再利用Hi-TOM方法进行靶点突变基因型的测序分析,证实基因编辑产生的定点突变可稳定遗传。最后对获得的突变体进行表型观察发现,BRC1的BnaC01g34090D和BnaA01g26700D的双拷贝纯合突变体表现出明显的多分枝表型,研究结果表明BnaBRC1参与油菜中的分枝和株型调控,为后续研究油菜的株型调控分子机理提供了重要研究材料。

甘蓝型油菜BnNF-YA1的克隆和功能鉴定

林科运, 段钰晶, 王高升, 孙念礼, 方玉洁, 王幼平

2022, 38(4): 106-116. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0959

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NF-YA是组成NF-Y转录因子的3个亚基之一,在植物中参与生长发育、胁迫响应以及与微生物互作等重要生物过程。通过克隆BnNF-YA1,并对BnNF-YA1进行生物信息学分析和表达模式分析,分离克隆其编码序列,构建过表达载体,转化甘蓝型油菜,通过阳性鉴定获得BnNF-YA1的转基因阳性植株,并对过表达BnNF-YA1的转基因植株进行了逆境表型鉴定。结果表明,BnNF-YA1的开放读码框为858 bp,编码285个氨基酸;烟草瞬时表达分析发现BnNF-YA1蛋白定位于细胞核内;酵母生化分析表明BnNF-YA1全长蛋白没有转录激活活性;表达分析结果显示,BnNF-YA1受PEG处理诱导表达,且在幼叶、花苞和受精后20 d的角果中表达水平较高;过表达BnNF-YA1的甘蓝型油菜对PEG和MV处理的耐受性提高,表明BnNF-YA1可能参与调控甘蓝型油菜对渗透胁迫和氧化胁迫的响应。

二倍体马铃薯中SCF^SLF复合体的组分分析

高蒙, 李富婷, 魏湛林, 张赛行, 白如仟, 尚轶, 马玲

2022, 38(4): 117-125. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0904

摘要 ( 391 )

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自交不亲和（self-incompatibility,SI）广泛存在于开花植物中,是防止近交促进杂交的一种途径,可有效维持物种的基因型多样性。车前科、茄科、蔷薇科等植物中的自交不亲和类型属于典型的配子体型自交不亲和（gametophytic self-incompatibility,GSI）。在GSI植物的杂交过程中,花粉管中的SCF^SLF复合体（Skp1/Cullin1/F-box）作为E3泛素连接酶,参与了花粉对异我型S-核糖核酸酶（S-RNase）的降解过程,是维持杂交亲和的关键因子。本研究通过整理GSI植物SCF^SLF复合体的研究进展,借助同源比对、进化树及蛋白序列分析等生物信息学分析手段,对二倍体马铃薯中SCF^SLF复合体的各个组分进行了初步分析,并对各组分基因的表达量和蛋白互作情况进行分析,最终确定了马铃薯花粉管中的SCF^SLF复合体可能是由Soltu.DM.06G001040,Soltu.DM.11G004330,Soltu.DM.06G022320以及相应的SLF蛋白组成的。

利用RNA-Seq鉴定调控甘蓝型油菜叶片光合特性的低温胁迫应答基因

金姣姣, 刘自刚, 米文博, 徐明霞, 邹娅, 徐春梅, 赵彩霞

2022, 38(4): 126-142. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1048

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明晰甘蓝型油菜光合特性对低温胁迫的响应,鉴定相关应答基因,以耐寒材料17NS和敏感材料NF24为研究对象,通过Illumina HiSeq^TM 2000平台进行RNA-Seq分析,探讨-4℃处理24 h后甘蓝型油菜的叶片形态、光合参数、叶片超微结构、基因调控表达模式等响应低温胁迫的分子机制。结果表明,低温胁迫下甘蓝型油菜响应光合调控的显著富集途径为光合作用途径和光合作用-天线蛋白途径,这两种途径中有64个特异表达基因,其中8个上调表达,56个下调表达,大部分注释到分子组成和生物学过程中,证实了光合作用与低温胁迫导致的幼苗叶片萎蔫、叶绿体数量和形态发生变化、类囊体结构受损、相对电解质渗透率增加等现象有关。通过qRT-PCR鉴定,前17个DEGs的表达模式与RNA-Seq分析结果一致,证实了RNA-Seq结果的可靠性,其中BnFd1（LOC106350097）和BnCP26（LOC106440450）均响应低温胁迫上调表达。BnFd1编码氨基酸产物是叶绿体上的铁氧还蛋白1（BnFd1）,属于不稳定亲水蛋白,定位于叶绿体和细胞质中,存在一个信号肽,属于PLNO3136超家族,存在保守的Fd1结构域;BnCP26编码氨基酸产物是类囊体上叶绿素a-b结合蛋白CP26（BnCP26）,属于稳定亲水蛋白,位于叶绿体中,无信号肽,属于叶绿素a_b结合超家族,存在保守的叶绿素A-B结合蛋白结构域。成功鉴定出2个甘蓝型油菜叶片低温应答基因BnFd1和BnCP26,与光合特性调控关系密切,物种间功能保守。

镉胁迫下锌硒交互作用对水稻镉毒害的缓解机制

呼艳姣, 陈美凤, 强瑀, 李海燕, 刘静, 秦樊鑫

2022, 38(4): 143-152. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1127

摘要 ( 479 )

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研究镉、锌、硒及不同组合复合添加对水稻种子萌发、植株生长发育和不同部位镉含量的影响,揭示锌、硒、锌硒交互作用对水稻镉毒害的缓解机制。以水稻品种南粳9108为研究对象,采用萌发试验和水培试验,测定其萌发、生长、生理指标及不同部位镉含量。结果表明：不同镉浓度水平胁迫下,种子萌发表现为低促高抑,添加锌后可以缓解镉对种子生理指标的抑制作用,减少镉含量的积累,添加硒则不能缓解种子生理指标的抑制作用,且高硒会加重毒害使种子生理指标值降低,锌硒联用可以促进种子萌发,但不能促进幼根幼芽生长;在5 mg/L镉胁迫下,添加不同浓度硒、锌均能显著增加水稻幼苗的根长、株高、叶片相对含水量、SPAD值,缓解镉对水稻生长发育的毒害,显著降低水稻根系镉含量;但锌硒联用会使水稻株高、SPAD值显著降低,而对水稻根长、叶片相对含水量的影响不显著。可见,镉胁迫下添加适宜浓度的锌、硒可以有效降低镉在水稻中的积累,缓解镉对水稻生长发育的毒害作用。

Burkholderia sp. GD17对水稻幼苗镉耐受的调节

祖国蔷, 胡哲, 王琪, 李光哲, 郝林

2022, 38(4): 153-162. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0915

摘要 ( 377 )

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探究根内生菌Burkholderia sp. GD17在水稻对镉（cadmium,Cd）胁迫应答中的调节作用,为减少Cd的积累、提高植株的Cd耐受性奠定基础。以接种GD17和未接菌的幼苗为材料,在添加Cd条件下,分析其生理生化代谢和相关基因表达。接菌5 d后,根中GD17菌的数量达到3.6×10⁶ CFU/g根鲜重,且在植株生长过程中内生菌数量维持在这一级别。Cd暴露（20和40 mg/kg土壤）20 d后,接种GD17植株的干（鲜）重显著高于未接菌植株。接种GD17和未接菌植株根中的Cd含量无显著差异,但前者地上部的Cd含量是后者的43%。Cd胁迫下,接种GD17根和叶片的丙二醛含量分别是未接菌植株的78%和64%。与未接菌植株相比,接种GD17叶片的超氧化物歧化酶活性降低,但过氧化物酶和过氧化氢酶活性均升高。接种GD17有效阻止了光合作用的损伤,如减缓Cd引发的总叶绿素含量、净光合速率和气孔导度的下降,以及胞间CO₂浓度的升高。叶绿素荧光成像进一步反映了GD17对光合作用的保护性影响。与未接菌植株相比,接种GD17植株根中所有分析的与Cd耐受相关基因的表达水平均显著升高。根部接种GD17可系统性地减轻Cd对水稻幼苗的伤害,其可能的机理包括：降低Cd的根-茎运输、减轻Cd引发的氧化伤害和对光合作用的损伤;上调Cd耐受相关基因在根中的表达。基于此,GD17菌株在低Cd水稻生产中具有潜在的应用价值。

番茄4CL基因家族鉴定和氮素处理下的表达分析

马馨馨, 许洋, 赵欢欢, 火兆燕, 王树彬, 钟凤林

2022, 38(4): 163-173. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1272

摘要 ( 553 )

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探究番茄4CL基因家族的基本理化性质、分子进化特性和其在不同浓度氮素下的表达模式。对番茄4CL基因家族成员进行全基因组鉴定,采用生物信息学方法对其进行分析,并在不同浓度氮素处理下进行qPCR验证。在番茄中共鉴定出6个4CL基因家族成员,全部成员均为稳定蛋白,有5个成员呈酸性,编码的氨基酸数在538-957之间,二级结构以无规则卷曲为主,三级结构除Sl4CL04以5bsw.1.A为模型,其他成员均以5bsr.1.A为模型。番茄4CL基因家族内含子数量在5-11之间,12个Motif在Sl4CL中排序及位置都非常保守,具有较高的同源性。启动子顺式作用元件分析发现MYB作用元件的分布最多,在不同浓度氮素处理下,6个基因表达量均有显著差异。对Sl4CL03构建过表达载体,亚细胞定位结果显示位于过氧化物酶体、叶绿体和细胞质。番茄4CL家族进化具有保守性和特异性,能够在氮素处理时进行相关机理调节。

大豆耐盐种质的筛选及其耐盐生理特性分析

石广成, 杨万明, 杜维俊, 王敏

2022, 38(4): 174-183. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0843

摘要 ( 546 )

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盐害是一种主要的非生物胁迫,严重影响大豆的产量和品质,筛选大豆耐盐种质对耐盐性研究具有重要意义。本研究以332份栽培大豆品种为研究对象,以苗期NaCl致死浓度为评价指标,初步评价其耐盐性。从中选择3份不同耐盐等级的材料为供试材料,公认的耐盐材料Lee68和盐敏材料Jackson为对照材料,用150 mmol/L NaCl溶液处理后,测定表型性状、生理指标及光合指标等,分析不同耐盐种质与这些指标间的关系,进一步探究耐盐生理特性。结果表明：（1）供试种质耐盐性差异较大,筛选出6份敏盐品种和18份耐盐品种。（2）形态性状分析表明不同耐盐等级的品种在盐胁迫下植株干重、株高和根长均下降,其中汾豆105和Lee68的相对干重、相对株高和相对根长较高,晋大70次之,陕西八月黄和Jackson的相对干重、相对株高和相对根长较低。（3）不同组织离子含量分析表明汾豆105、Lee68的根和茎中Na⁺、Cl^-积累较多,叶片中较少,而陕西八月黄和Jackson与其相反。（4）叶片光合特性分析表明盐胁迫下陕西八月黄和Jackson的SPAD均下降,晋大70、Lee68和汾豆105上升;净光合速率均降低,其中汾豆105和Lee68的降幅小,陕西八月黄和Jackson的降幅较大。综合形态和生理指标分析发现5个品种在盐胁迫下的耐盐能力：汾豆105和Lee68>晋大70>陕西八月黄和Jackson,与初筛结果一致,表明致死浓度可作为苗期耐盐性鉴定简便、可靠的指标,同时这些材料为大豆耐盐育种提供了基础材料。

油莎豆乙酰乳酸合酶基因CeALS的克隆与分析

肖艳华, 邹智, 赵永国, 郭安平, 张丽

2022, 38(4): 184-192. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1198

摘要 ( 362 )

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乙酰乳酸合酶（ALS）在植物的除草剂抗性中发挥重要作用。为揭示油莎豆ALS编码基因的序列特征、进化关系及表达特性,研究基于转录组数据,应用RT-PCR技术对其进行了克隆。序列分析显示,CeALS预测编码645个氨基酸,理论分子量为69.94 kD、等电点为6.10,属于叶绿体定位的亲水性蛋白。保守结构域和同源分析显示蛋白含有TPP_enzyme_N、TPP_enzyme_M和TPP_enzyme_C三个完整的乙酰乳酸合酶功能域,与其他莎草科植物中同源蛋白的一致性都在90%以上。进化分析显示,莎草科与禾本科属禾本目的姊妹科。qRT-PCR分析显示,CeALS主要在叶片和块茎中表达;在叶片发育过程中呈现逐步递增的趋势,其在成熟和衰老叶片中的表达水平显著高于幼嫩叶片。序列比对和SNP分析显示,团队收集的56份油莎豆种质均不存在抗药性变异。这些结果为除草剂抗性分子育种及油莎豆的开发与利用奠定了坚实的基础。

棉花抗枯萎病相关基因GhERF5-4D的克隆及功能分析

赵曾强, 郭文婷, 张析, 李潇玲, 张薇

2022, 38(4): 193-201. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1065

摘要 ( 363 )

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研究陆地棉ERF（ethylene-responsive factor）转录因子基因GhERF5-4D在棉花抗枯萎病中的作用,为棉花抗病分子机制及棉花抗病育种研究奠定基础。以枯萎病菌诱导棉花根部基因表达谱中的差异表达基因为探针,结合棉花全基因组数据库获得1个ERF转录因子基因GhERF5-4D,并进一步利用实时荧光定量（qRT-PCR）技术和病毒诱导基因沉默（virus induced gene silencing,VIGS）技术研究枯萎病菌胁迫和激素处理后基因GhERF5-4D的表达特征及其在棉花抗病过程中的作用。结果表明,GhERF5-4D（GenBank：MF093148）位于陆地棉D07染色体上,开放阅读框（open reading frame,ORF）为663 bp,编码220个氨基酸,仅含1个AP2结构域且无内含子,属于ERF亚族。该基因的表达特征在棉花抗感枯萎病品种及不同激素胁迫处理中存在显著差异,其在抗病品种中为上调表达,在感病品种中为下调表达;乙烯、茉莉酸甲酯处理后,该基因上调表达,而水杨酸处理后则下调表达。GhERF5-4D基因沉默后并进行枯萎病菌接种实验,结果表明,与对照相比,沉默株系更感病。对下游抗病相关防卫基因表达特征进行分析,发现PR2、PR4、PR5、NPR1、ERF1相对表达量均低于对照,而WRKY70相对表达量高于对照。GhERF5-4D能够响应枯萎病菌胁迫,并通过参与乙烯、茉莉酸途径调控下游相关抗病防卫基因提高棉花对枯萎病抗性。

马尾松NAC转录因子基因PmNAC8的克隆及表达分析

镐青青, 姚圣, 刘佳禾, 陈佩珍, 张梦洋, 季孔庶

2022, 38(4): 202-216. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0830

摘要 ( 437 )

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NAC（NAM,ATAF1/2,CUC2）家族基因参与调控植物生长发育、响应非生物胁迫及激素信号转导。研究马尾松中NAC转录因子在非生物胁迫中的应答,为阐明基因功能提供理论依据。以马尾松（Pinus massoniana）为试验材料,通过RT-PCR及RACE技术克隆一个NAC家族基因,并对其进行生物信息学分析。运用qRT-PCR检测其组织表达特性及对逆境胁迫的响应情况;以基因组DNA为模板,运用染色体步移（genome walking）技术克隆该基因上游启动子序列;通过农杆菌注射本氏烟草（Nicotiana benthamiana）,观察其亚细胞定位。该基因全长1 726 bp,开放阅读框为1 209 bp,编码402个氨基酸,将其命名为PmNAC8,GenBank登录号为MZ291447;亚细胞定位结果显示,该基因定位于细胞核;其密码子使用偏性较弱,偏好使用A/T结尾的密码子,且烟草与酵母更适合作为PmNAC8的异源表达受体;qRT-PCR显示PmNAC8在根部表达量最高,且受机械损伤及植物激素GA、ABA的诱导;克隆获得PmNAC8上游1 492 bp的启动子区域,含有多个胁迫诱导元件、赤霉素调控元件和光响应元件。PmNAC8参与多种逆境胁迫,可能在赤霉素信号途径中发挥重要作用。

玉米秸秆高效降解微生物复合菌系的构建及降解效果评价

王新光, 田磊, 王恩泽, 钟成, 田春杰

2022, 38(4): 217-229. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0968

摘要 ( 513 )

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针对玉米秸秆降解困难、利用率低的问题,本文筛选构建了由枯草芽孢杆菌WF-8（Bacillus subtilis WF-8）、地衣芽孢杆菌WF-11（B. lincheniformis WF-11）、蜡状芽孢杆菌WS-1（B. cereus WS-1）和黑胡桃链霉菌WF-10（Streptomyces nogalater WF-10）组成的高效降解复合菌系HD并进行秸秆降解效果评价,为高效降解玉米秸秆复合菌剂的研制和开发提供理论依据。本研究通过单因素试验结合正交试验和响应面试验,对复合菌系HD产酶培养基及发酵条件进行优化,液态和固态发酵试验评价复合菌系HD对玉米秸秆的降解效果。结果表明,复合菌系HD最佳碳氮源为秸秆粉和（NH₄）₂SO₄,最适添加量分别为15 g/L和4 g/L;复合菌系HD最优发酵条件为：温度34℃、接种量5%、时间6 d和pH7.2。优化后的复合菌系纤维素酶活为164.21 U/mL,是优化前的1.90倍,高于单菌酶活。将构建的复合菌系HD分别接种到液体发酵培养基和固体发酵培养基后,玉米秸秆降解率均显著高于单菌及对照组,降解率分别达到了47%和63.6%。研究结果表明复合菌系HD在降解玉米秸秆方面具有较大潜力,为高效降解玉米秸秆复合菌剂的研制和开发奠定了基础。

长枝木霉菌肥对玉米生长、土壤肥力和根际微生物的影响

祝静, 于存

2022, 38(4): 230-241. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0704

摘要 ( 498 )

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为探讨长枝木霉菌肥在玉米栽培上的应用效果及其作用机制。采用盆栽法,设置3个处理：（1）每克土加入0.01 g菌肥（YJ）,（2）0.07%化肥（YF）,（3）每克土加入0.01 g菌肥基质（YD）。测定不同处理下玉米生长、生理、土壤养分、土壤酶活及根际微生物群落等指标。结果表明,YJ和YF处理对玉米生长具有显著的促进作用,二者与YD处理相比均差异显著（P<0.05）,而YJ与YF处理相比,对玉米生长指标影响的差异不显著（P>0.05）;其中,与YD处理相比,YJ和YF处理对玉米苗高、根长、地上干重、地下干重、地上鲜重和地下鲜重分别提高了44.65%和39.87%、75.74%和71.25%、83.33%和33.33%、300%和150.00%、101.85%和55.56%、356.67%和130.00%;与YD处理相比,YJ和YF处理均可提高玉米的生理指标,其中YJ处理对玉米生理指标的促进作用更明显（P<0.05）;YJ和YF处理均可提升玉米根际土壤养分和土壤酶活性,且YJ处理比YF处理的提升幅度更大;对玉米根际微生物群落的影响结果显示,YJ处理可以增加玉米根际土真菌OTU数量,减少根际土细菌OTU数量（P<0.05）;YF处理会增加根际土细菌OTU数量,但会减少真菌OTU数量。综上,长枝木霉菌肥与化肥相比对玉米生长、生理、土壤养分、土壤酶活和土壤微生物群落的积极作用更为明显,有望在未来全部或部分的代替化肥,在促进玉米生长的同时,减少无机化肥的用量。

地黄不同时期内生促生细菌的筛选及其促生特性分析

王春艳, 腊贵晓, 苏秀红, 李萌, 董诚明

2022, 38(4): 242-252. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0964

摘要 ( 383 )

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从地黄中开发优势菌种资源并分析促生特性,为开发地黄微生物专用促生菌肥提供基础。采用稀释平板法,以地黄不同时期根、茎、叶为材料分离内生细菌,根据形态学、生理生化、16S rRNA分析进行分类归属。选出54株内生细菌对产IAA、铁载体活性,溶磷以及固氮能力进行了评价,结果显示在不同时期共分离出512株内生细菌,将其归类为54组,每组选出1株进行检测,其中41株具有产IAA的能力;29株具有溶磷能力;28株具有产铁载体能力;25株具有固氮能力。该结果为研究地黄专用微生物促生菌肥提供参考,并为后续微生物促生菌肥应用到地黄大田实验中奠定基础。

解淀粉芽胞杆菌不同整合位点对外源碱性蛋白酶表达的影响

牛馨, 张莹, 王茂军, 刘文龙, 路福平, 李玉

2022, 38(4): 253-260. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0755

摘要 ( 301 )

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为探究基因组上不同整合位点对外源碱性蛋白酶表达的影响,基于解淀粉芽胞杆菌TCCC 111018基因组信息,通过预测基因组上复制起始位点OriC确定了yaah基因整合位点;与此同时,通过分析6个胞外蛋白酶基因（epr、vpr、mpr、apr、bpr和nprE）单独缺失后对外源碱性蛋白酶酶活力的影响,并对发酵上清液中主要分泌蛋白的分析和质谱鉴定,确定了nprE和amyE基因位置为另外两个整合位点。在确定的3个整合位点处分别整合克劳氏芽胞杆菌来源的碱性蛋白酶基因aprE,并对整合菌株的碱性蛋白酶酶活力进行对比分析,结果表明整合菌株解淀粉芽胞杆菌18-ΔY∷aprE 和18-ΔN∷aprE碱性蛋白酶酶活力分别达到784.36 U/mL和1 289.09 U/mL,分别比原始菌株提高了15%和88.9%,实时荧光定量PCR和SDS-PAGE凝胶电泳表明18-ΔN∷aprE的碱性蛋白酶的转录水平和表达量均最高,这表明在nprE基因位点整合碱性蛋白酶基因可以有效提高碱性蛋白酶表达量,为进一步构建工业酶生产菌株奠定了基础。

水生栖热菌漆酶TaLac的性质分析及对孔雀石绿染料的脱除

毛国涛, 王杰, 王凯, 王方园, 曹乐言, 张宏森, 宋安东

2022, 38(4): 261-268. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0852

摘要 ( 359 )

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为挖掘适用于脱除有毒染料孔雀石绿（malachite green,MG）的DUF152家族漆酶,利用生物信息学方法在嗜热菌水生栖热菌中筛选候选酶TaLac,构建重组表达载体pET28a-TaLac,在大肠杆菌中进行过量表达和纯化,测定TaLac的酶学性质,探究TaLac对MG的脱色和脱毒能力。结果表明,TaLac具有DUF152家族保守铜原子结合位点,利用Ni亲和层析纯化得到高纯度的TaLac具有氧化2,6-二甲基苯酚（2,6-dimethylphenol,DMP）等漆酶底物的催化活性。以DMP为底物,该酶的最适pH为5.0,最适温度为60℃,K_m为0.74 mmol/L。此外,TaLac在50℃热处理4 h后,仍保留80%的原始活力;该酶可耐受高浓度的Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺和Ba²⁺等金属离子。TaLac可于3 h内使50 mg/L MG完全脱色,并彻底消除MG对玉米萌发的毒害作用。因此,TaLac是具有活性的DUF152家族漆酶,具有良好的热稳定性,可高效催化MG的脱色与脱毒。

密码子优化的吡喃糖氧化酶基因在毕赤酵母中的表达

王玥, 高庆华, 董聪, 罗同阳, 王庆庆

2022, 38(4): 269-277. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0148

摘要 ( 390 )

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吡喃糖氧化酶（pyranose oxidase,PROD,简称P2O）在木质素降解、碳水化合物的生物转化合成中具有重要作用,还应用于生物燃料电池、生物传感器以及临床诊断分析中。本实验室进行了吡喃糖氧化酶在毕赤酵母中的高效表达及酶学性质研究,为以后吡喃糖氧化酶的工业化高效生产提供理论依据。利用生物技术方法,基于毕赤酵母密码子偏好性优化吡喃糖氧化酶基因密码子。通过基因外源表达技术构建吡喃糖氧化酶重组毕赤酵母GS115菌株以实现吡喃糖氧化酶的高效表达,并对重组吡喃糖氧化酶的酶学性质进行研究。优化高产重组菌株的发酵条件,在10 L发酵罐中进行扩大培养。结果显示,吡喃糖氧化酶密码子优化后,其在毕赤酵母中实现了高效表达。在10 L发酵罐经过132 h诱导表达后,酶活达220 U/mL。酶学性质研究发现：重组吡喃糖氧化酶最适作用温度为55℃,在不超过60℃条件下热稳定性良好。该酶作用的最适pH为6.5,在pH 5-9条件下,其相对酶活高于50%。P2O在较广的pH范围内均表现出较高的稳定性,尤其是对碱性条件有较强的耐性。金属离子Cu²⁺ 对酶活的抑制作用较大。底物特异性检测结果显示,该重组酶的最适底物为D-葡萄糖。该研究成功构建了密码子优化的吡喃糖氧化酶的重组表达质粒pPIC9K-P2O,并在毕赤酵母中实现了高效表达。

高剂量单宁酸对小鼠肠道屏障和肠道菌群的影响

何亚伦, 曾丽荣, 刘雄, 张铃, 王琼

2022, 38(4): 278-287. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0860

摘要 ( 830 )

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以正常饮食小鼠和高脂饮食诱导肥胖模型小鼠为对象,研究高剂量单宁酸对小鼠肠道屏障及肠道菌群的影响。通过H&E染色、RT-qPCR、16S rRNA测序等方法进行检测分析。研究发现高剂量单宁酸（400 mg/kg BW）灌胃可使小鼠的体重和进食量降低,增加小鼠体内各肠段内容物的含量,其中结肠内容物的含量显著增加。并且高剂量单宁酸干预后可造成肠道功能损伤及肠道屏障破坏,如杯状细胞数量和隐窝长度减少,及肠道紧密连接蛋白（ZO-1,Occludin及Claudin）表达降低。此外,口服高剂量单宁酸会导致小鼠结肠肠道菌群的多样性发生变化,并增加了SCFA产生菌Alistipes,Ruminococcus和 Blautia以及肥胖负相关菌群Alistipes和Oscillibacter的含量。结果表明,高剂量单宁酸对肠黏膜屏障的破坏影响了小鼠对食物的消化吸收,这可能是高剂量单宁酸干预后小鼠体重快速下降的主要潜在原因。另一方面,高剂量单宁酸所造成的肠道菌群变化也会对小鼠的体重产生影响。

MFG-E8作为外泌体载体蛋白的作用与功能

黎智康, 刘晨雪璇, 谭楚敏, 熊盛, 谢秋玲

2022, 38(4): 288-294. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0814

摘要 ( 636 )

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构建MFG-E8全长和截短体的重组质粒,分析各截短体蛋白能否将目的蛋白带到外泌体上并确定其位置,以探讨MFG-E8各结构域功能及其作为外泌体上载体蛋白的效率。利用PCR扩增出带有信号肽的MFG-E8及其截短体基因,与EGFP基因连接,构建7种重组质粒。之后PEI介导瞬转HEK293F细胞进行表达,利用EGFP的荧光,通过Western blot和激光共聚焦显微镜检测蛋白表达情况及其在胞内的位置。同时提取转染细胞分泌的外泌体,通过Western blot和电镜检测重组蛋白在外泌体中的情况。最后将含有重组蛋白的外泌体转染293T细胞,荧光显微镜观察外泌体将重组蛋白带入受体细胞中的情况。结果表明,成功构建MFG-E8全长及截短体重组质粒并在HEK293F细胞中表达,各重组蛋白在胞内均有表达,其中EGF-L表达量最高,C2最低,细胞上清中只能检测到EGF-L、C1、EC1的表达。转染细胞分泌的外泌体只检测到MFG-E8、EC1和C1C2三种蛋白。含有这3种蛋白的外泌体转染HEK293T细胞,3组细胞均有荧光,其中MFG-E8-EGFP的外泌体效果最好。MFG-E8能够作为蛋白载体将目的蛋白带到外泌体膜上,其C1、C2结构域对该过程至关重要,EGF-L的存在可以促进蛋白表达。

TRV介导的小报春基因沉默技术体系的建立

付偲僮, 司未佳, 刘颖, 程堂仁, 王佳, 张启翔, 潘会堂

2022, 38(4): 295-302. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0924

摘要 ( 828 )

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小报春是报春花科报春花属的二年生草本花卉,具有较高的观赏价值和园林应用前景,是研究花柱二型的理想材料,建立快速高效的报春花属基因功能验证技术,是小报春基因功能研究中的关键问题。以小报春为材料,以八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因作为标记基因,探索TRV病毒载体在小报春中的最佳侵染对象、侵染液配方、菌液浓度和侵染方式,建立适用于小报春的VIGS体系。结果表明,用含有200 μmol/L乙酰丁香酮（AS）、10 mmol/L MgCl₂和10 mmol/L乙磺酸缓冲液（MES）的浸染液,将含有pTRV1和pTRV2-PfPDS的菌液OD₆₀₀值均调至1.0等体积混合后通过叶背注射方式侵染小报春,以TRV病毒载体上的引物对处理后的植株叶片进行PCR,在出现表型变化的植株和空载组中均检测到TRV1和TRV2的病毒载体,白化植株的PfPDS表达量显著低于空载组和对照组。建立的VIGS体系侵染效率达60%,沉默表型可持续12个月之久,并能在小报春植株的各部位（从叶片到萼片）均起到沉默作用。建立了小报春基因沉默体系,由于沉默效果持续时间长,所有基因都可以利用这一方法进行功能验证。

基于GBS-seq的青藏扁蓿豆SNP标记开发

周晓楠, 徐金青, 雷雨晴, 王海庆

2022, 38(4): 303-310. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0906

摘要 ( 355 )

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开发青藏扁蓿豆（Medicago archiducis-nicolai）单核苷酸多态性标记（single nucleotide polymorphism,SNP）,并开展遗传多样性初步分析,为青藏扁蓿豆种质资源的评价与利用提供理论支持。以5个青藏扁蓿豆群体共80份材料进行GBS（genotyping-by-sequencing）测序,采用GATK软件开发SNP标记,并以此进行遗传结构和遗传多样性的初步分析。测序产生的序列数据量为60.79 Gb,过滤后共获得12 796个SNP位点,且SNP突变类型存在明显的转换型偏差现象。不同地理来源青藏扁蓿豆群体观测杂合度（H_O）为0.187 68-0.304 36,期望杂合度（H_E）为0.201 97-0.364 34,遗传多样性指数（Pi）为0.178 32-0.241 34;祁连（QLCD）群体具有相对最高的遗传多样性水平。遗传结构分析表明5个群体分为2组,且群体遗传距离与地理距离之间存在极显著的正相关性。SNP标记适用于青藏扁蓿豆遗传多样性分析。

2022, 38(4): 311-311.

摘要 ( 98 )

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