生物技术通报

植物PRR免疫受体功能研究进展

叶红, 王玉昆

2023, 39(12): 1-15. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0765

摘要 ( 360 )

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植物在长期的适应环境过程中进化出大量细胞表面和细胞内免疫受体来感知环境中的各种生物和非生物刺激，进而引发受体依赖的免疫反应。细胞表面模式识别受体（PRR）能够识别病原微生物模式分子并激活基础免疫，从而使植物获得相应的耐受性。目前，借助于高效的研究手段，研究者在PRR介导的植物抗病及环境胁迫耐受方面取得了一些进展。本文主要综述近年来在植物PRR种类和结构、配体识别和结合机制、PRR介导的先天性免疫特征和机理以及新PRR受体的鉴定等方面取得的研究进展，同时关注近年来植物PRR受体在赋予植物对盐胁迫抗性等方面的研究成果，以期为深入理解植物与环境互作的免疫基础，并为利用基因工程培育优良抗病和抗逆植物品种提供理论基础和指导。

质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白SOS1在植物离子稳态平衡中的作用

朱业胜, 伍国强, 魏明

2023, 39(12): 16-32. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0793

摘要 ( 1155 )

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植物通过一系列复杂转运系统调节离子稳态以适应盐渍环境，SOS（salt overly sensitive）信号通路是植物响应非生物胁迫的主要信号途径，主要由质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白SOS1、丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶SOS2和钙感应器SOS3组成。SOS1作为SOS信号通路的主要成员之一，广泛存在于高等植物中，由于早期的进化差异，可能导致不同物种SOS1的结构和理化性质存在一定的特异性。SOS1蛋白为一个同型二聚体，每个单体由跨膜和胞内结构域组成，这为整合来自不同途径的信号和调节Na⁺转运提供了稳定的对接平台。SOS1基因转录水平受到不同胁迫条件的调控，通过Ca²⁺信号调控、磷酸化、自抑制和与离子转运体协同调控等机制可抑制或激活SOS1活性。该蛋白具有调控植物昼夜节律和pH以及维持离子稳态等功能，在植物逆境胁迫响应中发挥重要作用。论文对SOS1的结构、功能、调控机制及其维持植物离子稳态平衡作用等方面的研究进展加以综述，并对其未来研究方向进行展望，以期为农作物抗逆性遗传改良提供理论支持和优异基因资源。

植物光系统 II（PSII）应答非生物胁迫机理研究进展

程爽, ULAANDUU Namuun, 李卓琳, 胡海玲, 邓晓霞, 李月明, 王竞红, 蔺吉祥

2023, 39(12): 33-42. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0658

摘要 ( 728 )

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植物生长过程受到一系列以环境因子（温度、干旱、盐和重金属等）为代表的非生物胁迫影响，进而阻碍以物质转化与能量代谢等为主要特征的光合进程。光系统 II（PSII）是位于类囊体膜上的多亚基色素-蛋白质复合物，通过捕获光能完成水的光解和质体醌的还原，对植物生长发育尤为重要。一般来说，非生物胁迫会抑制PSII的活性、影响PSII的结构、阻碍电子传递和能量转换，而PSII作为光合作用中最易受影响的部分，近年来与环境因子之间的关系备受关注。基于此，本文对主要非生物胁迫如温度、干旱、盐，以及重金属下植物PSII的生理应答研究进行了归纳，并基于叶绿素荧光技术从PSII的结构与功能、电子传递过程、光抑制与光保护等方面进行了综述。并对现有研究的不足提出了展望，为今后深入研究非生物胁迫下植物PSII响应逆境胁迫过程中的生理与分子机制提供理论基础。

非天然氨基酸的应用及生物合成策略

李海宁, 张红兵, 耿革霞, 李冉, 贾振华

2023, 39(12): 43-55. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0648

摘要 ( 1734 )

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非天然氨基酸是一类不受遗传密码子约束的特殊氨基酸，它们具有独特的空间构型和化学性质，为多个领域提供了新的资源和机会。当前，非天然氨基酸可以通过化学合成和生物合成两种方式合成，其中相较于化学合成，生物合成具有更高的效率和立体选择性、更低的成本和污染，是一种有潜力的合成方式。本文综述了非天然氨基酸在蛋白质探针、酶工程、抗体药物偶联物、抗菌肽等方面的研究进展和应用案例，展示了非天然氨基酸如何突破天然氨基酸的限制，拓展蛋白质的结构和功能多样性。同时介绍了非天然氨基酸的生物合成策略，包括代谢工程中的静态调控和动态调控策略以及发酵优化策略。最后，展望了非天然氨基酸的生物合成和应用的未来发展趋势和挑战，为非天然氨基酸的合成和开发提供参考和启示。

S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖的3-氨基-3-羧基丙基利用酶研究进展

何家乐, 董敏

2023, 39(12): 56-70. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0220

摘要 ( 206 )

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S-腺苷-L-甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine，SAM）是生物体内重要的辅因子。SAM的结构中具有3个不稳定的C-S键，不同的SAM依赖酶能够选择性地切割其中不同的C-S键来催化各种类型的反应。其中，利用SAM甲基部分的甲基转移酶和腺苷部分的SAM自由基酶被广泛研究。UniProt数据库中保存了超过1 800 000条SAM依赖的甲基转移酶序列；SAM自由基酶也已经成为最大的酶家族之一，数目超过700 000个。但利用SAM中3-氨基-3羧基丙基（3-amino-3-carboxypropyl，ACP）的酶却报道相对较少，本文对目前这一类酶的研究进行分类介绍，并对这一领域未来研究方向进行展望。

黑曲霉葡萄糖吸收定量检测的方法建立及其在MstC功能研究中的应用

高凯月, 郭雨婷, 杜奕谋, 郑小梅, 马欣荣, 赵伟, 郑平, 孙际宾

2023, 39(12): 71-80. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0759

摘要 ( 182 )

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黑曲霉是有机酸与酶制剂重要的工业生产菌株，具有强大的水解酶系与葡萄糖转运系统，可快速响应胞外碳源变化，摄取环境中葡萄糖供给细胞生长和产物合成。作为重要的碳源底物与关键的信号分子，葡萄糖的摄取吸收直接影响黑曲霉细胞生长与发酵性能。针对目前丝状真菌缺乏简便葡萄糖吸收能力定量表征方法的问题，本文以2-（N-（7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-氨基）-2-脱氧葡萄糖（2-NBDG）作为葡萄糖吸收探针，通过将预培养的黑曲霉孢子与2-NBDG孵育后，利用荧光显微成像与流式细胞分析，建立了丝状真菌的葡萄糖吸收的定量检测方法。结果发现，2-NBDG 的最佳使用浓度为150 μmol/L，最佳孵育时间为4 h。进一步利用该定量分析方法，发现低亲和力葡萄糖转运蛋白MstC的过表达使黑曲霉葡萄糖吸收提高1.44倍，同时在前期研究的基础上，利用多序列比对分析，设计了MstC的突变体R188K，通过检测发现该点突变可直接导致MstC葡萄糖转运活性的丧失，这表明Arg188是影响MstC葡萄糖转运能力的关键氨基酸位点。本文葡萄糖摄取定量检测方法的建立及其在MstC功能研究上的应用，不仅加深了丝状真菌葡萄糖吸收的定量认识，也为葡萄糖转运系统的改造优化提供了技术支撑。

基于抗体-适配体夹心生物传感器检测大肠杆菌O157: H7

侯炜辰, 叶柯, 李洁, 张洋子, 许文涛, 朱龙佼, 李相阳

2023, 39(12): 81-89. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0698

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大肠杆菌O157: H7（Escherichia coli O157：H7）是一种重要的与公共卫生相关的食源性病原体。抗体分子是体液免疫应答中最重要的效应分子，具有多种生物学活性，最主要的生物学功能是与相应抗原特异性结合。适配体是体外合成的较短DNA序列，可通过识别特定区域和靶标特异性结合。利用抗体和适配体的特异性识别功能及免疫磁珠的捕获作用和磁分离，并通过多克隆抗体和裁剪得到的适配体搭建生物传感器，使用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR）可以实现对靶标在（8×10³）-（8×10⁶） CFU/mL范围内的定量检测，检测限为800 CFU/mL。

荧光素酶辅助定量大肠杆菌破碎效果的方法

李奕雅, 吴一凡, 丁能水, 范小萍, 陈凡

2023, 39(12): 90-98. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0129

摘要 ( 218 )

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建立基于萤火虫荧光素酶的大肠杆菌超声破碎辅助定量方法，利用荧光素酶灵敏度高、检测迅速的特点，对靶细胞的破碎效果进行表征。以表达了萤火虫荧光素酶的大肠杆菌作为内标，在破碎前与靶蛋白表达菌按一定比例混合，考察不同破碎条件下荧光素酶和靶蛋白活性向胞外释放的情况，对辅助定量效果进行评价。结果表明，将表达了萤火虫荧光素酶的大肠杆菌按1∶500（体积比）同待破碎菌悬液混合，能够通过破碎后上清液中荧光素酶活性的变化，正确反映靶细胞的破碎程度，并为破碎过程中蛋白质的活性保存提供参考。破碎产物中引入的荧光素酶，对后续靶蛋白的镍珠法纯化没有影响。含有萤火虫荧光素酶的菌体，可在-80℃环境下保存至少90 d而不产生酶活性的显著下降，且细胞对超声破碎的耐受性也不因冻存改变，可在临用前直接解冻并与靶细胞混合，起到辅助定量作用。因此，利用萤火虫荧光素酶对大肠杆菌超声破碎的程度进行辅助定量，是简便、稳定且高效的。

RNAi技术在寄生蜂中的应用研究进展

张龙喜, 吕琳, 张欢欢, 周金成, 车午男, 董辉

2023, 39(12): 99-108. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0580

摘要 ( 739 )

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RNA干扰技术问世至今20余年，已被广泛用于基因功能研究。膜翅目寄生蜂是农林害虫防治领域重要的天敌昆虫资源。RNAi技术对靶基因的昆虫沉默效果依赖于dsRNA的递送效率。寄生蜂幼期通过摄取寄主昆虫营养完成其生长发育，并与寄主昆虫发生相互作用，给RNAi技术的实施带来挑战。目前，RNAi技术已在丽蝇蛹集金小蜂（Nasonia vitripennis）、中红侧沟茧蜂（Microplitis mediator）、菜蛾盘绒茧蜂（Cotesia vestalis）、蝶蛹金小蜂（Pteromalus puparum）、斑痣悬茧蜂（Meteorus pulchricornis）等至少13种寄生蜂中开展。本文归纳了RNAi技术在寄生蜂基因调控方面的研究进展，并总结了在寄生蜂类群中影响RNAi效率的因素，以期为RNAi技术在寄生蜂类群中的应用提供参考。

单细胞染色质转座酶可及性高通量测序技术及其应用

赵若含, 赵净颖, 柏毅承, 张瑞芳, 贾俊静, 豆腾飞

2023, 39(12): 109-117. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0518

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单细胞染色质转座酶可及性的高通量测序（single-cell assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing, scATAC-seq）是利用转座酶研究单细胞染色质开放性的高通量测序技术，对于研究全基因组的表观遗传调控具有重要的意义。可从多个维度揭示有关染色质“组装”的重要信息，从而映射出细胞中的转录因子调控蛋白的结合区域和核小体定位等信息。目前，scATAC-seq技术已在生物和医学领域得到广泛应用，主要用于开放染色质图谱的绘制、细胞分化和发育、疾病致病机制以及肿瘤微环境的研究。本文阐述了scATAC-seq技术研究单细胞染色质开放区域的发展概况、数据分析和相关应用，期望对单细胞全基因组水平的染色质开放区域研究、顺式调控元件鉴定以及遗传调控网络的解析等提供借鉴，以期为今后更好的在生命科学研究中起到推动作用。

细胞特异性核酸适配体在疾病治疗中的应用

钟朝滨, 朱龙佼, 张博洋, 张洋子, 陈可仁, 许文涛

2023, 39(12): 118-127. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0289

摘要 ( 161 )

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核酸适配体是由20-100个核苷酸组成的单链脱氧核糖核酸（ssDNA）或核糖核酸（RNA），一般是通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）进行筛选。核酸适配体可以与多种靶标物质特异性结合，包括毒素、金属离子、生物大分子、微生物等，已被广泛应用于食品检测、医疗诊断等领域。细胞作为人体最基本的组成单位是大多数疾病病理机制和治疗策略的研究重心。近年来，核酸疗法以更安全更高效的优势成为疾病治疗领域的研究重心，研究人员认识到核酸适配体的靶向结合能力可以应用到细胞的靶向治疗中。因此，开发出Cell-SELEX技术用于筛选可以靶向细胞标志物的核酸适配体。细胞特异性核酸适配体与传统的核酸适配体的区别，在于它们的特异性靶标是细胞成分，它们可以直接结合与细胞生长和代谢相关的物质影响细胞生理活动，也可以作为靶向递送工具递送药物，在疾病的精准治疗中具有突破性影响。因此，细胞特异性核酸适配体引发了广泛关注。本文对细胞特异性核酸适配体在多种疾病治疗中的研究进展进行了综述，以期为其在人类疾病治疗中的应用提供参考。

陆地棉与瑟伯氏棉远缘杂交后代性状鉴定与遗传分析

候林慧, 郑赟, 荣二花, 吴玉香

2023, 39(12): 128-135. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0539

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远缘杂交及多倍化是物种形成和种质创新的基础，将陆地棉与野生瑟伯氏棉进行远缘杂交及染色体加倍获得可育杂种。旨在将瑟伯氏棉的有益农艺性状转移到陆地棉中，拓宽陆地棉的遗传基础。以陆地棉为母本，瑟伯氏作父本进行远缘杂交合成杂种F₁，并进行染色体加倍，获得异源六倍体，对F₁及异源六倍体进行形态学、细胞学、生理生化及SSR分子标记鉴定。形态学鉴定结果表明，异源六倍体植株整体与杂种三倍体相似，介于双亲之间，异源六倍体的雄蕊多于亲本及F₁，有淡红色的花斑，与亲本及F₁都不同。细胞学鉴定表明，随着倍性的增加，气孔密度呈下降趋势，而气孔长度、叶绿体数和花粉粒直径均呈上升趋势；杂种三倍体（F₁）和异源六倍体的减数分裂行为表明，二者的减数分裂均有正常和异常行为，三倍体中的多分体较多，而六倍体正常四分体明显增多。三倍体的多分体中，正常四分体占比为24.33%；六倍体的多分体中，正常四分体占比为82.17%，表明六倍体的育性在恢复。生理生化结果表明，酶的活性随不同世代倍性的增长而升高。SSR鉴定结果表明，三倍体杂种和异源六倍体既扩增出了父母本的条带，同时也扩增出了新的特异性条带，表明远缘杂交过程中产生了染色体重组现象。通过远缘杂交成功合成陆瑟杂种，通过染色体加倍成功获得了可育的异源六倍体。

52个马铃薯遗传多样性分析及SSR分子身份证构建

安苗, 王彤彤, 付逸婷, 夏俊俊, 彭锁堂, 段永红

2023, 39(12): 136-147. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0512

摘要 ( 219 )

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马铃薯（Solanum tuberosum L.）种质资源遗传多样性评价是开展遗传育种的前提和基础，为探究马铃薯种质资源的遗传背景，进而为新品种的选育提供育种材料。以52个马铃薯品种（系）为研究材料，采用SSR标记分析亲缘关系，进而评价其遗传多样性，并构建指纹图谱。从25对SSR引物中筛选出多态性丰富、稳定性好的16对引物，并对52份马铃薯品种（系）进行SSR扩增分析，16对SSR引物扩增出147个多态性条带，引物平均多态条带比率为64.71%，平均Nei's遗传多样性（Nei's genetic diversity, H）和平均Shannon's指数（Shannon index, I）分别为0.14和0.24。在遗传相似系数0.23处，52份材料经聚类分析分为3大类，类群I包括49个品种（系），46个是北方品种（系），3个国外引进品种（系），均适宜晋北地区种植；类群II包括2个品种，‘北方016’和‘晋薯16号’，特点是薯皮黄色、干物质含量高；类群III仅包括‘晋薯15号’，在大类的划分上未按照地理来源进行聚类。在遗传相似系数0.36处，类群I又可以分为7个亚类。基于最少引物鉴定最多种质的原则，利用C59、S25、C33、S151共4对引物组合可区分全部供试品种，构建出基于SSR标记的数字化指纹图谱及分子身份证。利用SSR标记技术多态性引物可以评价马铃薯种质资源的遗传多样性，通过分子身份证能够准确鉴别以及溯源不同马铃薯品种（系）。

PEG模拟干旱条件下黄瓜种子发芽前后转录组分析

谢洋, 周国彦, 苏航, 邢雨蒙, 闫立英

2023, 39(12): 148-157. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0819

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干旱是影响黄瓜生长发育并导致产量降低最为普遍的非生物胁迫因素之一。为解析黄瓜干旱胁迫响应分子作用机制，以抗旱型旱黄瓜‘KS33’与敏感型旱黄瓜‘KS30’为试材，利用PEG模拟干旱对种子进行处理，选取发芽前期和发芽后期进行转录组测序。结果表明，发芽前期是抗旱基因挖掘的重要时期，其中，抗旱型材料发芽前期PEG模拟干旱诱导较对照（DT1_TvsDT1_CK）鉴定到727个上调和345个下调差异基因，敏感型材料发芽前期PEG模拟干旱诱导较对照（DS1_TvsDS1_CK）鉴定到1 226个上调和111个下调差异基因；KEGG富集联合分析鉴定到富集于亚油酸代谢（csv00591）、戊糖、葡萄糖醛酸转换（csv00040）、苯丙素的生物合成（csv00940）和植物激素信号转导（csv04075）通路上的20个抗旱关键候选基因。关联SNP变异位点信息及RT-qPCR分析验证，最终筛选出抗旱基因CsaV3_4G023820、CsaV3_2G006420及2个相关SNP分子标记。

黄瓜内果皮汁液对种子萌发的影响

杨艳, 莫雨杏, 周祎, 陈惠明, 肖浪涛, 王若仲

2023, 39(12): 158-168. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0390

摘要 ( 168 )

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明确黄瓜内果皮汁液在种子萌发中的作用、化学成分及机制，为基于黄瓜来源的种子萌发抑制剂研发提供一定的理论依据。以易胎萌黄瓜（C-L）种子为供试材料，研究难胎萌黄瓜（M-H）内果皮汁液（质量分数为100%、50%）及其不同提取液（质量分数为3%）对C-L种子萌发的影响，并分析汁液化学成分。针对质量分数为100%的M-H汁液和蒸馏水（对照）处理的种子生理生化指标动态变化进行分析。质量分数为100%、50%的M-H黄瓜内果皮汁液对C-L种子萌发均表现出显著的抑制作用，20 h抑制率分别为100%和73%。乙醇相、正丁醇相在种子整个萌发过程中均发挥抑制作用，与对照相比，26 h其抑制率分别提高12.22%和47.77%。在汁液中鉴定到影响种子萌发的化合物：肉豆蔻酸、棕榈酸、柠檬酸和组氨酸。质量分数为100%汁液处理的种子可溶性糖含量变化不大。植物激素ABA含量一直高于对照，ABA/GA₃ 0-20 h显著高于对照。ABA合成酶基因CsNCED1 10-15 h表达量增加，CsNCED2 15-25 h表达量显著增加；ABA信号转导基因CsPYL2、CsPP2C2、CsSnRK2和代谢基因CsCYP707A1 10 h后表达量均显著增加，20 h时表达量均最高。黄瓜内果皮汁液中的肉豆蔻酸、棕榈酸、柠檬酸、组氨酸可能通过促使ABA合成基因CsNCED2及信号转导基因CsPYL2、CsPP2C2、CsSnRK2表达量增加，从而使得ABA含量提高，同时阻碍可溶性糖代谢，进而有效抑制种子萌发。

菠菜PSY基因家族的鉴定与表达分析

任丽, 乔舒婷, 葛晨辉, 魏梓桐, 徐晨曦

2023, 39(12): 169-178. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0392

摘要 ( 202 )

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八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase, PSY）是植物类胡萝卜素合成途径中的第一个限速酶，对植物的生长发育具有重要作用。为了解菠菜（Spinacia oleracea L.）中PSY基因家族功能，本研究通过生物信息学方法对菠菜PSY基因家族成员的数目、结构、启动子元件、氨基酸特性和基因进化等进行鉴定分析，并利用实时荧光定量PCR技术（RT-qPCR）分析其在菠菜组织中及响应红蓝光比例变化的表达模式，同时测定R1B3（红光∶蓝光=1∶3）和R3B1（红光∶蓝光=3∶1）处理后菠菜总类胡萝卜素含量，进行SoPSYs基因表达量与总类胡萝卜素含量变化的相关性分析。结果显示，菠菜共有4个PSY基因，含有SQS_PSY保守结构域，SoPSY蛋白为亲水性蛋白。菠菜PSY1、PSY2和苋科的甜菜进化关系较近，PSY3、PSY4与番茄PSY3有较近的亲缘关系。菠菜PSY基因启动子序列上存在多种光响应和植物激素相关元件。SoPSY基因具有组织表达特异性，SoPSY1、SoPSY2、SoPSY3仅在叶片中表达，SoPSY4主要在根中表达。菠菜类胡萝卜素含量在R1B3和R3B1处理后均下降。不同基因型菠菜中，各SoPSY基因响应红蓝光比例变化的表达模式具有差异性，其中SoPSY1的表达在栽培类型菠菜中无显著变化，SoPSY2的表达模式在两种类型菠菜中相反，SoPSY3在野生型与栽培型菠菜中表达模式一致，且这3个基因的相对表达水平与总类胡萝卜素含量变化密切相关。本研究为深入了解PSY基因在菠菜中的生物学功能，以及响应红蓝光比例变化的调控机理奠定了基础。

香蕉MaMC6的克隆及原核表达分析

滕梦鑫, 徐亚, 何静, 汪奇, 乔飞, 李敬阳, 李新国

2023, 39(12): 179-186. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0694

摘要 ( 190 )

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Metacaspases（MCs）是植物程序性细胞死亡的调控基因，参与植物对胁迫的响应。利用PCR技术，从巴西蕉（Musa AAA Cavendish cv. Brazil）细胞中克隆到MaMCs家族成员MaMC6，对其进行生物信息学分析、表达模式分析和功能验证。结果表明，MaMC6由320个氨基酸组成，为稳定蛋白，具有亲水性，不含跨膜结构，含有一个caspase-like domain，属于II型metacaspase蛋白，具有一个防御和应激响应元件。RT-qPCR分析结果显示，100 mmol/L NaCl处理后MaMC6在2 h时相对表达量达到对照的7.70倍；盐胁迫下CaCl₂处理后，基因的表达在2 h时为对照的3.99倍；而钙离子螯合剂EGTA 和钙离子通道阻碍剂LaCl₃的处理提高了MaMC6在盐胁迫下的表达，2 h时达到对照的9.92和11.20倍。亚细胞定位结果显示，MaMC6定位在细胞质和细胞核上。转大肠杆菌结果显示，重组菌株pET28a-MaMC6在NaCl、甘露醇和高温胁迫下生长情况优于对照菌株pET28a。综上所述，MaMC6可能参与香蕉对非生物胁迫的响应过程。本研究为进一步研究MaMCs在香蕉抗逆中的作用提供参考。

基于SSR标记的广东黄皮种质资源遗传多样性分析及分子身份证构建

陆育生, 彭程, 常晓晓, 邱继水, 陈喆, 陈慧琼

2023, 39(12): 187-199. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0349

摘要 ( 156 )

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揭示广东黄皮种质资源的遗传多样性水平及亲缘关系，为黄皮种质资源的合理保护和高效利用提供参考依据。利用12对SSR引物分析广东黄皮种质资源的多态性，利用UPGMA进行聚类分析，通过数字和字母赋值编码构建分子身份证。12对引物在供试材料中共扩增出43个等位基因（Na），平均等位基因数3.583；期望杂合度（He）变幅为0.294-0.665，均值为0.524；多态性信息指数（PIC）变幅为0.291-0.642，均值为0.484；Shannon信息指数（I）变化范围为0.567-1.096，均值为0.913；UPGMA聚类可将84份种质划分为6个类群，并对每一份供试材料构建了分子身份证。广东黄皮种质资源具有较为丰富的遗传多样性，未严格按照地理来源进行聚类，通过赋值编码SSR扩增得到的基因型，构建了黄皮资源的分子身份证。

芍药苷转化酶G6046的异源表达及酶活鉴定

韩潆仪, 李章涵, 曹学丽, 裴海闰

2023, 39(12): 200-208. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0653

摘要 ( 177 )

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芍药苷是一种在传统草药芍药中发现的糖苷类化合物，对心脑血管系统有保护作用。然而，口服芍药苷的生物利用度较低，直接吸收的很少，极大地限制了其临床应用。已有研究表明，芍药苷的药理作用可能是由其代谢产物产生的，且主要在肠内菌中被代谢。本文研究了芍药苷转化酶G6046在大肠杆菌BL21 DE3中的诱导表达和纯化，并通过优化诱导条件提高酶的产量，发现在诱导表达的最佳条件（16℃，诱导24 h）下，菌体的产酶量可达到5.34 mg/g，产酶量提高51.69%。基于此诱导条件，本研究对G6046与芍药苷的反应条件（pH和温度）进行优化，发现G6046在pH 9.0、45℃时反应最快，酶活性最高，比酶活为14.56 U/mg。在此优化条件下扩大反应体系，将反应规模从G6046-底物（1/1, mg/mg）扩大到G6046-底物（1/20，mg/mg），转化产物的产量显著提升，为分离芍药苷转化产物奠定了基础。

生防细菌HK11-9对黄瓜棒孢叶斑病的防病能力及其鉴定

张林林, 沈虎生, 杨冰, 何梦菡, 朴凤植, 申顺善

2023, 39(12): 209-218. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0407

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为探讨黄瓜棒孢叶斑病生防细菌HK11-9的防病能力，通过皿内试验测定HK11-9对黄瓜棒孢叶斑病菌多主棒孢霉的抑菌活性、通过离体和活体接种试验评价其对黄瓜棒孢叶斑病的防治效果，进行盆栽试验分析HK11-9在黄瓜叶部的定殖能力及其对黄瓜叶部防御酶活性的影响，同时，测定HK11-9的生物学功能并对其进行鉴定。结果显示，HK11-9显著抑制多主棒孢霉的菌丝生长和孢子萌发；在离体接种和活体接种条件下，HK11-9均对黄瓜棒孢叶斑病具有明显的防治效果，其防治效果分别达到62.80%和67.73%；同时，HK11-9在黄瓜叶部具有稳定的定殖能力，在黄瓜叶部能保持10⁴CFU/g的定殖密度，能够显著提高黄瓜叶部PAL、POD和PPO活性。HK11-9菌株具有分解蛋白、分解纤维素、分解淀粉和产嗜铁素作用，对多种植物病原真菌具有抑菌活性；并根据形态特征、生理生化特性和16S rRNA序列同源性分析，将HK11-9菌株鉴定为多黏类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）。综上所述，生防细菌HK11-9防治黄瓜棒孢叶斑病具有极大的潜力。

内生菌对干旱胁迫下甘蔗的生理响应及抗旱性评价

罗艳菊, 谢林艳, 邹清林, 李四杰, 刘涵, 刘鲁峰, 何丽莲, 李富生

2023, 39(12): 219-228. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0818

摘要 ( 165 )

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探究接种内生菌对干旱胁迫下甘蔗的生理响应及缓解干旱胁迫的效果，为开发利用甘蔗抗旱性功能菌株和甘蔗抗旱栽培技术的推广提供研究基础。选择体外耐旱性较强的4株甘蔗内生菌为目标菌株，盆栽试验设2个土壤含水量，分别为正常浇水（CK：土壤含水量25%-30%）和中度干旱胁迫（土壤含水量10%-12.5%），并分别设接种单一内生菌和组合内生菌及不接种内生菌的处理，共8个处理。测定甘蔗苗期的生理生化指标，并对各处理进行抗旱性综合评价。结果表明，与CK相比，干旱胁迫促进甘蔗植株脯氨酸（proline, Pro）、可溶性蛋白（soluble protein, SP）、可溶性糖（soluble sugar, SS）、丙二醛（malondialdehyde, MDA）的积累，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化物酶（peroxidase, POD）活性的升高；并降低了叶片相对含水量（leaf relative water content, RWC）、离体失水率（water loss rate in vitro, RWL）和叶绿素（chlorophyll, ChI）的含量。干旱胁迫下，与未接种内生菌的处理相比，接种内生菌能有效的缓解干旱胁迫，其中，ZM菌株单独接种处理（ZD）的抗旱性综合评价值D值最高，且通过灰色关联性分析可知SOD、ChI、RWC、Pro与各处理的D值密切相关。ZM菌株接种缓解甘蔗苗期干旱胁迫的效果最佳，且通过增加ChI、RWC、Pro等含量和SOD酶活性来提高甘蔗苗期的抗旱性。

贝莱斯芽孢杆菌ZHX-7的分离鉴定及抑菌促生效果

李莹, 宋新颖, 何康, 郭志青, 于静, 张霞

2023, 39(12): 229-236. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0152

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为获得高效拮抗花生病害的生防微生物，以花生冠腐病菌为指示菌，采用稀释涂布平板法和平板对峙法，从山东莱西采集的花生连作田的病、健株根际土壤样品中筛选到1株高效生防菌株，编号为ZHX-7。结合形态学特征和16S rDNA、gyrB序列分析，确定ZHX-7为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。ZHX-7的菌悬液、无菌发酵液和挥发性气体对花生白绢病菌、基腐病菌、网斑病菌和轮斑病菌菌丝生长的抑制均达到极显著的水平，平板对峙试验表明ZHX-7的菌悬液对花生白绢病菌、基腐病菌、网斑病菌和轮斑病菌的抑菌率分别为64.40%、70.37%、77.43%和65.32%。在以ZHX-7无菌发酵液稀释10倍的PDA培养基上，花生白绢病菌、基腐病菌、网斑病菌和轮斑病菌菌丝的生长抑制率分别为67.81%、52.16%、23.52%和69.93%。双皿对扣试验表明ZHX-7的挥发性气体对花生白绢病菌、基腐病菌、网斑病菌和轮斑病菌的抑菌率分别为86.82%、35.40%、81.70%和44.19%。ZHX-7可产生蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶等次级代谢产物；此外，在温室盆栽条件下，ZHX-7有菌发酵液明显促进了花生的生长，同对照相比，鲜质量、干质量分别增加31.24%和26.47%，并且ZHX-7有菌发酵液明显提高了花生对白绢病的抗性，防效达到51.76%。综上所述，本研究筛选获得的一株贝莱斯芽孢杆菌ZHX-7，能够抑制多种花生病原真菌，同时促进花生生长，是一株具有宽广拮抗谱的多功能菌株，具有较好的生防应用潜力。

一株耐低温异养硝化-好氧反硝化菌的分离鉴定及其脱氮特性

董怡华, 王凌潇, 任涵雪, 陈峰

2023, 39(12): 237-249. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0452

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为了提高低温废水的生物脱氮效率，从寒冷地区冬季土壤和底泥中分离筛选耐低温异养硝化-好氧反硝化细菌，研究其脱氮特性及途径。通过菌落和细胞形态特征观察、16S rRNA基因序列分析鉴定菌种。分别以NH₄⁺-N、NO₃^--N、NO₂^--N为唯一氮源，以NH₄⁺-N和NO₃^--N为混合氮源，考察菌株在低温条件（10℃）的硝化、反硝化以及同步硝化反硝化性能。采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）对菌株的脱氮功能酶基因扩增，推测低温脱氮途径。结果表明，从河水底泥中筛选出一株异养硝化-好氧反硝化菌，经鉴定为Pseudomonas veronii，命名为P. veronii DH-3。该菌分别以相同初始含氮量（105 mg/L）的NH₄⁺-N、NO₃^--N和NO₂^--N为唯一氮源，在10℃好氧培养48 h时，氮的去除率分别为99.07%、96.89%和90.29%，且在脱氮过程中几乎无亚硝酸盐的累积。以NH₄⁺-N和NO₃^--N为混合氮源时，NH₄⁺-N在48 h内被完全去除，NO₃^--N的去除率为87.09%；氮平衡分析结果表明，以NO₃^--N和NO₂^--N为唯一氮源时含氮气体和细胞内生物氮的转化率均低于NH₄⁺-N，表明该菌株的异养硝化能力强于好氧反硝化能力。脱氮功能基因hao、napA、nirS、nirK、cnorB和nosZ的成功表达，进一步证实该菌株具有硝化反硝化能力。根据上述研究结果，推测该菌株低温脱氮的主要途径为异养硝化-好氧反硝化作用和同化作用。菌株P. veronii DH-3具有良好的异养硝化-好氧反硝化性能，为低温含氮废水的生物净化提供了理论支持。

一株异养硝化-好氧反硝化细菌的筛选及氮转化特性研究

蒋慧慧, 王强, 付维来, 饶志明, 张显

2023, 39(12): 250-260. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0614

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水产养殖过程中氮元素超标易造成水质恶化，威胁水产动物的生长繁殖，亟需安全、高效的脱氮方法。从福建某水产养殖池底的污泥中筛选出一株氨氮降解菌，菌种鉴定后进行适应性驯化，并研究不同条件对菌株生长和氨氮降解的影响，随后又以亚硝态氮为唯一氮源检测菌株的好氧反硝化特性。菌株经16S rRNA鉴定为阿氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai，命名为JN01；驯化后，菌株的生长、氨氮去除率均有不同程度提高，初始NH₄⁺-N浓度为200 mg/L的氮去除率最高达87.29%；影响菌株脱氮的单因素实验结果表明，当NH₄⁺-N浓度为200 mg/L、丁二酸钠为碳源、碳氮比为15∶1、pH 7.5、培养温度为30℃时，菌株的氨氮降解率可以达到92.78%。在亚硝态氮为唯一氮源的条件下，菌株JN01也能进行好氧反硝化转化，NO₂^--N降解率为82.30%。B. aryabhattai JN01具有良好的异养硝化和好氧反硝化特性，具备同时解决养殖废水中氨氮和亚硝酸盐超标的应用潜力。

石珊瑚共附生真菌次级代谢产物的抗炎活性及化学多样性研究

廖清楠, 周龙建, 杨志友, 冯昀铠, 黄谊君, 胡雪琼, 张翼, 刘亚月

2023, 39(12): 261-275. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0501

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以石珊瑚共附生真菌为研究对象，探究不同培养条件对其次级代谢产物抗炎活性和化学多样性的影响。基于OSMAC（one stain many compounds）策略，分别选用马铃薯葡萄糖水（potato dextrose broth, PDB）和糙米培养基，并设置 3 种盐度（0.3%、3.0% 和 10.0%），对 31 株石珊瑚来源共附生真菌进行小规模发酵培养。以脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的BV-2小胶质细胞为炎症模型，从中筛选出具有抗炎活性的菌株；并通过薄层色谱法（thin-layer chromatography, TLC）指纹图谱、超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法（ultra-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry, UPLC-QTOF-MS）以及基于特征的分子网络（feature-based molecular networking, FBMN）等技术手段进一步分析抗炎活性菌株次级代谢产物的化学多样性。结果表明，5株菌株在糙米培养基条件下表现出显著的抗炎活性，对LPS诱导的BV-2细胞中一氧化氮（nitric oxide, NO）的释放显示中等或强的抑制活性，且呈现显著的浓度剂量依赖性。而菌株C3-9粗提物在10和20 µg/mL的低浓度条件下也表现出了显著的抑制NO产生的作用，进一步的TLC和FBMN分析显示菌株C3-9的次级代谢产物中含有丰富的抗炎活性化合物，且具有高度的多样性。石珊瑚共附生真菌C3-9次级代谢产物具有显著的抗炎活性和多样性，为后续抗炎活性化合物的发现提供了基础。

珊瑚状猴头菇多糖的提取及其体外抗氧化活性分析

涂晓媛, 褚路路, 王冕, 陈炳智, 江玉姬

2023, 39(12): 276-286. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0710

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珊瑚状猴头菇是近几年栽培驯化成功的新品种，珊瑚状猴头菇多糖具有抗氧化等生理活性。以多糖提取率为指标，利用响应面法优化热水浸提珊瑚状猴头菇多糖的提取工艺，并通过紫外吸收光谱、傅里叶变换红外光谱、X-衍射初步表征珊瑚状猴头菇多糖，同时测定其体外抗氧化活性。珊瑚状猴头菇多糖最佳工艺参数为提取温度93℃、提取时间2.0 h、料液比1∶33（g/mL）、颗粒大小80目；表征结果显示珊瑚状猴头菇多糖含有少量蛋白质和核酸，具有多糖化合物的典型吸收峰和吡喃糖环结构，同时可能存在晶体和非晶体结构；体外抗氧化试验表明，珊瑚状猴头菇多糖对DPPH、ABTS⁺、·OH自由基有良好的清除效果，其EC₅₀值分别为0.663 mg/mL、0.767 mg/mL和0.952 mg/mL。珊瑚状猴头菇多糖具有良好的体外抗氧化活性，研究结果为进一步探究珊瑚状猴头菇多糖体内抗氧化活性及其他功效奠定研究基础。

猪源致病性大肠杆菌基因组比较与毒力因子分析

吴莉丹, 冉雪琴, 牛熙, 黄世会, 李升, 王嘉福

2023, 39(12): 287-299. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0578

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不同菌株猪源致病性大肠杆菌的致病力有较大差异，通过着重研究菌株基因组中携带的毒力因子种类和数量，以解析猪源大肠杆菌致病的分子机制。利用二代高通量DNA测序技术测定猪源致病性大肠杆菌的基因组DNA序列，通过生物信息学方法，分析不同毒力菌株的基因组结构特征、进化类型、携带的毒力因子基因及其碱基变异，采用PCR方法对候选毒力因子基因进行验证。猪源致病性大肠杆菌不同毒力菌株的基因组全长范围为4.62-5.3 Mb，含有3 364-3 557个编码基因，菌株的系统进化群和多位点序列分型多属于A群和ST10克隆复合群。6株菌携带112-280个毒力因子基因，强毒菌株的毒力因子基因尤其是毒素基因多于弱毒菌株，且各菌株分泌系统基因的数量变异较大。此外，毒力因子基因中检测到插入缺失、移码突变和无义突变等高影响碱基变异。采用PCR验证了代表性毒力因子基因及其变异。猪源致病性大肠杆菌的毒力与基因组长度、编码基因的数量和变异相关，与GC含量、前噬菌体和CRISPR序列没有必然联系。

Atteva charopis的比较线粒体基因组研究及系统发育分析

林兴雨, 宋南

2023, 39(12): 300-310. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0171

摘要 ( 148 )

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线粒体基因组有助于对巢蛾总科的分子进化和系统发育的理解。本研究测序、分析了Atteva charopis Turner, 1903的线粒体全基因组，并基于线粒体基因组的核苷酸和氨基酸数据重建了巢蛾总科的系统发育关系。在系统发育分析中，内群取样包含巢蛾总科的10种昆虫，外群选择2个谷蛾总科Tineoidea（Phyllocnistis citrella和Caloptilia theivora）昆虫；分别利用最大似然法和贝叶斯法重建巢蛾总科的系统发育关系。Atteva charopis的线粒体基因组全长为15 163 bp（GenBank序列号：OQ130005），包含37个基因（13个蛋白质编码基因、2个核糖体RNA基因和22个转运RNA基因）和一段非编码控制区。与假定昆虫的trn基因（trnI-trnQ-trnM）相比，该线粒体基因出现了trn基因重排（trnI-trnM-trnQ）。两种不同的系统发育分析方法构建的系统发育关系树显示，潜叶蛾科、Praydidae和斑巢蛾科为单系群，而菜蛾科为非单系群，斑巢蛾科和Praydidae亲缘关系较近，Atteva charopis与Atteva aurea形成姐妹群。本研究结果可为深入研究巢蛾总科的系统发育提供线粒体基因组数据。

米曲霉磷酸甲羟戊酸激酶功能研究

尚怡彤, 闫欢欢, 王丽红, 田学琴, 薛萍红, 罗涛, 胡志宏

2023, 39(12): 311-319. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0702

摘要 ( 168 )

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磷酸甲羟戊酸激酶（PMK）是甲羟戊酸（MVA）途径的关键酶。在真菌中，MVA途径是麦角甾醇生物合成的上游，因此PMK也被称为Erg8。为了研究磷酸甲羟戊酸激酶在米曲霉（Aspergillus oryzae）麦角甾醇合成通路中的作用，对米曲霉AoErg8基因功能进行研究。采用生物信息学方法鉴定米曲霉中的该基因，通过系统发育树和酵母异源互补分析其是否保守，利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测其表达模式，同时通过荧光蛋白标记对其亚细胞定位进行分析，最后测定AoErg8基因过表达对米曲霉生长和麦角甾醇含量的影响。结果表明，AoErg8进化保守，其表达量在不同生长时间和不同非生物胁迫下均发生了改变；AoErg8能恢复酿酒酵母erg8突变体的温度敏感表型；AoErg8定位于细胞质中；米曲霉中AoErg8过表达导致麦角甾醇含量降低，并且影响米曲霉生长和孢子形成。因此，米曲霉AoErg8的功能相对保守，其过表达可以降低麦角甾醇含量并影响菌落生长和孢子形成。该研究进一步揭示丝状真菌米曲霉麦角甾醇生物合成和调控机理，为米曲霉或其他真菌脂质代谢的基因工程奠定基础。

漆酶BmLac的异源表达、酶学特性及棉酚降解的研究

魏婷柳, 苗华彪, 吴倩, 黄遵锡

2023, 39(12): 320-328. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-1469

摘要 ( 197 )

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为开发能高效降解游离棉酚的酶蛋白。从土壤中筛选得到一株Bacillus amyloliquefaciens XP-13，从其基因组扩增获得了基因BmLac，进而构建Ppic9k-BmLac重组质粒，将其导入毕赤酵母GS115实现了异源表达，对漆酶BmLac的酶学特性、棉酚降解效果进行研究。结果表明，以ABTS为底物时，该酶的最适反应条件为pH 4，55℃，最适条件下酶活是101.56 U/mL；在90℃下孵育1 h后，相对酶活仍保留70%以上；在pH 3-7孵育1 h，其相对酶活均保留96%以上。1 mmol/L的Cu²⁺能使该酶酶活提高1.93倍，但高浓度（10 mmol/L）的Fe²⁺、Fe³⁺和Al³⁺完全抑制该酶活性。在55℃下反应2 h后，该酶对棉酚的降解率高达94.57%（无介体）和98.73%（有ABTS）。综上，漆酶BmLac具有良好的热稳定性和广泛的pH适应性，并能有效降解棉酚，该酶为有效降解棉籽粕中的游离棉酚提供基础支撑。

2023, 39(12): 329.

摘要 ( 76 )

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